CN102816855B

CN102816855B - 基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102816855B
Application number: CN201210321641.8A
Authority: CN
Inventors: 周小明; 刘宏星; 邢达
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-09-03
Also published as: CN102816855A

Abstract

本发明公开了一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法及检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法主要的步骤包括：（1）食品致病菌DNA的提取及酶切，（2）扩增引物及核酸探针序列设计，（3）超分支滚环扩增反应，（4）退火杂交，（5）纳米金探针的制备，（6）胶体金核酸试纸条的制备，（7）样品的检测。当样品中含有目的基因片段时，胶体金核酸试纸条的T线和C线处都会形成红线；若样品中不含目的基因片段，胶体金核酸试纸条只有C线处会形成红线。本发明可以快速、特异、灵敏、定性和定量检测食品样本中的食品致病菌，其探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。

Description

基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法及检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒。

背景技术

近年来，食源性致病菌以其传染性和致病性，在全球范围内造成了越来越多的食品安全事件，随着人们的生活水平和接受教育水平的不断提高，食品安全越来越受到人们的广泛重视，食品致病菌问题也相应地更加备受关注。快速、高特异性、高灵敏度的检测食品致病菌的方法不仅可以快速诊断致病的原因，在现实生活中还能预防肠道传染病和食物中毒的发生。

目前食源性致病菌的检测方法主要依靠分离培养和生化鉴定，该方法费时费力。而灵敏度更高、特异性更好的基于核酸的检测方法，虽然可以直接用于细菌检测而不需要前期培养或者缩短孵育时间，但是需要温度循环和昂贵的设备，例如聚合链式酶反应（PCR）和基于核酸扩增的荧光检测技术。随着胶体金诊断技术的发展，一种检测速度快、特异性好、灵敏度高、设备简单、成本低、操作简单的胶体金免疫试纸条在生物医学领域特别是医学检验中，得到了广泛应用，早孕试纸条成功的商品化应用就是证明，但是胶体金免疫试纸条所用的单克隆抗体也比较昂贵，针对不同的检测样品，需要调整抗体的类型，不适于广谱性检测。近期，一种基于核酸检测的核酸试纸条发展迅速，它与恒温扩增的方法相结合用于检测，已有环介导的恒温扩增核酸试纸条（LAMP-NALFTS），基于核酸序列的核酸试纸条（NASBA-NALFTS），交叉引物恒温扩增核酸试纸条，循环探针温扩增核酸试纸条（CPT-NALFTS），重组聚合酶温扩增核酸试纸条（RPA-NALFTS），链置换恒温扩增核酸试纸条（SDA-NALFTS）等方法的报道，但是普遍存在探针设计复杂，检测灵敏度相对不高，易出现假阳性等问题，且在食源性致病微生物检测领域的应用较少。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条进行简便、灵敏度高、探针设计简单、操作步骤简短及特异性高的检测食品致病菌的方法。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法实现检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法，具体包括如下步骤：

（1）食品致病菌基因组DNA的提取及酶切

提取食品致病菌的基因组DNA，根据食品致病菌的保守序列选择限制性内切酶对食品致病菌的基因组DNA进行酶切反应得到靶片段。

（2）扩增引物及核酸探针序列设计

根据步骤（1）得到的靶片段序列设计一条5’端磷酸化修饰的锁式探针（padlock probe）；

根据锁式探针序列设计两条扩增方向相反的引物1和引物2，引物1和引物2的5’端修饰有功能基团；

设计一条与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA，作用是使其与超分支滚环扩增的双链产物退火杂交，为试纸条上核酸杂交提供空闲碱基位点；

