ES2907298T3 - Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas - Google Patents

Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas Download PDF

Info

Publication number
ES2907298T3
ES2907298T3 ES16717283T ES16717283T ES2907298T3 ES 2907298 T3 ES2907298 T3 ES 2907298T3 ES 16717283 T ES16717283 T ES 16717283T ES 16717283 T ES16717283 T ES 16717283T ES 2907298 T3 ES2907298 T3 ES 2907298T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
culture medium
beta
medium
sample
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16717283T
Other languages
English (en)
Inventor
Murielle Dequaire-Rochelet
Alain Hartmann
Catherine Neuwirth
Benoit Chantemesse
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre Hospitalier Univ De Dijon
Universite de Bourgogne
Centre Hospitalier Universitaire de Dijon
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre Hospitalier Univ De Dijon
Universite de Bourgogne
Centre Hospitalier Universitaire de Dijon
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Hospitalier Univ De Dijon, Universite de Bourgogne, Centre Hospitalier Universitaire de Dijon, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Centre Hospitalier Univ De Dijon
Application granted granted Critical
Publication of ES2907298T3 publication Critical patent/ES2907298T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
    • C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Método para la determinación in vitro de la presencia de bacterias productoras de betalactamasas, en una muestra que puede contener dichas bacterias, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: (a) incubar dicha muestra en un medio que contiene un sustrato de las betalactamasas, que tiene propiedades electroquímicas, en particular una betalactamina que tiene propiedades electroquímicas, y (b) aplicar un medio de análisis electroquímico para determinar la presencia del sustrato de las betalactamasas después de haber sido hidrolizadas.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas
La presente invención se refiere a un método para detectar, en una muestra o un medio de cultivo, la presencia de bacterias resistentes a las betalactaminas por su capacidad de producir betalactamasas.
Las betalactaminas, que incluyen las penicilinas, las monobactamas, las cefalosporinas y los carbapenems, son antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis del peptidoglicano. Se trata de moléculas frecuentemente utilizadas en el tratamiento de primera línea de las infecciones graves tanto en asistencia ambulatoria como en medicina hospitalaria. Las betalactamasas son enzimas que hidrolizan el núcleo betalactama de las betalactaminas. Este es el mecanismo de resistencia más frecuente a las betalactaminas. Las betalactamasas se clasifican según Ambler (Ambler, R. P. Philos. Trans. R. Soc. London Ser B, 1980, 289, 321-331) en 4 grupos:
A: penicilinasas, incluidas las betalactamasas de espectro extendido, BLEE
B: metaloenzimas
C: cefalosporinasas
D: oxacilinasas
En las enterobacterias, la producción de betalactamasas de espectro extendido (en adelante, BLEE) o de cefalosporinasas hiperproducidas es actualmente el principal mecanismo de resistencia a las cefalosporinas de 3a generación (en lo sucesivo denominadas C3G), tales como la cefotaxima, la ceftriaxona o la ceftazidima, que son las oxiimino-cefalosporinas. La cefepima, que es la única cefalosporina de 4a generación (en lo sucesivo denominada C4G), es, por su parte, hidrolizada por las BLEE pero generalmente no por las cefalosporinasas. Las penicilinas también se hidrolizan, pero los carbapenems, no. La actividad de las BLEE puede inhibirse con ácido clavulánico, tazobactam o sulbactam (inhibidores de las penicilinasas). La cloxacilina puede inhibir la actividad de las cefalosporinasas. Las carbapenemasas (enzimas que pueden pertenecer a las clases A, B y D según Ambler) son enzimas que hidrolizan a los carbapenems, pero también con mayor frecuencia a las penicilinas y a las cefalosporinas.
La detección precisa y rápida de las bacterias resistentes a las cefalosporinas de 3a generación, productoras de BLEE o de cefalosporinasas hiperproducidas, o de carbapenemasas, es crucial para el manejo de los pacientes. Debe conducir a la implementación de un tratamiento antibiótico adecuado. En ausencia de producción de enzimas que hidrolicen las C3G, estos últimos pueden ser utilizados en primera intención, mientras que en caso contrario resulta necesario recurrir a los carbapenems. En este caso, también es necesario determinar si estas bacterias producen carbapenemasas.
Hasta ahora, la técnica clásica utilizada para detectar las bacterias productoras de betalactamasas se basa en la implementación de un antibiograma y en la realización de la prueba de doble sinergia que permite evidenciar la restauración de la sensibilidad a las C3G en presencia del inhibidor de penicilinasas. A pesar de su eficacia, la implementación de esta técnica requiere una etapa previa de cultivo y aislamiento de las bacterias, lo que implica un retraso de al menos 24 horas antes de que sea detectable la producción de betalactamasas.
La presencia de bacterias productoras de betalactamasas también puede demostrarse mediante métodos de biología molecular, por ejemplo detectando mediante PCR y/o secuenciación los genes que codifican para las betalactamasas. Si bien pueden permitir una caracterización específica de los genes que codifican, por ejemplo, las BLEE, estas técnicas de laboratorio son costosas y bastante largas de implementar debido a la extracción previa del ADN de muestras complejas.
Por tanto, existe una urgente necesidad en el campo de la salud de desarrollar un método eficaz, rápido y de bajo coste para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas, con el fin de detectar la presencia de cepas bacterianas resistentes a las betalactaminas.
Nordmann et al. (J. Clin. Microbiol., 2012, 50, 3016-3022) describen un método para detectar bacterias productoras de BLEE que implica el uso de cefotaxima y un indicador de pH coloreado. Este método se basa en que la hidrólisis del núcleo betalactámico de la cefotaxima conduce a la formación de una función ácido carboxílico y por tanto a la acidificación del medio de reacción. El cambio de pH del medio se visualiza gracias al uso de un indicador coloreado.
A pesar de su eficacia y su rapidez, este método requiere primero una etapa restrictiva de aislamiento de las cepas bacterianas.
Otro enfoque colorimétrico consiste en el uso de nitrocefina, una cefalosporina cromogénica, que puede ser hidrolizada por todas las betalactamasas, provocando el cambio de color de amarillo a rojo (O'Callaghan et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1972, 1, 283-288). El esquema 1 a continuación ilustra la hidrólisis del núcleo betalactámico de la nitrocefina por una betalactamasa. Más recientemente, se ha propuesto otra cefalosporina cromogénica llamada HMRZ-86 (Hanaki et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 53, 888-889) para detectar, según el mismo principio, las cepas bacterianas resistentes a las C3G.
Figure imgf000003_0001
Esquema 1
Sin embargo, este método nuevamente requiere el uso de cepas bacterianas previamente aisladas para permitir la detección colorimétrica. Este método no se puede utilizar directamente en muestras complejas que presenten una coloración que pueda interferir con la detección colorimétrica de la hidrólisis de la nitrocefina. Aquí nuevamente, este método impone un retraso de al menos 24 horas entre la toma de una muestra clínica y la entrega del resultado.
En los últimos años también se ha propuesto la técnica de espectrometría de masas por MALDI-TOF para detectar los productos de hidrólisis de las betalactaminas tras la incubación de estos últimos en presencia de cepas productoras de betalactamasas (Hrabák et al., J. Clin. Microbiol. 2011,49, 3222-3227 ; Sparbier et al., J. Clin. Microbio., 2012, 50, 927-937). Sin embargo, esta técnica de laboratorio, que también debe implementarse con cepas previamente aisladas, sigue siendo costosa y requiere personal cualificado para la interpretación de los espectros de masa.
Por otro lado, Gongalves et al. (Electrochemistry Communication 38 (2014) 131-133) presentan un biosensor amperométrico para la detección de la penicilina G mediante la medida amperométrica de la variación del pH del medio ligada a la hidrólisis con penicilinasa de la penicilina G a ácido peniciloico. Como la penicilina G y el ácido peniciloico no son electroactivos, la medida amperométrica se realiza en presencia de cobalto que desempeña el papel de mediador redox.
Chen et al. (Int. J. Electrochem. Sci., 7 (2012) 7948-7959) describen un método de detección electroquímica de la cefalexina tras su hidrólisis obtenida mediante el calentamiento a 70°C de una solución alcalina de cefalexina privada de oxígeno y en la oscuridad. Los productos de la hidrólisis de la cefalexina (escisión del enlace C-C=O del anillo p-lactama) descritos en este documento se produjeron bajo condiciones extremas muy específicas y no se pueden obtener mediante la incubación de cefalexina con una betalactamasa, ya que esta corta el anillo p-lactama en el enlace amida.
Hasta la fecha, el estado de la técnica no describe ningún sustrato de betalactamasa ni ningún producto resultante de la hidrólisis por una betalactamasa que tenga propiedades electroactivas.
Sin embargo, los inventores han descubierto que ciertos sustratos de betalactamasas y/o su producto hidrolizado por una betalactamasa tienen propiedades electroactivas.
En este contexto, el objetivo de la invención es por lo tanto proporcionar un método electroquímico capaz de determinar de forma rápida y eficaz la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en una muestra sin aislar previamente las cepas bacterianas.
La invención se refiere a un método para determinar in vitro la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en una muestra susceptible de contener dichas bacterias, que comprende las siguientes etapas:
(a) incubar dicha muestra en un medio que contiene un sustrato de betalactamasas con propiedades electroquímicas, en particular una betalactamina con propiedades electroquímicas, más particularmente una cefalosporina, como sustrato de las betalactamasas,
(b) aplicar un medio de análisis electroquímico para determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas.
La etapa de determinación de la presencia de bacterias productoras de betalactamasas se realiza por detección electroquímica de la presencia del sustrato de betalactamasa hidrolizado.
La invención se basa en el hecho de que ciertos sustratos de betalactamasas después de haber sido hidrolizados por una betalactamasa pueden detectarse electroquímicamente.
El método de la presente invención se define en la reivindicación 1.
En particular, la hidrólisis por una betalactamasa del núcleo betalactama de una betalactamina puede detectarse electroquímicamente.
En el contexto de la presente invención, una betalactamina que tiene propiedades electroquímicas es principalmente una cefalosporina, más particularmente la nitrocefina o el compuesto HMRZ-86 (isómero E del (6R,7R)-trifluoroacetato del ácido 7-[[2-(2-amino-4-tiazolil)-2-[(1 -carboxi-1 -metiletoxi)imino]acetil]amino]-1 -aza-3-[2-(2,4-dinitrofenil)etenil]-8-oxo-5-tiabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico).
