CN107076743A - 用于检测水解β‑内酰胺环抗微生物剂的酶活性的方法 - Google Patents

用于检测水解β‑内酰胺环抗微生物剂的酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测能够水解生物细胞中的β‑内酰胺环抗微生物剂的酶活性的方法，包括：在电化学电池中，使所述生物细胞与包含β‑内酰胺环的所述酶活性的至少一种底物接触，以及利用监测装置检测所述电化学电池中的阻抗变化。本发明特别适用于检测产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)。

Description

用于检测水解β-内酰胺环抗微生物剂的酶活性的方法
技术领域
本发明涉及抗生素抗性检测领域。
特别地，本发明涉及一种用于检测β-内酰胺酶活性的方法，包括在电化学电池中使疑似含有所述酶活性的样品与至少一种包含β-内酰胺环的底物接触，以及测量电化学电池中的阻抗参数细胞。本发明特别用于检测产生产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)。
发明背景
存在对快速检测生物细胞中的β-内酰胺酶活性的需求，特别是用于诊断导致感染的病原体介质或用于检测耐药性病原体的传感器和方法。
碳青霉烯目前是用于治疗由产生广谱β-内酰胺酶(ESBL)的多重耐药肠杆菌科菌株引起的严重感染的首选药物。最近在肠杆菌科中出现的碳青霉烯抗性越来越多地被报道，如今成为重大临床关注点。肠杆菌科的碳青霉烯抗性或降低的易感性的最常见机制，包括具有低碳青霉烯水解活性的β-内酰胺酶(头孢菌素酶或ESBL)的存在，以及由于孔蛋白丢失或改变导致的通透性降低。碳青霉烯抗性也越来越多地源自于Ambler A类(主要是KPC)、B类(主要是VIM、IMP、NDM)或D类(主要是OXA-48)碳青霉烯酶的生产。
考虑到碳青霉烯类抗性扩散的风险，因此强烈地需要能够以高置信度和高特异性检测产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的快速方法和装置。
目前，在临床实验室中对此类病原体的完全鉴定需要长达72小时，包括建立抗性谱，然后通过表型测试或分子方法确认检测碳青霉烯酶的存在。
碳青霉烯酶基因的分子鉴定是有局限性的，因为它只允许检测特定的细菌和/或抗性基因，并且还特别昂贵，因为它需要特定的仪器、消耗品、熟练人员且通常还要专用室。
目前，大多数用于检测产生碳青霉烯酶的生物体的方法基于表型和基因型方法。
参考表型方法在于，通过将所述疑似病原体在限定浓度的该抗微生物剂的存在下，在固体琼脂板或液体培养基中培养数小时，定性或定量地确定疑似病原体对抗微生物剂的抗性。然后进行需要24小时以上培养的确认测试，以确定对碳青霉烯的抗性是否源于碳青霉烯酶或其他机制(盘组合测试，“Hodge测试”)。这些方法耗时且缺乏灵敏性和特异性。
还有几种更直接的方法也曾得到开发，包括依赖于通过抗性菌株产生的β-内酰胺酶进行直接β-内酰胺水解观察的方法。碳青霉烯酶类的β-内酰胺酶的亚胺培南水解如下所示：
碳青霉烯更具体而言是亚胺培南的水解，可以使用内源或外源比色法来监测。当指示剂是β-内酰胺的亚分子部分时，该方法视为内源比色法；当指示剂仅是与所选β-内酰胺一起加入的另一种试剂时，该方法是外源比色法。
在现有的内部法中，betaLACTATM测试(Bio-Rad，Marnes-la-Coquette，France)依赖于显色头孢菌素HMRZ-86，其光化学性质强烈依赖于β-内酰胺酶对β-内酰胺进行解环。水解的分子从黄色变成红色，并且可以通过肉眼检测。然而，这种显色分子不能检测OXA-48碳青霉烯酶。
最近，Nordmann、Poirel和Dortet开发了碳青霉烯酶活性特异性检测的外源比色法，称为“CarbaNP-测试”。该测试特别基于一项观察结果，即亚胺培南水解导致其β-内酰胺环打开并形成一个或多个羧酸官能团。然后，可以用酚红作为酸碱比色指示剂来容易地监测由此得到的酸度增加。然后用肉眼估计苯酚红色变化。该方法允许在约3小时内检测产生碳青霉烯酶的生物，并且旨在消除使用需要额外延时进行诠释的表型/基因型确认测试的需要。然而，CarbaNP测试需要制备pH颜色指示剂和不同的试剂，并且需要预先裂解程序以释放反应介质中的β-内酰胺酶。此外，根据几项研究，CarbaNP-测试仍然缺乏对产生OXA-48的生物的检测灵敏性。这种方法的另一个缺点是其依赖于肉眼操作者的观察，这是主观的，特别是当颜色并非直观的黄色而是橙色时，而且当前的实验室信息管理系统(LIMS)不容易追踪临床实验室等。
本发明人惊奇地发现了一种用于鉴定β-内酰胺酶活性，更具体而言能够鉴定CPE的新颖、原创的外源方法，其解决了本领域已知检测测试所遇到的缺点。本发明的方法(以下也称为“BYG-测试”，是Bogaerts-Yunus-Glupczynski的缩写)有利在其更迅速、可追踪、可重复使用、更灵敏且具有特异性，并且比已知的检测测试需要的材料更少。此外，在一个具体实施例中，本发明的方法能够在含有β-内酰胺酶的生物细胞中直接检测β-内酰胺酶活性，并且甚至不需要裂解所测试的生物细胞(例如细菌)。本发明的方法因此提供了可用于检测任何类型的β-内酰胺酶生产者，包括碳青霉烯酶和/或头孢菌素酶生产者的快速、可靠和可负担的解决方案，其可以在全世界的任何临床微生物学实验室中实施，而对实验室技术员而言没有显著的额外工作量。更普遍地，本发明的方法还允许检测能够水解β-内酰胺环抗微生物剂的任何细胞酶。
发明内容
因此，本发明涉及一种用于在样品中检测β-内酰胺酶活性的方法，其特征在于，所述方法是阻抗测定法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使所述样品与至少一种具有所述β-内酰胺酶活性的底物接触；和
(ii)通过收集数据点来检测所述电化学电池中的阻抗变化；
其中所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
在一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。
在一个实施例中，所述β-内酰胺酶活性是碳青霉烯酶活性或头孢菌素酶活性。
在一个实施例中，所述样品包含游离酶。在又一个实施例中，所述样品包含生物细胞，优选为细菌。在一个实施例中，所述细菌是选自肠细菌细胞和非发酵性革兰氏阴性细菌细胞的革兰氏阴性细菌。
在一个实施例中，所述底物选自青霉烷、头孢烯、单环β-内酰胺、碳青霉烯、碳青霉烷、氧青霉烷、青霉烯，碳头孢烯和氧头孢烯，或其组合，优选地，所述底物是亚胺培南。
在一个实施例中，所述第一步骤在至少一种辅因子盐，优选为ZnSO4的存在下进行。所述第一步骤在至少一种副盐，优选为CaCl2、MnCl2、MgCl2、NaCl或KCl或其任何组合的存在下进行，所述组合例如为CaCl2和MnCl2或CaCl2和MgCl2。
在一个实施例中，还包括裂解所述生物细胞的步骤。在又一个实施例中，所述方法不包括裂解所述生物细胞的步骤。
本发明的又一目的在于，一种用于鉴定β-内酰胺酶活性的方法，包括以下步骤：
(i)在有所述β-内酰胺酶活性的至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使疑似含有所述β-内酰胺酶活性的样品与其至少一种底物接触；
(ii)在没有所述至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使所述样品与所述至少一种底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
本发明还涉及一种用于筛选抑制β-内酰胺酶活性的候选抑制剂的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使包含所述β-内酰胺酶活性的样品与所述β-内酰胺酶活性的至少一种底物和至少一种候选抑制剂接触；
(ii)在不存在所述至少一种候选抑制剂的情况下，使所述样品与所述至少一种所述β-内酰胺酶活性的底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
本发明还涉及一种用于筛选不被β-内酰胺酶活性水解的候选β-内酰胺试剂(优选为抗微生物剂)的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使包含所述β-内酰胺酶活性(在生物细胞内或游离形式下)的样品与至少一种候选β-内酰胺试剂接触；
(ii)使所述样品与所述β-内酰胺酶活性的已知底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种候选抗微生物剂包括β-内酰胺环。
本发明的又一目的在于，一种用于通过测量工作电极阻抗来检测样品中的β-内酰胺酶活性的系统，所述系统包括：
-复用器，其至少包括499kΩ电阻器和无限电阻器，
-工作电极，其由导电固体聚合物换能器制成并涂有聚苯胺；
-输入端，其用于接收指示施加于所述工作电极和参比电极之间的电位的输入信号；和
-输出端，其用于传输指示在对电极和所述工作电极之间流动的电流大小的输出信号；
所述工作电极和参比电极用于浸入样品中或装载样品；
-数字处理器，其连接到数模转换器以产生所述输入信号；以及连接到模数转换器以接收数字值形式的至少一个数据点；
-计算机，其收集至少80个数据点，优选为至少400个数据点，并计算所述数据点的连续积分，以得到加总后对应于全局电导的参数。
在一个实施例中，所述聚苯胺涂覆的电极是可重复使用的。
在一个实施例中，所述工作电极涂覆有聚苯胺和至少一种β-内酰胺酶活性的底物，优选地，其中所述底物是碳青霉烯，更优选为亚胺培南。
在一个实施例中，本发明的方法中，所述检测阻抗变化的步骤包括：
-使用如上所述的系统，在所述电化学电池中以数据点的形式收集交换的电荷；和
-计算所述数据点的连续积分，并对所述积分求和以获得全局电导。
定义
如本申请所使用的术语“灵敏度”(也称为真阳性率)测量正确识别的实际阳性的比例；而术语“特异性”(也称为真阴性率)是指正确鉴定为阴性的阴性比例。
如本申请所使用的用于数字前的术语“约”表示所述数字的值加或减10％。
在本发明的定义内，“抗微生物剂”是指杀灭或抑制微生物生长，更优选为细菌生长的试剂。
“β-内酰胺环”是指四元内酰胺，即具有以下通式(I)的四元环酰胺。
“包含β-内酰胺环的抗微生物剂”或“β-内酰胺抗微生物剂”是指在其分子结构中含有β-内酰胺环的抗微生物剂。β-内酰胺抗微生物剂具体包含青霉烷(与噻唑烷环稠合的β-内酰胺)，头孢烯(与3,6-二氢-2H-1,3-噻嗪环稠合的β-内酰胺)，单环β-内酰胺(未与任何其他环稠合的β-内酰胺)，碳青霉烯(与2,3-二氢-1H-吡咯环稠合的β-内酰胺)，碳青霉烷(与吡咯烷环稠合的β-内酰胺)，氧青霉烷(与恶唑烷稠合的β-内酰胺)，青霉烯(与2,3-二氢噻唑环稠合的β-内酰胺)，碳头孢烯(与1,2,3,4-四氢吡啶环稠合的β-内酰胺)和氧头孢烯(与3,6-二氢-2H-恶嗪环稠合的β-内酰胺)。青霉烯具体包含青霉素、氨基青霉素(氨苄青霉素，阿莫西林，巴卡西林和匹凡西林)、羧基青霉素(羧苄青霉素，替卡西林，替莫西林)和脲基青霉素(阿洛西林，美洛西林，哌拉西林)。头孢烯具体包括头孢菌素(例如头孢噻肟)和头孢霉素。具体而言，单环β-内酰胺包括氨曲南、替加蒙、卡鲁胺和诺卡菌素A。具体而言，碳青霉烯和青霉烯包括厄他培南、亚胺培南、美罗培南、多利培南、比阿培南，帕尼培南，拉祖培南(razupenem)，替比培南，来那培南，头茂培南和法罗培南。
