WO2020254711A1 - Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos - Google Patents

Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos Download PDF

Info

Publication number
WO2020254711A1
WO2020254711A1 PCT/ES2020/070406 ES2020070406W WO2020254711A1 WO 2020254711 A1 WO2020254711 A1 WO 2020254711A1 ES 2020070406 W ES2020070406 W ES 2020070406W WO 2020254711 A1 WO2020254711 A1 WO 2020254711A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tazobactam
piperacillin
blood
tem
isolates
Prior art date
Application number
PCT/ES2020/070406
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Younes Smani
Ángel RODRÍGUEZ VILLODRES
José Antonio LEPE JIMÉNEZ
Jerónimo PACHÓN DÍAZ
Original Assignee
Servicio Andaluz De Salud
Universidad De Sevilla
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Servicio Andaluz De Salud, Universidad De Sevilla filed Critical Servicio Andaluz De Salud
Publication of WO2020254711A1 publication Critical patent/WO2020254711A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to kits and methods for the detection of absence or presence of b-lactamase, such as penicillinase, cephalosporinase or carbapenemase, in a sample as well as to a method the extended spectrum resistance to ⁇ -lactams in clinical isolates .
  • b-lactamase such as penicillinase, cephalosporinase or carbapenemase
  • RMA Microbial resistance to antibiotics
  • E. coli is one of the most important pathogens in humans. Among gram-negative bacteria, E. coli is primarily responsible for bloodstream infections and urinary tract infections. For the treatment of infections caused by E. coli, b-lactam antibiotics with b-lactamase inhibitors (BL / IBL) are used, such as ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate, or piperacillin / tazobactam. However, the excessive and indiscriminate use of this family of antibiotics is producing the appearance of resistant strains and the decrease in the effectiveness of the available treatments. Likewise, the inappropriate application of antibiotics can give bacteria the opportunity to modulate their own pathogenicity and / or resistance (Adamus-Bialek et al., 2019).
  • Fig. 1 Detection method for extended spectrum resistance to b-lactams with b-lactamase inhibitors (REEI).
  • Fig. 2. Detection time in strains resistant to P / T and sensitive to it, but with the ability to develop REEI. S: sensitive, R: resistant, P / T: piperacillin / tazobactam.
  • the inventors have developed a method that takes only about 10 min to detect resistant isolates, and a maximum of 2 h to identify isolates that can develop a REEI. These detection times are a great advance compared to the 24 hours currently required. Early detection of these resistances, with results obtained on the same day as bacterial growth, would allow better optimization in the use of BL / IBL antibiotics, decision-making on treatment, and patient management. Its implementation in clinical practice would be feasible, due to its easy preparation and execution, without the need for reagents or special devices, and with the advantage that the ampicillin / sulbactam solution is quite stable over time. Furthermore, the implementation of the new method in clinical practice would not produce a large increase in the total costs of the process.
  • the test developed in this study is capable of both detecting resistance and identifying a possible development of REEI due to an inappropriate use of the antibiotic.
  • a first aspect of the invention relates to a method of identifying bacterial isolates resistant to combinations of a b-lactam antibiotic with a b-lactamase inhibitor, capable of hydrolyzing the b-lactam ring of a combination of a b-lactam antibiotic. with a b-lactamase inhibitor (BL / IBL), hereinafter the first method of the invention, which comprises detecting the protons that are shed from the b-lactam ring.
  • BL / IBL b-lactamase inhibitor
  • the BL / IBL combination is selected from the list consisting of: ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate, piperacillin / tazobactam, or any of their combinations.
  • Piperacillin / tazobactam is a broad-spectrum antibiotic recommended for the empirical treatment of serious infections, such as sepsis or intra-abdominal infection.
  • the Abusive use of this antimicrobial is leading to the emergence of resistant strains.
  • the BL / IBL combination is piperacillin / tazobactam.
  • detection is carried out in a blood culture or in a body fluid, preferably a body fluid inoculated into blood culture bottles.
  • the detection of the protons is carried out by means of a pH change indicator.
  • the method of the invention makes it possible to identify isolates capable of hydrolyzing the b-lactam ring of the antibiotic, carried out by the enzyme b-lactamase.
  • a colorimetric enzymatic assay was carried out using phenol red.
  • Phenol red is a pH indicator that turns orange and yellow when the medium is acidified. Therefore, the presence of a b-lactamase enzyme hydrolyzes the b-lactam ring of the antibiotic, protons are released that acidify the medium, and a color change to yellow tones can be seen. On the contrary, if there is no enzyme, the medium remains at the same pH and does not change color (red-pink hue).
  • the colorimetric methods that allow to detect the hydrolysis of the antibiotic through the change of color in the medium (from pink to yellow), as a result of the decrease in pH after the action of b-lactamase.
  • the pH change is measured by a colorimetric method.
  • the colorimetric method is a phenol red enzymatic method.
  • the time it takes for the medium to change color will indicate whether the clinical isolate shows resistance to piperacillin / tazobactam ( ⁇ 10 minutes) or possible acquisition of resistance to it (between 11 and 120 minutes).
  • the detection method was carried out both at 6-8 hours and at 24 hours.
  • the bacterial isolates are of the order Enterobacteriales, preferably of the family Enterobacteriaceae and even more preferably of the genus Escherichia. Even more preferably they are of the Escherichia coli species.
  • the bacterial isolates are of the order Enterobacteriales, preferably of the family Enterobacteriaceae and even more preferably of the genus Klebsiella. Most preferably they are of the species that is selected from the list consisting of: Klebsiella aerogenes, Klebsiella africana, Klebsiella granulomatis, Klebsiella grimontii, Klebsiella huaxiensis, Klebsiella kielensis, Klebsiella michiganensis, Klebsiella, Klebsiella milletisiella, Klebsiella pasteiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella quasivariicola, Klebsiella senegalensis, Klebsiella spallanzanii, Klebsiella steroids, Klebsiella variicola, or any of their combinations.
  • BL / IBL The combination of b-lactams with b-lactamase inhibitors (BL / IBL) represents the main strategy to combat bacterial resistance against these antibiotics.
  • the use of these antibiotics makes it possible to deal with urinary, intra-abdominal and bloodstream infections caused by Escher ⁇ chia coli.
  • the excessive and indiscriminate use of these BL / IBLs (ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam) has produced the appearance of resistant variants.
  • the objective of this work is to develop and validate a method capable of detecting strains of E. coli resistant to piperacillin / tazobactam and strains that can develop resistance to the three BL / IBL combinations "resistance of extended spectrum to the BL / IBL ”(REEI).
  • the results obtained in this work demonstrate the efficacy and sensitivity of the developed detection method, showing great potential in its possible clinical application, which would cause a reduction in unnecessary costs, ineffective treatments and the inappropriate use of BL / IBL.
  • coli isolate can present different resistance phenotypes: 1) RSS, resistant to ampicillin / sulbactam but sensitive to amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam, 2) RRS, resistant to ampicillin / sulbactam and amoxicillin / clavulanate but sensitive to piperacillin / tazobactam, and 3) RRR, resistant to ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam.
  • RSS resistant to ampicillin / sulbactam but sensitive to amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • RRS resistant to ampicillin / sulbactam and amoxicillin / clavulanate but sensitive to piperacillin / tazobactam
  • RRR resistant to ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clav
  • a second aspect of the invention refers to a method for determining the capacity for development of extended spectrum resistance to b-lactams (REEI), hereinafter the second method of the invention, which comprises inducing a process of antibiotic pressure in those isolates that present a low level of resistance to BL / IBL (RSS and RRS), identified by the first method of the invention.
  • REEI extended spectrum resistance to b-lactams
  • the second method of the invention comprises: a) inoculating subinhibitory concentrations of piperacillin / tazobactam (ratio 8: 1), corresponding to concentrations one dilution below the minimum inhibitory concentration (MIC) in the isolates that present a low level of resistance a BL / IBL (RSS and RRS), identified by the method according to claims 1-10, b) repeat the process until reaching the concentration of 256/32 mg / L of piperacillin / tazobactam, or until the concentration that did not allow the bacterial growth, and c) culturing the pressed clinical isolates in each of the piperacillin / tazobactam concentrations for subsequent determination.
  • Extended spectrum b-lactamases also called extended spectrum b-lactamases (ESBL) are enzymes produced by gram-negative bacilli, mainly Enterobacteriaceae, most frequently by E. coli and Klebsiella pneumoniae. They are capable of inactivating, in addition to penicillins and first and second generation cephalosporins, oximino-cephalosporins and aztreonam. The first isolation took place in Germany in 1983 from a strain of K. Ozaenae receiving the name of SHV-2. In Spain the it was first described in 1988.
  • Classic ESBLs are derived from the broad-spectrum b-lactamases of group 2b (TEM-1, TEM-2, and SHV-1) of the Bush, Jacoby, and Medeiros classification; they possess penicillinase activity and can be inhibited by clavulanic acid.
  • a third aspect of the invention refers to a Kit or device for identifying bacterial isolates resistant to combinations of b-lactam antibiotic with a b-lactamase inhibitor, hereinafter kit or device of the invention, comprising means for the detection of protons shed from the b-lactam ring.
