CN1987466A - 微孔板pH传感器的原位制备方法 - Google Patents

微孔板pH传感器的原位制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其步骤是首先将三乙氧基－3－异氰酸丙基硅烷滴入pH敏感试剂的乙醇溶液中，得反应液A；其次是将硅氧烷、酸和水混合，得反应液B；第三是取反应液A、反应液B及氯化钙溶液，按比例混合，得溶液C；第四是取溶液C涂于微孔板的微孔底部，用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔中央刺孔，避光保存。放置一段时间后加蒸馏水于微孔中，保存备用。本方法简便快速，成本低，通用性强，该传感器可用于各种水解反应及与pH变化有关的化学反应的监测。用于β－内酰胺酶抑制剂及β－内酰胺抗生素筛选获得满意结果。

Description

微孔板pH传感器的原位制备方法
技术领域
本发明涉及生物、医学、药学、材料、化学等学科的交叉学科领域。更具体涉及一种微孔板底部pH传感器的制备方法。
背景技术
β-内酰胺类抗生素，如青霉素及链霉素等，是最常用的抗生素。由于在临床治疗及动物饲养等方面的广泛使用，甚至滥用，抗药性问题日益突出，甚至对继续使用抗生素治疗带来严重威胁。抗药性产生的原因是由于细菌产生β-内酰胺酶。随着抗生素的不断使用，新的酶及变种酶不断产生，抗药性问题日趋严重。
β-内酰胺酶(E.C.3.5.2.6)是一类β-内酰胺水解酶，它催化水解β-内酰胺环，酰胺键断裂，生成β-氨基酸。最新研究成果表明，目前已经证实的β-内酰胺酶共有340余种。根据它们氨基酸序列及催化机理的不同，这些酶可分为A，B，C，D4类。
目前常用于酶活性测定的方法主要是紫外-可见分光光度法，由于这种方法灵敏度低，因而采用微孔板进行高通量检测受到限制，劳动强度大，耗时长，影响分析结果。另外，对于米氏常数过大及催化效率过低的酶，由于底物或酶浓度高，严重干扰紫外-可见分光光度分析。米氏常数过小，初始速率测定有困难，也会干扰紫外-可见分光光度分析。
高通量微孔板常用于大量样品的高通量检测，但由于微孔板多为塑料制品，如聚苯乙烯微孔板。聚苯乙烯透光性强、易成型、成本低、经久耐用，发光测定通常采用聚苯乙烯微孔板。但由于聚苯乙烯表面亲水性差，对酶等生物大分子物理吸附强，严重影响分析结果。因此聚苯乙烯微孔板内表面须进行亲水处理。常用的方法有：等离子处理法、光化学氧化、化学氧化及涂层。等离子处理，如离子轰击与植入、电子束辐射等方法均需要特定的设备，成本高；光化学氧化及化学氧化需采用强酸及强氧化剂、紫外线照射等，对环境污染较大。因而微孔板内涂层法成为一种简便、适用的表面改性技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微孔板pH传感器的原位制备方法。采用pH敏感分子与凝胶共价偶联技术，该传感膜性质稳定，对pH变化响应快，亲水性好，灵敏度高，通用性强。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
其步骤如下：
将1-10μL的三乙氧基-3异氰酸丙基硅烷(TESPI)滴入pH敏感试剂5-氨基荧光素(FITC)的乙醇溶液中，TESPI与FITC的摩尔比控制在为1∶1～1∶20范围内，温度在5-50℃，反应1-30小时，得反应液A，所偶联的pH敏感试剂可以是FITC；(2)将硅氧烷、0.01M酸和水按1∶1∶3～10∶1∶3比例混合，超声0.2～2.0小时，得反应液B，硅氧烷为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，酸为盐酸或硫酸或硝酸或磷酸等；(3)取反应液A，反应液B及0.1M氯化钙(CaCl2)溶液，按10∶10∶1～1∶1∶10的比例混合，得溶液C；(4)取溶液C1.-0～50μL于96(384或1856)孔板的微孔中，涂于微孔底部，然后用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔板中央刺一小孔，室温(20-25℃)保存20～120小时后，加适量蒸馏水于微孔中，保存备用。传感器放置一年以上，性能基本不变(见图1～5)。本传感器用于7种商用抗生素筛选及2种细菌酶抑制剂筛选研究，可在半小时内完成。
抗生素药物的筛选：在0.1mL一定浓度的β-内酰胺酶和0.1MNaCl溶液中注入0.1mL的不同抗生素，根据荧光强度的变化，便可判断不同β-内酰胺酶可以水解的抗生素(见表1)。
表1抗生素药物的筛选结果
                                     不同的β-内酰胺酶
 蜡状芽胞杆菌β-内酰胺酶II 蜡状芽胞杆菌β-内酰胺酶   地衣芽胞杆菌β-内酰胺酶 肠杆菌P99β-内酰胺酶
  青霉素G     √     √     √     -
  青霉素V     √     √     √     -
  氨卡青霉素     √     √     √     -
  头孢呋辛     √     -     √     -
  头孢西丁     -     -     -     -
  羟羧氧酰胺菌素     -     -     -     -