如本申请所用的术语“β-内酰胺酶活性”是指能够水解包含β-内酰胺环的试剂(例如β-内酰胺抗微生物剂)的酶活性。因此，根据本发明，术语“β-内酰胺酶活性”包括碳青霉烯酶活性(即能够水解碳青霉烯抗微生物剂的β-内酰胺结构的酶活性)和头孢菌素酶活性。
在本发明的定义内，“电化学电池”是指能够从化学反应得到电学性能或通过引入电能促进化学反应的装置。本发明所用的电化学电池是本领域技术人员公知的。
在本发明的定义内，“电学性能易于变化的感测材料”(响应于所述至少一种底物和酶之间的即时相互作用产生的变化，或响应于其与分析物相互作用产生的变化)是指对氧化还原反应灵敏并随之改变其电学性能的任何材料。“改变其电学性能”是指导致所述材料的电荷改变的任何改变，或导致所述材料的颜色改变的任何改变。
具体实施方式
因此，本发明提供了一种检测β-内酰胺酶活性的方法，其中所述方法基于通过阻抗测定，检测由包含β-内酰胺环的试剂和β-内酰胺酶活性之间的即时相互作用产生的变化。要强调的是，本发明的方法不依赖于对所述β-内酰胺酶活性水解所述β-内酰胺试剂产生的β-内酰胺试剂的代谢物的定量。
有利地，本发明的方法事实上依赖于以下观察：β-内酰胺酶(其可以是碳青霉烯酶和/或头孢菌素酶)对含β-内酰胺的底物的酶促水解，触发电化学电池中的氧化还原活性和可选地引起pH变化。根据这一观察，本发明人进行了各种经验并实施了一种方法，与现有技术的方法相比，该方法显示出突出的增强特异性和灵敏度。具体而言，如实施例中所证明的，当用于鉴定表达能够水解β-内酰胺环的酶的细菌时，本发明的方法表现出的特异性超过90％，优选为超过91％、92％、93％％、94％％、95％％、96％％、97％％、98％％、99％或甚至100％，且其灵敏度结合超过90％，优选为超过91％、92％、93％％、94％％、95％％、96％％、97％％或以上。
在一个实施例中，本发明的方法允许使用细菌悬浮液鉴定表达β-内酰胺酶活性的细菌。在另一个实施例中，本发明的方法允许使用仅一个从固体培养基(例如固体琼脂板)回收的菌落来鉴定表达β-内酰胺酶活性的细菌。
本发明涉及一种用于在样品(优选为含有生物细胞)中检测β-内酰胺酶活性的方法，其中所述方法是阻抗测定法，包括以下步骤：
(i)使疑似含有所述β-内酰胺酶活性的样品与至少一个电化学电池中所述β-内酰胺酶活性的至少一种底物接触；和
(ii)通过收集数据点来检测所述电化学电池中的阻抗变化；
其中所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
在一个实施例中，该阻抗变化是电导变化。
在一个实施例中，数据点是数字值，优选地对应于交换电荷。
在一个实施例中，收集至少80个数据点，优选为至少100、200、400、600、800或1000个数据点或更多。在一个实施例中，本发明的方法包括计算数据点的连续积分，以便得到参数，可以将该参数求和以对应于全局电导。在一个实施例中，本发明的方法包括计算1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个连续积分。
因此，本发明的方法基于阻抗，即本发明的方法包括测量电极的阻抗。实际上，如实施例中所示，本发明的阻抗测定允许鉴定酶活性，例如OXA-48碳青霉烯酶。
要强调的是，本发明的方法不包括任何循环伏安测定。
在一个实施例中，所述至少一种底物与β-内酰胺酶活性相互作用产生一种变化，该变化特别是可以基于氧化还原活性。在一个实施例中，该至少一种底物与β-内酰胺酶活性的相互作用进一步产生pH变化。
在一个实施例中，用监测装置检测阻抗变化，其中所述监测装置包括：一种或多种传感材料，其电学性能受到由该至少一种底物和β-内酰胺酶活性之间的即时相互作用而产生变化；以及用于监测所述感测材料的电学特性的检测器。
在一个实施例中，当受到所述酶活性时，该至少一种底物产生至少一种氧化还原反应，并且用包括一种或多种合适感测材料的监测装置检测阻抗变化。
在本发明的一个具体实施例中，随后进行步骤(i)和(ii)。
然而，在本发明的一个优选实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行，即当将底物与疑似含有所述β-内酰胺酶活性的样品接触时，开始检测步骤。
在一个实施例中，本发明的方法在室温下进行，例如在约15℃至约25℃的温度下进行。
在一个具体的实施例中，本发明的方法允许检测至少一种β-内酰胺酶，请参见Bush-Jacoby分类中提及(功能组1至3，包括亚组；Bush K.,“The ABCD’s ofβ-lactamasenomenclature”,J Infect Chemother.2013Aug 19(4):549-59))。在一个具体实施例中，本发明的方法允许检测属于Bush-Jacoby组2df(Ambler的分子类D)、2f(分子类A)、3a和3b(分子类B1、B2和B3)的至少一种碳青霉烯酶。在一个具体实施例中，本发明的方法允许检测至少一种头孢菌素酶。
可以通过本发明的方法检测的酶的示例包括但不限于：CARB型β-内酰胺酶(CARB-1至CARB-44)，具有或不具有ESBL活性(超广谱β-内酰胺酶)、具有或不具有抑制剂抗性的TEM型(TEM-1至TEM-223)，ESBL或非ESB、具有或不具有抑制剂抗性的SHV-型(SHV-1至SHV-193)，CTX-M-型(CTX-M-1至CTX-M-170)，ESBL酶如PER酶(例如PER-1至PER-8)，VEB酶(例如VEB-1至VEB-16)，BEL酶例如BEL-1至BEL-3)，非ESBL、ESBL或碳青霉烯酶OXA型酶(例如OXA-1至OXA-494)，尤其是OXA-48及其碳青霉烯酶变体(例如：OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232、OXA-244、OXA-370、OXA-494)，包括ESBL和碳青霉烯酶的GES型酶(例如GES-1至GES-27)，头孢菌素酶诸如CMY酶(例如CMY-1至CMY-135)，DHA酶(例如DHA-1至DHA-23)，例如ACT-1至ACT-38，ACC-1至ACC-5，FOX-1至FOX-12，MIR-1至MIR-18，MOX-1至MOX-11，超广谱AmpC(ESAC)酶，碳青霉烯酶例如KPC型(其中KPC代表克雷伯氏肺炎菌碳青霉烯酶)酶(例如KPC-2至KPC-24)，NDM型(其中NDM代表新德里金属酶)酶(例如NDM-1至NDM-16)，VIM型(其中VIM代表维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶)酶(例如，例如，VIM-1至VIM-46)，IMP-型酶(例如IMP-1至IMP-53)，GIM-型酶(例如GIM-1或GIM-2)，IMI酶(例如IMI-1至9)，IND-1至IND-15，SFO酶，TLA酶，IBC酶，SME酶，NMC酶和CCRA酶。
优选地，所述酶选自CTX-M型(CTX-M-1至CTX-M-170)，OXA型碳青霉烯酶(例如OXA-48样，OXA-23、24、25、26、27、40、58、72)，尤其是OXA-48及其碳青霉烯酶变体(例如：OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232、OXA-244、OXA-370、OXA-494)，GES型碳青霉烯酶(例如，GES-2和GES-25)，碳青霉烯酶例如KPC型(其中KPC代表克雷伯氏肺炎菌碳青霉烯酶)酶(例如KPC-2至KPC-24)，NDM型(其中NDM代表新德里金属酶)(例如NDM-1至NDM-16)，VIM-型(其中VIM代表维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶)酶(例如VIM-1至VIM-46)，IMP型酶(例如IMP-1至IMP-53)，GIM型酶(例如GIM-1或GIM-2)，IMI酶(例如IMI-1至IMI-9)。
优选地，所述酶选自OXA型碳青霉烯酶(例如OXA-48，OXA-162，OXA-181，OXA-204和OXA-232)，KPC型酶(例如，KPC-2或KPC-3)，NDM型酶(例如NDM-1或NDM-5)，VIM型酶(例如VIM-1，VIM-2，VIM-4，VIM-27和VIM-31)，GIM型酶(例如GIM-1)，IMI酶(例如IMI-1和IMI-2)和IMP型酶(例如IMP-1，IMP-4，IMP-8和IMP-11)。
在一个实施例中，本发明的方法允许检测样品中β-内酰胺酶活性的存在，并且还允许鉴定所述β-内酰胺酶活性。事实上，如实施例中所示，特别是在图4、5和7中，所获得的曲线的形状随着检测到的β-内酰胺酶活性而变化。因此，根据一个实施例，本发明的方法允许检测和鉴定样品中的特异性β-内酰胺酶活性。
在本发明的一个实施例中，应用本发明方法的样品，包含至少一种疑似显示至少一种β-内酰胺酶活性(包括碳青霉烯酶活性和/或头孢菌素酶活性)的生物细胞。
在本发明的一个实施例中，将本发明的方法应用于疑似含有β-内酰胺酶活性的样品。在一个具体的实施例中，所述β-内酰胺酶活性来自所述样品中存在的至少一种β-内酰胺酶，例如至少一种碳青霉烯酶和/或至少一种头孢菌素酶。
在一个具体实施例中，所述至少一种β-内酰胺酶在样品中处于游离形式。在一个具体实施例中，所述至少一种β-内酰胺酶未经纯化。在一个具体实施例中，待通过本发明的方法检测的至少一种β-内酰胺酶在样品中处于游离形式，并可选地通过本领域已知的任何合适的方法纯化。
由此，在一个具体的实施例中，本发明的方法实施于含有针对酶活性的游离酶并以纯化或非纯化形式存在的样品。
在另一个实施例中，β-内酰胺酶活性例如存在于生物细胞内或其间膜间隙中，例如在革兰氏阴性细菌的周质中。在另一个实施例中，β-内酰胺酶活性显示在生物细胞的外膜和/或包膜上。在另一个实施例中，β-内酰胺酶活性显示在生物细胞内部和外部。
在本发明的定义内，“生物细胞”是指由膜包封的生物单元。在本发明的一个具体实施例中，应用本发明方法的生物细胞是细菌，优选为革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在一个具体的实施例中，应用本发明的方法的生物细胞是革兰氏阴性细菌。在一个具体实施例中，应用本发明的方法的生物细胞是革兰氏阳性细菌。在本发明的一个具体实施例中，应用本发明方法的生物细胞是革兰氏阴性细菌，其选自肠细菌细胞(肠杆菌科)和非发酵革兰氏阴性细菌细胞(例如不动杆菌属(Acinetobacter spp)和假单胞菌属(Pseudomonas spp)。在本发明的一个具体实施例中，应用本发明方法的生物细胞是选自：不动杆菌(包括鲍曼不动杆菌，pittii不动杆菌，溶血不动杆菌和琼氏不动杆菌的)，豚鼠气单胞菌，丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌，枸橼酸柠檬酸杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，杨氏柠檬酸杆菌，产气肠杆菌，阿氏肠杆菌，阴沟肠杆菌，大肠杆菌，产酸克雷伯杆菌，克雷伯氏肺炎菌，摩氏摩根菌，奇异变形杆菌，雷特格氏变形杆菌，普通变形杆菌，斯氏普罗威登斯菌，普罗威登斯菌Providenciavermicola，假单胞菌(包括铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌)，肠沙门氏菌，粘质沙雷氏菌和弗氏志贺菌。