  • the device of the invention comprises means for identifying the pH of the medium, and even more preferably they are colorimetric means.
  • the colorimetric reagents are selected from phenol red, bromothymol blue and more preferably phenol red.
  • Another aspect of the invention relates to a computer program that comprises instructions for carrying out the procedure according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included and which has been adapted to execute, or to be used in the execution of the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM memory, a CD ROM memory or a semiconductor ROM memory, a USB memory stick, or a magnetic recording medium, for example a floppy disk or a disk. Lasted.
  • the programs could be supported on a carrier signal transmissible; for example, it could be an electrical or optical signal that could be carried via electrical or optical cable, by radio, or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Computer programs also cover cloud applications based on this procedure.
  • Bacterial inocula were prepared from suspensions at 0.5 on the McFarland scale (1x10 8 colony forming units (CFU) / mL), and dilutions were made until obtaining a final concentration on the plate of 5x10 5 CFU / mL. Subsequently, the plate was incubated at 37 ° C for 18-20 hours and a reading of the the same. The sensitivity of the clinical isolates was performed on the original isolates (isolated from the patient and without having been subjected to antibiotic pressure with piperacillin / tazobactam) and, subsequently, on these same isolates pressed with increasing concentrations of piperacillin / tazobactam (see section Antibiotic Pressure ).
  • a design was made based on a colorimetric test.
  • the foundation of this test is based on the ability to reveal the hydrolysis of the b-lactam ring by beta-lactamase. This hydrolysis produces the acidification of the medium, which can be detected by adding a pH indicator, such as phenol red.
  • the clinical isolates to be tested were inoculated into different blood culture bottles (BACTECTM Standard / 1 OAerobic / F and BACTECTM Lytic / 10Anerobic / F, Becton Dickinson, United States) at a concentration of 1x10 6 CFU / mL, and were incubated at 37 ° C with shaking at 180 rpm for 6-8 and 24 hours. After these times, the samples were processed and the detection method validated. To do this, 2 ml_ of bacterial suspension grown in the blood culture were taken, transferred to an Eppendorf tube and centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes.
  • the supernatant was removed and the pellet was resuspended with 1 ml_ of physiological serum. Again, the sample was centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes and the supernatant was removed. The pellet was then resuspended in 100 ml of B-PER II lysis buffer (Bacterial Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher Scientific, USA) and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After this time, the sample was centrifuged again at 10,000 rpm for 2 minutes.
  • the test is designed to detect both resistance to piperacillin / tazobactam and the possible development of an REEI
  • the antibiotic used in the test is ampicillin / sulbactam instead of piperacillin / tazobactam.
  • This is due to two Reasons: 1) resistance to piperacillin / tazobactam mediated by b-lactamases also leads to resistance to ampicillin / sulbactam and 2) the development of a REEI always begins with resistance to ampicillin / sulbactam, which allows us to detect hydrolysis of the antibiotic, although the isolate is sensitive to piperacillin / tazobactam, thus avoiding false negatives.
  • bla EM Form: 5'-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG, Reverse: 5'-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA
  • bla or ox A -i Formward: 5'-GGA TAA AAC CCC CAA AGG AA-3 ', Reverse: 5'-TGC ACC AGT TTT CCC ATA CA-3'
  • S v Formward: 5'-GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC, Reverse: 5'-TTA GCG TTG CCA GTG CTC.
  • bacterial DNA extraction was performed with a suspension of several fresh colonies of the bacteria in an Eppendorf tube in Milli-Q water at 96 ° C for 10 minutes.
  • the PCR reaction was then prepared containing 10 pL of PCR buffer, 2.5 pL of each primer, 0.5 pL of MyTaq polymerase, and 29.5 pL of Milli-Q water. 5 pL of the extracted DNA supernatant was added to the PCR reaction, with a final volume of 50 pL.
  • a 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, USA) was used with the following program for the amplification of the respective genes: a denaturation cycle of 4 minutes at 95 ° C, followed by 35 cycles of amplification of 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 58 ° C for bla E u, 46 ° C for b / aox A -i and 62 ° C for blasm, and 1 minute and 15 seconds at 72 ° C, and a final extension cycle 7 minutes at 72 ° C.
  • a verification of the amplification of the gene was carried out by means of agarose gel electrophoresis (1%) and the visualization of the band generated with a size corresponding to the study gene.
  • PCR products were purified using EZNA Gel extraction kit 02500-02 (OMEGA bio.tek, USA). The sequences were analyzed in the genomics and sequencing service of the Institute of Biomedicine of Seville equipped with the Sanger ABI3500 Genetic 121 Analyzer (Applied Biosystems, Foster, VA, United States) sequencer. Sequences were analyzed using SnapGene® Viewer 2.7.2 software and BLAST internet services (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
  • Sensitivity is defined as: True Positive / (True Positive + False Negative).
  • Positive predictive value is defined as: True Positive / (True Positive + False Positive)
  • the negative predictive value is defined as: True Negatives / (True Negatives + False Negatives)
  • RSS Resistant to ampicillin / sulbactam and sensitive to amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • RRS Resistant to ampicillin / sulbactam and amoxicillin / clavulanate and sensitive to piperacillin / tazobactam
  • RRR Resistant to ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • NEG negative result in relation to the resistance mechanisms studied (TEM, OXA-1, SHV)
  • RSS Resistant to ampicillin / sulbactam and sensitive to amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • RRS Resistant to ampicillin / sulbactam and amoxicillin / clavulanate and sensitive to piperacillin / tazobactam
  • RRR Resistant to ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • NEG negative result in relation to the resistance mechanisms studied (TEM, OXA-1, SHV)
  • RSS Resistant to ampicillin / sulbactam and sensitive to amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • RRS Resistant to ampicillin / sulbactam and amoxicillin / clavulanate and sensitive to piperacillin / tazobactam
  • RRR Resistant to ampicillin / sulbactam, amoxicillin / clavulanate and piperacillin / tazobactam
  • NEG negative result in relation to the resistance mechanisms studied (TEM, OXA-1, SHV)
  • the main purpose of the REEI detection method is the identification of E. coli isolates capable of hydrolyzing the b-lactam ring of the antibiotic, carried out by the enzyme b-lactamase.
  • a colorimetric enzymatic assay was carried out using phenol red.
  • Phenol red is a pH indicator that turns orange and yellow when the medium is acidified. Therefore, the presence of a b-lactamase enzyme, hydrolyzes the b-lactam ring of the antibiotic, protons are released that acidify the medium, and a color change to yellow tones can be seen. On the contrary, if there is no enzyme, the medium remains at the same pH and does not change color (red-pink hue).
  • the detection method was carried out both at 6-8 hours and at 24 hours. These times were chosen in order to verify their efficacy in the period of time in which a blood culture from a patient with E. coli bacteremia can be positive, which allows greater relevance in future clinical application.
  • Tables 1 -3 the results of all the clinical isolates in the two measurement times can be observed. The tables group the E. coli strains very precisely based on the results of the REEI detection method. Table 1 shows the isolates with negative results for the test at both times. These results are consistent with previous results, as these isolates are sensitive to piperacillin / tazobactam.
  • Piperacillin / tazobactam sensitive clinical isolates (Table 1-2) were pressed to increasing concentrations of piperacillin / tazobactam (up to 256/32 mg / L) to determine their ability to develop a REEI. In this way, the effectiveness of the method with respect to sensitive strains has been verified with a positive result in the detection test.
  • Table 1 shows the 23 clinical isolates that did not acquire resistance when pressed with piperacillin / tazobactam and whose test result was negative. The original MICs and those obtained after pressing with piperacillin / tazobactam were not significantly different.
  • Table 2 shows the 47 clinical isolates that developed a REEI when pressed with piperacillin / tazobactam. In this case, the new MICs increased between 8-256 times compared to the original MIC, with results> 512 mg / L (except for C1-102 and C1-31). The resistant isolates were not pressed (Table 3). Therefore, the results obtained in this section strengthen the validity of the detection method, since in addition to identifying resistance to piperacillin / tazobactam, it can detect possible development of REEI.
  • b-lactamases One of the main mechanisms related to resistance to BL / IBL is the production of b-lactamases.
  • these enzymes there are especially those of the TEM type (ISTEM gene), but those of the OXA-1 type (b / aoxA-1 gene) and SHV (o / as H v gene) can also be observed. Therefore, in all the study strains, it was verified by specific PCR whether or not they contained these genes (Table 1-3). PCR products (or amplifications) that were positive were sequenced to specifically determine the type of enzyme (eg: TEM-1). The isolates that presented some resistance mechanism, showed agreement with the results obtained in all the previous tests (MICs, detection test, acquired pressure).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Método de identificación de aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico β-lactámico con inhibidores de β-lactamasa, capaces de hidrolizar el anillo β- lactámico de una combinación de un antibiótico β-lactámico con un inhibidores de β- lactamasa (BL/IBL), método para determinar la capacidad de desarrollo de resistencia de espectro extendido a los β-lactámicos (REEI), y kit.