En el contexto de la presente invención, dicho sustrato de betalactamasas que posee propiedades electroquímicas también puede ser el sustrato (reactivo R2) del kit p CARBA™ comercializado por Bio-rad.
La nitrocefina puede ser hidrolizada por todos los tipos de p-lactamasas, mientras que el compuesto HMRZ-86 solo es degradado por bacterias resistentes a las C3G; es decir, productoras de BLEE, de cefalosporinas hiperproducidas y de carbapenemasas. El sustrato (reactivo R2) del kit p CARBA™ es hidrolizado únicamente por bacterias productoras de carbapenemasas.
Los inventores han demostrado por primera vez que las propiedades electroquímicas de determinados sustratos de betalactamasas, en particular de ciertas betalactaminas, tales como la nitrocefina o el compuesto HMRZ-86, son muy distintas de las de estos sustratos hidrolizados. Por ejemplo, la nitrocefina hidrolizada es un producto electroactivo capaz de generar una corriente de oxidación anódica específica y medible por un método electroquímico. La oxidación de la nitrocefina hidrolizada genera una corriente anódica en un intervalo de potenciales diferente de aquel en el que aparece dicha corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina. Por lo tanto, la corriente anódica específica de la nitrocefina hidrolizada se puede utilizar como respuesta analítica que indica la presencia de nitrocefina hidrolizada por una betalactamasa.
A diferencia de los métodos ya desarrollados en la técnica anterior que requieren el cultivo de las bacterias durante un período de al menos 24 horas previamente, el método descrito en la invención hace que sea posible detectar la presencia o ausencia de bacterias productoras de las betalactamasas después de sólo unas pocas horas de incubación de la muestra, en particular de 1 a 4 horas, antes de la realización de la medida electroquímica.
A modo de ejemplo, el tiempo de incubación de una muestra con un medio que contiene nitrocefina es típicamente de 5 a 30 minutos.
Un medio que contiene un sustrato de betalactamasas que tiene propiedades electroquímicas puede ser un medio tamponado al que se añade un sustrato de betalactamasas electroactivo. Dicho medio tamponado puede ser, como ejemplo, un tampón fosfato de pH 7 y de concentración 100mM.
Se entiende por “betalactamasas” una familia de enzimas capaces de hidrolizar el núcleo p-lactama de una p-lactamina. Las penicilinas, las cefalosporinas, las monobactamas y los carbapenems son las cuatro familias de p-lactaminas.
De acuerdo con sus propiedades catalíticas y su afinidad por ciertos sustratos, así como sus sensibilidades a ciertos tipos de inhibidores de las betalactamasas, las principales betalactamasas son los siguientes: las penicilinasas, las cefalosporinasas inducibles, las cefalosporinasas hiperproducidas, las betalactamasas de espectro extendido y las carbapenemasas.
Se entiende por "penicilinasas" las enzimas que hidrolizan las amino-, carboxi- y ureido-penicilinas. Son inhibidas por los inhibidores de las penicilinasas como el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam.
Se entiende por "cefalosporinasas inducibles" las enzimas que hidrolizan las aminopenicilinas y las cefalosporinas a partir de 1a y/o 2a generación. Son insensibles a la acción de los inhibidores de las penicilinasas; sin embargo, son inhibidas por la cloxacilina. La expresión de un gen que codifica una cefalosporinasa puede ser inducida por un inductor, que puede ser en particular una betalactamina.
Se entiende por “cefalosporinasas hiperproducidas” las enzimas que hidrolizan a las aminopenicilinas, las carboxi- y las ureido-penicilinas y las cefalosporinas de 1a, 2a, 3a e incluso 4a generación. Son insensibles a la acción de los inhibidores de las penicilinasas; sin embargo, son inhibidas por la cloxacilina. La expresión de estas enzimas se desreprime y conduce a una producción abundante de estas enzimas.
Se entiende por “betalactamasas de espectro extendido (BLEE)” las enzimas que hidrolizan las amino-, carboxi- y ureido-penicilinas y las cefalosporinas de 1a, 2a, 3a y 4a generación y son susceptibles a la inhibición por inhibidores de la penicilinasa.
Se entiende por "carbapenemasas" las enzimas que tienen una actividad hidrolítica sobre los carbapenems, pero generalmente también sobre las penicilinas y cefalosporinas de 1a, 2a, 3a y 4a generación.
Según la invención, las betalactamasas pueden ser producidas en particular por bacterias Gram-negativas:
i. de la familia de las Enterobacteriacear, especialmente de los géneros Escherichia (en particular Escherichia coli), Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Morganella, Proteus, Providencia, Pantoea, Hafnia, Citrobacter, Salmonella, Shigella y Yersinia.
ii. no termentadoras, en particular Pseudomonas (en particular P. aeruginosa), Stenotrophomonas y Acromobacter.
iii. Acinetobacter(en particular A. baumannii).
En un modo de realización particular, el mencionado método de la invención comprende además, antes de la implementación de la etapa (a), una etapa para concentrar las bacterias presentes en una muestra susceptible de contenerlas. La concentración de las bacterias se puede realizar, por ejemplo, por filtración o centrifugación.
En un modo de realización particular, la etapa (a) del método de la invención mencionado anteriormente se lleva a cabo en un medio que contiene un sustrato de betalactamasas que tiene propiedades electroquímicas, en particular una betalactamina que tiene propiedades electroquímicas, en particular, la nitrocefina, el compuesto HMRZ-86 o el sustrato (reactivo R2) del kit p CARBA™. El experto en la técnica sabrá elegir una concentración adecuada para dicho sustrato.
Según la invención, un medio de análisis electroquímico para poner en práctica la invención puede ser una medida potenciométrica, una medida de impedancia, una medida culombimétrica o una medida amperométrica.
En un modo de realización ventajoso, el análisis electroquímico se implementa mediante una medición amperométrica.
El término "medida amperométrica" significa una medida de la corriente eléctrica en función de una diferencia de potencial establecida entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia.
La medida de la corriente eléctrica se puede realizar mediante técnicas amperométricas conocidas, preferentemente por voltamperometría de barrido de potencial que puede ser lineal, cíclica, pulsada, o bien del tipo de salto de potencial, como la cronoamperometría.
En un modo de realización particularmente ventajoso de la invención, la presencia de un sustrato de betalactamasas hidrolizada se mide por voltamperometría cíclica o lineal.
La puesta en práctica de estas técnicas requiere un montaje que puede tener dos o incluso tres electrodos, es decir un montaje que comprende un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y eventualmente un electrodo auxiliar (contraelectrodo). El electrodo de trabajo, cuya superficie sirve como sitio para la transferencia de electrones, puede ser a base de carbono o a base de un metal noble o incluso a base de un óxido metálico. El electrodo de referencia es un electrodo cuyo potencial es constante, lo que permite imponer un potencial definido con precisión al electrodo de trabajo. El electrodo de referencia puede ser un electrodo de Ag/AgCl. El contraelectrodo, que permite establecer el paso de la corriente eléctrica con el electrodo de trabajo, puede estar fabricado con un material inerte, como platino o carbono. El experto en la técnica sabrá elegir y combinar los electrodos adecuados según sus conocimientos generales.
En cuanto al método de fabricación de los electrodos, es preferible la técnica de serigrafía, aunque se pueden contemplar otros métodos de fabricación industrial como el rotograbado, la impresión por inyección de tinta o eventualmente la fotolitografía. Tales electrodos obtenidos por serigrafía son especialmente adecuados porque pueden fabricarse en masa a bajo coste y, por lo tanto, ser eventualmente de un solo uso. Además, tanto su forma geométrica como su tamaño pueden modularse fácilmente. Estos electrodos pueden ser serigrafiados en la forma de un sensor y opcionalmente integrados en el fondo de los pocillos de una microplaca o de otros soportes o sistemas que permitan la filtración de las suspensiones bacterianas y la incubación con nitrocefina u otro sustrato de las betalactamasas con propiedades electroquímicas .
En un modo de realización particular, la medida amperométrica se implementa con un sensor serigrafiado. Permite realizar la medición en un pequeño volumen de solución del orden de pocos microlitros.
En un modo de realización particular, la medida amperométrica se implementa con un dispositivo que comprende tres electrodos: un electrodo de referencia de Ag/AgCl, un electrodo de trabajo de carbono y un contraelectrodo de carbono.
En otro modo de realización particular, la medida amperométrica se implementa con un sensor serigrafiado que comprende un electrodo de referencia de Ag/AgCl, un electrodo de trabajo de carbono y un contraelectrodo de carbono.
La presencia de un sustrato hidrolizado, por ejemplo nitrocefina hidrolizada, se indica por la presencia de una corriente de oxidación anódica en un intervalo de potenciales y la ausencia de dicha corriente para un control que carece de dicho sustrato hidrolizado.
Cuando un sustrato hidrolizado, en particular una betalactamina hidrolizada, por ejemplo la nitrocefina hidrolizada, se somete a una medición mediante voltamperometría cíclica, su presencia se indica mediante un pico de corriente de oxidación anódica específico del sustrato hidrolizado en un intervalo de potenciales de determinado.
Por ejemplo, cuando la detección se lleva a cabo mediante voltamperometría cíclica usando un electrodo de referencia de Ag/AgCl en un tampón de pH neutro que contiene, por ejemplo, nitrocefina, la intensidad relacionada con la corriente de pico de oxidación anódica que corresponde a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada se mide en un intervalo de potenciales comprendido entre 0,1 V y 0,5 V, en particular entre 0,2 V y 0,4 V, más particularmente entre 0,23 V y 0,33 V.
En particular, cuando la detección se realiza por voltamperometría cíclica en un tampón de fosfato de pH 7 que contiene nitrocefina, la corriente de pico de oxidación anódica ligada a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada es de 0,3 V frente a Ag/AgCl.
Cuando se utiliza otro tipo de electrodo de referencia y/u otro medio de reacción para implementar el método de la invención, el experto en la técnica sabrá calcular o identificar este intervalo de potenciales según sus conocimientos generales.