在一个具体实施例中，本发明的方法用于检测产生碳青霉烯酶的细菌，包括肠杆菌和革兰氏阴性非发酵细菌。
在一个实施例中，生物细胞先前从个体的生物样品(例如尿液样品，唾液样品，呼吸样品(例如支气管肺泡灌洗液，气管内抽吸物，鼻咽吸出物等)，伤口样品，皮肤样品和软组织样品，粪便样品，筛查样品(直肠、会阴或皮肤拭子)或血液样品)中回收和分离。在另一个实施例中，生物细胞预先通过取样获得，例如来自环境取样或对消化产品的取样。
在一个实施例中，首先处理从生物样品或任何其它取样中获得的生物细胞以增加细菌浓度，例如获得的生物细胞浓度为至少约107个细胞/mL，优选为至108个细胞/mL，更优选为至少109个细胞/mL，更优选为至少约1010个细胞/mL，甚至更优选为至少约1011个细胞/mL或更多。
在一个实施例中，首先处理从生物样品或任何其他取样中获得的生物细胞以增加细菌细胞数目，例如获得至少约103个细胞的多个生物细胞，优选为至少约104个细胞，更优选为至少约105个细胞，甚至更优选至少106个细胞或更多。
处理的示例包括但不限于细菌细胞的培养、离心、过滤等。
在一个实施例中，本发明的生物细胞在实施本发明的方法之前预先在培养基中生长，例如液体或固体培养基，优选在固体培养基上。可以使用的固体培养基的示例包括但不限于：具有5％绵羊血液的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA II)(Becton Dickinson)，BrillianceCRE琼脂(Oxoid)，巧克力琼脂PolyViteX(BioMérieux)，ChromID Carba(BioMérieux)，ChromID OXA-48(BioMérieux)，具有5％绵羊血液的哥伦比亚琼脂(Becton Dickinson)，具有5％马血(Becton Dickinson)，CPS(BioMérieux)，Drigalski乳糖琼脂(BioRad)，ESBL(BioMérieux)，KPC CHROMagar(Biotrading)，Mac Conkey琼脂(BioMérieux)，Mueller Hinton II琼脂(Becton Dickinson)，有或无ZnSO4(浓度为35、70或140μg/ml)的Mueller Hinton琼脂(粉末，Oxoid)，BBL Chromagar Orientation(BectonDickinson)，营养肉汤+琼脂(Oxoid)或UriSelectTM4培养基(BioRad)。优选地，培养基选自具有5％绵羊血液的胰酶大豆琼脂(TSA II)(Becton Dickinson)，Brilliance CRE琼脂(Oxoid)，巧克力琼脂PolyViteX(BioMérieux)，ChromID Carba(BioMérieux)，ChromIDOXA-48(BioMérieux)，具有5％绵羊血液的哥伦比亚琼脂(Becton Dickinson)，具有5％马血的哥伦比亚琼脂(Becton Dickinson)，Drigalski乳糖琼脂(BioRad)，ESBL(BioMérieux)，KPC CHROMagar(Biotrading)，有或无ZnSO4(浓度为35、70或140μg/ml)的Mueller Hinton琼脂(粉末，Oxoid)，BBL Chromagar Orientation(Becton Dickinson)和营养肉汤+琼脂(Oxoid)。
在一个实施例中，在实施本发明的方法之前，将生物细胞在37℃下培养约18至24小时。在另一个实施例中，将生物细胞在室温下(即在约15℃至约25℃的温度范围内)储存至多48小时，优选为至多24小时。
在一个实施例中，生物细胞由此预先从固体培养基中回收。
在本发明的定义内，“所述β-内酰胺酶活性的底物”或“底物”，是指适合由β-内酰胺酶活性水解的任何化合物。在一个具体实施例中，用于本发明方法的底物含有β-内酰胺环。
在一个具体实施例中，用于本发明的底物是抗微生物剂，优选为β-内酰胺抗微生物剂。在一个具体实施例中，用于本发明的底物选自：青霉烷、头孢烯、单环β-内酰胺、碳青霉烯、碳青霉烷、氧青霉烷、青霉烯，碳头孢烯和氧头孢烯，或其组合。在一个具体实施例中，用于本发明的底物选自：青霉素，氨基青霉素(氨苄青霉素，阿莫西林，巴卡西林和匹凡西林)，羧基青霉素(羧苄青霉素，替卡西林，替莫西林)，脲基青霉素(andureidopenicillins)(阿洛西林，美洛西林，哌拉西林)，头孢菌素，头孢霉素，氨曲南，替加蒙，卡鲁胺，诺卡菌素A，厄他培南，亚胺培南，美罗培南，多利培南，比阿培南，帕尼培南，拉祖培南，替比培南，来那培南，头茂培南和法罗培南或其组合。在一个具体实施例中，用于本发明方法的底物是碳青霉烯，优选为选自：厄他培南，美罗培南，多利培南，比阿培南和亚胺培南，或其组合。在一个具体实施例中，用于本发明的底物是亚胺培南，替莫西林或头孢噻肟，优选为亚胺培南。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的还原或氧化。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的酸化或碱化。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的还原和酸化。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的还原和碱化。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的氧化和碱化。
在本发明的一个具体实施例中，使至少一种底物和所述酶活性接触，产生电极的氧化和酸化。
在一个实施例中，所述底物，优选为亚胺培南，其使用浓度为约0.1mg/mL至约20mg/mL，更优选为约1mg/mL至约10mg/mL，甚至更优选为约3mg/mL至6mg/mL的浓度使用，并且甚至更优选为约6mg/mL。
在本发明的一个具体实施例中，使样品与β-内酰胺酶底物接触的步骤，在至少一种辅因子盐的存在下进行。根据本发明，“至少一种辅因子盐”是指任何盐或其组合，其存在是检测或监测β-内酰胺酶活性的要求或能将其增强。在一个具体实施例中，在样品与β-内酰胺酶活性的底物接触中不加入辅因子盐。在另一个实施例中，辅因子盐选自过渡金属和后过渡金属盐或其组合。在本发明中，“过渡金属盐”是指包括：Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、La、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Ac、Unq、Unp、Unh、Uns、Uno、Une和Unr，或其组合的金属的盐。在本发明中，“后过渡金属盐”是指包括选自Al、In、Sn、Bi、Pb,Ga、Ge、Sb、Po、Uut、Uuq、Uup、Uuh和Tl或其组合的金属的盐。
在本发明的一个具体实施例中，用于本发明方法的辅因子盐是ZnSO4。在一个具体实施例中，用于本发明方法的辅因子盐以大于0mM至约1M的量存在。在一个具体实施例中，用于本发明方法的辅因子盐的含量为大于0mM至约25mM。在一个具体实施例中，用于本发明方法的辅因子盐的含量为约0.01mM至约0.15M。在一个实施例中，辅因子盐的含量为约0.01mM至约1.75mM，更优选为约0.05mM至约1mM，更优选为约0.075至约0.1mM，甚至更优选为约0.077或约0.1mM。在另一个实施例中，辅因子盐的含量为约0.1mM至约0.5mM，优选为约0.3mM。
在一个实施例中，包含酶活性的样品还包含约0.01mM至约1.75mM、优选为约0.075至约1mM、更优选为约0.077或约0.1mM的ZnSO4。在另一个实施例中，包含酶活性的样品还包含约0.1mM至约0.5mM、优选为约0.3mM的ZnSO4。
在另一个实施例中，底物所在的介质包含约0.01mM至约1.75mM、优选为约0.075至约1mM、更优选为约0.077或约0.1mM ZnSO4。在另一个实施例中，底物所在的介质包含约100mM至约0.5mM，优选为约0.3mM ZnSO4。
在本发明的一个具体实施例中，使样品与β-内酰胺酶活性的底物接触的步骤，在选自碱金属盐(IA族)和碱土金属盐(IIA族)的至少一种辅盐的存在下进行。
根据本发明，“碱金属盐”是指选自Li，Na，K，Rb，Cs和Fr的金属的盐，或其任何组合。
根据本发明，“碱土金属盐”是指选自Be，Mg，Ca，Sr，Ba和Ra的金属的盐，或其任何组合。
在一个具体实施例中，不加入用于使样品与β-内酰胺酶底物接触的辅盐。
在另一个实施例中，用于本发明方法的辅盐选自CaCl2,MgCl2,MnCl2,MgSO4,NH4Cl,NaCl,KCl,CaSO4,ZnCl2或其组合。在一个具体的实施例中，用于本发明方法的辅盐是CaCl2和MgCl2的组合。
在一个具体实施例中，用于本发明方法中的辅因子盐的含量为大于0M至1M。在一个具体实施例中，用于本发明方法的辅因子盐的含量为例如大于50mM至300mM，例如约100mM，150mM或200mM。在另一个实施例中，用于本发明方法的辅因子盐的含量为约15至约50mM，优选为约17mM或约34mM。
在一个实施例中，辅盐是浓度为约100、150或200mM，优选为约150mM的CaCl2。在另一个实施例中，辅盐是浓度为约100、150或200mM，优选为约150mM的MnCl2。
在另一个实施例中，辅盐是浓度为约17或34mM的CaCl2。在另一个实施例中，辅盐是浓度为约17或34mM的MnCl2。
在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MgCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约50,75或100mM(优选为约75mM)，MgCl2的浓度为约50,75或100(优选为约75mM)。
在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MgCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约10至30mM，优选为17mM，MgCl2的浓度为约10至30mM，优选为17mM。
在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MnCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约50、75或100mM(优选为约75mM)，MnCl2的浓度为约50、75或100(优选为约75mM)。
在另一个实施例中，次盐是CaCl2和MnCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约10至30mM，优选为17mM，MnCl2的浓度为约10至30mM，优选为17mM。
在一个实施例中，次盐是NaCl或KCl。优选地，NaCl或KCl以约150mM至约5M的浓度存在。在一个实施例中，NaCl的浓度为约5M或约4M。在另一个实施例中，NaCl的浓度为约1.2M。在另一个实施例中，KCl的浓度为约3M或约4M。