Description

KIT Y MÉTODO DE DETECCIÓN RÁPIDA DE BACTERIAS RESISTENTES A LAS COMBINACIONES DE ANTIBIÓTICO B-LACTÁMICO CON UN INHIBIDOR DE B- LACTAMASA. Y DE LA RESISTENCIA DE EXPECTRO EXTENDIDO A LOS B-
LACTÁMICOS EN AISLADOS CLÍNICOS.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a kits y métodos para la detección de ausencia o presencia de b-lactamasa, tales como penicilinasa, cefalosporinasa o carbapenemasa, en una muestra así como a un método la resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La resistencia microbiana a los antibióticos (RMA) constituye un serio problema a nivel mundial (O’Neill, 2016; WHO, 2017). La RMA es un proceso natural que se ha observado desde el descubrimiento de los primeros antibióticos (Alós, 2015). El uso excesivo e indiscriminado de antibióticos, ha acelerado la aparición y propagación de la resistencia bacteriana a los antibióticos a nivel mundial. Como resultado, los tratamientos disponibles se vuelven ineficaces frente a estas bacterias resistentes. Se ha estimado que, de seguir así, el número de muertes por bacterias multirresistentes en el año 2050 llegará a ser de 10 millones de personas al año, superando así a las muertes por cáncer(0’Neill, 2016). En consecuencia, el desarrollo de nuevas estrategias para enfrentar este peligro inminente se ha convertido en una prioridad urgente para la OMS y muchos gobiernos. Estas estrategias incluyen regulaciones más estrictas sobre el uso de antibióticos, para minimizar la aparición de resistencia a los antibióticos, y la financiación de investigación para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos. Además, la detección y caracterización rápida de bacterias resistentes a antibióticos mediante el uso de técnicas fiables tiene una gran importancia tanto en el tratamiento de las infecciones como en el control de la propagación de estos aislados.
E. coli es uno de los patógenos más importantes en los seres humanos. Entre las bacterias gramnegativas, E. coli es la principal responsable de infecciones del torrente sanguíneo e infecciones del tracto urinario. Para el tratamiento de las infecciones causadas por E. coli se utilizan los antibióticos b-lactámicos con inhibidores de b-lactamasa (BL/IBL), como ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico o piperacilina/tazobactam. Sin embargo, el uso excesivo e indiscriminado de esta familia de antibióticos está produciendo la aparición de cepas resistentes y la disminución de la eficacia de los tratamientos disponibles. Asimismo, la aplicación inadecuada de antibióticos puede dar la oportunidad a las bacterias de modular su propia patogenicidad y/o resistencia (Adamus-Bialek et al., 2019).
En la práctica clínica diaria, las muestras procedentes de pacientes con posibles infecciones intraabdominales y del torrente sanguíneo son inoculadas en frascos de hemocultivo, los cuales se incuban en un sistema automático que detecta el crecimiento bacteriano. En aquellos frascos que resulten con crecimientos positivos, se procede a realizar una identificación del microorganismo y un perfil de resistencia a diferentes antibióticos. Esta información le permitirá al clínico decidir qué tratamiento es el más adecuado. En la actualidad, se necesitan más de 24 h para llevar a cabo este proceso. Para optimizar este proceso, se requiere de un método rápido, sencillo y fácil de interpretar, que detecte bacterias resistentes a los BL/IBL (Burnham et al., 2017; Sommer et al., 2017).
Recientemente, con el objetivo de cubrir esta necesidad, varios grupos de investigación están desarrollando nuevos métodos para la detección de cepas E. coli resistentes a ampicilina (Lee at al., 2019; Pitruzzello et al., 2019). La implementación de estos nuevos métodos en la práctica clínica podría suponer un gran avance en la detección de variantes resistentes. Sin embargo, estas técnicas actualmente no son factibles debido a su alto coste y la necesidad de personal cualificado para desarrollarlas e interpretarlas.
Por ello, es necesario desarrollar un nuevo método capaz de detectar cepas de bacterias de la familia Enterobacteriaceae, y en concreto de E. coli, resistentes a piperacilina/tazobactam (P/T) y cepas que pueden desarrollar una resistencia de espectro extendido a los BL/IBL (REEI) debido a una exposición ineficaz a los BL/IBL, mediante un test rápido, sencillo y barato.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig.1. Método de detección de resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos con inhibidores de b-lactamasas (REEI). Fig.2. Tiempo de detección en cepas resistentes a P/T y sensibles al mismo, pero con capacidad de desarrollar REEI. S: sensible, R: resistente, P/T: piperacilina/tazobactam.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han desarrollado un método que solo necesita aproximadamente 10 min para detectar aislados resistentes, y un máximo de 2 h para identificar aislados que puedan desarrollar una REEI. Estos tiempos de detección son un gran avance si se comparan con las 24 h que se necesita actualmente. La detección temprana de estas resistencias, con resultados obtenidos durante el mismo día del crecimiento bacteriano, permitiría una mejor optimización en el uso de los antibióticos BL/IBL, la toma de decisión del tratamiento y el manejo del paciente. Su implementación en la práctica clínica sería viable, debido a su fácil preparación y ejecución, sin la necesidad de reactivos ni aparatos especiales, y con la ventaja de que la solución de ampicilina/sulbactam es bastante estable en el tiempo. Además la implementación del nuevo método en la práctica clínica no produciría un gran aumento de los costes totales del proceso.
El test desarrollado en este estudio es capaz, tanto de detectar resistencias, como de identificar un posible desarrollo de REEI por un uso inadecuado del antibiótico.
MÉTODO PARA DETECTAR RESISTENACIAS A INHIBIDORES DE B-LACTAMASAS
Un primer aspecto de la invención se refiere a un método de identificación de aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b- lactamasa, capaces de hidrolizar el anillo b-lactámico de una combinación de un antibiótico b- lactámico con un inhibidor de b-lactamasa (BL/IBL), de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende la detección de los protones que se desprenden del anillo b- lactámico.
Preferiblemente la combinación BL/IBL se selecciona de la lista que consiste en: ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico, piperacilina/tazobactam, o cualquiera e sus combinaciones.
Piperacilina/tazobactam es un antibiótico de amplio espectro recomendado para el tratamiento empírico de las infecciones graves, como sepsis o infección intraabdominal. Sin embargo, el uso abusivo de este antimicrobiano está llevando a la aparición de cepas resistentes al mismo. Por tanto, aún más preferiblemente, la combinación BL/IBL es piperacilina/tazobactam.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección se realiza en un hemocultivo o en un líquido corporal, preferiblemente un líquido corporal inoculado en frascos de hemocultivo.
En otra realización preferida la detección de los protones se realiza mediante un indicador de cambio de pH.
El método de la invención permite identificar aislados capaces de hidrolizar el anillo b- lactámico del antibiótico, llevada a cabo por la enzima b-lactamasa. Para ello, se realizó un ensayo enzimático colorimétrico utilizando el rojo fenol. El rojo fenol es un indicador de pH que vira a tonalidades naranjas y amarillas cuando el medio se acidifica. Por lo tanto, la presencia de una enzima b-lactamasa, hidroliza el anillo b-lactámico del antibiótico, se desprenden protones que acidifican el medio, y se puede visualizar un cambio de color a tonalidades amarillas. Por el contrario, si no hay enzima, el medio se mantiene con el mismo pH y no cambia de color (tonalidad rojo-rosa).
Por ejemplo, los métodos colorimétricos que permite detectar la hidrólisis del antibiótico mediante el cambio de color en el medio (de rosa a amarillo), como resultado de la disminución del pH tras la acción de la b-lactamasa.
Por tanto, en una realización preferible de este aspecto de la invención, el cambio de pH se mide mediante un método colorimétrico. Más preferiblemente, el método colorimétrico es un método enzimático con rojo fenol.
El tiempo que tarda en cambiar de color el medio va a indicar si el aislado clínico presenta resistencia a piperacilina/tazobactam (<10 minutos) o posible adquisición de resistencia al mismo (entre 11 y 120 minutos).
El método de detección se llevó a cabo tanto a las 6-8 horas como a las 24 horas.
La detección temprana de este mecanismo, en aislados de E. coli resistentes o potencialmente resistentes a piperacilina/tazobactam es fundamental, para poder establecer un tratamiento antibiótico adecuado de las infecciones graves, especialmente durante las primeras 24 horas, momento en el que el uso de piperacilina/tazobactam tiene especial relevancia, evitando así un posible fracaso terapéutico por la presencia de bacterias resistentes.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los aislados bacterianos son del orden Enterobacteriales, preferiblemente de la familia Enterobacteriaceae y aún más preferiblemente de género Escherichia. Aún más preferiblemente son de la especie Escheríchia coli.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los aislados bacterianos son del orden Enterobacteriales, preferiblemente de la familia Enterobacteriaceae y aún más preferiblemente de género Klebsiella. Más preferiblemente son de la especie que se selecciona de la lista que consiste en: Klebsiella aerogenes, Klebsiella africana, Klebsiella granulomatis, Klebsiella grimontii, Klebsiella huaxiensis, Klebsiella kielensis, Klebsiella michiganensis, Klebsiella milletis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pasteurii, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella quasivariicola, Klebsiella senegalensis, Klebsiella spallanzanii, Klebsiella steroids, Klebsiella variicola o cualquiera de sus combinaciones.