设计一条5’端修饰有功能基团的多聚T探针；

设计一条5’端修饰有功能基团的多聚A捕捉探针。

（3）超分支滚环扩增反应

连接反应：反应体系包括步骤（1）中所述的靶片段、步骤（2）中所述的锁式探针、连接酶及其缓冲液和双蒸水；

消化反应：反应体系包括上述连接反应的产物、核酸外切酶及其缓冲液和双蒸水；

扩增反应：反应体系包括上述消化反应的产物、步骤（2）中所述的引物1和引物2、dNTP、聚合酶及其缓冲液和双蒸水。

（4）退火杂交

将超分支滚环扩增反应产物与步骤（2）中所述的5’端含多聚A尾的单链DNA退火杂交。

（5）纳米金探针的制备

纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸（HAuCl₄）为原料制备纳米金；

纳米金探针的制备：将步骤（2）中所述的多聚T探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。

（6）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、NC膜和吸水板按图4所示结构组装：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；

所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线（T线）和含链霉亲和素和多聚A捕捉探针的控制线（C线）。

（7）样品的检测

将由步骤（4）得到的退火杂交产物与SSC缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加SSC缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食品致病菌；为了定量检测，可用读条机读取检测线和控制线上的信号。

步骤（1）中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella enterica）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）、志贺氏菌（Shigella.Spp）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和蜡状芽孢杆菌（Yersiniaenterocolitica）等。

步骤（1）中所述的食品致病菌的保守序列优选为食品致病菌的16S-23S启动子间基因片段或食品致病菌的毒力基因片段，如单增李斯特菌表达溶素O的基因（hlyA），沙门氏菌的侵袭基因A（invA）等。

步骤（2）中所述的锁式探针分为5’端和3’端与靶片段序列毗邻互补的区域和中间与超分支滚环扩增的两个引物（引物1和引物2）结合的区域。

步骤（2）中所述的引物1的功能基团优选为生物素。

步骤（2）中所述的引物2的功能基团优选为生物素。

步骤（2）中所述的单链DNA的多聚A尾优选为16～32个A。

步骤（2）中所述的多聚T探针的功能基团优选为巯基，多聚T探针中T的数量优选为16～32个；

步骤（2）中所述的多聚A捕捉探针的功能基团为生物素，多聚A捕捉探针中A的数量优选为16～32个。

当食品致病菌为单增李斯特菌时：

其保守序列为表达溶素O基因（hlyA，NCBI编号：AF253320），用限制性内切酶Bsp1286Ⅰ（Sdu Ⅰ）和EcoT14Ⅰ（Sty Ⅰ）对单增李斯特菌基因组DNA进行酶切，得到hlyA靶片段，序列为：5’-TCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACG

GC-3’，单下划线表示的是hlyA靶片段与锁式探针结合的区域，竖线表示隔开了锁式探针的5’和3’端；

步骤（2）中所述的5’端磷酸化修饰的锁式探针的序列为：5’-phosphate-GCGT CTTAGGACTTGCAGGCGGG

（phosphate表示磷酸化），单下划线部分为与hlyA靶片段互补配对的，双下划线表示的是引物1结合的区域，点下划线表示的是引物2结合的区域；

步骤（2）中所述引物1为：5’-Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’（Bio表示生物素）；

步骤（2）中所述引物2为：5’-Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’（Bio表示生物素）；

步骤（2）中所述的5’端含多聚A尾的单链DNA的序列为：5’-Poly（dA）-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚A尾为16个A；

步骤（2）中所述的多聚T探针的5’端修饰有巯基、T的数量为16个，步骤（2）中所述的多聚A捕捉探针5’端修饰有生物素、A的数量为16个。

当食品致病菌为沙门氏菌时：

其保守序列为侵袭基因A（invA，NCBI编号：EU348367），用限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ对沙门氏菌基因组DNA进行酶切，得到invA靶片段，序列为：5’-GTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGACTTGTGCCGAAGAGCCGGC-3’；

根据超分支滚环扩增的原理，针对不同靶序列设计的锁式探针，可以有相同的连接序列，所以该锁式探针的连接序列与检测单增李斯特菌时锁式探针的连接序列相同，故可以使用相同的引物；

步骤（2）中所述的5’端磷酸化修饰的锁式探针的序列为：5’-phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3’（phosphate表示磷酸化）；