  先锋霉素II     √     √     √     √
√：β-内酰胺酶能水解    -：β-内酰胺酶不能水解
β-内酰胺酶抑制剂的筛选：取适量β-内酰胺酶与β-内酰胺酶抑制剂混和溶液0.1mL于微孔中，将微孔板放入微孔板读数仪，再将0.1mL一定浓度的抗生素药物注射到微孔中，记录荧光强度变化曲线，根据该曲线变化即可进行抗生素药物和β-内酰胺酶抑制剂的筛选。(见表2)
表2 β-内酰胺酶抑制剂的筛选结果
           克拉维酸             舒巴坦
β-内酰胺酶   IC50/nM   文献值   IC50/nM   文献值
金黄色葡萄球菌PC1β-内酰胺酶   300±8.0     314   100±7.6     80
蜡状芽胞杆菌β-内酰胺酶   60±6.0     157    80±5.2
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
从pH 7.0变到pH 4.0所需时间约2分钟；荧光强度增大约7倍；(通常的文献方法只能增强2～3倍)。传感器连续使用40天后，荧光强度偏差在10％以内。传感器放置一年以上，性能基本不变。本传感器用于7种商用抗生素筛选及2种细菌酶抑制剂筛选研究，可在半小时内完成。与传统的紫外分光光度法相比，分析速度大大提高，灵敏度可提高10～100倍。此外对于米氏常数较大或较小，因而无法采用紫外可见分光光度法测定的酶、颜色较深的培养液及高背景介质，对本传感器的分析应用无干扰。
附图说明
图1为溶液pH变化对荧光强度的影响
pH4.0，5.0：0.05 M邻苯二甲酸缓冲溶液
pH6.0，7.0，8.0：0.05 M磷酸缓冲溶液
pH9.0：12.5mM硼砂缓冲溶液
图2A、2B为传感器对pH变化的响应特性及可逆性
图2A为0.2mM pH7.0磷酸缓冲溶液平衡后注入0.05M pH4.0邻苯二甲酸缓冲溶液，
图2B为0.05M pH4.0邻苯二甲酸缓冲溶液平衡后注入0.05M pH7.0磷酸缓冲溶液
图3为传感膜的激发及发射光谱
激发波长480nm，发射波长485nm
图4为青霉素浓度变化对荧光强度的影响
0.1mL 2.8×10-7M青霉素酶和0.1M NaCl溶液中注入0.1mL不同浓度的青霉素
图5为不同浓度青霉素酶的反应动力学曲线
0.1mL 2.5nM(a)和5.0nM(b)青霉素酶和0.1M NaCl溶液中注入0.1mL 10mM的青霉素溶液
具体实施方式
一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其步骤为：
(1)将10μL的三乙氧基-3异氰酸丙基硅烷(TESPI)滴入pH敏感试剂5-氨基荧光素(FITC)的乙醇溶液中，TESPI与FITC的摩尔比控制在为1∶14，温度在5或10或15或20或25或28或31或33或36或41或46或50℃，反应1或3或5或10或15或20或24或28或30小时，得反应液A；
(2)将四乙氧基硅烷0.6mL、0.01M盐酸40μL和水0.12mL混合均匀，超声1或1.5或2小时，得反应液B；
(3)取反应液A 0.2mL，反应液B 0.2mL及0.1M氯化钙(CaCl2)溶液1.0mL混合均匀，得溶液C；
(4)取溶液C1.0或5或10或15或20或30或40或50μL于96或384或1856孔板底部涂匀，用密封带将微孔封住，并用针在每个微孔板中央刺一小孔，室温20℃保存20或24或48或72或96或115或120小时后，加0.2mL蒸馏水于微孔中，保存备用。

Claims (5)

1、一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)将1-10μL的三乙氧基-3-异氰酸丙基硅烷滴入pH敏感试剂的乙醇溶液中，摩尔比为1∶1～1∶20，温度在5-50℃，反应1～30小时，得反应液A；
(2)将硅氧烷、0.01M酸和水按1∶1∶3～10∶1∶3比例混合，超声0.2～2小时，得反应液B；
(3)取反应液A、反应液B及0.1M氯化钙溶液，按10∶10∶1～1∶1∶10的比例混合，得溶液C；
(4)取溶液C1.0～50μL于96或384或1856孔板底部，用密封带将将微孔板的微孔封住，并用针在每个微孔中央刺一小孔，室温保存20～120小时后，加蒸馏水于微孔中，保存备用。
2、根据权利要求1所述的一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其特征在于：微孔板为聚苯乙烯微孔板或玻璃微孔板。
3、根据权利要求1所述的一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其特征在于：硅氧烷为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷。
4、根据权利要求1所述的一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其特征在于：酸为盐酸或者是硫酸、硝酸、磷酸。
5、根据权利要求1所述的一种微孔板pH传感器的原位制备方法，其特征在于：所述的pH敏感试剂可以是FITC。
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