En los servicios de Microbiología, es frecuente observar un patrón de resistencia gradual y unidireccional a los BL/IBL en E. coli, que se extiende desde ampicilina/sulbactam hasta piperacilina/tazobactam, pasando por amoxicilina/clavulánico. De esta forma, un aislado de E. coli puede presentar diferentes fenotipos de resistencia: 1) RSS, resistente a ampicilina/sulbactam pero sensible a amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam, 2) RRS, resistente a ampicilina/sulbactam y amoxicilina/clavulánico pero sensible a piperacilina/tazobactam, y 3) RRR, resistente a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam. Se ha demostrado la capacidad que tiene E. coli para adquirir resistencia a las tres combinaciones de antibióticos (RRR) a partir de aislados que presentan un bajo nivel de resistencia a los mismos (fenotipo RSS o RRS). Estos resultados han permitido describir un nuevo fenómeno en E. coll·. el desarrollo de resistencia de espectro extendido a los BL/IBL (REEI).
La detección temprana de este mecanismo, en aislados de E. coli resistentes o potencialmente resistentes a piperacilina/tazobactam es fundamental, para poder establecer un tratamiento antibiótico adecuado de las infecciones graves, especialmente durante las primeras 24 horas, momento en el que el uso de piperacilina/tazobactam tiene especial relevancia, evitando así un posible fracaso terapéutico por la presencia de bacterias resistentes. MÉTODO PARA DETECTAR RESISTENACIAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
La combinación de b-lactámicos con inhibidores de b-lactamasa (BL/IBL) representa la principal estrategia para combatir la resistencia bacteriana frente a estos antibióticos. El uso de estos antibióticos permite hacer frente a las infecciones urinarias, intraabdominales y del torrente sanguíneo provocadas por Escheríchia coli. Sin embargo, el uso excesivo e indiscriminado de estos BL/IBL (ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam) ha producido la aparición de variantes resistentes. Actualmente, no existen métodos disponibles en la práctica clínica que identifiquen rápidamente aislados resistentes y/o que puedan desarrollar una posible resistencia a los BL/IBL, causando en muchas ocasiones el fracaso terapéutico. Por ello, el objetivo de este trabajo es desarrollar y validar un método capaz de detectar cepas de E. coli resistentes a piperacilina/tazobactam y cepas que pueden a desarrollar una resistencia a las tres combinaciones de BL/IBL “resistencia de espectro extendido a los BL/IBL” (REEI). Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la eficacia y sensibilidad del método de detección desarrollado, mostrando un gran potencial en su posible aplicación clínica, lo que provocaría una reducción en costes innecesarios, tratamientos inefectivos y el uso inadecuado de los BL/IBL.
En los servicios de Microbiología, es frecuente observar un patrón de resistencia gradual y unidireccional a los BL/IBL en E. coli, que se extiende desde ampicilina/sulbactam hasta piperacilina/tazobactam, pasando por amoxicilina/clavulánico. De esta forma, un aislado de E. coli puede presentar diferentes fenotipos de resistencia: 1) RSS, resistente a ampicilina/sulbactam pero sensible a amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam, 2) RRS, resistente a ampicilina/sulbactam y amoxicilina/clavulánico pero sensible a piperacilina/tazobactam, y 3) RRR, resistente a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam. En un estudio realizado en el grupo de Enfermedades Infecciosas en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (I BiS), se ha demostrado la capacidad que tiene E. coli para adquirir resistencia a las tres combinaciones de antibióticos (RRR) a partir de aislados que presentan un bajo nivel de resistencia a los mismos (fenotipo RSS o RRS). Estos resultados han permitido describir un nuevo fenómeno en E. coii\ el desarrollo de REEI.
La relevancia clínica de este fenómeno hace que sea de especial importancia la identificación temprana de aislados clínicos tanto resistentes a piperacilina/tazobactam, en los que el tratamiento empírico con este antibiótico no sería apropiado, como aquellos sensibles a piperacilina/tazobactam, pero que puedan desarrollar una REEI, en los que el tratamiento con piperacilina/tazobactam podría llevar a un posible fracaso terapéutico por adquisición de resistencia al mismo. Sin embargo, actualmente no se dispone de ningún método que pueda detectar rápidamente si un aislado clínico de E. coli es resistente a piperacilina/tazobactam y/o puede desarrollar una REEI.
1) la resistencia a piperacilina/tazobactam mediada por b-lactamasas conlleva también una resistencia a ampicilina/sulbactam y
2) el desarrollo de una REEI siempre comienza por una resistencia a ampicilina/sulbactam, lo que nos permite detectar hidrólisis del antibiótico, aunque el aislado sea sensible a piperacilina/tazobactam, evitando así falsos negativos.
Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para determinar la capacidad de desarrollo de resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos (REEI), de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende inducir un proceso de presión antibiótica en aquellos aislados que presenten un bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS y RRS), identificados por el primer método de la invención.
Preferiblemente el segundo método de la invención comprende: a) inocular concentraciones subinhibitorias de piperacilina/tazobactam (ratio 8:1), correspondientes a concentraciones una dilución por debajo de la concentración mínima inhibitoria (CMI) en los aislados que presenten un bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS y RRS), identificados por el método según las reivindicaciones 1-10, b) repetir el proceso hasta alcanzar la concentración de 256/32 mg/L de piperacilina/tazobactam, o hasta la concentración que no permitía el crecimiento bacteriano, y c) cultivar los aislados clínicos presionados en cada una de las concentraciones de piperacilina/tazobactam para su determinación posterior.
Las b-lactamasas de espectro extendido (BLEE), también llamadas b-lactamasas de espectro ampliado (BLEA), son enzimas producidas por bacilos gramnegativos fundamentalmente enterobacterias, con más frecuencia por E. coli y Klebsiella pneumoniae. Son capaces de inactivar además de a las penicilinas y a las cefalosporinas de primera y segunda generación, a las oximino-cefalosporinas y al aztreonam. El primer aislamiento tuvo lugar en Alemania en 1983 a partir de una cepa de K. Ozaenae recibiendo el nombre de SHV-2. En España la primera se describió en 1988. Las BLEE «clásicas» derivan de las b-lactamasas de amplio espectro del grupo 2b (TEM-1 , TEM-2, y SHV-1) de la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros; poseen actividad penicilinasa y pueden ser inhibidas por el ácido clavulánico.
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un Kit o dispositivo para identificar aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b- lactamasa, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende medios para la detección de los protones que se desprenden del anillo b-lactámico.
Preferiblemente el o dispositivo de la invención comprende medios para identificar el pH del medio, y aún más preferiblemente son medios col orí métricos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención los reactivos colorimétricos se seleccionan de entre rojo fenol, azul de bromotimol y más preferiblemente es rojo fenol.
AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN IMPLEMENTÁNDOLO EN UN PROGRAMA DE ORDENADOR
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa y que se haya adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible; por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Otros aspectos de la invención se refieren al medio de almacenamiento legible y a la señal transmisible que comprende instrucciones de programa necesarias para la ejecución del método de invención por un ordenador.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 <223> blaTEM Forward SEQ ID NO: 2 <223> blaTEM Reverse SEQ ID NO: 3
<223> blaOXA-1 Forward SEQ ID NO: 4 <223> blaOXA-1 Reverse SEQ ID NO: 5 <223> blaSHV Forward
SEQ ID NO: 6
<223> blaSHV Reverse EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislados clínicos
Para la realización de este estudio, se utilizaron 1 15 aislados clínicos de Escherichia coli obtenidos a partir de muestras de sangre y muestras intraabdominales de pacientes con bacteriemia o infección intraabdominal ingresados en el Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla (Tabla 1 -3). Para todos los experimentos se utilizó como referencia la cepa de colección E. coli ATCC 25922.
Ensayos de sensibilidad antimicrobiana
Previamente a este trabajo, se determinaron los perfiles de resistencia a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam mediante el método de microdilución en caldo a través del sistema semi-automatizado MicroScan Walk Away NM44 panels (Beckman Coulter, Inc., USA) (Tabla 1 -3). La selección de los aislados clínicos de E. coli para este estudio se realizó teniendo en cuenta estos perfiles de resistencia a los BL/IBL (SSS, RSS, RRS, RRR). Posteriormente se confirmó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de estos aislados a piperacilina/tazobactam mediante el método estándar de microdilución en caldo Mueller Hinton Broth (MHB) (Sigma-Aldrich, Spain), recomendado por el Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) (CLSI 2015, 2019). La combinación piperacilina/tazobactam se utilizó en un ratio de 8: 1 en lugar de una concentración de tazobactam fija a 4 mg/L (como recomienda el CLSI). Esta modificación se ha hecho en base a que este cociente permite obtener una relación entre piperacilina y tazobactam más similar a la alcanzada en el cuerpo humano tras una dosis de piperacilina/tazobactam. Para realizar las diluciones se utilizaron placas Microtiter con pocilios en fondo“U” y se realizaron diluciones seriadas con concentraciones de piperacilina/tazobactam comprendidas entre 0, 125/0,015- 512/64 mg/L. Los inóculos bacterianos se prepararon a partir de suspensiones a 0,5 en la escala de McFarland (1x108 unidades formadoras de colonia (UFC)/mL), y realizando diluciones hasta obtener una concentración final en la placa de 5x105 UFC/mL. Posteriormente, la placa se incubó a 37°C durante 18-20 horas y se procedió a la lectura de la misma. La sensibilidad de los aislados clínicos se realizó en los aislados originales (aisladas del paciente y sin haber sido sometidas a presión antibiótica con piperacilina/tazobactam) y, posteriormente, en estos mismos aislados presionados con concentraciones crecientes de piperacilina/tazobactam (ver sección Presión Antibiótica).