步骤（2）中所述的5’端含多聚A尾的单链DNA的序列为：5’-Poly（dA）-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚A尾为16个A；

步骤（3）中所述的连接酶及其缓冲液优选为Taq DNA连接酶及其相配的商品化的缓冲液；

步骤（3）中所述的连接反应的条件优选为：60℃反应1h，接着95℃反应10min。

步骤（3）中所述的核酸外切酶及其缓冲液优选为Exco Ⅰ和ExcoⅢ及其相配的商品化的缓冲液；

步骤（3）中所述的消化反应的条件优选为：37℃反应2～4h，接着95℃反应10min。

步骤（3）中所述的聚合酶及其缓冲液优选为Bst DNA聚合酶（大片段）及其相配的商品化的缓冲液；

步骤（3）中所述的扩增反应的条件优选为：63～65℃反应1h。

步骤（4）中所述的退火杂交的条件优选为：95℃反应2min，然后37℃反应5min。

步骤（5）中所述的纳米金探针的制备方法为：将20μL 200μM的5’端修饰有巯基的多聚T探针、0.66μL 500μM的醋酸缓冲液（pH 5.2）和1μL 10μM TCEP（磷酸三氯乙酯）混匀，室温、避光孵育1小时；在不断的摇动下，加入1mL 10nM的纳米金胶体溶液，密封，室温避光用振荡器600rpm反应16小时；缓慢震荡下逐滴加入20μL500mM的Tris醋酸缓冲液（pH 8.2），再逐滴加入200μL1MNaCl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，收集沉淀即得到纳米金探针。

步骤（5）中所述的包埋缓冲液为：Na₃PO₄20mM，BSA（牛血清白蛋白）质量百分比5%，Tween X-100体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比8%。

步骤（6）中所述的底板的材料优选为PVC塑料。

步骤（6）中所述的样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为：pH 8.0，体积百分比0.25%的Triton X-100，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl。

步骤（6）中所述的金垫的材料优选为玻璃纤维，其的处理方法为：用50μL步骤（4）中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存。

步骤（6）中所述的硝酸纤维素膜的处理方法优选为：用喷膜仪将6μL链霉亲和素溶液喷到检测线（T线）的位置，将6μL链霉亲和素溶液和多聚A捕捉探针混合液喷到控制线（C线）的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1.67mg/mL，所述的多聚A捕捉探针的浓度为1mM；所述的检测线宽2mm与金垫相隔6mm，所述的控制线宽2mm与金垫相隔12mm。

步骤（6）中所述的吸水板的材料优选为吸水纤维。

步骤（6）中所述的组装优选为：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于NC膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与NC膜重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的条。

步骤（7）中所述的样品的检测的过程优选为：将30μL由步骤（4）得到的退火杂交产物与120μL 4×SSC缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，10min后，再滴加50μL 4×SSC缓冲液，15min之内读取结果。

实现使用上述方法检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，包含A、B、C三个分试剂盒。

A分试剂盒包含引物、dNTP、DNA连接酶、核酸外切酶和DNA聚合酶及其相配的商品化的酶缓冲液和胶体金核酸试剂条。

所述的引物包括引物1和引物2：

引物1为：5’-Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’，

引物2为：5’-Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’。

所述的DNA连接酶优选为Taq DNA连接酶，核酸外切酶优选为Exco Ⅰ和ExcoⅢ，DNA聚合酶优选为Bst DNA聚合酶。

所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板（材料为PVC塑料）上且依次紧密相连的样品板（材料为玻璃纤维）、金垫（材料为玻璃纤维）、硝酸纤维素膜和吸水板（材料为吸水纤维）；所述的紧密连接的方式优选为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于硝酸纤维素膜上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2mm；金垫包埋有连接多聚T探针的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有一条含链霉亲和素的检测线和一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的多聚A捕捉探针的控制线，检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板；检测线宽度为2mm与金垫相隔6mm，控制线宽度为2mm与金垫相隔12mm；多聚T探针T的数量为16个，多聚A捕捉探针A的数量为16个。