Dado que la presencia de un sustrato hidrolizado, por ejemplo nitrocefina hidrolizado o el compuesto HMRZ-86 hidrolizado, se detecta por un método electroquímico, el método descrito en la invención demuestra ser particularmente ventajoso para el análisis de muestras de color o turbias sin tratamiento previo, con la posibilidad de ofrecer una medida cuantificada con buena sensibilidad utilizando equipos de bajo coste, pequeño tamaño y eventualmente portátiles.
Una muestra susceptible de ser analizada por el método de la invención puede ser una muestra biológica, una muestra de origen ambiental o una muestra alimentaria.
Una muestra biológica puede ser en particular una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de tejido o una muestra de pulmón.
Una muestra de origen ambiental pueden ser las aguas residuales, las aguas residuales hospitalarias, las aguas residuales tratadas o los lodos del tratamiento de aguas residuales, así como los residuos de los reactores de metanización húmedos o secos (digestatos).
Una muestra de alimentos pueden ser los productos y subproductos de origen animal y más particularmente de origen aviar como las aves de corral, susceptibles de contener bacterias resistentes a las betalactamasas.
En particular, el método de la invención comprende las etapas siguientes:
(a) incubar una muestra que pueda contener dichas bacterias en un medio que contenga un sustrato de betalactamasas, en particular una betalactamina, que tengan propiedades electroquímicas,
(b) aplicar una medida amperométrica respectivamente al medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a) y a un control negativo,
(c) determinar la presencia de las bacterias productoras de betalactamasas comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica que corresponde a la oxidación del sustrato hidrolizado, en particular de la betalactamina hidrolizada, medido para el medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a), con el valor de la intensidad de la corriente anódica medida para el control negativo.
De acuerdo con la invención, un control negativo es un medio que contiene dicho sustrato en ausencia de muestra.
Más particularmente, el método de la invención comprende las siguientes etapas:
(a) incubar una muestra que pueda contener dichas bacterias en un medio que contiene nitrocefina,
(b) aplicar una medida amperométrica respectivamente al medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a) y a un control negativo,
(c) determinar la presencia de las bacterias productoras de beta-lactamasas comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica que corresponde a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada medido para el medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a), con el valor de la intensidad de la corriente anódica medida para el control negativo.
Una medida amperométrica aplicada a dicho control negativo permite indicar cualquier corriente que no esté ligada a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada.
Durante una medida amperométrica, la presencia de nitrocefina hidrolizada está indicada por la aparición o el aumento de una corriente anódica en un determinado intervalo de potenciales con respecto a la corriente anódica del control medida en el mismo intervalo.
Además, el método descrito en la presente invención ofrece la posibilidad de cuantificar las bacterias productoras de betalactamasas en una muestra.
En efecto, la intensidad de la corriente anódica producida por la oxidación de un sustrato hidrolizado, en particular de nitrocefina hidrolizada, es cuantitativamente proporcional a la cantidad de nitrocefina hidrolizada. Cuando la cantidad de sustrato está en exceso, la cantidad de sustrato hidrolizado también es proporcional a la cantidad de betalactamasas involucradas en la hidrólisis de dicho sustrato, así como a la cantidad de bacterias productoras de estas enzimas. En consecuencia, la comparación del valor de la intensidad de la corriente anódica específica para el sustrato hidrolizado con un valor de referencia, leído en una curva de calibración, permite determinar la cantidad de bacterias productoras de betalactamasas.
Un modo de realización particular de la invención permite tanto determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en una muestra susceptible de contenerlas como cuantificarlas.
En este modo de realización, el método comprende además, después de determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas, una etapa que consiste en comparar el valor de la intensidad de la corriente anódica medido para dicho medio obtenido al final de la etapa (a) con una curva de calibración establecida en las mismas condiciones.
Dicha curva de calibración se establece diluyendo en serie una muestra de referencia que contiene una cantidad conocida de bacterias productoras de betalactamasas y previamente determinada por cualquier método convencional, como por ejemplo el recuento en medio de cultivo o PCR en tiempo real.
En un modo de realización particular, la invención se refiere a un método que permite la determinación y cuantificación de las bacterias productoras de betalactamasas en una muestra susceptible de contener dichas bacterias, comprendiendo dicho método:
(a) incubar una muestra que puede contener dichas bacterias en un medio que contenga un sustrato de betalactamasas, en particular una betalactamina, que tenga propiedades electroquímicas,
(b) aplicar una medida amperométrica respectivamente al medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a) y a un control negativo,
(c) determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica que corresponde a la oxidación del sustrato hidrolizado, en particular de la betalactamina hidrolizada, medida para el medio mencionado anteriormente obtenido al final de la etapa (a), con el valor de la intensidad de la corriente anódica medido para el control negativo;
(d) comparar el valor de la intensidad de la corriente anódica medido para dicho medio obtenido al final de la etapa (a) con una curva de calibración establecida en las mismas condiciones para cuantificar dichas bacterias.
Dependiendo de la especificidad de los sustratos que tienen propiedades electroquímicas, el método de la invención se puede implementar para determinar específicamente in vitro la presencia de bacterias productoras de uno o más tipos de betalactamasas.
En un modo de realización particular, el método de la invención permite determinar y cuantificar in vitro la presencia de bacterias resistentes a una cefalosporina de 3a generación, usando dicho método en la etapa (a) una betalactamina hidrolizada solo por las beta-lactamasas de espectro extendido, las cefalosporinasas hiperproducidas y las carbapenemasas, en particular el compuesto HMRZ-86 (isómero E del (6R,7R)-trifluoroacetato del ácido 7-[[2-(2-amino-4-tiazolil)-2-[(1-carboxi-1-metiletoxi)imino]acetil]amino]-1-aza-3-[2-(2,4-dinitrofenil)etenil]-8-oxo-5-tiabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico)
En otro modo de realización particular, el método de la invención permite determinar y cuantificar in vitro la presencia de bacterias productoras de carbapenemasas, implementando dicho método en la etapa (a) un sustrato hidrolizado únicamente por las carbapenemasas, en particular el sustrato (reactivo R2) del kit p CARBA™ comercializado por Bio-rad.
En otro modo de realización particular, por medio de la nitrocefina y al menos otra betalactamina y al menos un inhibidor de una betalactamasa, el método de la invención también hace que sea posible discriminar el tipo de betalactamasas producidas por las bacterias mencionadas anteriormente en una muestra susceptible de contenerlas.
En efecto, los inventores han encontrado que, en una serie de medios de cultivo que contienen, respectivamente, un sustrato específico y, eventualmente, un inhibidor específico para un tipo de betalactamasa, las bacterias que producen los diferentes tipos de betalactamasas pueden dar respectivamente un perfil específico en términos de intensidades de la corriente anódica para la nitrocefina hidrolizada durante la implementación de una medida amperométrica.
Una de las ventajas de este modo de realización es que permite la discriminación de las betalactamasas en matrices complejas y coloreadas sin aislamiento previo de las bacterias.
Más particularmente, un método de la invención hace que sea posible además discriminar el tipo de betalactamasas elegidos entre las penicilinasas, las betalactamasas de espectro extendido, las cefalosporinasas inducibles, las cefalosporinasas hiperproducidas y las carbapenemasas, producidas por las bacterias mencionadas anteriormente en una muestra susceptible de contenerlas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar una fracción de la muestra mencionada anteriormente en paralelo en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B y un medio de cultivo C:
o siendo el medio de cultivo A un medio de cultivo de base,
o siendo el medio de cultivo B un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina de 3a generación, y
o siendo el medio de cultivo C un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina y un inhibidor de penicilinasas, y
opcionalmente en un medio de cultivo B', un medio de cultivo C', un medio de cultivo D y un medio de cultivo E:
o siendo el medio de cultivo B' un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina de 3a generación diferente a la presente en el medio B;
o siendo el medio de cultivo C' el medio de cultivo B' suplementado con un inhibidor de las penicilinasas;
o siendo el medio de cultivo D un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina y un inhibidor de las cefalosporinasas, y
o siendo el medio de cultivo E un medio de cultivo de base suplementado con un carbapenem, (b) incubar en paralelo dichos medios de cultivo obtenidos al final de la incubación del paso (a) en un medio que contiene nitrocefina;
(c) aplicar un medio amperométrico a dichos medios obtenidos al final de la etapa (b) para determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas y discriminar el tipo de betalactamasas.
De acuerdo con la invención, un medio de cultivo de base puede ser cualquier tipo de medio de cultivo usado convencionalmente para incubar bacterias, tales como el medio LB (caldo de Luria Bertani), TSB (caldo de triptona soja) o BHI (infusión de corazón cerebro).
En un modo de realización particular, antes de la implementación de la etapa (b) y después de la etapa (a), el método de la invención anteriormente mencionado comprende además una etapa para la concentración de las bacterias presentes en los medios de cultivo con el fin de dar una respuesta catalítica más significativa. La concentración de las bacterias se puede realizar, por ejemplo, por filtración o por centrifugación.
De acuerdo con la invención, dicha cefalosporina de 3a generación se selecciona entre la cefotaxima, la ceftazidima y la ceftriaxona; dicho carbapenem se selecciona entre el ertapemem, el imipenem o el meropenem.
De acuerdo con la invención, dicho inhibidor de las penicilinasas se elige en particular entre el ácido clavulánico, el tazobactam o el sulbactam; dicho inhibidor de las cefalosporinasas es en particular la cloxacilina.
El medio de cultivo B o B' permite inhibir el crecimiento de las bacterias productoras de penicilinasas o de cefalosporinasas inducibles.
El medio de cultivo C o C' permite inhibir el crecimiento de las bacterias productoras de una penicilinasa o una betalactamasa de espectro extendido. En un modo de realización particular, un medio de cultivo C es un medio de cultivo B suplementado con un inhibidor de penicilinasas.
El medio de cultivo D permite inhibir el crecimiento de las bacterias productoras de una cefalosporinasa inducible o hiperproducida.
El medio de cultivo E permite inhibir el crecimiento de las bacterias productoras de cualquier betalactamasa excepto una carbapenemasa.