本发明还涉及包含至少一种辅因子盐，优选为ZnSO4的缓冲液。优选地，辅因子盐的浓度为约0.01mM至约1.75mM，优选为约0.075至约1mM，更优选为约0.077或约0.1mM；或浓度范围为约0.1mM至约0.5mM，优选为约0.3mM。
在一个实施例中，缓冲液还包含底物，优选为亚胺培南。优选地，底物的浓度范围为约0.1至约20mg/mL，更优选为约1至约10mg/mL，甚至更优选为约3至6mg/mL，甚至更优选为约6mg/mL。
本发明还涉及包含至少一种辅盐的缓冲液。在一个实施例中，辅盐是浓度为约100、150或200mM，优选为约150mM的CaCl2或MnCl2。在一个实施例中，辅盐是浓度范围为约10至约50mM，优选为约17mM或约34mM的CaCl2或MnCl2。在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MgCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约50、75或100mM(优选为约75mM)，MgCl2的浓度为约50、75或100(优选为约75mM)。在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MgCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度范围为约10至约30mM(优选为约17mM)，MgCl2的浓度范围为约10至约30mM(优选为约17mM)。在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MnCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度为约50、75或100mM(优选为约75mM)，MnCl2的浓度为约50、75或100(优选为约75mM)。在另一个实施例中，辅盐是CaCl2和MnCl2的组合，其中优选CaCl2的浓度范围为约10至约30mM(优选为约17mM)，MnCl2的浓度范围为约10至约30mM(优选为约17mM)。在一个实施例中，次盐是NaCl或KCl。优选地，NaCl或KCl以约150mM至约5M的浓度存在。在一个实施例中，NaCl的浓度为约5M或4M。在另一个实施例中，NaCl的浓度为约1.2M。在另一个实施例中，KCl的浓度为约3M或约4M。
本发明还涉及包含至少一种辅因子盐和至少一种辅盐的缓冲液。在一个实施例中，本发明的缓冲液包含ZnSO4(优选浓度范围为约0.05至约0.1mM，更优选为约0.077mM或约0.1mM至约0.5mM，优选为约0.3mM)、CaCl2(优选浓度范围为约5至约50mM，更优选为约15至约20mM，更优选为约17mM)和MgCl2(优选浓度范围为约5至约50mM，更优选为约15至约20mM，更优选为约17mM)。在另一个实施例中，本发明的缓冲液包含ZnSO4(优选浓度范围为约0.05至约0.1mM，更优选为约0.077mM，约0.1mM至约0.5mM，优选为约0.3mM)和NaCl优选浓度范围为约0.1M至约5M，更优选为约0.5M至约2M，甚至更优选为约1.2M或浓度约4M)。
在一个实施例中，缓冲液还包含底物，优选为亚胺培南。优选地，底物的浓度范围为约0.1至约20mg/mL，更优选为约1至约10mg/mL，甚至更优选为约3至6mg/mL，甚至更优选为约6mg/mL。
在具体实施例中，本发明的方法还包括裂解生物细胞的步骤。在一个具体实施例中，裂解生物细胞的步骤在步骤(i)期间或之前进行。在这样的实施例中，所述生物细胞通过本领域已知的任何化学和/或物理方法裂解。在一个具体的实施例中，通过对含有生物细胞的样品进行溶剂和/或去污剂处理，和/或通过剧烈摇动含有所述生物细胞的培养基来进行生物细胞的裂解。
在另一个具体实施例中，本发明的方法不包括裂解生物细胞的任何步骤。发明人确实意外地发现，生物细胞可以与酶活性的底物直接接触，而无生物细胞的任何裂解。在一个具体的实施例中，在缺乏细胞裂解的情况下，在如上所述辅盐的存在下增强了酶活性的检测。
在具体实施例中，用于本发明的电化学电池包括至少两个电极，即至少一个工作电极和一个对电极。在一个具体实施例中，用于本发明的电化学电池包括三个电极，包括工作电极、对电极和参比电极。
在一个具体的实施例中，用于本发明方法的感测材料包括对氧化还原反应灵敏随后改变其电学性能的聚合物。
在具体实施例中，用于本发明的感测材料选自聚苯胺、聚噻吩和聚吡咯及其组合。
在特定实施例中，用于本发明的感测材料是聚苯胺(也称为“PANI”)。聚苯胺可以充当pH计量和氧化还原滴定的介质。聚苯胺是非常便于用作固体电化学换能器的聚合物材料，因为其具有许多令人感兴趣的氧化还原和酸碱状态的性质组合。图1显示了在垂直的氧化还原平衡和水平的酸碱平衡中的聚苯胺。该聚合物的平均分子结构已由Mac-Diarmid等人(MacDiarmid et al.,Synth.Meth.18(1987),285-290；Chiang et MacDiarmid,Synth.Met.,13(1986),193-205)所测定，其还描述了PANI氧化还原和酸-碱形式之间的可能转换。
在本发明的一个实施例中，感测材料，优选为聚苯胺，显示在电极上，并且可用于检测氧化或还原事件和酸化或碱化。为此，仔细选择感测材料的初始氧化还原和酸碱性状态，以便在检测期间最大化其电化学响应。在一个具体实施例中，用于本发明的聚苯胺的初始状态优选为根据Focke等人(J.Phys.Chem.,1987,91:5813-5818)所述的电导率、氧化还原电位和pH相图来选择。
在一个实施例中，用于本发明的方法中的电极是可重复使用的。实际上，发明人已经证明(参见实施例)，由于擦除电极所获得的结果的程序，电极可以使用高达至少10次，优选15次，更优选20次而没有任何故障。
在使用之前，新鲜电合成的聚苯胺电极处于不导电的部分氧化状态。从该状态开始，任何产生电子(还原)的氧化还原反应将还原聚苯胺，从而提高其导电性。pH降低也将提高电导，但其量值取决于聚苯胺的氧化还原状态。
在一个实施例中，本发明的方法包括构成“复位(RESET)步骤”的第一步骤。该步骤使所有电极在使用之前处于相同的初始状态。由于这个步骤，一个电极可以重复使用数次。在一个实施例中，在所述复位步骤期间，将优选为约500至1000mV范围内，更优选为约800mV内的电位施加在电极上一段时间，优选为5至60秒，更优选为15秒。在另一个实施例中，复位步骤包括将电极在含有氧化剂的试剂(例如过硫酸铵(NH4)2S2O8的介质中插入一段时间。
本发明还涉及电极再生缓冲液或电极清洁缓冲液。
在本发明的定义内，“检测器”是指允许检测感测材料的电学变化的任何装置。在本发明的特定实施例中，通过电极之间的电测量来执行电学变化检测。在这样的实施例中，用于本发明方法的检测器可以包括任何类型的电导计。
在特定实施例中，检测器可操作地耦合到覆盖有或包括有如上所定义的感测材料(优选聚苯胺)的电极。
在本发明的特定实施例中，底物在所述感测材料上或其内。在一个具体实施例中，通过本领域已知的任何共价或非共价偶联方法，将底物偶联到电化学活性检测材料上。
在本发明的一个实施例中，底物化学耦合到覆盖至少一个电极上的电化学活性传感材料，或电极的其它地方(支撑材料，对电极等)。在另一个实施例中，将底物在电化学活性传感材料或电极上的其它地方(支撑材料，对电极等)上冻干。在另一个实施例中，将底物结合在电化学活性传感材料中或放置在置于电极上的惰性可溶性或不溶性材料(例如支撑材料，对电极等)中。
本发明进一步涉及涂覆有感测材料的电极，其电学性能(i)经受氧化还原变化和可选地经受酸碱变化，或(ii)经历由该至少一个底物和β-内酰胺酶活性之间的即时相互作用产生的变化。用于本发明的感测材料如上所定义，更具体地是聚苯胺。在一个具体实施例中，本发明的电极进一步涂覆有至少一种用于根据本发明检测酶活性的底物，并且优选用β-内酰胺抗微生物剂涂覆，优选为碳青霉烯，更优选为用亚胺培南。
在特定实施例中，聚苯胺处于翠绿亚胺状态或处于比翠绿亚胺更氧化的状态或处于任何其它状态。
本发明还涉及如上定义的电极在检测样品中β-内酰胺酶活性的方法中的用途。
本发明还涉及可以用于通过测量工作电极阻抗来检测样品中的β-内酰胺酶活性的系统，所述系统包括：
-复用器，其至少包括499kΩ电阻器和无限电阻器，
-工作电极，其由导电固体聚合物换能器制成并涂有聚苯胺；
-输入端，其用于接收指示施加于所述工作电极和参比电极之间的电位的输入信号；和
-输出端，其用于传输指示在对电极和所述工作电极之间流动的电流大小的输出信号；
所述工作电极和参比电极用于浸入样品中或装载样品；
-数字处理器，其连接到数模转换器以产生所述输入信号；以及连接到模数转换器以接收数字值形式的至少一个数据点；
-计算机，其收集数据点并计算所述数据点的连续积分，以得到加总后对应于全局电导的参数。
在一个实施例中，收集至少80个数据点，优选至少100、200、400、600、800或1000个数据点或更多。在一个实施例中，计算1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续积分。
在一个实施例中，聚苯胺涂覆的电极是可重复使用的。
在一个实施例中，工作电极涂覆有聚苯胺和至少一种β-内酰胺酶活性底物，优选其中所述底物是碳青霉烯，更优选亚胺培南。
在一个实施例中，本发明的系统还包括与499kΩ电阻器并联的电容器。
在本发明的定义内，“样品”是指至少一个疑似显示β-内酰胺酶活性的生物细胞或包含至少一种产生该活性的酶的溶液。
在一个实施例中，本发明方法的第一步因此包括：
-如上定义的样品
-底物；
可选地，在至少一种如上文所述的辅盐和/或至少一种辅因子盐的存在下。
在本发明的一个实施例中，样品对应于含有生物细胞或游离酶的介质，其中进一步添加至少一种底物。
在另一个实施例中，该至少一种底物包含在所述进一步添加有生物细胞或游离酶的介质中。
“介质”是指用于实施本发明方法的任何合适环境：因此，介质可以是例如液体或半固体，例如凝胶。在本发明的另一个实施例中，介质是水，优选软化水或注射用水，或盐水缓冲液。在另一个实施例中，在不存在介质的情况下，使生物细胞或游离酶活性与至少一种底物接触。
在一个实施例中，包括一种或多种感测材料的监测装置的全部或部分(例如，覆盖有聚苯胺的电极)浸入包含待测试样品的介质中，并且可选地进一步包含至少一种底物和/或至少一种辅因子盐和/或至少一种辅盐。优选地，根据该实施例，监测装置处于竖直位置。
在一个实施例中，制备包含待测试的生物细胞或酶和可选地包含至少一种辅因子和/或至少一种辅盐的第一介质，并将底物依次加入到第一介质中。优选地，底物与监测装置在第一介质中的插入相伴。
在另一个实施例中，
-制备包含待测试的生物细胞或酶和可选地包含至少一种辅盐的第一介质；
-制备包含底物和可选地包含至少一种辅因子盐的第二介质，
-所述第一和第二介质在第三介质中混合，其中插入所述监测装置。
优选地，在混合步骤的同时将监测装置插入第三介质中。
在另一个实施例中，包括一个或多个感测材料的监测装置的全部或部分(例如，用聚苯胺覆盖的电极)和在感测材料上或其内的底物，浸入含有待测试的生物细胞或酶的介质中，并且可选地还包含至少一种辅因子盐和/或至少一种辅盐。
在特定实施例中，本发明的方法通过将样品和可选地将所述至少一个底物装载到感测材料上来进行。
在一个实施例中，样品是液体形式，并且所述样品的液滴被加载到所述感测材料上。优选地，根据该实施例，监测装置处于水平位置。