B分试剂盒包含限制性内切酶Bsp1286Ⅰ、EcoT14Ⅰ及其商品化的酶缓冲液、5’端磷酸化修饰的锁式探针B和与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNAB；

所述的锁式探针B为：

5’-phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-3’；

所述的单链DNA B为：5’-Poly（dA）-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚A尾A的数量为16个。

C分试剂盒包含限制性内切酶Taq Ⅰ、Alu Ⅰ及其商品化的酶缓冲液、5’端磷酸化修饰的锁式探针C和与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA C；

所述的锁式探针C为：5’-phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3’；

所述的单链DNA C为5’-Poly（dA）-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚A尾A的数量为16个。

分试剂盒A和B一起用于检测单增李斯特菌；分试剂盒A和C一起用于检测沙门氏菌。

本发明的基本原理如图1所示：

当存在检测的目的基因片段时，超分支滚环扩增产生两端含功能基团的长短不一的双链，该双链与一条带有多聚A尾的的单链序列混合，退火杂交，形成含有空闲杂交位点的杂交复合物，当将含有该杂交产物的样品滴加到样品板上时，通过层析作用，与结合垫处已经包埋有多聚T包被的纳米金探针再次杂交，形成”三明治”结构，当其到达已包埋有与引物的功能基团互补的基团或物质的检测线（T线）处时就会形成一条红色的线，过量的多聚T包被的纳米金探针继续层析，到达已包埋有多聚A的控制线（C线）处时形成第二条红色的线；

而不含目的片段时，检测线（T线）处因不能形成”三明治”结构的杂交产物，而没有红色的线出现，只有过量的多聚T包被的纳米金探针继续层析，到达已包埋有多聚A捕捉探针的控制线（C线）处时形成一条红色的线；

若检测线（T线）和控制线（C线）处都无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）超分支滚环扩增降低非特异性扩增几率，不易出现假阳性。设计一条5’端磷酸化修饰的闭合探针，当且仅当闭合探针的5’和3’并列分别与一段待检测的DNA完全互补配对时，5’和3’的距离很近，中间没有隔开一个碱基的距离，这个时候连接酶就会特异的连接5’和3’，使先前的开环的闭合探针成为一个封闭的环的结构；而当没有目的DNA存在时，闭合探针就不能与非目的DNA完全互补配对，这样5’和3’的距离就不会拉近，因此连接酶也就不能将其连接上；

（2）可以实现定性或者定量检测，结果稳定；

（3）检测速度快，特异性好，灵敏度高；

（4）设备简单，成本低，无需昂贵的仪器；

（5）探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。

附图说明

图1是本发明原理图，超分支滚换扩增原理（A），试纸条各部位包埋情况（B），试纸条阳性检测原理（C）。

图2是13nm胶体金的吸收光谱图，在520mm处有最大吸收峰。

图3是超分支滚环扩增的产物的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

图4是试纸条的组装结构及各部分的尺寸图；

图5是超分支滚环扩增核酸试纸条检测单增李斯特菌结果图，阴性结果（1号试纸条）和阳性结果（2号试纸条）；

图6是超分支滚环扩增核酸试纸条检测沙门氏菌的阳性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂均购自新英格兰生物技术公司，试纸条材料及设备均购自上海金标生物有限公司。

实施例1

1.单核增生李斯特菌的DNA的提取及酶切

采用TIANamp Bacteria DNA kit抽提单增李斯特菌（菌株号为CMCC54007，购自广州微生物研究所）基因组DNA。单增李斯特菌的保守序列为表达溶素O基因（hlyA，NCBI编号：AF253320），用EcoT14Ⅰ（Sty Ⅰ）酶和Bsp1286Ⅰ（Sdu Ⅰ）酶对单增李斯特菌基因组DNA进行酶切反应。