El uso de los medios B, B', C y C' permite discriminar las bacterias productoras de BLEE sensibles a una cefalosporina de 3a generación, por ejemplo la cefotaxima, pero resistentes a otra cefalosporina de 3a generación por ejemplo la ceftazidima, o viceversa.
Después de la incubación respectiva de las fracciones de la misma muestra en los medios de cultivo A, B, C, y, opcionalmente, los medios de cultivo B 'C', D y E, se diferencian las betalactamasas producidas por las bacterias resultantes de estas fracciones. La presente invención permite indicar esta diferencia mediante un método amperométrico que indica la cantidad de nitrocefina hidrolizada por estas betalactamasas por los valores de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada.
Los valores de ía, íb, íb’, íc, íc’, íd e íe son los valores de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada respectivamente medida para las bacterias resultantes de los medios de cultivo A, B, B', C, C', D y E.
En el contexto del método de la invención, una penicilinasa se caracteriza por la presencia de corrientes específicas para la nitrocefina hidrolizada obtenidas por las bacterias resultantes de un medio A, un medio B y, opcionalmente, un medio B', y la ausencia de corriente específica para las bacterias resultantes a partir de un medio C y opcionalmente de un medio C'. el valor ía puede ser menor o mayor que el valor de íb y eventualmente de íb'.
Una BLEE se caracteriza por una alta intensidad de la corriente anódica específica para la nitrocefina hidrolizada obtenida para las bacterias resultantes, respectivamente, de un medio A, un medio B y, eventualmente, un medio de B' y la ausencia de esta corriente específica para bacterias procedentes de un medio de C y eventualmente de un medio C'. Los valores íb y eventualmente íb' están cerca del valor ía .
Una cefalosporinasa inducible se caracteriza por una corriente anódica específica de la nitrocefina hidrolizada obtenida para las bacterias procedentes de los medios A, B y eventualmente B', C y eventualmente C', con ía <íb <íc y eventualmente ía < íb' < íc', y la ausencia de esta corriente específica para bacterias procedentes de un medio D.
Una cefalosporinasa hiperproducida se caracteriza por una gran intensidad de la corriente anódica específica de la nitrocefina hidrolizada obtenida para las bacterias procedentes de un medio A, la presencia de esta corriente específica para las bacterias procedentes, respectivamente, de un medio B y de un medio de C, eventualmente de un medio B' y de un medio C', siendo íb > íc y eventualmente íb' > íc, y la ausencia de esta corriente específica para bacterias procedentes de un medio D.
Una carbapenemasa se caracteriza por la presencia de una corriente anódica específica de la nitrocefina hidrolizada obtenida para bacterias procedentes de los medios A, B y eventualmente B', C y eventualmente C', D y E.
En un modo de realización más particular, la invención se refiere a un método para determinar la presencia de bacterias productoras de una betalactamasa de espectro extendido, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar una fracción de la muestra mencionada anteriormente en paralelo en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B y un medio de cultivo C como se ha definido anteriormente,
(b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar un medio amperométrico a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) para determinar la presencia de bacterias productoras de una betalactamasa de espectro extendido.
En otro modo de realización más particular, la invención se refiere a un método para determinar la presencia de bacterias productoras de una betalactamasa de espectro extendido, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar una fracción de la muestra mencionada anteriormente en paralelo en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo B', un medio de cultivo C y un medio de cultivo C', como se han definido anteriormente,
(b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar un medio amperométrico a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) para determinar la presencia de bacterias productoras de una betalactamasa de espectro extendido.
El uso de los medios B, B', C y C' permite discriminar bacterias productoras de BLEE sensibles a una cefalosporina de 3a generación pero resistente a otra cefalosporina de 3a |.
En un modo de realización particular, el medio de cultivo B es el medio de cultivo A suplementado con cefotaxima; el medio de cultivo B' es el medio de cultivo A suplementado con ceftazidima; el medio de cultivo C es el medio de cultivo B suplementado con un inhibidor de penicilinasa; el medio de cultivo C' es el medio de cultivo B' suplementado con un inhibidor de penicilinasa.
En otro modo de realización particular, el medio de cultivo B es el medio de cultivo A suplementado con ceftazidima; el medio de cultivo B' es el medio de cultivo A suplementado con cefotaxima; el medio de cultivo C es el medio de cultivo B suplementado con un inhibidor de penicilinasa; el medio de cultivo C' es el medio de cultivo B' suplementado con un inhibidor de penicilinasa.
El uso de estos medios en el contexto de la invención permite discriminar entre las bacterias productoras de BLEE que son bien sensibles a la cefotaxima pero resistentes a la ceftazidima o bien resistentes a la cefotaxima pero sensibles a la ceftazidima.
Ventajosamente, dicho método para determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas y discriminar el tipo de betalactamasas comprende las siguientes etapas:
(a) incubar una fracción de la muestra mencionada anteriormente en paralelo en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo B', un medio de cultivo C y un medio de cultivo C':
o siendo el medio de cultivo A un medio de cultivo de base,
o siendo el medio de cultivo B y el medio de cultivo B' medios de cultivo de base suplementados respectivamente con una cefalosporina de 3a generación diferente,
o siendo el medio de cultivo C y el medio de cultivo C' respectivamente los medios de cultivo B y B' suplementados con un inhibidor de penicilinasa,
y eventualmente en un medio de cultivo D y un medio de cultivo E:
o siendo el medio de cultivo D un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina y un inhibidor de cefalosporinasa, y
o siendo el medio de cultivo E un medio de cultivo de base suplementado con un carbapenem, (b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina;
(c) aplicar un medio amperométrico a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) para determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas y discriminar el tipo de betalactamasas.
Según otro modo de realización más particular, el método de la invención permite determinar y discriminar las bacterias productoras de betalactamasas en una muestra susceptible de contenerlas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar paralelamente una fracción de la muestra mencionada anteriormente en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo C, un medio de cultivo D, un medio de cultivo E, eventualmente un medio B 'y un medio C', como se han definido previamente,
(b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar una medida amperométrica respectivamente a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) y a un control negativo,
(d) determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en dicha muestra mediante la comparación del valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada obtenido para la fracción cultivada en el medio de cultivo A con el valor de la intensidad de la corriente obtenida para el control negativo, y
(e) discriminar el tipo de betalactamasas producidas por las bacterias mencionadas anteriormente en dicha muestra, comparando los valores respectivos de la intensidad de la corriente anódica mencionada anteriormente obtenidos para las fracciones cultivadas en paralelo en los medios de cultivo A, B, C, D y E, eventualmente B 'y C', con los valores respectivos obtenidos para una cepa bacteriana de referencia.
El término "cepa bacteriana de referencia" significa una cepa bacteriana que produce una betalactamasa cuyo tipo ya ha sido identificado.
En un modo de realización aún más particular, el método de la invención comprende además una etapa (f) después de la etapa (e) que permite cuantificar bacterias productoras de la betalactamasa discriminada en la etapa (e) por comparación del valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la nitrocefina hidrolizada por dicha betalactamasa con una curva de calibración establecida en las mismas condiciones.
El valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la nitrocefina hidrolizada por una betalactamasa de espectro extendido se calcula según la fórmula: íb-íc .
El valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la nitrocefina hidrolizada por una cefalosporinasa hiperproducida se calcula según la fórmula: íb-íd.
El valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la nitrocefina hidrolizada por una carbapenemasa corresponde al valor iE.
Más ventajosamente, el método de la invención puede incluso discriminar las bacterias que producen una subfamilia de betalactamasa, utilizando un medio adicional que contiene un sustrato y un inhibidor específico de una subfamilia de betalactamasa.
El método de la invención puede, en particular, discriminar las bacterias productoras de una subfamilia de carbapenemasa, utilizando un medio adicional que contiene un carbapenem y un inhibidor específico de una subfamilia de carbapenemasa.
La discriminación se basa en la sensibilidad específica de una subfamilia de carbapenemasas a ciertos tipos de inhibidores. Por ejemplo, las metalo-betalactamasas, una subfamilia de carbapenemasas perteneciente a la clase B según Ambler, son sensibles al EDTA o al ácido mercaptoacético, mientras que las carbapenemasas de clase A según la clasificación Ambler son sensibles al ácido clavulánico y al ácido borónico.
De acuerdo con la invención, un inhibidor de carbapenemasas se elige entre el EDTA, el ácido mercaptoacético, el ácido borónico o el ácido clavulánico.
En otro modo de realización ventajoso, el método de la invención permite discriminar el tipo de betalactamasas y, eventualmente, precisar la subfamilia de carbapenemasas producidas por las bacterias mencionadas anteriormente en una muestra susceptible de contenerlas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar en paralelo una fracción de la muestra mencionada anteriormente:
o en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B y un medio de cultivo C, tal como se han definido anteriormente, y
o eventualmente en un medio de cultivo B', un medio de cultivo C', un medio de cultivo D, un medio de cultivo E y un medio de cultivo F, la siendo los medios de cultivo B', C', D y E tal como se han definido previamente, siendo el medio de cultivo F un medio de cultivo de base suplementado con un carbapenem y un inhibidor específico de una subfamilia de carbapenemasas;
(b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar un medio de análisis electroquímico a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) para determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas y discriminar el tipo de betalactamasas.
El medio de cultivo F permite inhibir el crecimiento de las bacterias que producen un tipo de carbapenemasa que es sensible al inhibidor mencionado anteriormente específico para una subfamilia de carbapenemasa: el EDTA y el ácido mercaptoacético son inhibidores de específicos de la clase B, mientras que el ácido borónico y el ácido clavulánico son inhibidores específicos de la clase A.