Método de detección de resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos en combinación con inhibidores de b-lactamasas (REEI)
Se realizó un diseño basado en un ensayo colorimétrico. El fundamento de este test está basado en la capacidad de poner de manifiesto la hidrólisis del anillo b-lactámico por parte de la betalactamasa. Esta hidrólisis produce la acidificación del medio, la cual puede ser detectada mediante la adición de un indicador de pH, como el rojo fenol.
Para el desarrollo del método de detección, se inocularon los aislados clínicos a testar en diferentes frascos de hemocultivos (BACTECTM Standard/1 OAerobic/F y BACTECTM Lytic/10Anerobic/F, Becton Dickinson, Estados Unidos) a una concentración de 1x106 UFC/mL, y se incubaron a 37°C con agitación a 180 rpm durante 6-8 y 24 horas. Transcurridos estos tiempos, se procedió al procesamiento de las muestras y la validación del método de detección. Para ello, se cogieron 2 ml_ de suspensión bacteriana crecida en el hemocultivo, se pasaron a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 10.000 rpm durante 2 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 1 ml_ de suero fisiológico. De nuevo, la muestra se centrifugó a 10.000 rpm durante 2 minutos y se eliminó el sobrenadante. Después, el pellet se resuspendió en 100 mI_ de buffer de lisis B-PER II ( Bacterial Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Pasado este tiempo se procedió a centrifugar nuevamente la muestra a 10.000 rpm durante 2 minutos. Posteriormente, en una placa multipocillo de fondo plano, se añadieron 30 mI_ del sobrenadante a una solución de 195 mI_ compuesta por 190 pi¬ de ampicilina (3 mg/ml_) + sulbactam (4 pg/mL) + 5 pL de rojo fenol al 0,5% v/v. Finalmente, la placa se incubó a 37°C durante 120 minutos, con lectura cada 10 minutos (Figura 1 ). Para interpretar los resultados, se consideró como resultado positivo aquellas muestras con el mínimo cambio de color con respecto al control negativo.
Cabe destacar que, aunque el test está diseñado para detectar tanto la resistencia a piperacilina/tazobactam como el posible desarrollo de una REEI, el antibiótico utilizado en el mismo es ampicilina/sulbactam en lugar de piperacilina/tazobactam. Esto es debido a dos motivos: 1) la resistencia a piperacilina/tazobactammediada por b-lactamasas conlleva también una resistencia a ampicilina/sulbactam y 2) el desarrollo de una REEI siempre comienza por una resistencia a ampicilina/sulbactam, lo que nos permite detectar hidrólisis del antibiótico, aunque el aislado sea sensible a piperacilina/tazobactam, evitando así falsos negativos.
Presión antibiótica
Con el objetivo de determinar la capacidad de desarrollo de REEI en aquellos aislados con bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS y RRS) en los que el test ha resultado positivo, se procedió a aplicar el método de presión antibiótica. Para iniciar el proceso de presión antibiótica y asegurar un crecimiento adecuado, se utilizaron las concentraciones sub inhibitorias de piperacilina/tazobactam (ratio 8: 1), correspondientes a concentraciones una dilución por debajo de la CMI. Para ello, se inocularon los diferentes aislados en tubos Falcon, que contenían 10 ml_ de MHB (Sigma-Aldrich, España) y piperacilina/tazobactama la concentración adecuada, con una suspensión bacteriana ajustada a 1x105 UFC/mL. Posteriormente se incubaron a 37°C con agitación a 180 rpm durante 18-20 h. Transcurrido este tiempo, en los cultivos con crecimiento positivo se volvió a repetir la inoculación con 1x105 UFC/mL de suspensión bacteriana en medio con una concentración 2 veces mayor de P/T. Este proceso se repitió hasta alcanzar la concentración de 256/32 mg/L de P/T, o hasta la concentración que no permitía el crecimiento bacteriano. En cada una de las concentraciones de P/T, los aislados clínicos presionados se cultivaron en placas de agar sangre (Thermo Fisher Diagnostics, España) a 37°C para realizar determinaciones posteriores (p. ej.: CMIs).
Extracción de ADN, PCR, purificación, secuenciación y ensamblaje
Para determinar posibles mecanismos de resistencia antibiótica presentes en los aislados bacterianos de este estudio, se determinó la presencia de los genes que codifican las b- lactamasas más comunes (ó/aTEM, ó/aoxA-i y blasm) en los aislados analizados. Para ello, los genes codificantes de estas b-lactamasas fueron caracterizados utilizando cebadores específicos para bla EM (Forward: 5’-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG, Reverse: 5’-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA), blaox A-i (Forward: 5’-GGA TAA AAC CCC CAA AGG AA-3’, Reverse: 5’-TGC ACC AGT TTT CCC ATA CA-3’), y ó/aS v (Forward: 5’-GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC, Reverse: 5’-TTA GCG TTG CCA GTG CTC). En primer lugar, se realizó la extracción de ADN bacteriano con una suspensión de varias colonias frescas de la bacteria en un tubo Eppendorf en agua Milli-Q a 96°C durante 10 minutos. A continuación, se preparó la reacción de PCR que contenía 10 pL de tampón de PCR, 2,5 pL de cada cebador, 0,5 pL de polimerasa MyTaq y 29,5 pL de agua Milli-Q. Se añadieron 5 pL del sobrenadante del ADN extraído a la reacción de PCR, con un volumen final de 50 pL. Se utilizó un termociclador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) con el siguiente programa para la amplificación de los respectivos genes: un ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95°C, seguido por 35 ciclos de amplificación de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 58°C para bla Eu, 46°C para b/aoxA-i y 62°C para blasm, y 1 minuto y 15 segundos a 72°C, y un ciclo de extensión final de 7 minutos a 72°C. Se realizó una comprobación de la amplificación del gen mediante electroforesis en gel de agarosa (1 %) y la visualización de la banda generada con un tamaño correspondiente al gen de estudio. Para la secuenciación del gen, se purificaron los productos de PCR utilizando E.Z.N.A. Gel extraction kit 02500-02 (OMEGA bio.tek, Estados Unidos). Las secuencias se analizaron en el servicio de genómica y secuenciación del Instituto de Biomedicina de Sevilla equipado con el secuenciador Sanger ABI3500 Genetic 121 Analyzer (Applied Biosystems, Foster, VA, Estados Unidos). Las secuencias se analizaron utilizando el software SnapGene® Viewer 2.7.2 y los servicios de Internet de BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Validación del método de detección
Los parámetros estadísticos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo fueron utilizados en la determinación de la validez del método de detección desarrollado y puesto a punto en este trabajo.
La sensibilidad se define como: Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos).