20μL Bsp1286Ⅰ酶切反应体系：

反应条件：60℃1h→95℃10min；

40μL EcoT14Ⅰ酶切反应体系：

反应条件：60℃1h→95℃10min，得到hlyA靶片段，其序列：5’-TCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGC-3’。

2.引物及探针设计

根据hlyA靶序列设计一条5’端磷酸化的锁式探针，用来与靶序列进行连接成环；再根据锁式探针序列用Primer5.0引物设计软件设计两条最适的超分支滚环扩增的引物；同时设计了一条与锁式探针互补的且5’端含多聚A尾（多聚A尾的数量为16个）的单链序列，各序列的碱基序列及标记如下表：

3.纳米金的制备

采用柠檬酸盐还原法制备纳米金，将100mL 1mM的HAuCl₄加热沸腾，快速搅拌下迅速加入10mL 38.8mM的柠檬酸钠溶液，2min内溶液颜色由金黄色→灰色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌20min，冷却至室温得到纳米金胶体溶液，用紫外吸收光谱仪测得其吸收峰在520nm左右处（图1所示），即得到13nm的纳米金胶体溶液。

4.多聚T探针与纳米金的连接（TCEP法标记纳米金探针）

向PCR管中加入20μL 200μM的5’端修饰有巯基的多聚T探针（T数量为16），接着向PCR管中加入0.66μL 500μM的醋酸缓冲液（pH 5.2）和1μL 10μMTCEP（磷酸三氯乙酯）以活化巯基，室温、避光孵育1小时；取洁净的离心管，加入1mL 10nM的纳米金胶体溶液，然后在不断的摇动下，加入TCEP处理过的多聚T探针溶液，盖上管盖，室温避光放置至少16小时，用振荡器600rpm加速反应；缓慢震荡下向管中逐滴加入20μL500mM的Tris醋酸缓冲液（pH8.2），Tris醋酸缓冲液的终浓度为5mM；再向管中逐滴加入200μL 1M NaCl，避光孵育一天；12000rpm，4℃离心30分钟，取出离心管，纳米粒子沉积在管底，轻轻吸掉上清，用1mL包埋缓冲液（20mM Na₃PO₄，质量百分比5%BSA，体积百分比0.25%Tween X-100，质量百分比8%sucrose）重悬，用于试纸条金垫处的包埋。

5.超分支滚环扩增

（1）连接反应

当且仅当锁式探针的两个臂与目标序列完全互补配对时，这个线性的锁式探针才能被Taq DNA连接酶特异的连接上，20μL连接反应体系：

反应条件：60℃1h→95℃10min。

（2）消化反应

为了减少不依赖连接反应的扩增反应，没有被连接上的的锁式探针和多余的核苷酸链用核酸外切酶Ⅰ（切单链）和核酸外切酶Ⅲ（切双链）进行消化，20μL消化反应体系：

反应条件：37℃2h→95℃10min。

（3）扩增反应

60μL扩增反应体系：

反应条件：63℃1h。超分支滚环扩增的产物为长短不一的双链DNA，琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图3所示（M：DL 2000，1～3：超分支滚环扩增的产物，C：对照组）：超分支滚换扩增扩增产生长短不一的双链DNA，电泳条带为连续间断条带。

6.退火杂交

将超分支滚环扩增的产物与含多聚A尾的单链序列与退火杂交，反应条件为：95℃反应2min，然后37℃反应5min。

7.胶体金核酸试纸条的组装与准备

（1）样品板：用样品板处理缓冲液（pH 8.0、体积百分比0.25%的TritonX-100，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl）浸润，置于干燥器中室温保存；

（2）金垫：将60μL标记好的纳米金-探针溶液喷在其上，室温下干燥，干燥器中4℃保存；

（3）NC膜：用喷膜仪将6μL1.67mg/mL的链霉亲和素溶液喷到检测线（T线）的位置，将6μL 1.67mg/mL的链霉亲和素溶液和1mM 5’端修饰有生物素的多聚A捕捉探针（A的数量为16）混合液喷到控制线（C线）的位置，C线和T线处划线宽度为2mm，两条线相隔4mm，包埋好探针的NC膜置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；

