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Abstract

本发明提供了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极及金电极外依次修饰的capture probe层和RCA产物层；本发明提供的制备方法是采用核算适配体的特异性识别进行制备，其制备的电极灵敏度和特异性高，可快速的检测鼠伤寒沙门氏菌。

Description

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比率。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研究表明鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。调查中,鼠伤寒沙门氏菌感染数量占当年沙门氏菌感染总量的17%。同时,在我国境内已发现的 290 余种沙门氏菌血清型中, 鼠伤寒沙门氏菌也是最常见的血清型之一。
目前，主要用来检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括生化鉴定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺点与限制，需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程,耗时一周左右, 不利于快速、准确地对食品中的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。因此, 有必要建立一种高效快速检测鼠伤寒沙门氏菌的新方法。
发明内容
为了解决检测鼠伤寒沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。使用本发明的生物传感器，沙门氏菌检测限可达1×10-16mol/ml。
本发明还提供了基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制备方法。
本发明中一共用到了4条DNA链，分别是：HAP、padlock probe、ligation probe、capture probe。
其序列分别为：
HAP：5’- TCT TGC CTA CGT CA T TTT TTT TAG TAA TGC CCG GTA GTT ATT CAA AGA TGA GTA GGA AAA GAT AGG CAA GA-3’（SEQ ID NO：1）；
padlock probe：5’-p-TGA CGT AGG CAA GAT AGA GGA GAC CCA GTA GCC AGA TGT AGC TTC GTA GGA CTT AAAGGT AGT TGG AGC TGT-3’（ SEQ ID NO：2）；
ligation probe：5’-TCT TGC CTA CGT CAA CAG CTC CAA CTA CC-3’（ SEQ IDNO：3）
capture probe：5’-GAG ACC CAG TAG CCA GAT GTA GCT-SH-3’（ SEQ ID NO：4）；
HAP中，中间下划线部分序列是适配体序列。
padlock probe：中间划线部分与capture probe序列相同。
其中发夹结构的序列HAP中，中间下划线部分序列为目标物鼠伤寒沙门氏菌的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密结合。由于变形而暴露出的5’端下划线部分为滚环复制的引物序列，可以与环中padlock probe中5’端下划线部分结合，起始滚环复制过程。
padlock probe 的5’端磷酸化，且下划线部分的序列和3’端部分的序列分别与ligation probe的5’端和3’端互补 ，在T4 DNA连接酶的作用下可以连接成环。
capture probe 的3’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将capture probe 固定在电极表面，5’端含有与padlock probe环状结构内部序列（加下划线部分）相同的序列，能够与滚环放大（Rolling Circle Amplification,RCA）的产物结合，从而起到捕获作用。
本发明中用到了两种酶：Phi 29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶。Phi 29 DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，T4 DNA连接酶催化相邻 DNA 链的 5'-P 末端和 3'-OH 末端以磷酸二酯键结合的反应，需 ATP 作辅酶。
本发明中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过滚环放大的方式来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
padlock probe在引物和T4 DNA连接酶的作用下完成成环反应。发夹结构的DNA中有目标物的适配体和RCA所需引物，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构的DNA链打开，同时暴露出引物序列。此时均相中的环状结构就可以与打开的发夹结构的引物端发生互补配对，从而将环状结构与HAP 固定到一起。此时在Phi 29 DNA聚合酶与dNTP 的共同作用下，以环状结构为模板、在引物作用下发生RCA反应，得到大分子量的复制产物，即为RCA产物，而MB能够结合到产物上，随着RCA反应的不断进行，结合到产物上的MB数量不断增加，从而使信号放大。
在均相反应中，成环反应和RCA的反应条件均为37℃，反应时间是2 h。
一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极，在金电极上从内往外依次修饰有capture probe层和RCA产物层；
所述的生物传感器，capture probe层的厚度为10±2 nm，RCA产物层的厚度为30±2 nm。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；
（2）将capture probe层修饰到电极表面；
（3）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好capture probe层的电极上，37℃，孵育2h。
所述的制备方法，优选将capture probe层修饰到电极表面的操作步骤如下：将capture probe 10 μL滴加到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2 h。
所述的制备方法，操作步骤如下：
（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP和待测目标物加入1号离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（2）向2号离心管中加入padlock probe、连接酶、ligation probe，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
（3）向1号离心管中加入第2步所得产物，聚合酶及dNTP，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
（4）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2 h，清洗；
（5）将电极插入到MB溶液中，37℃孵育10 min，清洗；
所述的生物传感器，HAP（摩尔）、padlock probe（摩尔）、ligation probe（摩尔）、聚合酶（活力）、连接酶（活力）和dNTP（活力）的摩尔与活性的比为1：1：1：2：40：2。