La especificidad se define como: Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos)
El valor predictivo positivo (VPP) se define como: Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Positivos) El valor predictivo negativo (VPN) se define como: Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Negativos)
RESULTADOS Sensibilidad antimicrobiana en los aislados clínicos de Escheríchia coli
Los perfiles de resistencia de los aislados clínicos que se han utilizado en este estudio fueron previamente analizados (Tabla 1-3). Estos resultados permitieron seleccionar 115 E. coli con diferentes perfiles de resistencia para desarrollar y validar el método de detección de estudio. La evaluación de la sensibilidad a piperacilina/tazobactam por el método de microdilución en caldo, confirmó el perfil de resistencia de la mayoría de aislados clínicos de E. coli a este antibiótico. Sesenta y siete aislados de E. coli (58,3%) mostraron sensibilidad a piperacilina/tazobactam, según los puntos de corte establecidos por el CLSI (CLSI, 2019). Por el contrario, 41 aislados de E. coli (35,7%) presentaron resistencia a piperacilina/tazobactam, con CMIs ³128 mg/L. El resto de aislados (6,1%) presentaron un perfil intermedio. Aunque en la mayoría de los casos los resultados obtenidos por E-test y/o Microscan, en el servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen del Rocío, y microdilución en caldo, en el Instituto de Biomedicina de Sevilla, fueron los mismos, se observaron algunas excepciones que a continuación se van a detallar. C2-169 con un perfil de resistencia RRR tuvo una CMI de 64 mg/L (Tabla 1). Las cepas C1-8 y C1-102 con una CMI de 4 mg/L tenían un perfil RRR (Tabla 2). Finalmente, las cepas C1-136 (RRS) y C1-166 (RSS) con una CMI >512 mg/L, y C1-189 (RSS) con una CMI de 128 mg/L (Tabla 3). En todos los aislados con resultados discordantes entre ambos métodos, se realizaron réplicas biológicas para confirmar los valores de CMIs, obteniendo los mismos resultados. En el primer caso, la cepa C2-169 muestra una CMI próxima al punto de corte, lo que podría explicar su perfil intermedio- resistente (CLSI, 2019). En el resto de cepas, las diferencias se podrían deber a problemas técnicos en el desarrollo de E-test. Tabla 1. Aislados clínicos de Escherichia coli con resultado negativo para el test de detección (N=24)
Perfil de CMI Mecanismo de Test Tiempo Test Tiempo „ Nueva CMI
Aislado Origen
resistencia* (mg/L) resistencia (6-8h) (min) (24 h) (min) Pres,on (mg/L)
Cl-74 Sangre RRS 16 NEG >120 >120 32
Cl-83 Sangre RRS 8 NEG >120 >120 8
Cl-90 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 2
Cl-95 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 8
Cl-97 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 16
Cl-100 Sangre SSS 2-4 NEG >120 >120 4
Cl-110 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-111 Sangre SSS 2-4 NEG >120 >120 16
Cl-128 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 8
Cl-138 Sangre RSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-144 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-146 Sangre SSS 2-4 NEG >120 >120 4
Cl-152 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-155 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-157 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 2
Cl-168 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
Cl-169 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 2
Cl-172 Sangre SSS 2 NEG >120 >120 2
Cl-177 Sangre SSS 4 NEG >120 >120 4
C2-4 Bilis SSS 2 NEG >120 >120 2
C2-8 Bilis SSS 8 NEG >120 >120 8
C2-12 Bilis RRS 4 NEG >120 >120 4
C2-169 Bilis RRR (64) 64 NEG >120 >120 64
ATCC25922 ATCC SSS 2 NEG >120 >120 2
* SSS: Sensible a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
RSS: Resistente a ampicilina/sulbactamy sensible a amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
RRS: Resistente a ampicilina/sulbactamy amoxicilina/clavulánicoy sensible a piperacilina/tazobactam
RRR: Resistente a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánicoy piperacilina/tazobactam
- Resultado negativo (test de detección o presión)
+Resultado positivo (test de detección o presión)
NEG: resultado negativo en relación a los mecanismos de resistencia estudiados (TEM, OXA-1 , SHV)
r·'-
.55
1
!c c ro
E
c
E
c o ro
<D
O
C
oo
O Tabla 2. Aislados clínicos de Escheríchia coli con resultado positivo para el test de detección, sensibles a piperacilina/tazobactam y que desarrollan resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos con inhibidores de b-lactamasas (N=47).
Perfil de CMI Mecanismo de Test Tiempo Test Tiempo „ Nueva CMI
Aislado Origen Presión
resistencia* (mg/L) resistencia (6-8 h) (min) (24 h) (min) (mg/L)
Cl-8 Sangre RRR 4 NEG + 25 + 60 + 256
Cl-31 Sangre RRS 8 TEM-40/SHV + 25 + 60 + 64
Cl-38 Sangre RRS 16 TEM-35 + 1 + 1 + 256
Cl-48 Sangre RRS 4 TEM-1 + 20 + 30 + 128
Cl-65 Sangre RRS 8 TEM-l/SHV + 60 + 60 + 512
Cl-72 Sangre RRS 16 TEM-1 + 30 + 60 + 512
Cl-81 Sangre RRS 16 TEM-30 + 2 + 1 + 512
Cl-82 Sangre RRS 32 TEM-1 + 10 + 10 + 512
Cl-91 Sangre RSS 1 NEG + 40 + 20 + 256
Cl-93 Sangre RSS 2 SHV + 20 + 10 + 512
Cl-94 Sangre RRS 32 TEM-1 + 15 + 10 + 256
Cl-99 Sangre RSS 8 TEM-1 v/SHV + 40 + 30 + >512
Cl-102 Sangre RRR 4 TEM + 1 + 2 + 32
Cl-103 Sangre RSS 8 TEM + 40 + 100 + 512
Cl-106 Sangre RSS 8 TEM-1 + 40 + 25 + 512
Cl-108 Sangre RSS 2 TEM 512
Cl-118 Sangre RRS 16 NEG
Figure imgf000021_0001
256
Cl-120 Sangre RSS 8 TEM-1
Figure imgf000021_0002
>512
Cl-121 Sangre RSS 8 TEM-lv/SHV
Figure imgf000021_0003
256
Cl-126 Sangre RSS 8 TEM-1
Figure imgf000021_0004
512
Cl-129 Sangre RSS 16 TEM
Figure imgf000021_0005
256
Cl-130 Sangre RSS 8 TEM-lv
Figure imgf000021_0006
256
Cl-137 Sangre RSS 8 TEM-1
Figure imgf000021_0007
>512
Cl-139 Sangre RSS 8 TEM-1
Figure imgf000021_0008
>512
Cl-141 Sangre RSS 4 TEM-l/SHV
Figure imgf000021_0009
>512
Cl-142 Sangre RRS 4 TEM-135/SHV
Figure imgf000021_0010
512
Cl-143 Sangre RSS 8 TEM-1
Figure imgf000021_0011
>512
Cl-153 Sangre RSS 8 TEM-l/SHV
Figure imgf000021_0012
>512
Cl-159 Sangre RSS 2 TEM-1
Figure imgf000021_0013
100 +
Figure imgf000021_0014
512
Cl-160 Sangre RSS 4 TEM-1
Figure imgf000021_0015
512
Cl-161 Sangre RSS 16 TEM-1
Figure imgf000021_0016
100 +
Figure imgf000021_0017
>512
Cl-162 Sangre RSS 4 NEG
Figure imgf000021_0018
512
Cl-164 Sangre RSS 8 TEM-lv
Figure imgf000021_0019
512
Cl-170 Sangre RSS 4 TEM-1
Figure imgf000021_0020
Cl-171 Sangre RSS 8 NEG >120 + 40 + 512
Cl-174 Sangre sss 2 TEM + >120 + 120 + >512
Cl-175 Sangre RSS 16 TEM-1 + 30 + 60 + 512
Cl-183 Sangre RSS 8 TEM-1 + 30 + 40 + 512
Cl-187 Sangre RSS 2 TEM-1 + 100 + 40 + >256
Cl-190 Sangre RSS 16 SHV >120 + 120 + 512
Cl-191 Sangre RSS 8 TEM-1 + 60 + 100 + 256
Cl-306 Sangre RSS 16 TEM-l/SHV + 30 + 30 + 128
C2-14 Bilis RRS 8 TEM-1 + 10 + 10 + 512
Absceso
C2-47 RSS 8 TEM-1 + 20 + 30 + 512 intraabdominal
C2-49 Líquido peritoneal RSS 8 TEM-1 + 15 + 30 + 512
C2-54 Intraabdominal RRS 8 TEM-1 + 15 + 30 + 256
PT3 Sangre RSS 8 TEM-l/SHV + 30 + 50 + 256 (PT4)
* SSS: Sensible a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
RSS: Resistente a ampicilina/sulbactamy sensible a amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
RRS: Resistente a ampicilina/sulbactamy amoxicilina/clavulánicoy sensible a piperacilina/tazobactam
RRR: Resistente a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánicoy piperacilina/tazobactam
- Resultado negativo (test de detección o presión)
+Resultado positivo (test de detección o presión)
NEG: resultado negativo en relación a los mecanismos de resistencia estudiados (TEM, OXA-1 , SHV)
CMI: concentración mínima inhibitoria
Tabla 3. Aislados clínicos de Escherichia coli que son positivos para el test de detección, resistentes a piperacilina/tazobactam (N=45)
Perfil de CMI Mecanismo Test Tiempo Test Tiempo
Aislado Origen
resistencia* (mg/L) de resistencia (6-8 h) (min) (24 h) (min)
Cl-23 Sangre RRR >256 TEM-1 + 2 + 10
Cl-109 Sangre RRR >256 SHV + 2 + 2
Cl-116 Sangre RRR 256 TEM-1 v + 5 + 4
Cl-136 Sangre RRS >512 TEM + 20 + 25
Cl-166 Sangre RSS >512 TEM-1 + 100 + 30
Cl-189 Sangre RSS 128 TEM + 10 + 10
Cl-239 Sangre RRR >256 TEM-1 + 2 + 2
Cl-436 Sangre RRR >256 TEM-1 + 3 + 3
C2-23 Bilis RRR >256 TEM-1 + 10 + 10
C2-45 Líquido peritoneal RRR 256 TEM-1 /SHV + 10 + 60
C2-48 Absceso intraabdominal RRR >256 TEM-1 /SHV + 2 + 10
C2-57 Bilis RRR >256 NEG + 2 + 10
C2-72 Absceso intraabdominal RRR >256 TEM-1 + 20 + 4
C2-74 Líquido peritoneal RRR 256 TEM + 5 + 3
C2-82 Absceso hepático RRR >256 TEM-1 /SHV + 3 + 3
C2-90 Líquido peritoneal RRR 256 TEM-1 + 4 + 2
C2-95 Líquido peritoneal RRR 64 TEM-l/SHV + 15 + 15
C2-103 Líquido peritoneal RRR 256 TEM-1 + 2 + 3
C2-106 Líquido peritoneal RRR 128 OXA-l/SHV + 30 + 25
C2-113 Absceso intraabdominal RRR 256 TEM-1 + 2 + 3