En un modo de realización particularmente ventajoso, el método de la invención para discriminar el tipo de betalactamasas y eventualmente precisar la subfamilia de carbapenemasas producidas por dichas bacterias comprende las siguientes etapas:
(a) incubar una fracción de la muestra mencionada anteriormente en paralelo en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo C, un medio de cultivo D, un medio de cultivo E y un medio de cultivo F, tales como se han definido anteriormente, y eventualmente un medio de cultivo B' y un medio de cultivo C', tales como se han definido anteriormente,
(b) incubar en paralelo los medios de cultivo mencionados anteriormente obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar una medida amperométrica respectivamente a los medios mencionados anteriormente obtenidos al final de la etapa (b) y a un control negativo,
(d) determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en la muestra mencionada anteriormente mediante la comparación del valor de la intensidad de la corriente anódica que corresponde a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada obtenido para la fracción cultivada en el medio de cultivo A con el valor de la intensidad de la corriente obtenida para el control negativo,
(e) discriminar el tipo de betalactamasas producidas por las bacterias mencionadas anteriormente en dicha muestra, comparando los valores respectivos de la intensidad de la corriente anódica mencionada anteriormente obtenidos para las fracciones cultivadas en paralelo en los medios de cultivo A, B, C, D, e y F, y, eventualmente, los medios de cultivo B' y C', con los valores respectivos obtenidos para una cepa bacteriana de referencia.
El método de la presente invención puede utilizarse durante el desarrollo de nuevos antibióticos de la familia de las plactaminas, en particular para estudiar la estabilidad de la molécula frente a diferentes betalactamasas.
La presente invención se ilustra con más detalle mediante las figuras y los ejemplos siguientes.
Figuras
Figura 1: Voltamogramas cíclicos (v = 50 mV-s-1) obtenidos para una solución de nitrocefina 500pM en PBS en ausencia (línea discontinua) y en presencia de BLEE (línea continua) después de 10 min de incubación.
Figura 2: Curva de calibración (log-log) de una BLEE cuyas cantidades se determinan por el método de voltamperometría cíclica según la invención (A, □) y por el método espectrofotométrico (B, O). Las respuestas analíticas se registran después de 10 min de incubación de las BLEE con una solución de nitrocefina 500pM preparada en PBS. Los medios de reacción se diluyen 5 veces en PBS antes de realizar la medida espectrofotométrica. El valor R corresponde a las respuestas de corriente o a las densidades ópticas, respectivamente normalizadas con los valores obtenidos en ausencia de BLEE (iü = 50±5 nA; DO0 = 0,097±0,008). La desviación estándar representa el error estándar de las dos medidas.
Figura 3: Curvas voltamétricas (v = 50 mV-s-1) registradas con un sensor serigrafiado para las cepas de E. co liBLEE+ (A) y BLEE-(B), cultivadas a 37°C durante 4 horas 30 min en un medio de cultivo que contenía 4 pg-mL-1 de cefotaxima tras centrifugación (1 mL; 7.000g; 10 min) e incubación del sedimento durante 10 min con 50 pL de una solución 500gM de nitrocefina en PBS.
Figura 4: Voltamogramas cíclicos (v = 50 mV-s-1) registrados con un sensor serigrafiado para la cepa de E. co liBLEE+ cultivada en un medio de cultivo que contiene solo 4 pg-mL-1 de cefotaxima (A) o suplementado con 10 pg-mL-1 de clavulanato de potasio, luego centrifugada (1 mL; 7.000g; 10 min) antes de una etapa de incubación del sedimento con 50 pL en una solución de nitrocefina 500pM en PBS durante 10 min.
Figura 5: Curva de calibración de la cepa BLEE después de incubación a 37°C durante 3 horas 30 min en un medio de cultivo LB suplementado con 4 pg-mL-1 de cefotaxima. A continuación, el cultivo bacteriano se diluye en serie y se filtran volúmenes de 10 mL por duplicado. Las bacterias recuperadas tras la filtración se incuban durante 10 min con 80 pL de la solución de nitrocefina 500pM en PBS. El eje de abscisas corresponde al número de bacterias recuperadas después de la filtración. Las barras de error representan la desviación estándar de dos experimentos. El cuadrado abierto (□) representa el control negativo que consiste en la cepa BLEE+ cultivada con 4 pg-mL-1 de cefotaxima y 10 pg-mL-1 de ácido clavulánico. El círculo abierto (O) corresponde a la señal de nitrocefina no hidrolizada.
Figura 6: Curvas de calibración de una cepa de E. coli productora de BLEE realizadas en tres muestras de agua residual sin tratar (■) y tres muestras de agua tratada previamente esterilizada en autoclave (□). El valor de i(nA) corresponde a la corriente del pico de oxidación de nitrocefina hidrolizada registrado para una cantidad de bacterias de la cual se restó la medida para el control negativo.
Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F: Perfiles de las corrientes de oxidación (pA) de la nitrocefina hidrolizada registrados para diferentes tipos de betalactamasas y utilizados para discriminar las betalactamasas en muestras médicas (hemocultivos, cepas aisladas).
Figura 8: Voltamogramas cíclicos (v = 50 m Vs-1) registrados para seis cultivos líquidos (V = 50 pL) que contenía, respectivamente, una cepa no productora de betalactamasa (K12), una cepa productora de cefalosporinasa inducible, una cepa productora de penicilinasa, una cepa productora de BLEE, una cepa productora de cefalosporinasa hiperproducida, un -cepa productora de carbapenemasa, después de la incubación con 50 pL de HMRZ-86 (0,5mM en PBS) durante 30 min.
Figura 9: Curvas de calibración realizadas con dos cepas de E. coli productoras de BLEE (tipo CTX-M15) representadas respectivamente por los símbolos ■ y • en una muestra de agua residual esterilizada en autoclave. El valor de i(nA) corresponde a la corriente pico de oxidación del HMRZ-86 de la cual se ha restado la medida para el control negativo con un valor promedio de 235±15 nA (A).
Figuras 10A, 10B, 10vs, 10D: Cada figura representa los voltamogramas cíclicos (v = 50 m Vs-1) registrados para tres soluciones de Carba-S (30 pL) incubadas a 37°C durante 30 min respectivamente con una cepa productora de BLEE, una cepa productora de cefalosporinasas hiperproducidas y una cepa productora de carbapenemasas. Figura 10A: cepa productora de carbapenemasas OXA-48. Figura 10B: cepa productora de carbapenemasas OXA-48+CTX-M. Figura 10C: cepa productora de carbapenemasas NDM-1. Figura 10D: cepa productora de carbapenemasas KPC-2.
Ejemplos
Ejemplo I: Identificación de las bacterias productoras de betalactamasas utilizando nitrocefina como sustrato
1. Materiales y métodos
1.1. Reactivos y soluciones
El tampón de fosfato (PBS; 100mM; pH = 7,0) y todas las soluciones acuosas se preparan con agua Milli-Q 18-MQ (sistema de purificación Millipore).
El medio de cultivo, consistente en caldo Luria, (LB, 10 g L -1 de Bacto triptona, 5 g L -1 de extracto de levadura Bacto, 5 g-L-1 de NaCI) se prepara en el laboratorio y se esteriliza en autoclave a 120°C.
La nitrocefina se adquiere en Merck Millipore (Referencia 484400). Se prepara una solución madre de nitrocefina 10-2M en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y luego se almacena en forma de alícuotas de 50 pL a -20°C.
La sal sódica de cefotaxima (n.° de catálogo C 7039-100 mg) y el clavulanato de potasio (n.° de catálogo 33454-100 mg) están disponibles en Sigma-Aldrich. Se preparan diariamente soluciones madre de 1 mgm L-1 en PBS.
La BLEE se extrajo de una cepa de E. coli aislada en el laboratorio de bacteriología del Centro Hospitalario Universitario de Dijon (1485; tipo CTX-M-1).
La cepa de E. coli K12 y la cepa de E. coli productora de BLEE (MIAE6690) provienen de la colección de cepas del INRA de Dijon. Las muestras de estas cepas se almacenan a -80°C en forma de alícuotas de 500 pL que contienen 50% de suspensión bacteriana y 50% de glicerol (v/v).
1.2. Aparatos de medida y electrodos
1.2.1. Para la prueba de concepto
Las medidas electroquímicas se realizan con un potenciostato PGSTAT12 Autolab (Metrohm) controlado por el programa GPES (versión 4.9).
Los sensores se preparan con una máquina de serigrafía manual (Circuit Imprimé Frangais, Bagneux, Francia) con tinta de carbono (Electrodag® PF 407A, Acheson Coloids). Se imprime una serie de 6 sensores en una película de poliéster flexible pasando tinta a través de un marco de serigrafía (120 hilos/cm) usando una espátula. Después de una etapa de secado (1 hora a 65°C), los sensores se almacenan a temperatura ambiente.
Cada sensor está constituido por un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. La superficie de trabajo del sensor (7,07 mm2) está delimitada con un anillo adhesivo que también permite definir la celda electroquímica. Para realizar la medida amperométrica, se inserta el sensor en un conector (Dropsens) conectado al potenciostato, luego se deposita sobre la superficie del sensor una gota de 20 pL de la solución que se va a analizar. Después de haber sumergido un alambre de plata cubierto con un precipitado de cloruro de plata (Ag/AgCl) que constituye el electrodo de referencia, las medidas se realizan por voltamperometría cíclica (v = 50 m Vs-1) a temperatura ambiente.
1.2.2 Para la discriminación de las betalactamasas en muestras de sangre y la cuantificación de las cepas productoras de BLEE:
Las medidas voltamétricas (v = 50 m Vs-1) se llevan a cabo mediante el depósito de gotas de 30 pL de solución sobre sensores serigrafiados en carbono suministrados por Dropsens (DRP-110) previamente conectados a un potenciostato portátil PSTAT Mini 910 (Methohm) accionados por la conexión USB del ordenador y controlados por el programa PSTAT (versión 1.0).
1.3. Detección amperométrica de la actividad de las betalactamasas
Se introducen 5 pL de una solución de BLEE en un tubo de polipropileno que contiene 45 pL de una solución de nitrocefina 0,5mM en tampón de fosfato (PBS; 100mM; pH = 7,0). Después de una etapa de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, se toman 20 pL de la mezcla y se transfieren a la superficie del sensor de carbono serigrafiado. A continuación, se sumerge un electrodo de referencia (Ag/AgCl) en los 20 pL de solución previamente depositados y las medidas de voltametría cíclica se llevan a cabo procediendo como sigue: potencial de barrido entre -0,4 V y 1,2 V a una velocidad de 50 m Vs-1.
El pico de oxidación que aparece alrededor de 0,3 V resulta de la hidrólisis del anillo betalactámico de la nitrocefina y puede elegirse como respuesta analítica para identificar betalactamasas en una muestra.