所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将capture probe 固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37℃孵育2h使均相中的RCA产物与电极表面的capture probe 完成杂交反应，从而将RCA产物固定到电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的DNA聚合酶的链延伸和置换作用，滚环放大作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补鼠伤寒沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用鼠伤寒沙门氏菌的适体作为识别物质实现了对目标物鼠伤寒沙门氏菌的高特异性检测；
2、利用了连接酶的连接作用，实现了挂锁探针的成环；
3、利用聚合酶的聚合作用，实现了滚环复制过程，起到了信号放大的作用；
4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；
6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中鼠伤寒沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；
8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为生物传感器的横截面的结构示意图。
其中，1为金电极，2为capture probe层，3为RCA产物层。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
如附图1所示，一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极1，在金电极1上从内往外依次修饰有capture probe层2和RCA产物层3。
本发明提供的生物传感器的制备方法如下：
a、金电极1首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
b、将10 μL的capture probe（10 μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；至此电极的capture probe层2修饰过程先告一段落，后再在均相溶液中修饰RCA产物层3，均相反应中的修饰步骤如下：
a、将灭菌水，10×的缓冲液（buffer）适量，1μL HAP的DNA链（10 μM）和1 μL不同浓度的目标（100 pM，500 pM，1 nM，5 nM，10 nM，50 nM，100 nM，500 nM，
1μM）依次 加入到预先准备好的灭菌的1-9号离心管中，震荡30 s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
b、向另外准备好的9个离心管中分别加入padlock probe（1 μL，浓度为10 μM）、连接酶（1 μL）、ligation probe（1 μL，浓度为10 μM），震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
c、继续向a步中1-9号离心管中加入b步所得孵育混合液（10 μM），聚合酶（1 μL）和dNTP（1 μL），震荡30 s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
d、将c步反应后的溶液（10 μL）滴加到预先修饰好capture probe的电极上，然后将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2 h；
e、将电极插入MB溶液（80 μM），37℃孵育10 min；
f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10 min，共清洗3次。
所述的生物传感器，HAP（摩尔）、padlock probe（摩尔）、ligation probe（摩尔）、聚合酶（活力）、连接酶（活力）和dNTP（活力）的摩尔与活性的比为1：1：1：2：40：2。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、PBS缓冲液是由方法配制：Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM), NaCl (140 mM),KCl (1 mM), MgCl2 (1 mM), CaCl2 (1 mM), 最终溶液的pH值为7.4。
2、配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
检测发现，在目标物的浓度在100pM 到 1μM时，目标物浓度的对数与电流大小成正比关系，同时，我们在100pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即电流最低点因此可得到该方法的检测下限为1×10-16mol/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器， 其特征在于，在金电极从里到外依次修饰有捕获探针capture probe层、滚环复制RCA产物层；
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对电极进行预处理；电极在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗；
（2）将捕获探针capture probe层修饰到电极表面；将10 μM的capture probe 10 μL滴加到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2 h；
（3）将孵育好的RCA产物溶液滴加到修饰好捕获探针capture probe层的电极上，37℃，孵育2 h；具体步骤如下：
1) 将灭菌水，10×的buffer缓冲液、1μL浓度为10μM的HAP和1μL待测目标物加入1号离心管中，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；
2) 向2号离心管中加入1μL浓度为10μM的挂锁探针padlock probe、1μL连接酶、1μL浓度为10μM的连接探针ligation probe，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
3) 向1号离心管中加入第2步所得产物，再加入1μL聚合酶和1μL dNTP，震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
4) 将孵育好的混合溶液滴加到修饰好捕获探针capture probe层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2 h，清洗；
5) 将电极插入到MB溶液中，37℃孵育10 min，清洗即得；
所述的HAP、padlock probe、ligation probe、聚合酶、连接酶和dNTP的摩尔与活性的比为1：1：1：2：40：2；其中HAP、padlock probe和ligation probe的单位为摩尔，聚合酶、连接酶和dNTP的单位为活力；
所述HAP的序列如SEQ ID NO ：1所示；
所述padlock probe的序列如SEQ ID NO ：2所示；
所述ligation probe的序列如SEQ ID NO ：3所示；
所述capture probe的序列如SEQ ID NO ：4所示。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的capture probe层的厚度为10±2 nm，RCA产物层的厚度为30±2 nm。
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