根据第一实施例，本发明的方法包括：
-制备包含待测试的生物细胞或游离酶和可选地包含至少一种辅盐的第一液体介质；
-制备包含底物和可选地包含至少一种辅因子盐的第二液体介质；
-混合所述第一和第二介质，从而获得第三介质；和
-将一滴第三介质装载到所述感测材料上。
优选地，该液滴具有约30至约60μL的体积，优选为约50μL的体积。
根据第二实施例，本发明的方法包括：
-制备包含基质和可选地包含至少一种辅因子盐的液体介质；
-将一滴该液体介质装载到所述感测材料上；
-制备包含生物细胞或游离酶和可选地包含至少一种辅盐的悬浮液；和
-将一滴该悬浮液加载到液体介质的液滴上。
在一个实施例中，该液体介质液滴的体积为约1μL至约50μL，优选为约2μL至约10μL，更优选为约5μL。
在另一个实施例中，该悬浮液液滴的体积约1μL至约50μL，优选为约35μL至约50μL，更优选为约45μL。
在另一个实施例中，该液体介质液滴和悬浮液液滴的体积之和的范围为约30至约60μL，优选为约50μL。
根据第三实施例，本发明的方法包括：
-制备包含底物和可选地包含至少一种辅因子盐和可选地包含至少一种辅盐的缓冲液；
-制备在前述步骤中获得的所述缓冲液中的生物细胞或游离酶的悬浮液；和
-将一滴所述悬浮液加载到所述感测材料上。
优选地，液滴具有约30μL至约60μL的体积，优选为约50μL的体积。
优选地，该缓冲液包含ZnSO4(优选浓度范围为约0.05mM至约0.1mM，更优选为约0.077mM)，CaCl2(优选浓度范围为约5至约50mM，更优选为约15至约20mM，甚至更优选为约17mM)和MgCl2(优选浓度范围为约5至约50mM，更优选为约15至约20mM，甚至更优选为约17mM)。
根据第四实施例，本发明的方法包括：
-将所述生物细胞的群落装载到所述感测材料上；
-制备包含底物和可选地包含至少一种辅因子盐和可选地包含至少一种辅盐的缓冲液；和
-将一滴所述缓冲液加载到先前装载在感测材料上的生物细胞上。
优选地，液滴具有约30至约60μL的体积，优选为约50μL的体积。
在一个实施例中，缓冲液包含NaCl(优选浓度范围为约0.1M至约5M，更优选为约0.5M至约2M，甚至更优选为约1.2M)和ZnSO4(优选浓度范围为约0.05至约0.1mM，更优选为约0.077mM)。在另一个实施例中，缓冲液包含4M NaCl和0.3mM ZnSO4。
在特定实施例中，当所述至少一个底物在所述感测材料上或其内时，通过将样本加载到所述感测材料上来执行本发明的方法。在具体实施例中，可选地包含至少一种底物的样品，在其加载到所述感测材料上时或加载之前，与至少一种辅因子盐和/或至少一种辅盐混合。
本发明还涉及用于鉴定β-内酰胺酶活性的方法，包括以下步骤：
(i)在有所述β-内酰胺酶活性的至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使疑似含有所述β-内酰胺酶活性(在生物活性或游离形式中)的样品与其至少一种底物接触；
(ii)在没有所述至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使所述样品与所述至少一种底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
在一个实施例中，该至少一种底物与酶活性的相互作用产生阻抗变化(尤其基于氧化还原活性)。在另一个实施例中，当接触所述酶活性时，所述至少一种底物产生至少一种氧化还原反应。
在一个实施例中，使用如上所述的监测装置来检测阻抗变化。
在根据本发明的鉴定β-内酰胺酶活性的方法中，可以随后或同时测试数种已知能够防止β-内酰胺环抗微生物剂因各种酶活性发生水解的特异性抑制剂的抑制效果。本领域已知的用于防止β-内酰胺环水解的任何抑制剂均可以有利地用于本发明的鉴定方法中。对于更具体地鉴定碳青霉烯酶，用于本发明的方法的合适抑制剂包括但不限于：
-A类碳青霉烯酶抑制剂(例如克拉维酸盐，优选浓度为0.1mg/L至10mg/L，优选浓度为2mg/L；他唑巴坦，优选浓度为0.1mg/L至10mg/L，更优选浓度为4mg/L；舒巴坦，优选浓度为0.1mg/L至10mg/L，更优选浓度为4mg/L；硼酸盐及其衍生物(仅用于KPC碳青霉烯酶)，优选浓度为10至10000mg/L；
-B类碳青霉烯酶抑制剂(例如阳离子螯合剂，例如EDTA，优选浓度为0.1至10mM，更优选浓度为10mM；或吡啶二酸，优选浓度为10至10000mg/L)；
-C类碳青霉烯酶抑制剂(例如硼酸盐及其衍生物，优选浓度为10至10000mg/L；苯唑西林和氯唑西林，优选浓度为100至8000mg/L，更优选浓度为4000mg/L)；和
-D类碳青霉烯酶抑制剂(例如阿维菌素，优选浓度为0.1至10mg/L，更优选浓度为4mg/L)。
在具体实施例中，本发明的鉴定β-内酰胺酶活性的方法允许在已知类型的β-内酰胺酶种类(包括碳青霉烯酶和/或头孢菌素酶)中测定所述酶活性。
当在存在和不存在可能的抑制剂的情况下相仿地检测到阻抗变化时，应该推断所测试的抑制剂不阻止β-内酰胺抗微生物剂的水解，因此所测试的酶活性不属于受试抑制剂靶向的β-内酰胺酶类。类似地，如果在不存在受试抑制剂的情况下检测到阻抗变化，但是在该抑制剂存在下不再检测到阻抗变化，则应当推断底物不再被酶活性水解，并且受试酶活性因此属于通常被该抑制剂靶向的特定酶类别。相应类别的酶还可以从一种或多种具有不同特异性的已知抑制剂所进行的一个或多个比较测试中推导出。
本发明的另一个目的涉及筛选用于抑制β-内酰胺酶活性的候选抑制剂的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使包含所述β-内酰胺酶活性(在生物细胞或游离形式中)的样品与至少一种所述酶活性的底物和至少一种候选抑制剂接触；
(ii)使所述样品与所述β-内酰胺酶活性的所述至少一种底物接触，而不与所述至少一种候选抑制剂接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的阻抗变化；
其中所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
在一个实施例中，该至少一种底物与酶活性的相互作用产生阻抗变化(特别是基于氧化还原活性)。在另一个实施例中，当接触所述酶活性时，所述至少一种底物产生至少一种氧化还原反应。
在一个实施例中，使用如上所述的监测装置来检测阻抗变化。
在一个实施例中，本发明的筛选方法的目的在于，鉴定能够通过特异酶活性防止β-内酰胺抗微生物剂水解的新抑制剂。在本发明的方法中，当在存在和不存在候选抑制剂的情况下相仿地检测到阻抗变化时，应当推断受试候选抑制剂不能通过测试样品所含酶活性防止β-内酰胺抗微生物剂的水解，因此其不能被认为是受试酶类的实际抑制剂。相反，如果在没有受试候选抑制剂的情况下检测到阻抗变化，但是在该候选抑制剂的存在下不再检测到阻抗变化，则应当推断受试候选抑制剂能够抑制受试β-内酰胺环抗菌剂的水解。有利地，可以用几类酶活性测试相同的候选抑制剂，因为其可以对酶的分类或其子类显示强特异性，或者相反地显示出一些普遍抑制能力。通过本发明的方法进行测试的候选抑制剂，可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备。
本发明的另一个目的涉及，用于筛选不被所述β-内酰胺酶活性水解的候选β-内酰胺试剂(优选为抗微生物剂)的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使包含所述β-内酰胺酶活性(在生物细胞内或游离形式下)的样品与至少一种候选β-内酰胺抗菌试剂接触；
(ii)使所述样品与所述β-内酰胺酶活性的已知底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种候选抗微生物剂包括β-内酰胺环。
在一个实施例中，该至少一种底物与β-内酰胺酶活性的相互作用基于氧化还原活性产生阻抗变化。在另一个实施例中，当接触所述酶活性时，所述至少一种底物产生至少一种氧化还原反应。
在一个实施例中，使用如上所述的监测装置来检测阻抗变化。
在另一个实施例中，本发明的筛选方法目的在于，鉴定受试特异性β-内酰胺酶活性所不能水解的新抗微生物剂。
作为前提条件，待测试的候选抗微生物剂包含含有β-内酰胺环的化合物。在一个实施例中，候选抗微生物剂与酶活性的相互作用产生阻抗变化(尤其是基于氧化还原活性)。
在本发明的筛选方法中，当在存在受试β-内酰胺酶活性的已知底物的情况下且存在候选抗微生物剂的情况下相仿地检测到阻抗变化时，则应推断受试候选抗微生物剂实际上被测试样品包含的β-内酰胺酶活性所水解，因此其不能用作针对受试酶类的抗微生物剂。相反，如果在存在受试β-内酰胺酶活性的已知底物的情况下检测到阻抗变化，但是在候选抗微生物剂的存在下没有检测到变化，则应推断受试候选抗微生物剂对所述β-内酰胺酶活性的水解有抗性，并且是针对所受试酶类的具有潜力的抗微生物剂。
在具体实施例中，本发明的鉴定和筛选方法有利地用含有具有测试酶活性的游离酶的样品进行，而不是对含有所述酶活性的生物细胞进行。
本发明的另一个目的是诊断引起感染的病原体或检测耐药性病原体的方法。
在一个实施例中，本发明的方法旨在确定病原体对β-内酰胺抗微生物剂的抗性起源。换句话说，本发明的方法旨在回答以下问题：对β-内酰胺抗微生物剂耐受的病原体，是否因为它表达β-内酰胺酶活性？
在一个实施例中，本发明的方法是确定β-内酰胺抗微生物剂是否可用于患者的方法。实际上，如果患者受到表达(通过本发明的方法测定的)β-内酰胺酶活性的细菌细胞感染，则该患者不会受益于β-内酰胺抗微生物剂给药。因此，该患者的第一选择可以选用其他抗微生物剂。
在一个实施例中，本发明的方法可用于流行病学领域。实际上，通过本发明的方法鉴定为受到表达β-内酰胺酶活性的细菌细胞感染的患者可以进行隔离，以避免任何污染，并因此避免流行或大流行。
根据一个实施例，本发明的方法包括将在步骤(ii)测量的阻抗变化与在参考方法中测量的阻抗变化进行比较的步骤。
优选地，所述参考方法不包括使样品与底物接触的步骤。因此，根据一个实施例，本发明的方法包括将在存在底物的情况下测量的阻抗变化与在没有底物的情况下测量的阻抗变化进行比较的步骤。
当在存在和不存在底物的情况下相仿地检测阻抗变化时，应推断测试样品不包含β-内酰胺酶活性。类似地，如果在底物存在下检测到阻抗变化，但在不存在该底物时不再检测到阻抗变化，则应推断测试样品包含β-内酰胺酶活性。
在另一个实施例中，本发明的方法不包括将在步骤(ii)中测量到的阻抗变化与在参考样本中测量的阻抗变化进行比较的步骤。实际上，发明人已经展示(参见实施例)了，通过仅分析在底物存在下获得的结果也可以获得非常有价值的结果(约100％的特异性，约95％的灵敏度)。在一个实施例中，当本发明的方法包括如上所述的复位步骤时，特别适用该不具有阴性对照的实施例。
本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包含：含有如上文所定义的电极的电化学电池，用于分析测量数据的微控制器，以及可选地包含如上所述的至少一种缓冲液。
本发明的另一个目的是试剂盒，其包含如上文所定义的系统和可选地包含至少一种如上所述的缓冲液。
本发明的另一个目的是在本发明的方法中使用的USB电极读取器。
本发明的另一个目的是在本发明的方法中使用的无线电极读取器。