1.4. Medida amperométrica y colorimétrica de actividad BLEE con nitrocefina
Se introducen 45 pL de una solución de nitrocefina (0,5mM en PBS) en un tubo de polipropileno que contiene 5 pL de la solución de BLEE previamente diluida en PBS. La mezcla de reacción se incuba durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se detecta el producto de la reacción enzimática por amperometría y espectrofotometría. La medida electroquímica se realiza transfiriendo 20 pL de la mezcla sobre la superficie del sensor de carbono serigrafiado para realizar la medida voltamétrica como se ha indicado anteriormente. La intensidad de la corriente de pico de oxidación medida a aproximadamente 0,3 V frente a Ag/AgCl se elige como respuesta analítica. Para la detección espectrofotométrica, la solución se diluye en PBS (factor 5) y luego se pipetea en cubetas de un solo uso (ratiolab® Q-VETTES semi-micro, n° 2712120) antes de realizar una medida de absorbancia a A = 520 nm con un espectrofotómetro DU® 800 (Beckman Coulter).
1.5. Detección de una cepa productora de betalactamasas
Se cultivan en paralelo 10 pL de la cepa de E. coli K12 (BLEE-) no productora de betalactamasas y 10 pL de la cepa de E. coli MIAE6690 productora de BLEE (BLEE+) en un tubo que contiene 10 mL de medio LB suplementado con cefotaxima (4 pg-mL-1) durante 4 horas 30 min a 37°C. Luego, se transfiere 1 mL de cada suspensión bacteriana a un tubo de polipropileno y se centrifuga a 7.000g durante 10 min. Después de retirar el sobrenadante, se introduce en el tubo un volumen de 50 pL de una solución de nitrocefina (0,5mM en PBS) y se incuba con el sedimento bacteriano durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se aspira el líquido y se transfiere al sensor serigrafiado para realizar la medida voltamétrica como se ha indicado en el apartado 1.3.
1.6. Identificación de cepas resistentes a cefalosporinas de 3a generación en hemocultivos
Los hemocultivos proporcionados por el laboratorio de Bacteriología de la CHRU de Dijon son muestras de sangre que han sido cultivadas bien en viales de Bactec™ adaptados para la investigación de microorganismos principalmente aeróbicos, o bien en viales de Bactec™ dedicados al crecimiento de bacterias principalmente anaerobias.
Se introducen paralelamente volúmenes de 10 pL de muestra en tubos que contienen 10 mL de medio LB (Medio A), 10 mL de medio LB suplementado con cefotaxima a 4 pg-mL-1 (Medio B) y 10 mL de medio LB suplementado con cefotaxima a 4 pg-mL-1 y ácido clavulánico a 100 pg-mL-1 (medio C). Después de una etapa de incubación a 37°C con agitación durante 2 horas, se toman con una jeringa 5 mL del contenido de cada tubo y luego se filtra con un dispositivo de filtración manual (Swinnex®, 13 mm, Millipore) equipado con una membrana con una porosidad de 0,45 pm (HVLP, 13 mm, Millipore). A continuación, cada filtro se coloca en el fondo de un micropocillo de poliestireno (placa de 24 pocillos, Cellstar®, 662160) en el que luego se introducen 80 pL de una solución de nitrocefina (0,5mM en PBS), luego se deja incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Se toman 40 pL de cada mezcla y se transfiere a la superficie de un sensor serigrafiado de carbono (Dropsens, DRP-110) previamente conectado a un potenciostato portátil PSTAT Mini 910 (Methohm) alimentado por la conexión USB del ordenador y controlado por el programa PSTAT (versión 1.0). Las mediciones de voltametría lineal se llevan a cabo realizando un barrido lineal de potencial desde -0,1 V hasta 1,2 V a una velocidad de 50 m Vs-1.
La corriente de pico (i) que aparece alrededor de 0,3 V, ligada a la hidrólisis del anillo betalactámico de la nitrocefina, se elige como respuesta analítica. La comparación de los valores de corriente i medidos para cada condición de incubación de la muestra (Medio A, B, C) permite concluir sobre la capacidad de la cepa para producir o no una enzima que hidrolice la cefotaxima.
1.7. Cuantificación de cepas productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en aguas residuales
1.7.1. Realización de una curva de calibración en E. coli productora de BLEE en agua procedente de plantas de tratamiento de aguas residuales
Se cultivan 10 pL de cepa de E. coli MIAE6690 productora de BLEE en un tubo que contiene 10 mL de medio de cultivo LB suplementado con cefotaxima (4 pgm L-1) durante la noche a 42°C y con agitación. La concentración de bacterias en el cultivo así obtenido (S0) se determina realizando diluciones seriadas en un medio TS que contiene Triptona (10 g L -1) y NaCl (5gL-1), extendiendo luego las soluciones en placas que contienen un medio de gelosa (35,6 g L -1 de Triptona Bilis X-glucosa, 4 m gL-1 de cefotaxima).
El cultivo S0 se diluye en serie (factores de dilución entre 10 y 108) en una muestra de agua de planta de tratamiento de aguas residuales (bien sin trata o bien tratada) previamente esterilizada en autoclave preparando volúmenes de solución de 1 mL en tubos de polipropileno.
A continuación, 500 pL de estas soluciones previamente diluidas (factores de dilución entre 104 y 108) se introducen por separado en un tubo que contiene 25 mL de medio LB suplementado con cefotaxima a 4 pgm L-1 y se incuban a 42°C con agitación durante 4 horas. Se incuba en las mismas condiciones (control negativo) un volumen de 500 pL de la muestra de agua de la planta de depuración (bien sin tratar o bien tratada) previamente esterilizada en autoclave, utilizada para realizar las diluciones de la cepa bacteriana. Luego se extraen volúmenes de 10 ml por duplicado de cada tubo con una jeringa y a continuación se filtran por separado utilizando un dispositivo de filtración manual (Swinnex®, 13 mm, Millipore) equipado con una membrana con una porosidad de 0,45 pm (HVLP, 13 mm, Millipore). A continuación, cada filtro se coloca en el fondo de un micropocillo de poliestireno (placa de 24 pocillos, Cellstar®, Referencia: 662160) en el que luego se introducen 80 pL de una solución de nitrocefina (0,5mM en PBS), luego se deja incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Se toman 40 pL del contenido de cada pocillo y se transfieren a la superficie de un sensor de carbono serigrafiado (Dropsens, DRP-110) previamente conectado a un potenciostato portátil PSTAT mini 910 (Methrohm) y se realizan las medidas de voltametría lineal como se ha mencionado en la parte 1.6.
1.7.2. Detección de cepas productoras de BLEE en muestras de agua de plantas de tratamiento de aguas residuales
Se filtran volúmenes de aguas residuales (1-10 mL) y de agua tratada (20-100 mL) por duplicado a través de membranas de 0,45 pL de porosidad (HAWP, 47 mm, Millipore) usando una rampa de filtración de acero inoxidable (Sartorius Combisart). Para cada muestra se introduce una de las membranas en un tubo que contiene 25 mL de medio LB suplementado con cefotaxima a 4 pgm L-1 (Medio B) mientras que la segunda se sumerge en un tubo que contiene 25 mL de medio LB suplementado con cefotaxima a 4 gg-mL-1 y ácido clavulánico a 10 gg-mL-1 (medio C). Todos los tubos se incuban a 42°C con agitación durante 4 horas, luego se filtra su contenido y se analiza en presencia de nitrocefina como se ha indicado en 1.7.1.
Para una muestra dada, se anotan las intensidades de pico medidas a aproximadamente 0,3 V para las incubaciones en los medios B y C, respectivamente. íb e ic. La cantidad de cepas productoras de BLEE se calcula a partir del valor de corriente i = íb — ic usando una curva de calibración (1.7.1).
2. Resultados
2.1. Caracterización electroquímica de la nitrocefina hidrolizada
La nitrocefina fue hidrolizada con una betalactamasa de espectro extendido en cantidad abundante. Los comportamientos voltamétricos de la nitrocefina (S) y su forma hidrolizada (P) se estudiaron mediante voltametría cíclica utilizando electrodos serigrafiados a base de carbono. Tanto la nitrocefina como la nitrocefina hidrolizada presentan un pico de oxidación anódica irreversible (a1) a aproximadamente 1,0 V frente a Ag/AgCl. Este pico se puede atribuir a la oxidación del grupo tiol en el grupo dihidrotiazina o a otras funciones específicas de los derivados de las cefalosporinas. A diferencia de la nitrocefina, la nitrocefina hidrolizada (P) genera un pico de oxidación anódica irreversible bien definido (a2) observado a un potencial anódico más bajo de aproximadamente 0,3 V (Fig. 1). La presencia del pico a2 indica la de nitrocefina hidrolizada y, por lo tanto, puede elegirse como una respuesta analítica para evidenciar la actividad de betalactamasa de espectro extendido.
2.2. Medición de la actividad de las BLEE
La actividad de las BLEE se midió en paralelo mediante una medida espectrofotométrica y una medida voltamperométrica utilizando nitrocefina. Cada serie de experimentos se lleva a cabo mediante la variación de la concentración de BLEE y las curvas de calibración (log-log) obtenidas con el método electroquímico de la invención y el método espectrofotométrico se muestran en la Fig. 2. Cada medición se normaliza mediante comparación con la señal obtenida en ausencia de BLEE. La curva de calibración obtenida por el método voltamperométrico muestra que este método permite la detección cuantitativa de la actividad de las BLEE con una sensibilidad cercana a la del método espectrofotométrico. Además, el método voltamperométrico de la invención ofrece un área de linealidad más amplia. La reproducibilidad de la medida espectrofotométrica y la de la medida voltamperométrica son similares.