（4）组装：按图4所示结构安装，每部分之间重叠2mm，最后切成4mm宽的条。

8.样品准备与检测

将30μL由步骤（4）得到的退火杂交产物与120μL4×SSC缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，等待10min后，再滴加50μL4×SSC缓冲液，15min之内读取结果。检测结果如图5所示：1号试纸条（单增李斯特菌阴性）只在C线处形成红线，2号试纸条（单增李斯特菌阳性）在C线和T线处都形成红线，表明该试纸条能正确检测样品中是否含有目的基因片段，进而确定所检测食品致病菌。

实施例2

采用TIANamp Bacteria DNA kit提取沙门氏菌（菌株号为CMCC50040，购自广州微生物研究所）的基因组DNA，根据NCBI公布的沙门氏菌invA基因序（GenBank EU348367）中的保守序列，并使用NCBI中的blast比对，采用TaqⅠ（酶切位点为TCGA）和Alu Ⅰ（酶切位点为AGCT）进行酶切反应得到invA靶片段，其序列为：5’-GTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGACTTGTGCCGAAGAGCCGGC-3’。

根据invA靶片段序列设计一条5’端磷酸化修饰的锁式探针，该锁式探针序列为：5’-phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3’；该探针的临近5’端和3’端的两部分与靶序列互补配对，中间两部分分别为引物1和引物2的结合区域，又根据超分支滚环扩增的原理，针对不同靶序列设计的锁式探针，可以有相同的连接序列，所以该锁式探针的中间与引物1和引物2结合的区域的序列与检测单增李斯特菌时锁式探针的中间两部分区域的序列相同，故可以使用相同的引物；

引物1为：5’-Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’，

引物2为：5’-Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’；

多聚A尾的单链DNA的序列为：5’-Poly（dA）-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚A尾为16个A。

根据实施例1的方法进行超分支滚环扩增、退火杂交和制备胶体金核酸试纸条，将退火杂交产物滴加到胶体金核酸试纸条上进行检测，检测结果如图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的试剂盒，其特征在于：包含A、B、C三个分试剂盒；

A分试剂盒包含引物、dNTP、DNA连接酶、核酸外切酶和DNA聚合酶及其相配的商品化的酶缓冲液和胶体金核酸试剂条；

所述的引物包括引物1和引物2：

所述的引物1为：5’-生物素-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’，

所述的引物2为：5’-生物素-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’；

所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板上且依次紧密相连的样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板；金垫包埋有连接多聚T探针的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有一条含链霉亲和素的检测线和一条含链霉亲和素和5’端修饰有生物素的多聚A捕捉探针的控制线，检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板；

B分试剂盒包含限制性内切酶Bsp1286Ⅰ、EcoT14Ⅰ及其商品化的酶缓冲液、5’端磷酸化修饰的锁式探针B和与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA B；

所述的锁式探针B为：5’-phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGGATT

AGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-3’；

所述的单链DNA B为：5’-Poly（dA）-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCG

TGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚A尾A的数量为16个；

C分试剂盒包含限制性内切酶TaqⅠ、AluⅠ及其商品化的酶缓冲液、5’端磷酸化修饰的锁式探针C和与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA C；

所述的锁式探针C为：5’-phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACG

GGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3’；

所述的单链DNA C为5’-Poly（dA）-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCG

TGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚A尾A的数量为16个；

2. 根据权利要求1所述的基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的试剂盒，其特征在于：

所述的连接酶为Taq DNA连接酶；所述的核酸外切酶为ExcoⅠ和ExcoⅢ；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；

所述的紧密连接的方式为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2 mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2 mm，吸水板位于硝酸纤维素膜上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2 mm；

所述的检测线宽度为2 mm与金垫相隔6 mm；所述的控制线宽度为2 mm与金垫相隔12 mm；

所述的多聚T探针T的数量为16个；所述的聚A捕捉探针A的数量为16个。