本发明的另一个目的是用于实现本发明的方法的数据采集软件(iOS，Windows，Linux或Android)。
本发明的另一个目的是用于分析通过本发明方法获得的数据的数据分析软件(iOS，Windows，Linux或Android)。
与现有技术的方法相比，本发明的方法具有以下优点。
-容易实现；
-更加安全，因为其仅需要低体积量的细菌悬浮液和/或仅需要少量细菌细胞；
-与现有技术的方法相比，其呈现出增加的灵敏度和特异性(特别地，本发明的方法可呈现100％的特异性和95％或更高的灵敏度)。因此，本发明的方法允许检测用现有技术的方法检测不到的菌株；
-能得到图：因此，用户不需要诠释本发明方法的结果，而在现有技术的比色方法的情形中则可能需要(因此，本发明的方法是客观的而不是主观的)。此外，由于本发明方法的结果是图，其是可追踪的，并且特别地，其可以被记录在例如数据库中；
-实施更快：实际上，可以在小于1小时，优选为约34分钟，更优选至多15分钟内获得结果，而现有技术的方法可能需要约3天才获得结果；
-可以在室温下(例如，在约15至约25℃的温度范围内)实施；
-在某些实施例中，不需要细菌细胞的裂解；
-可以直接在细菌菌落(例如从琼脂培养板回收的细菌菌落)上实施；
-在某些实施例中，不需要阴性对照。具体而言，当在实施本发明的方法之前将RESET步骤应用于本发明的电极时，不需要阴性对照；
-本发明的电极是可重复使用的，其对于环境目的(包括限制废弃物)是特别有意义的；
-允许检测β-内酰胺酶活性并鉴定所述β-内酰胺酶活性(即，可以根据本发明的方法鉴定特异性β-内酰胺酶活性的特征)。
附图说明
图1所示为聚苯胺在垂直方向上的氧化还原平衡和在水平方向上的酸碱平衡的图。这种聚合物的翠绿亚胺酸形式已知是稳定和高导电性的。
图2所示为用于执行电位测定的测量的恒电位器和相应的反馈回路算法的架构的示意图。ADC目标(ADC Target)代表模数转换器目标。DAC表示数模转换器。IC1、IC2和IC3对应于构成恒电位器的运算放大器。W对应于工作电极。C对应于对电极。R对应于参比电极。
图3所示为本申请的实施例中实现的阻抗测量的计时图。ADC代表模数转换器。DAC表示数模转换器。
图4所示为用菌株PEP119-KPC-2进行的总体电导测量的图。数据表示为以库仑为单位的交换电荷对时间的函数。
图5所示为用菌株PEP175-NDM-1进行的总体电导测量的图。数据表示为以库仑为单位的交换电荷基于时间的函数。
图6所示为用菌株PEP77-CTX-M-15进行的总体电导测量的图。数据表示为以库仑为单位的交换电荷基于时间的函数。
图7所示为用菌株PEP141-OXA-48进行的总体电导测量的图。数据表示为以库仑为单位的交换电荷基于时间的函数。
图8所示为用本发明的方法在无细胞裂解的情况下对49种菌株进行阻抗测定的总览图。数据表示为任意单位基于受试菌株的函数。
图9所示为用相同电极进行阻抗测定的图。
实施例
通过以下实施例，进一步对本发明进行说明。
实施例1：电位测定
材料与方法
恒电位仪
根据WO 2011/082837的公开内容准备恒电位仪。
电极
所制备的电极由八个探针组成，其设置为使得这些探针可以同时插入常见96孔多孔板的一列孔中。这些电极通过传统的印刷电路板(PCB)实现技术获得。铜电路通过焊料掩模保护。
因为聚苯胺不能在铜上进行电合成，且由于铜可能容易氧化，所有的电极区域都涂覆有在25μm干膜厚度下阻抗约为14-20欧姆/平方的电阻的丝网印刷碳层(Peeters SD2841 HAL-IR)。
单个探针由3个电极圆点组成。顶部点具有1毫米的直径，并且构成可在其上进行电学合成聚苯胺的工作电极。中间电极是参比电极，具有1毫米的直径，并通过在碳层上施加一小点固体Ag/AgCl汞合金(Dupont 5874银/氯化银组合物-在80℃下固化4小时)来功能化。已经在pH＝2至12的不同测量设置中检查了该固体Ag/AgCl参比电极的稳定性、可重复性和可靠性。该参比电极显示出的电极电位比商业Ag/AgCl参比电极(+197mV vs.标准氢电极(SHE))高100mV(+300mV vs.SHE)。底部电极的直径为1.5mm，构成对电极。它具有更大的表面，并且还覆盖有Ag/AgCl汞齐，以防止其对工作电极的电流限制。
所制备的电极的八个探针中的每一个均可通过存在于恒电位仪卡上的多路复用器进行分配。参比电极和对电极在恒电位仪电子电路的探针之间是共用的。仪器的尺寸达到约75mm×55mm×20mm。电极探针约4mm宽，并且可以容易地插入常见的96多孔平台中。
通过使用电位计在置于96多孔平台的一行中的八个电极的探针上进行电量分析，来进行聚苯胺电聚合。每个电池填充有300μL的0.2M苯胺/2M HCl水溶液。在每个工作电极(直径1mm)上以890mV相对于固体Ag/AgCl参比电极进行电聚合直到60μC电荷。电合成后，将电极的探针用蒸馏水冲洗三次，用1M氨水冲洗两次，最后用蒸馏水冲洗三次。然后使用N2干燥电极，并在任何测试之前储存在常见96多孔平台中。
在任何实验之前，将苯胺在减压下蒸馏。
所有化学品均购自Aldrich Chemicals。电合成和测量均在室温(20℃)下进行。
样品制备
将待测试的菌株在TSA(胰蛋白酶大豆琼脂5％绵羊血液)培养皿上35℃下生长过夜。将测试菌株的5个校准接种环(5x10μL)置于含有500μL Tris-HCl 20mmol/L裂解缓冲液(B-PERII，Bacterial Protein Extraction Reagent；Thermo Scientific Pierce，Rockford，IL，USA)的2mL微量离心管中30分钟以允许细胞膜裂解。在开始时和每10分钟涡旋搅拌1分钟以确保混合。30分钟后，将样品以10000×g离心5分钟，以使生物固体碎片沉降。在该离心步骤期间尽可能新鲜地制备3mg/mL亚胺培南、0.1mM ZnSO4溶液的亚胺培南溶液，因为其时间稳定性很弱(在室温下4小时认为是可接受的，亚胺培南可以预先制备并冷冻于-20℃下)。类似地，还用6mg/mL(包含3mg/mL亚胺培南和3mg/mL西司他丁)的溶液进行实验，
结果
使用恒电位仪和WO2011082837中描述的方法测定电化学平衡电位。作为提醒，并且如图2所示，生成简单的主动测量包括在恒电位器的输入和输出之间包括反馈回路。
在该实验配置中，借助于微控制器处理器来控制、监测和致动反馈回路。用处理器实现诸如图2所示的简单算法。该算法需要一些输入数据，所寻求的电流即[ADC TARGET](模数转换器目标)、用于施加电位的任意初始猜测、任意[DAC](数字模拟转换器)、增量和减量变量[Inc]和[Dec]，以DAC电压分辨率为初始值(在本例中为1mV)。处理器在恒电位器上施加任意工作电位，即任意[DAC]。该动作使得红色电化学电池中在所需时间量[ADC]之后产生电流。然后以可变步长增加或减少施加的工作电位[DAC]，以迭代地接近所需电流[ADC Target]。如果目标电流为零([ADC Target]＝0)，则施加的电位简单地趋向于工作电极的平衡电化学电位。
对于电位计，从多路复用器选择无限电阻器。作为结果，电流电压转换器IC3将对电极和工作电极之间的电流限制为运算放大器本征泄漏电流(对于常见运算放大器通常为10-100pA)。该电流-电压转换器然后达到准无穷大增益，并且通常给出两个极值，表明所施加的电位是高于还是低于工作电极平衡电位。在此配置中，[ADC Target]＝0，恒电位器作为离散电压比较器，允许使用聚苯胺产生简单的电位检测。使用无限电阻器来限制电流并且避免聚苯胺工作电极在测量期间改变。
[DAC]施加和[ADC]测量之间的延迟固定为20ms。当在8个探针上实现测量时，恒电位仪被多路复用以便为每次迭代选择不同的传感器，并且微控制器管理8组上述参数。
将电极的传感器放置在含有200μL含有或不含3mg/mL亚胺培南的0.1mM ZnSO4溶液的8孔阵列中，并静置2分钟，同时测量电化学电位。
然后，将60μL纯BPERII或裂解提取物在含有电极的阵列的不同孔中混合。
无细菌提取物的对照物，能够在实验期间控制亚胺培南在溶液中的稳定性，且无亚胺培南的对照则证实信号与碳青霉烯抗微生物剂的水解相关。
在约18分钟内进行测量。然后用pH4、pH7、pH4和pH7的标准缓冲液将电极校准约3分钟。
使用来自Riedel de Haen公司的FIXANAL配方获得用于校准的不同pH缓冲溶液。对于1升水溶液，pH＝4的缓冲液含有11.76g C6H8O7.H2O,2.57g NaCl和 68mL NaOH(1M)，pH＝7的缓冲液含有3.52g KH2PO4和7.26g Na2HPO4.2H2O。pH＝10的缓冲液含有4.77gNa2B4O7.10H2O和18.3mL NaOH(1M)。
在典型的实验中，平行测试2个菌株，该过程可以描述如下。
由于电极计具有八个探针，在同一时间测试了两个菌株(例如菌株1和菌株2)。从编号为1至8的8个孔的阵列中，孔1、孔2、孔4、孔5、孔7、孔8孔包含200μL的3mg/mL亚胺培南、0.1mM ZnSO4溶液。孔3和孔6含有200μL不含亚胺培南的0.1mM ZnSO4溶液。
在孔1和孔2中用70μL纯BPERII制备另一8孔阵列，在孔3、孔4和孔5中制备70μL菌株1裂解提取物，在孔6、孔7和孔8中制备70μL菌株2裂解提取物。使用8通道微量移液管从该阵列中取60μL。将此60μL在含有电极的阵列中混合，并进行测量。
由于已知碳青霉烯水解产生pH变化，对已经通过CarbaNP-测试(Nordmann-Poirel测试)测定为明显阳性的2种产碳青霉烯酶菌株(PEP119和PEP175)进行电位计实验。PEP119和PEP175是分别表达KPC-2和NDM-1基因的克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)菌株。
当与无亚胺培南提取物相比时，在将裂解提取物加入亚胺培南时观察到聚苯胺电位的增加(6分钟后的值：KPC-2＝+50mV和NDM-1＝+20mV)。然而，由于+60mV变化对应于一单位pH的下降变化，当与它们用CarbaNP测试获得的信号程度相比时，这些菌株的信号显得相当低。这个观察表明，电极在电位上经历两个相反的效应，且一些还原过程可能降低电位，而酸度可能增加电位。这种减少现象通过在电位测试之后马上用已知pH校准标准立即测试电极而得到了清楚证明。
在受试菌株提取物和β-内酰胺的存在下，清楚观察到电极减少，对于两种菌株，在pH＝4时电位变化约-120mV，在pH＝7时电位变化约-50mV。这意味着在pH校准之前观察到未经任何pH校准标准的信号，反映着结合了电极还原(数据未示出)的pH变化。
pH变化的具体观察可以通过用pH标准信号进行信号校准来获得。然而，，在紧接加入菌株提取物后的早期阶段，校准对信号获取的影响可能是不正确的，因为氧化还原和酸碱反应的动力学是未知的。
对于不表达碳青霉烯酶的菌株，没有观察到电极的还原和pH的降低。类似地，对于表达弱碳青霉烯水解酶OXA-48的菌株，没有观察到电极的还原和pH的降低。
电位测试清楚地表明，电极还原和酸化对电位具有相反的影响：酸性增加电位，而还原降低电位。
实施例2：阻抗测定
材料和方法
电极
如先前在实施例1中所公开的内容，制备用于阻抗测定的电极。
由于仪器限制，例如自然噪声，与电位法不同，电化学电池的阻抗测量需要使最低可测量电流流过聚苯胺工作电极。为了使电极变化最小化，该取样必须在时间上尽可能短，并尽可能接近电极的平衡电化学电位。