2.3. Detección de las cepas de E. coli productoras de BLEE por medición de voltamperometría cíclica
Para evaluar la capacidad del método voltamperométri
utilizaron dos cepas de E. coli cuyo genotipo está bien caracterizado, siendo uno productor de BLEE (BLEE+) y el otro no productor de BLEE (BLEE-). Las dos cepas se cultivaron primero en un medio LB que contenía 4 gg-mL-1 de cefotaxima. Después de la etapa de centrifugación, los sedimentos bacterianos respectivos de estas dos cepas se incubaron con nitrocefina como sustrato. La figura 3 muestra las respuestas voltamétricas obtenidas respectivamente para la cepa BLEE+ (curva A) y la cepa BLEE-(curva B). La curva A muestra un pico anódico a aproximadamente 0,4 V frente a Ag/AgCl, asociado con la hidrólisis catalítica del núcleo p-lactámico de la nitrocefina por la cepa BLEE+, mientras que no se registra ningún pico para la cepa BLEE-. Este resultado concuerda bien con los valores de densidad óptica de 0,934 y 0,002 obtenidos respectivamente para la cepa BLEE+ y la cepa BLEE-. El medio de cultivo suplementado con cefotaxima y el medio sin antibiótico también se sometieron a la medida voltamperométrica. No se observó ninguna señal específica en el intervalo de potencial [0,1-0,6 V frente a Ag/AgCl] para estos dos medios, lo que confirma que ni el medio de cultivo LB ni la cefotaxima interfieren en la detección voltamperométrica.
2.4. Discriminación de las bacterias productoras de BLEE
Dado que las cefalosporinasas hiperproducidas y las carbapenemasas también pueden hidrolizar la cefotaxima, las bacterias que producen estas enzimas también pueden dar una respuesta positiva en presencia de cefotaxima. Con el fin de distinguir entre bacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido y bacterias productoras de cefalosporinasas hiperproducidas y carbapenemasas, las bacterias se cultivaron simultáneamente en dos medios de cultivo, una que contenía cefotaxima como antibiótico, y el otro conteniendo además clavulanato de potasio como inhibidor de las BLEE. Después de la recuperación de las bacterias, los sedimentos bacterianos se incubaron con nitrocefina como sustrato. Las curvas voltamétricas registradas por voltamperometría cíclica se muestran en la figura 4. Se observó el pico anódico resultante de la hidrólisis de la nitrocefina para una cepa BLEE+ cultivada con cefotaxima (curva A), mientras que no se registró ninguna señal para la misma cepa cultivada en presencia de clavulanato de potasio (curva B). Este resultado confirma la presencia de bacterias productoras de BLEE.
Este resultado está de acuerdo con los valores obtenidos para el conteo de E. coli en medio selectivo ya que estos son respectivamente 80 ufcmL-1 para un cultivo suplementado con un inhibidor y 1,8x108 ufcmL-1 para un cultivo sin inhibidor.
2.5. Cuantificación de las bacterias productoras de betalactamasas
La capacidad del método de la invención para la determinación cuantitativa de bacterias productoras de BLEE se evaluó mediante una serie de diluciones de un cultivo de E. coli BLEE+ de 5x104 a 5x107 ufc mL-1, incubadas con cefotaxima.
La curva de calibración de la figura 5 presenta una amplia zona de linealidad, lo que permite prever la determinación cuantitativa de las cepas bacterianas productoras de BLEE. La meseta observada a altas concentraciones de bacterias productoras de BLEE sugiere que toda la nitrocefina inicialmente presente se ha hidrolizado.
2.6. Cuantificación de las bacterias productoras de betalactamasas en aguas residuales sin tratar o esterilizadas en autoclave
Se establecieron las curvas de calibración en E. coli productoras de BLEE para muestras de aguas residuales sin tratar y muestras de aguas tratadas previamente esterilizadas en autoclave según el método descrito en el apartado 1.7.1. Estas curvas de calibración se utilizaron para cuantificar las bacterias productoras de BLEE respectivamente en el agua sin tratar y el agua tratada según el método de la invención. Como se muestra en las tablas 1 y 2, los resultados obtenidos con un método de la invención concuerdan con los resultados obtenidos mediante el conteo de bacterias.
Tabla 1: Determinación de las cepas productoras de BLEE (ufc-L-1) en agua no tratada procedente de 5 estaciones depuradoras de aguas residuales de Costa de Oro (A, B, C, D, E).
Figure imgf000016_0001
Tabla 2 : Determinación de las cepas productoras de BLEE (ufc-L'1) en agua tratada procedente de 5 plantas de tratamiento de Costa de Oro (A, B, C, D, E).
Figure imgf000016_0002
2.7. Discriminación de las betalactamasas
Se analizaron mediante el método de la invención cinco cepas bacterianas procedentes de muestras clínicas y productoras de diferentes tipos de betalactamasas (penicilinasas, BLEE de tipo CTX-M , cefalosporinasa inducible, cefalosporinasa hiperproducida).
Cada cepa bacteriana, así como el control negativo, se incubaron respectivamente en tres medios de cultivo diferentes (medios A, B y C): siendo el medio A un medio de cultivo LB, siendo el medio B un medio de cultivo LB que contenía 4 pgmL de cefotaxima y siendo el medio C un medio de cultivo LB que contenía 4 pg-mL-1 de cefotaxima y 100 pgm L-1 de ácido clavulánico. Después de la filtración de las suspensiones bacterianas con Swinnex®, las membranas de filtración sobre las que se recuperaron las bacterias se incubaron en la oscuridad durante 10 min con 80 pL de nitrocefina 500pM.
La medición de voltamperometría cíclica se realizó utilizando electrodos de carbono. Los picos de corriente anódica correspondientes a la oxidación de nitrocefina hidrolizada para estos tres medios se denominan respectivamente ía, Ib y íc.
Los resultados obtenidos con las cepas productoras de las distintas betalactamasas se recogen en las figuras 7A a 7F.
Los resultados de la figura 7A corresponden a la respuesta de una muestra que contiene una cepa que no produce betalactamasas (negativa).
Los resultados de las figuras 7B y 7C corresponden a dos penicilinasas. La actividad catalítica de una penicilinasa se caracteriza por la presencia de la corriente anódica de nitrocefina hidrolizada obtenida para las bacterias procedentes de los medios A y B y la ausencia de la corriente anódica específica para las bacterias precedentes del medio C.
Una cefalosporinasa inducible (figura 7D) se caracteriza por los picos de la corriente anódica de la nitrocefina hidrolizada obtenidos en estos tres medios correspondientes a los siguientes criterios: ¡a<1 , ía<íb< íc, e ic>1.
Una betalactamasa de espectro extendido de tipo CTX-M (figura 7E) se caracteriza por los picos de la corriente anódica de la nitrocefina hidrolizada obtenidos en estos tres medios correspondientes a los siguientes criterios: ¡a>3, ¡b>3, e ¡c<0,2. Una cefalosporinasa hiperproducida (figura 7F) se caracteriza por los picos de la corriente anódica de la nitrocefina hidrolizada obtenidos en estos tres medios correspondientes a los siguientes criterios: ¡a>3, ¡a>¡b>¡c, e ¡c>1.
Se implementan respectivamente un antibiograma por difusión en gelosa y el método amperométrico de la invención para discriminar las bacterias productoras de betalactamasas en muestras de hemocultivo. Como muestran los resultados recogidos en la tabla 3 siguiente, la tasa de recuperación del método de la presente invención es del 100% con el antibiograma.
Tabla 3: Comparación de los resultados obtenidos tras realizar un antibiograma (ATB) e implementar el método electroquímico de la invención para la discriminación de las cepas productoras de betalactamasas en caldos de hemocultivo.
Figure imgf000017_0001
También se implementan un antibiograma por difusión en gelosa y el método amperométrico de la invención para discriminar las bacterias productoras de betalactamasas, obtenidas a partir de diversas muestras biológicas, tras su aislamiento en una gelosa lactosada de Drigalski. Los resultados recopilados en la tabla 4 indican que la tasa de recuperación del método de la presente invención es del 100% con el antibiograma.
Tabla 4: Comparación de los resultados obtenidos tras realizar un antibiograma (ATB) e implementar el método electroquímico de la invención para la discriminación de las cepas productoras de betalactamasas previamente aisladas en medio Drigalski.
Figure imgf000018_0001
Ejemplo II : Identificación de las bacterias resistentes a las C3G utilizando el compuesto HMRZ-86 como sustrato
1. Material y métodos :
1.1. Reactivos y soluciones
El compuesto HMRZ-86 fue sintetizado y suministrado por Kanto Chemical (Japón). Se preparó una solución madre de 10-2M en DMSO y se almacenó en alícuotas de 50 pL a -20°C.
Las cepas utilizadas en este ejemplo y recopiladas en la Tabla 5 a continuación provienen de la colección de cepas crioconservadas del INRA de Dijon.
Tabla 5
Figure imgf000019_0001
1.2. Identificación de las cepas resistentes a las C3G en cultivos líquidos
Cada cepa crioconservada se cultivó en 10 mL de medio LB a 37°C hasta obtener la fase estacionaria.
Se incubó un volumen de 50 pL de cultivo líquido en presencia de 50 pL de una solución 0,5mM de HMRZ-86 en PBS a 37°C con agitación durante 30 min. Se tomaron 40 pL de la mezcla de reacción y se transfirieron a la superficie de un sensor de carbono serigrafiado (Dropsens, DRP-110) previamente conectado a un potenciostato portátil STAT 8000P (Dropsens) alimentado por la conexión USB del ordenador y controlado por el programa DropView 8400. Las mediciones de voltametría lineal se realizaron haciendo un barrido de potencial lineal desde -0,1 V hasta 1,2 V a una velocidad de 50 m Vs-1. La corriente de pico que aparece en el intervalo de potencial 0,2-+0,55 V frente a Ag/AgCl, relacionado con la hidrólisis del anillo betalactámico del HMRZ-86, se elige como respuesta analítica. Si la intensidad de pico (i) tiene un valor superior a 500 nA, la muestra contiene una cepa capaz de degradar las C3G.
1.3. Realización de una curva de calibración de las cepas de E. coli productoras de BLEE en muestras de aguas residuales esterilizadas en autoclave
El protocolo descrito en 1.7.1. del Ejemplo I se implementó con una sola condición de cultivo (LB suplementado con cefotaxima a 4 pgm L-1). Los filtros se incubaron con 90 pL de HMRZ-86 (0,25mM en PBS) a 37°C durante 30 min. Las mediciones se realizaron por voltametría lineal como se mencionó anteriormente (párrafo 1.2). La corriente de pico que aparece en el intervalo de potencial 0,2-+0,55 V frente a Ag/AgCl, relacionado con la hidrólisis del anillo betalactámico de HMRZ-86, se elige como respuesta analítica. Su intensidad (i) es proporcional a la cantidad de cepas resistentes a las C3G presentes en la muestra.