C2-116 Absceso intraabdominal RRR 256 TEM-1 + 2 + 3
C2-117 Líquido peritoneal RRR 128 TEM-12 + 5 + 3
C2-136 Líquido peritoneal RRR 128 TEM-l/SHV + 5 + 1
C2-146 Líquido peritoneal RRR >256 TEM-1 + 1 + 1
C2-147 Absceso intraabdominal RRR >256 TEM-1 + 3 + 1
PT4 Sangre RRR 256 TEM-l/SHV + 10 + 15
PTR1 Sangre RRR 64 OXA-1 + 10 + 5
PTR2 Sangre RRR 256 TEM-1 + 10 + 1
PTR3 Sangre RRR 256 NEG + 10 + 1
PTR4 Sangre RRR >256 NEG + 3 + 1
PTR5 Sangre RRR >256 TEM-1 + 3 + 1
PTR7 Sangre RRR 256 SHV + 15 + 1
PTR8 Sangre RRR 128 OXA-1 + 30 + 2
PTR9 Sangre RRR 128 TEM-l/OXA-1 + 3 + 5
PTR10 Sangre RRR >256 SHV + 1 + 1
PTR11 Sangre RRR 128 TEM-1 + 3 + 1
PTR12 Sangre RRR 256 NEG + 3 + 1
PTR13 Sangre RRR 256 TEM-1 + 3 + 10
PTR14 Sangre RRR 32 SHV + 50 + 40
PTR15 Sangre RRR 128 OXA-1 + 10 + 10
PTR16 Sangre RRR 128 TEM-1 + 15 + 15
PTR17 Sangre RRR >256 TEM-l/OXA-1 + 10 + 3
PTR18 Sangre RRR 128 TEM-1 + 10 + 10
PTR19 Sangre RRR 64 OXA-1 + 10 + 10
PTR20 Sangre RRR >256 TEM/SHV + 10 + 3
RSS: Resistente a ampicilina/sulbactam y sensible a amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
RRS: Resistente a ampicilina/sulbactam y amoxicilina/clavulánico y sensible a piperacilina/tazobactam
RRR: Resistente a ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico y piperacilina/tazobactam
NEG: resultado negativo en relación a los mecanismos de resistencia estudiados (TEM, OXA-1 , SHV)
Figure imgf000027_0001
Método de detección de resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos en combinación con inhibidores de b-lactamasas (REEI)
La principal finalidad del método de detección de REEI es la identificación de aislados de E. coli capaces de hidrolizar el anillo b-lactámico del antibiótico, llevada a cabo por la enzima b-lactamasa. Para ello, se realizó un ensayo enzimático colorimétrico utilizando el rojo fenol. El rojo fenol es un indicador de pH que vira a tonalidades naranjas y amarillas cuando el medio se acidifica. Por lo tanto, la presencia de una enzima b- lactamasa, hidroliza el anillo b-lactámico del antibiótico, se desprenden protones que acidifican el medio, y se puede visualizar un cambio de color a tonalidades amarillas. Por el contrario, si no hay enzima, el medio se mantiene con el mismo pH y no cambia de color (tonalidad rojo-rosa).
El método de detección se llevó a cabo tanto a las 6-8 horas como a las 24 horas. Se eligieron estos tiempos con la finalidad de comprobar su eficacia en el lapso de tiempo en el que un hemocultivo de un paciente con bacteriemia por E. coli puede resultar positivo, lo que permite una mayor relevancia en la futura aplicación clínica. En las Tablas 1 -3 se pueden observar los resultados de todos los aislados clínicos en los dos tiempos de medida. Las tablas agrupan de manera muy precisa las cepas de E. coli en base a los resultados del método de detección de REEI. La Tabla 1 muestra los aislados con resultados negativos para el test en ambos tiempos. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores, ya que estos aislados son sensibles a piperacilina/tazobactam. En estos aislados no se ha detectado la presencia de las b- lactamasas (TEM, OXA-1 o SHV) que confieren resistencia a piperacilina/tazobactam, por lo que no se hidroliza el anillo b-lactámico durante el método de detección y el color no vira de rosa a tonalidades naranjas-amarillas. Por el contrario, los aislados clínicos de la Tabla 2 y 3 mostraron resultados positivos para el ensayo. En la Tabla 2 los aislados son sensibles a piperacilina/tazobactam pero presentan un fenotipo de bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS o RRS) y con la presencia de TEM, OXA-1 o SHV, excepto para las cepas C1-8, C1-91 , C1-93, C1-1 18, C1-162 y C1-171. Este comportamiento podría traducirse en el desarrollo de una REEI. En la Tabla 3 los aislados tienen perfil resistente y las enzimas b-lactamasas (TEM y SHV) están presentes, excepto en las cepas C2-57, PTR3, PTR4 y PTR12. Estos resultados nos indican que este método permite identificar y distinguir aislados con o sin resistencia a piperacilina/tazobactam (también a ampicilina/sulbactam y amoxicilina/clavulánico). Entre los dos grupos con resultados positivos para el test (Tabla 2 y 3) se observaron diferencias en los tiempos de positividad del test o cambio de color. Los aislados sensibles a piperacilina/tazobactam, pero capaces de desarrollar una REEI (Tabla 2) tuvieron un tiempo de detección por encima de los 10 minutos, mientras que en los aislados resistentes a piperacilina/tazobactam (Tabla 3) este tiempo de positividad fue mayoritariamente en los primeros 10 minutos (Figura 2).
Capacidad de desarrollar REEI en aislados clínicos de Escheríchia coli sensibles a piperacilina/tazobactamP
Los aislados clínicos sensibles a piperacilina/tazobactam (Tabla 1 -2), fueron presionados a concentraciones crecientes de piperacilina/tazobactam (hasta 256/32 mg/L) para determinar su capacidad de desarrollar una REEI. De esta manera, se ha comprobado la eficacia del método con respecto a las cepas sensibles con un resultado positivo en el test de detección.
En la Tabla 1 se muestran los 23 aislados clínicos que no adquirieron resistencia al ser presionados con piperacilina/tazobactam y cuyo resultado del test fue negativo. Las CMIs originales y obtenidas después de presionar con piperacilina/tazobactam no fueron significativamente diferentes. En la Tabla 2 se muestra los 47 aislados clínicos que desarrollaron una REEI al ser presionados con piperacilina/tazobactam. En este caso, las nuevas CMIs aumentaron entre 8-256 veces con respecto a la CMI original, con resultados >512 mg/L (a excepción de C1-102 y C1-31). Los aislados resistentes no fueron presionados (Tabla 3). Por lo tanto, los resultados obtenidos en este apartado afianzan la validez del método de detección, ya que además de identificar resistencia a piperacilina/tazobactam, puede detectar posible desarrollo de REEI.
Mecanismos de resistencia a BL/IBL
Uno de los principales mecanismos relacionados con la resistencia a los BL/IBL es la producción de b-lactamasas. Entre estas enzimas, se encuentran especialmente las de tipo TEM (gen ISTEM), pero también se pueden observar las de tipo OXA-1 (gen b/aoxA- 1) y SHV (gen ó/asHv). Por ello, en todas las cepas de estudio se comprobó mediante PCR específica si contenían o no estos genes (Tabla 1 -3). Los productos de PCR (o amplificaciones) que fueron positivas, fueron secuenciadas para determinar específicamente el tipo de enzima (p. ej. : TEM-1). Los aislados que presentaron algún mecanismo de resistencia, mostraron concordancia con los resultados obtenidos en todos los ensayos anteriores (CMIs, test de detección, presión adquirida). En las cepas sensibles (Tabla 1) no se detectó la presencia de ninguna de las b-lactamasas de estudio. Por ello, estas cepas son sensibles a piperacilina/tazobactam a además no pueden desarrollar una REEI. En el resto de cepas sí que se observó la existencia de una o varias b-lactamasas (Tabla 2 y 3). Del total de cepas analizadas en las que se detectó alguna betalactamasa, el 86,7% presentaba betalactamasas de tipo TEM, el 27,7% de tipo SHV y el 8,4% de tipo SHV. Las b-lactamasas predominantes fueron los de tipo TEM, especialmente TEM-1 en 58 aislados clínicos. Las enzimas tipo OXA-1 solo se encontraron en el grupo de aislados resistentes (Tabla 3).
Validación del método
Todos los aislados resistentes a piperacilina/tazobactam fueron detectados mediante el ensayo de estudio, sin obtener falsos positivos ni falsos negativos. La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo del método resultó del 100% (Tabla 4). El test también fue capaz de detectar cepas sensibles que podían desarrollar REEI. En este caso, también se obtuvieron valores del 100% en todos los parámetros estadísticos, excepto cuando el test se realizó a las 6-8 horas y se obtuvo una sensibilidad del 96% y un valor predictivo negativo del 93% (Tabla 5).
Tabla 4. Validez del test en la detección de resistencia a piperacilina/tazobactam (N=68) Test Sensibilidad Especificidad VPP VPN
6-8 horas 100% 100% 100% 100%
24 horas 100% 100% 100% 100%
VPP: valor predictivo positivo VPN: valor predictivo negativo Tabla 5. Validez del test en la detección de REEI (N=70)
Test Sensibilidad Especificidad VPP VPN 6-8 horas 96% 100% 100% 93%
24 horas 100% 100% 100% 100%
VPP: valor predictivo positivo
VPN: valor predictivo negativo

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un método de identificación de aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, capaces de hidrolizarel anillo b-lactámico de una combinación de un antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b- lactamasa (BL/IBL), que comprende la detección de los protones que se desprenden del anillo b-lactámico.