对于聚苯胺阻抗测量，首先使用上述电位测定法测定电化学电位。然而，为了确保测量的电位处于平衡并且在时间上稳定，实施了一项算法以便检查其时间稳定性。使用先前描述的电位法，一旦达到平衡电位并且由于有限的DAC分辨率，该算法将在任何情况下保持搜索目标电流。在理想情况下，这将导致1mVpp的平方振荡。然后，所得到的脉冲串在时间期间可以是红色，以诠释为如图2中的[Stab]参数所描述的算法每次迭代时比特移位的二进制数(上升为1，下降为0)。在此工作中，[Stab]定义为一个32位整数，初始为空值(null)。
由于各种稳定性模式可以作为电极阻抗的函数而出现，已经考虑了五种模式来指示平衡电化学电位稳定性。相应的二进制脉冲序列号及其对应整数转换在表1中示出。
序列脉冲二进制数 对应整数
10101010101010101010101010101010 2863311530
11001100110011001100110011001100 3435973836
11100011100011100011100011100011 3817748707
11110000111100001111000011110000 4042322160
11111000001111100000111110000011 4164816771
表1：稳定性及其转换为整数的序列脉冲二进制数。
一旦[Stab]参数等于这些数字之一，则认为电极是稳定的，并且可以在相对最优的条件下开始阻抗测量。在此测量之后，[Stab]参数将重置为空值。
图3中的计时图描述了阻抗实验的不同顺序：一旦传感器之一满足稳定性，多路复用器选择499kOhm电阻，并且通过[DAC]参数施加最后确定的平衡电位1秒，以设置相应的探针。之后，电位在DAC最大速度下升高10mV，在11.6ms期间以34487Hz的采样速率测量电流瞬态响应。之后，通过多路复用器选择无限电阻器，并将400个测量数据点传送到计算机。在第一次数据传输之后，多路复用器选择499kOhm电阻，并通过[DAC]参数施加平衡电位1秒钟,以重新设置电极。之后，电位此时在DAC最大速度下降低10mV，并且再次在11.6ms内以34487Hz采样速率测量电流瞬态响应。之后，多路复用器选择无限电阻，将新的400个数据点传输到计算机。
为了完整起见，对于图2的简化方案，将10pF电容器并联添加到499kOhm电阻器以减少噪声。
如图3的计时图所示，得到的电流瞬变通常在电化学中衰减。这些衰减掩盖了许多电极界面性质，例如溶液和界面电导、溶液双层电容等。
通过预处理大大降低了数据量。在当前情况下，由于激发的稳定性和低振幅，两个衰减通常完全相同。然后，在第二次瞬变的符号变化之后，这些变化平均为单个正衰减。选择计算各80个数据的5个连续积分，以允许不同类型的建模并得到最多5个参数。
在所给出的结果中，最简单的操作是这五个积分的总和，其在简单的欧姆定律计算之后对应于全局电导，基本上足以获得本测试用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科时的极高特异性和灵敏度。
在所提出的工作中，该数据表示为单位为库仑的交换电荷基于时间的函数，。
关于稳定性参数，随着稳定性随机发生，数据在随机时间产生。因此，一个电极的不同探针之间的数据比较需要将数据内插到恒定时基。在这项工作中，使用GNU Octave3.6.4获得立方样条插值、数据处理和绘图。
样品制备
根据Nordmann等人公开的流程，对相同的细菌提取物平行进行CarbaNP测试和本阻抗测定。并比较结果。简言之，将从抗菌谱中直接得到的一个校准剂量(10μL)的受试菌株悬浮在Tris-HCl 20mM裂解缓冲液(B-PERII，Bacterial Protein Extraction Reagent；Thermo Scientific Pierce，Rockford，IL，USA)中，涡旋1分钟并在室温下进一步培养30分钟。将该细菌悬浮液在室温下以10000×g离心5分钟。将30μL对应于酶细菌悬浮液的上清液在96孔板中与100μL由3mg亚胺培南一水合物(Sigma，Saint-Quentin Fallavier，France)，pH 7.8，酚红溶液和0.1mM ZnSO4(Merck Millipore，Guyancourt，France)制成的1mL溶液混合。
将60μL上清液与200μL含有0.1mM ZnSO4的3mg/L亚胺培南溶液混合。将电极浸入溶液中，并在最多1小时持续时间内收集信号。
可选地，为了改善测试的周转时间，评价另一流程。在该方案中，将10μL校准剂量的细菌悬浮在100μL盐水溶液(75mM MgCl2 75mM CaCl2)中，将30μL悬浮液转移至60μL含有3mg/mL亚胺培南和0.1mM ZnSO4的溶液中)，并将50μL悬浮液直接置于电极上，而不进行先前的培养和离心。在最多30分钟期间收集信号。
无细菌提取物的对照物能够在实验期间控制亚胺培南在溶液中的稳定性，而无亚胺培南的对照物则证实信号与碳青霉烯抗微生物剂的水解相关。
菌株
总共测试了121种肠杆菌(Enterobacteriaceae，参见下表2)。该集合包括在已表征的各种物种中表达β-内酰胺酶基因(包括碳青霉烯酶)的53种分离株，其中10株来自用于碳青霉烯酶检测的NEQAS外部质量控制2013(Labeled Neqas)，以及58种分离株(LabeledNRC)OXA-48生产者(n＝39)和非碳青霉烯酶生产者(n＝19)，根据ISO15189认证的终点PCR评估β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的存在。
表2：121种受试肠杆菌科菌株的描述。
对于阻抗测量，还原和酸化这两种现象共同互补地起作用。实际上，除了其电化学电位依赖性之外，聚苯胺的电导率也随pH和氧化还原活性而变化，但是变化为若干数量级。聚苯胺通常在电合成后以略微氧化的形式获得，其导电性对于其氧化还原态而言不是最高的。然后，还原会使聚苯胺回到其导电性最高的翠绿亚胺形式。此外，先前的电位测定实验清楚地表明，酸度可以变化最多两个数量级(-2个pH单位)，并且已知翠绿亚胺的酸形式甚至更具导电性。作为总体结果，电导率作为酸化和还原的函数而增加。测量聚苯胺电极的阻抗而不是电位。
图4和图5表示对于相同菌株(分别为PEP119和PEP175)进行阻抗测量的结果。当与单独的提取物相比时，亚胺培南存在的信号非常高。更有趣的是，图6和图7表示对于产CTX-M-15(非碳青霉烯酶)生产菌株PEP77获得的信号和产碳青霉烯酶OXA-48的PEP141获得的信号。虽然对于PEP77而言，没有在具有和不具有亚胺培南阻抗的曲线之间观察到差异，但是对于OXA-48生产者PEP141，亚胺培南曲线明显不同。
阻抗法显著改善了对碳青霉烯酶生产者的检测，因此构成了检测碳青霉烯酶的新诊断工具。
在第一个实施例中，在使用B-PERII裂解30分钟后接着进行离心步骤，获得结果。然后将电极投入200μL包含蛋白质提取物的反应混合物中。
在另一个实施例中，去掉了裂解培养和离心步骤。此外，没有将电极插入反应混合物中，而是将50μL反应混合物直接沉积在电极上以减少不方便的操作。
在本体溶液法中，如在CarbaNP-测试中，细菌细胞必须被裂解，以释放β-内酰胺酶并且允许其与亚胺培南底物发生反应和进行随后的比色反应。在电化学中，这些反应可以在电极和反应混合物之间的界面处具体观察到，因此主要是在与电极相互作用的界面处发生的反应。据发现，聚苯胺是足够好的介质，能够消除洗涤剂裂解提取的需要。此外，另外的实验证明，即使在没有盐的情况下，也可以检测碳青霉烯酶活性(包括OXA-48活性)的存在。
但是，适当的盐浓度有利于促进与电极接触处的β-内酰胺酶可及性。在不同浓度和不同组合(CaCl2、MgCl2、MnCl2、MgSO4、NH4Cl、NaCl、KCl、CaSO4、ZnCl2以及CaCl2和MgCl2的组合)中测试超过10种不同的盐混合物：以所有受试盐混合物检测产生碳青霉烯酶的菌株，但是用上述混合物(即，用CaCl2和MgCl2的组合)获得的结果最好。
实施例3：CarbaNP-测试和阻抗测定(有和无细胞裂解)
比较在收集菌株上获得的CarbaNP-测试、包括裂解步骤的阻抗测定和没有裂解步骤的阻抗测定结果。
在第一组实验中，使用与上述相同的B-PER提取流程分析所有53个收集菌株(表2中以“Tempo”标记的菌株)。将上清液平行用于CarbaNP测试的碳青霉烯酶检测和经细胞裂解的本发明阻抗测定。还使用没有培养和离心的新方法，对相同的菌株以无细胞裂解的阻抗测定进行评价。如上所述用非缓冲盐溶液代替B-PER裂解缓冲液，并立即用阻抗测定分析细菌悬浮液。与第一组实验相反，电极不插入溶液中，但是将约50μL的反应混合物直接沉积在电极上。有利地，本发明的检测测试可以在室温下进行，而其它已知检测测试(例如CarbaNP测试)需要将混合物在35-37℃下培养，从而妨碍了对结果的连续监测。
该简化步骤去掉了30分钟培养和初步离心步骤。Nordmann等人曾提出跳过离心步骤，但是由于培养基的浊度和观察到的未确定结果比率更高(没有亚胺培南变成黄色或橙色的阴性对照)，使用细菌悬浮液使得解释结果较为困难。
使用本发明的阻抗测定，在有和无细胞裂解的情况下，通过从亚胺培南信号中减去无亚胺培南时获得的信号，来自动计算得到的曲线。当所得曲线越过作为时间函数的确定阈值时，该菌株被认为是碳青霉烯酶生产者。无碳青霉烯酶的菌株没有超过该阈值。
从下表3中可以看出，CarbaNP-检验分别表现出89.2％、100％、100％和80％的灵敏度、特异性阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。用本发明的细胞裂解的电导率测试，这些值为97.3％、100％、100％和94.12％。使用该3种技术没有观察到假阳性结果，并且任何测试方法都没有检测到弱且稀有的碳青霉烯酶GES-6。更有趣的是，有一个OXA-48-生产者没有通过CarbaNP测试检测，但实际上被本发明使用和不适用细胞裂解的阻抗测定检测到了。据报道，CarbaNP测试对于检测这种重要的抗性性状存在弱点。对于CarbaNP测试和有细胞裂解的阻抗测定，培养和离心时间为约45分钟；而对于无细胞裂解的阻抗测定，培养和离心的时间为约30分钟。
表3：53个收集菌株的3项测试的比较。
3项测试获得的值是可比较的，但是利用本发明的阻抗测定显著改善了结果的可追溯性。这些测试也大大减少了获得结果的时间和动手时间。
通过CarbaNP测试或本发明的阻抗测定，在培养的5分钟内检测到了所有NDM、KPC、VIM或IMP-生产菌株。然而，CarbaNP测试对于阳性到达时间无法像本发明的阻抗测定一样容易精确地评估。在CarbaNP测试中，结果事实上由操作者裸眼评估，而阻抗测定的结果是量化的、计算得到的且可追踪的信号。此外，用亚胺培南培养的最大时间(即确认菌株确实不是碳青霉烯酶生产者所需的时间)对于CarbaNP测试为2小时，对于有细胞裂解的阻抗测定为1小时，并且对于不适用细胞裂解的阻抗测定为30分钟。
为了证实这些结果，还比较了来自比利时实验室的58个分离株(标记的NRC)OXA-48生产者(n＝39)和非碳青霉烯酶生产者(n＝19)的3个测试。在下表4中，显示CarbaNP-测试分别表现出78.38％、100％、100％和68％的灵敏度、特异性、PPV和NPV。这些值几乎与有细胞裂解的阻抗测定的值76.92％、100％、100和67.86％相同。无细胞裂解的阻抗测定呈现出更好的灵敏度，在小于30分钟内获得的值为94.87％、100％、100％和90.48％。此外，与有细胞裂解的阻抗测定在60分钟后(平均值＝39.24；SDT＝12.01)的信号强度(任意单位)相比，无细胞裂解的阻抗测定在30分钟后的信号强度(任意单位)(平均值＝39.24；＝15.15；SDT 8.12)(数据未显示)更好。CarbaNP-测试在39处未检测到8个OXA-48-生产者。此外，4个菌株的CarbaNP测试无法诠释，因为颜色变化独立于亚胺培南水解。此外，OXA-48样生产者的检测是最困难的，因为D类碳青霉烯酶的碳青霉烯酶活性较弱。特别是对于CarbaNP测试，其中从红色到橙色的颜色变化的解释可能取决于读取者。
表4：OXA-48生产者的3项测试的比较。
最后，本发明的方法正确鉴定了10个来自NEQAS的外部质量控制(见上表2)的菌株。在最长10分钟内检测到所有九种碳青霉烯酶产生菌，并且在30分钟后用无细胞裂解的阻抗测定确认了阴性菌株。用CarbaNP-测试获得相同的定性结果，但在1小时后方检测到OXA-48阳性菌株，2小时后方确认阴性菌株。
最后，在图8中，一式三份地测试49个收集菌株，证明无细胞裂解的阻抗测定的可重复性。
细菌对抗微生物剂的耐药性的出现和传播是重要的公共健康问题。β-内酰胺酶生产菌株的早期检测，特别是碳青霉烯酶，对于抗生素治疗或实施感染控制措施是最重要的。
作为结果，证实了本发明的测试能够以比现有的CarbaNP测试更好的灵敏度和特异性，检测产生碳青霉烯酶的肠杆菌科。有细胞裂解的测试提供了与CarbaNP-测试相仿的灵敏度和特异性的结果，但是相对于CarbaNP测试和基于酸度指示剂比色变化的其他方法，无细胞裂解的测试提供了另外的优点。本发明的技术确实有利地将得到结果的时间从超过2小时(包括细胞裂解)减少到了30分钟。
本发明的方法优点在于，除了介质酸化之外，氧化还原还参与改变了电极上的聚合物材料涂层(在优选实施例中，PANI)的阻抗。因此，本发明的传感器是比本领域公开的比色或碘指示剂更佳的用于检测由β-内酰胺酶、碳青霉烯酶和/或头孢菌素酶进行的水解的传感器。因此，在特定实施例中，本发明的测试是允许信号的测量和追溯的电化学测试，并且因此代表着显著的进步，特别是在临床实验室的认证过程的范围中。
在优选的实施例中，该测试在室温下进行，因此允许实时观察结果并避免对培养箱的要求。本发明的技术还允许将电极平行化至最多384个测试，其可用于高通量或用于筛选潜在抑制碳青霉烯酶的分子。
此外，在本发明的优选实施例中，不再需要细胞裂解来实施本发明的检测测试。此外，本发明的技术提高了该方法的灵敏度，特别是用于检测存在底物弱水解的OXA-48生产者。在上述公开的实验中，与现有技术的CarbaNP-测试相比，特别是用于检测OXA-48时，检测的灵敏度显著改善(94.9％对78.4％)。然而，通过本发明的测试没有检测到GES-6，推测是因为这种非常罕见的碳青霉烯酶似乎是非常弱的碳青霉烯水解酶，对其至今尚无对酶特性的精确描述。
除了碳青霉烯类水解之外，本发明的技术也完全适合于追踪涉及β-内酰胺抗微生物剂的酶活性的任何其它底物的水解。
实施例4：可重复使用的电极
在相同电极上测试克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)OXA-48菌株[NEQAS1943或PEP136]8次：有亚胺培南4次，无亚胺培南4次。然后相同的电极连续重复使用19次以证明其可重用性。
将一整环10μL的培养细菌重悬于110μL裂解缓冲液(75mM MgCl2+75mM CaCl2)中。将24μL该悬浮液加入到80μL含有0.1mM ZnSO4、含或不含3mg/mL亚胺培南(Imi)的溶液中。
然后，根据以下方案将50μL的后一悬浮液装载在电极上：
包括电学复位步骤的第一次测量：-Imi/+Imi/-Imi/+Imi/-Imi/+Imi/-Imi/+Imi。
对于第二次测量，根据以下替代方案，用水清洗电极并重新加载，以证明复位模式的总效率：+Imi/-Imi/+Imi/-Imi/+Imi/-Imi/+Imi-Imi并测量。
然后，根据用于第一次测量的方案，再次冲洗电极并重新加载，再次开始测量。重复该过程，直到使用相同的电极19次。
结果显示在图9中。在该图中，一条曲线表示在一次使用电极(有或无亚胺培南)中获得的4条曲线的平均值。
无亚胺培南的19条曲线是平直的。
第1至6次测量克雷伯氏肺炎菌OXA-48NEQAS 1943的应用显示相同的形状。
用培养48小时(而不是16至24小时)的克雷伯氏肺炎菌OXA-48PEP136实现的第7至10次应用，显示出较弱的曲线。
第11至19次再次测量克雷伯氏肺炎菌OXA-48NEQAS 1943的应用，证明了正确结果。
因此，这些结果表明，当本发明的方法包括第一复位步骤时，电极可重复使用至少19次。
实施例5：有或无阴性对照的方法
在第一代BYG测试中，BYG测试包括比较有亚胺培南的信号和无亚胺培南的信号。当这两个信号之间的差异为“显著”(即跨越特定阈值)时，菌株被认为产生能够水解包含β-内酰胺环的试剂的酶活性，例如碳青霉烯酶。这意味着一个菌株需要两指(电极)。
在第二代BYG测试中，去掉了比较步骤，即该方法仅包括分析有亚胺培南的指。实际上，发明人证明，当仅用亚胺培南分析指时可以获得非常有价值的结果。这意味着对于一个菌株只需一个电极，将电极/分析的成本减半。
目前，用本发明的BYG测试对319种肠杆菌进行前瞻性分析，当从有亚胺培南的值中减去无亚胺培南的值时，客达到97％的灵敏度和100％的特异性(仅5个碳青霉烯酶生产菌未被检测到)。
同时，当以重新调节的阈值仅观察相同菌株的有亚胺培南的信号时，可以保持100％的特异性，灵敏度为95％(9个肠杆菌科生产者的碳青霉烯酶未检测到：第一次分析的5个相同分离株+另外4株)。
因此，本发明方法非常独特的特征在于，能够无需阴性对照地在大量前瞻性菌株上获得95％的灵敏度(在临床观点上是非常可接受的)。相反，对于比色技术而言，阴性对照是强制性的。

Claims (18)

1.用于在样品中检测β-内酰胺酶活性的方法，其特征在于，所述方法是阻抗测定法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使所述样品与具有所述β-内酰胺酶活性的至少一种底物接触；和
(ii)通过收集数据点来检测所述电化学电池中的阻抗变化；
其中所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)和(ii)同时进行。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-内酰胺酶活性是碳青霉烯酶活性或头孢菌素酶活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含游离酶。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含生物细胞，优选为细菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌是选自肠细菌细胞和非发酵性革兰氏阴性细菌细胞的革兰氏阴性细菌。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述底物选自青霉烷、头孢烯、单环β-内酰胺、碳青霉烯、碳青霉烷、氧青霉烷、青霉烯，碳头孢烯和氧头孢烯，或其组合，优选地，其中所述底物是亚胺培南。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一步骤在至少一种辅因子盐，优选为ZnSO4的存在下进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一步骤在至少一种副盐，优选为CaCl2、MnCl2、MgCl2、NaCl或KCl或其任何组合的存在下进行，所述组合例如为CaCl2和MnCl2或者CaCl2和MgCl2。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，还包括裂解所述生物细胞的步骤。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法不包括裂解所述生物细胞的步骤。
12.用于鉴定β-内酰胺酶活性的方法，包括以下步骤：
(i)在含有所述β-内酰胺酶活性的至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使疑似具有所述β-内酰胺酶活性的样品与其至少一种底物接触；
(ii)在不含所述至少一种可能抑制剂的至少一个电化学电池中，使所述样品与所述至少一种底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
13.用于筛选抑制β-内酰胺酶活性的候选抑制剂的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使具有所述β-内酰胺酶活性的样品与具有所述β-内酰胺酶活性的至少一种底物和至少一种候选抑制剂接触；
(ii)在不存在所述至少一种候选抑制剂的情况下，使所述样品与具有所述β-内酰胺酶活性的至少一种底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种底物包含β-内酰胺环。
14.用于筛选不被β-内酰胺酶活性水解的候选β-内酰胺试剂(优选为抗微生物剂)的方法，包括以下步骤：
(i)在至少一个电化学电池中，使具有所述β-内酰胺酶活性(在生物细胞内或游离形式下)的样品与至少一种候选β-内酰胺试剂接触；
(ii)使所述样品与具有所述β-内酰胺酶活性的已知底物接触；
(iii)通过收集数据点来检测步骤(i)和(ii)的所述电化学电池中的阻抗变化；和
(iv)比较在步骤(iii)中检测到的所述阻抗变化；
其中，所述至少一种候选抗微生物剂包括β-内酰胺环。
15.用于通过测量工作电极的阻抗来检测样品中的β-内酰胺酶活性的系统，所述系统包括：
-复用器，其至少包括499kΩ电阻器和无限电阻器，
-工作电极，其由导电固体聚合物换能器制成并涂有聚苯胺；
-输入端，其用于接收指示施加于所述工作电极和参比电极之间的电位的输入信号；和
-输出端，其用于传输指示在对电极和所述工作电极之间流动的电流大小的输出信号；所述工作电极和参比电极用于浸入样品中或装载样品；
-数字处理器，其连接到数模转换器以产生所述输入信号；以及连接到模数转换器以接收数字值形式的至少一个数据点；
-计算机，其收集至少80个数据点，优选为至少400个数据点，并计算所述数据点的连续积分，以得到加总后对应于全局电导的参数。
16.根据权利要求15所述的系统，其特征在于，涂有聚苯胺的所述电极是可重复使用的。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的系统，其特征在于，所述工作电极涂覆有聚苯胺和具有β-内酰胺酶活性的至少一种底物，优选地，其中所述底物是碳青霉烯，更优选为亚胺培南。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测阻抗变化的步骤包括：
-使用根据权利要求15至18中任一项所述的系统，在所述电化学电池中以数据点的形式收集交换的电荷；和
-计算所述数据点的连续积分，并对所述积分求和以获得全局电导。
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