2.- El método según la reivindicación anterior donde la combinación BL/IBL se selecciona de la lista que consiste en: ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulánico, piperacilina/tazobactam, o cualquiera e sus combinaciones.
3.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la combinación BL/IBL es piperacilina/tazobactam.
4 - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la detección se realiza en un hemocultivo o en un líquido corporal, preferiblemente un líquido corporal inoculado en frascos de hemocultivo.
5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la detección de los protones se realiza mediante un indicador de cambio de pH.
6.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el cambio de pH se mide mediante un método colorimétrico.
7.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el método colorimétrico es un método enzimático con rojo fenol.
8.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el método de detección se llevó a cabo tanto a las 6-8 horas como a las 24 horas de hemoculivo.
9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los aislados bacterianos son del orden Enterobacteriales, preferiblemente de la familia
Enterobacteriaceae y aún más preferiblemente de género Escherichia.
10.- El método según la reivindicación anterior, donde los aislados bacterianos son de la especie Escherichia coii.
11.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los aislados bacterianos son del orden Enterobacteriales, preferiblemente de la familia Enterobacteriaceae y aún más preferiblemente de género Klebsiella.
11.- Un método para determinar la capacidad de desarrollo de resistencia de espectro extendido a los b-lactámicos (REEI) que comprende inducir un proceso de presión antibiótica en aquellos aislados que presenten un bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS y RRS), identificados por el método según las reivindicaciones 1-11.
12.- El método de determinación la capacidad de desarrollo de REEI según la reivindicación anterior, que comprende: a) inocular concentraciones subinhibitorias de piperacilina/tazobactam (ratio 8:1), correspondientes a concentraciones una dilución por debajo de la CMI en los aislados que presenten un bajo nivel de resistencia a BL/IBL (RSS y RRS), identificados por el método según las reivindicaciones 1-11 , b) repetir el proceso hasta alcanzar la concentración de 256/32 mg/L de piperacilina/tazobactam, o hasta la concentración que no permitía el crecimiento bacteriano, y c) cultivar los aislados clínicos presionados en cada una de las concentraciones e piperacilina/tazobactam para su determinación posterior.
13.- Un Kit o dispositivo para identificar aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa que comprende medios para la detección de los protones que se desprenden del anillo b- lactámico.
14.- El Kit o dispositivo para identificar aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa según la reivindicación anterior, que comprende medios para identificar el pH del medio.
15.- El Kit o dispositivo para identificar aislados bacterianos resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde los medios para identificar el pH del medio son reactivos colorimétricos que se seleccionan de entre rojo fenol y azul de bromotimol,
16.- El Kit o dispositivo según la reivindicación anterior donde el reactivo colorimétrico es rojo fenol.
PCT/ES2020/070406 2019-06-21 2020-06-22 Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos WO2020254711A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201930573 2019-06-21
ESP201930573 2019-06-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020254711A1 true WO2020254711A1 (es) 2020-12-24

Family

ID=74037333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2020/070406 WO2020254711A1 (es) 2019-06-21 2020-06-22 Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2020254711A1 (es)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832055A (zh) * 2021-09-13 2021-12-24 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 Klebsiella grimontii菌及其发酵水产品制备蛋白饮料的应用
CN116064296A (zh) * 2022-09-14 2023-05-05 广西大学 一株硝磺草酮降解菌Klebsiella pasteurii CM-1及应用
CN116064296B (zh) * 2022-09-14 2024-05-28 广西大学 一株硝磺草酮降解菌Klebsiella pasteurii CM-1及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015193501A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Université Catholique de Louvain Method for detecting enzyme activity hydrolyzing beta-lactam ring antimicrobial agents
US20180105862A1 (en) * 2015-04-03 2018-04-19 Universite De Bourgogne Novel method for detecting the presence of beta-lactamase-producing bacteria

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015193501A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Université Catholique de Louvain Method for detecting enzyme activity hydrolyzing beta-lactam ring antimicrobial agents
US20180105862A1 (en) * 2015-04-03 2018-04-19 Universite De Bourgogne Novel method for detecting the presence of beta-lactamase-producing bacteria

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUMAR M S ET AL.: "Molecular identification of multi drug resistant bacteria from urinary tract infected urine samples", MICROBIAL PATHOGENESIS, vol. 98, New York, Ny, pages 37 - 44, XP029705107, ISSN: 0882-4010, DOI: 10.1016/j.micpath. 2016.06.02 9 *
PASTERAN F ET AL.: "Simplified protocol for Carba NP test for enhanced detection of carbapenemase producers directly from bacterial cultures", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 53, no. 12, 1 December 2015 (2015-12-01), Usa, pages 3908 - 3911, XP055773723, ISSN: 0095-1137, DOI: 10.1128/JCM.02032-15 pubmed:26424841 *
RODRIGUEZ VILLODRES, A: "Bacteriemias por Escherichia coli: Analisis clmico-epidemiologico, de factores de patogenicidad y mecanismos de resistencia a betalactamicos/inhibidores de betalactamasas", TESIS DOCTORAL, 15 November 2019 (2019-11-15), Universidad de Sevilla, pages 1 - 209, XP055773722, Retrieved from the Internet <URL:https://idus.us.es/handle/11441/93377> *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832055A (zh) * 2021-09-13 2021-12-24 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 Klebsiella grimontii菌及其发酵水产品制备蛋白饮料的应用
CN116064296A (zh) * 2022-09-14 2023-05-05 广西大学 一株硝磺草酮降解菌Klebsiella pasteurii CM-1及应用
CN116064296B (zh) * 2022-09-14 2024-05-28 广西大学 一株硝磺草酮降解菌Klebsiella pasteurii CM-1及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gohel et al. Bacteriological profile and drug resistance patterns of blood culture isolates in a tertiary care nephrourology teaching institute
Fam et al. CTX-M-15-producing Escherichia coli clinical isolates in Cairo (Egypt), including isolates of clonal complex ST10 and clones ST131, ST73, and ST405 in both community and hospital settings
Dortet et al. Rapid detection of ESBL-producing Enterobacteriaceae in blood cultures
Isgren et al. Emergence of carriage of CTX-M-15 in faecal Escherichia coli in horses at an equine hospital in the UK; increasing prevalence over a decade (2008–2017)
Dashti et al. The characterization and antibiotic resistance profiles of clinical Escherichia coli O25b-B2-ST131 isolates in Kuwait
Zarifi et al. Prevalence of ESBLs in Acinetobacter baumannii isolated from intensive care unit (ICU) of Ghaem hospital, Mashhad, Iran
Elmowalid et al. Molecular detection of new SHV β-lactamase variants in clinical Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from Egypt
WO2020254711A1 (es) Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos
Cheng et al. Genomic analysis of Delftia tsuruhatensis strain TR1180 isolated from a patient from China with In4-like integron-associated antimicrobial resistance
Elsharawy et al. Phenotypic and Genotypic Characterization of Antimicrobial Resistance in Escherichia coli Isolates from Chicken Meat
Farizqi et al. Detection of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli genes isolated from cat rectal swabs at Surabaya Veterinary Hospital, Indonesia
Yusuf et al. Phenotypic occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in camels slaughtered at Kano abattoir, Kano, Nigeria
Liu et al. Colistin resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from snakes in Taiwan
Franolić et al. NDM-1-producing Enterobacter aerogenes isolated from a patient with a JJ ureteric stent in situ
Arafa et al. Determination of extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolated from horses with respiratory manifestation
Adeleke et al. Multiple-Antibiotic resistance and presence of CTX-M genes among enterobacteriaceae isolates from different sources in Iwo, Osun State, Nigeria
Muhammad Mustapha et al. Isolation of uropathogenic Escherichia coli from dogs and molecular detection of chloramphenicol resistance genes.
Gajamer et al. Detection of antibiotic resistance pattern with ESBL producers and MRSA among the uropathogens at Tertiary Health Care Centre, North Bengal
Do Toka et al. Antibiotic susceptibility pattern in clinical isolates of pseudomonas aeruginosa
Owrang et al. Identification and isolation of insertion sequences, in carbapenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii from Tehran hospitals
Nayak et al. Polymerase chain reaction-based typing methods and protein profiling analysis of Acinetobacter baumannii isolated from environmental and clinical sources from South India
AL-Mahfoodh et al. The molecular study for evaluation the antibiotic resistance of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae bacteria isolated from urinary tract infection patients
Elbehiry et al. Enterobacter cloacae from urinary tract infections: frequency, protein analysis, and antimicrobial resistance
El-Tarabili et al. Prevalence, antibiotic profile, virulence determinants, ESBLs, and non-β-lactam encoding genes of MDR Proteus spp. isolated from infected dogs
Orole Characterization and plasmid profile of resistant klebsiella pneumoniae isolates in patients with urinary tract infection in nasarawa state, Nigeria

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20825907

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20825907

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1