2. Resultados
2.1. Caracterización electroquímica del HMRZ-86 y sus formas hidrolizadas
Se incubó una solución de HMRZ-86 con varias cepas bacterianas resistentes o sensibles a las C3G, es decir, respectivamente capaces o no de hidrolizar la molécula de HMRZ-86.
Se muestran las respuestas voltamétricas del HMRZ-86 y de sus formas hidrolizadas (Figura 8). Los voltamogramas registrados para el HMRZ-86 incubado con las cepas sensibles a las C3G (no productoras de betalactamasa, productoras de penicilinasa o de cefalosporinasa inducible) tienen todos el mismo perfil con dos ondas de oxidación de muy baja intensidad a aproximadamente 0,2 y 0,4 V frente a Ag/AgCl que desaparecen en favor de picos de oxidación bien definidos para las formas hidrolizadas del HMRZ-86. Más concretamente, la hidrólisis de1HMRZ-86 por las cepas productoras de BLEE y de carbapenemasas conduce a un producto que presenta un pico de oxidación P1 muy específico (figura 8) en torno a 0,25 V frente a Ag/AgCl, mientras que el producto resultante de la hidrólisis de1HMRZ-86 por una cepa productora de cefalosporinasa hiperproducida se oxida específicamente a aproximadamente ~+0,5 V frente a Ag/AgCl para dar un pico P2 (figura 8). Por lo tanto, la presencia de los picos P1 o P2 indica la de1HMRZ-86 hidrolizado y puede elegirse como una respuesta analítica para poner en evidencia las cepas resistentes a las C3G. Además, el pico P2 permite identificar específicamente las cepas productoras de cefalosporinasas hiperproducidas.
2.2. Cuantificación de las cepas resistentes a las C3G: ejemplo de curvas de calibración de cepas productoras de BLEE en aguas residuales esterilizadas en autoclave
La capacidad del método de la invención para la determinación cuantitativa de las bacterias resistentes a las C3G con el sustrato HMRZ-86 se evaluó aplicando la curva de calibración establecida según el protocolo 1.3. descrito en este ejemplo. La Figura 9 reúne las curvas de calibración obtenidas para dos cepas de E. coli productoras de BLEE (tipo CTX-M15) inoculadas en muestras de aguas residuales previamente esterilizadas en autoclave. Con una zona de linealidad entre 10 y 1.000 bacterias filtradas, este método permite prever la cuantificación de las cepas resistentes a las C3G con buena sensibilidad.
Ejemplo III: Identificación de bacterias resistentes a los carbapenems
1. Material y métodos:
1.1. Reactivos
El sustrato denominado en adelante "Carba-S" y su diluyente corresponden respectivamente a los reactivos R2 y R3 del kit p Carba™ Test comercializado por Biorad. La solución de Carba-S se preparó agregando 550 pL de R3 en R2.
Las cepas utilizadas en este ejemplo y recopiladas en la tabla 6 siguiente provienen de la colección de cepas crioconservadas del INRA de Dijon.
Tabla 6
Figure imgf000020_0001
1.2. Identificación de las cepas resistentes a carbapenems de colonias aisladas
Cada cepa crioconservada se cultivó en una gelosa Muller Hinton a 37°C.
Se incubó un asa de 1 pL en presencia de 30 pL de la solución Carba-S a 37°C con agitación durante 30 min. Se tomaron 40 pL de la mezcla de reacción y se transfirieron a la superficie de un sensor de carbono serigrafiado (Dropsens, DRP-110) previamente conectado a un potenciostato portátil STAT 8000P (Dropsens) alimentado por la conexión USB del ordenador y controlado por el programa DropView 8400. Las mediciones de voltametría lineal se realizaron haciendo un barrido de potencial lineal desde -0,1 V hasta 1,2 V a una velocidad de 50 mV s-1. La corriente de pico (i) que aparece a aproximadamente 0,3-0,8 V frente a Ag/AgCl, relacionada con la hidrólisis del Carba-S, se elige como respuesta analítica. La presencia del pico (i) con una intensidad superior a 200 nA permite concluir sobre la presencia de una cepa productora de carbapenemasas.
2.2. Resultados:
2.1. Caracterización electroquímica del sustrato Carba-S y sus formas hidrolizadas a partir de las colonias aisladas
La solución de Carba-S se incubó con diferentes cepas bacterianas sensibles o resistentes a los carbapenems, es decir, respectivamente capaces o no de degradar la molécula de Carba-S, y se analizó mediante voltametría lineal con sensores serigrafiados.
Las respuestas voltamétricas grabadas para las colonias sensibles a los carbapenems (productoras de BLEE y de cefalosporinasas hiperproducidas) y las colonias productoras de carbapenemasas de tipo OXA 48, OXA 48 CTXM, KPC-2 y NDM-1 se muestran respectivamente (figura 10A, 10B, 10C y 10D). La comparación de los voltamogramas muestra que solo las curvas registradas para las cepas productoras de carbapenemasas muestran de una a tres ondas de oxidación con picos bien definidos en un intervalo de potencial de 0,2 a 0,8 V frente a Ag/AgCl. Así, mediante una medida voltamétrica, es posible distinguir el Carba-S de sus productos de degradación y, por lo tanto, evidenciar la presencia de cepas productoras de carbapenemasas.
Ejemplo IV: Resultados Comparativos
Ensayo comparativo 1
El método electroquímico de la invención se aplicó al análisis de un panel de 40 cepas productoras de diferentes plactamasas y se comparó con el ensayo p-Lacta™ (Biorad) cuyo principio se basa en la detección colorimétrica cualitativa de las cepas resistentes a las C3G. Los resultados recopilados en la Tabla 7 se obtuvieron después de 30 minutos de incubación de las bacterias con el sustrato HMRZ-86 para los dos métodos. En base a la interpretación de los resultados propuesta por el proveedor, el ensayo p-Lacta™ permite identificar las cepas resistentes a las C3G con un índice de concordancia de 68% mientras que con el método electroquímico de la invención se obtuvo un índice de concordancia de 95%. A diferencia de la colorimetría, la amperometría ofrece la ventaja de medir un valor de corriente encriptado que, por un lado, evita cualquier interpretación subjetiva del resultado (color intermedio), y por otro lado, permite la trazabilidad del resultado.
Tabla 7: Comparación de los resultados obtenidos con el método electroquímico de la invención para cultivos líquidos con los obtenidos con el ensayo p-Lacta™ realizado según recomendaciones del proveedor con colonias aisladas. En ambos casos, las lecturas se tomaron después de 30 min de incubación con el sustrato HMRZ-86.
Tabla 7
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000022_0001
Ensayo comparativo 2
El método electroquímico de la invención se aplicó al análisis de un panel de 28 cepas productoras de BLEE, de cefalosporinasa hiperproducida y de carbapenemasa y se comparó con ensayo p-Carba™ (Biorad) cuyo principio se basa en la detección colorimétrica cualitativa de las cepas resistentes a los carbapenems. Los resultados recopilados en la tabla 8 se obtuvieron después de 30 min de incubación de un asa de 1 pL de colonias aisladas con el sustrato Carba-S por los dos métodos. En base a la interpretación de los resultados propuesta por el proveedor, el ensayo p-Carba™ permite identificar las cepas resistentes a los carbapenems con un índice de concordancia de 43%, mientras que con el método electroquímico de la invención se obtuvo un índice de concordancia de 100%. También aquí, mediante una medida de corriente encriptada, el método electroquímico de la invención evita cualquier interpretación subjetiva del resultado (color intermedio), y permite obtener un resultado fiable mucho más rápidamente que la colorimetría.
Tabla 8: Comparación de los resultados obtenidos para el análisis de colonias aisladas con el método electroquímico de la invención y con el ensayo p-Carba™ realizado según las recomendaciones del proveedor. En ambos casos, las lecturas se tomaron después de 30 min de incubación con el sustrato Carba-S.
Tabla 8
Figure imgf000023_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Método para la determinación in vitro de la presencia de bacterias productoras de betalactamasas, en una muestra que puede contener dichas bacterias, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar dicha muestra en un medio que contiene un sustrato de las betalactamasas, que tiene propiedades electroquímicas, en particular una betalactamina que tiene propiedades electroquímicas, y
(b) aplicar un medio de análisis electroquímico para determinar la presencia del sustrato de las betalactamasas después de haber sido hidrolizadas.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho medio de análisis electroquímico es una medida potenciométrica, una medida de impedancia, una medida culombimétrica o una medida amperométrica.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que dicho sustrato de las betalactamasas es una betalactamina, en particular seleccionada entre el grupo que comprende la nitrocefina, el compuesto HMRZ-86 (isómero E del (6R,7R)-trifluoroacetato del ácido 7-[[2-(2-amino-4-tiazolil)-2-[(1-carboxi-1-metiletoxi)imino]acetil]amino]-1-aza-3-[2-(2,4-dinitrofenil)etenil]-8-oxo-5-tiabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico) o el sustrato (reactivo R2) del kit p CARBA™.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho método comprende las siguientes etapas:
(a) incubar una muestra que puede contener dichas bacterias en un medio que contiene un sustrato de las betalactamasas, en particular una betalactamina, que tiene propiedades electroquímicas,
(b) aplicar una medida amperométrica a dicho medio obtenido al final de la etapa (a) y a un control negativo, respectivamente,
(c) determinar la presencia de las bacterias productoras de betalactamasas comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación del sustrato hidrolizado, en particular de la betalactamina hidrolizada, medida para dicho medio obtenido al final de la etapa (a), con el valor de la intensidad de la corriente anódica medida para el control negativo.
5. Método según la reivindicación 4, para determinar y cuantificar las bacterias productoras de betalactamasas en una muestra que puede contener dichas bacterias, comprendiendo dicho método adicionalmente, después de la etapa (c), una etapa (d) consistente en comparar el valor de la intensidad de la corriente anódica medida para dicho medio obtenida al final de la etapa (a) con una curva de calibración establecida en las mismas condiciones.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que permite además discriminar el tipo de betalactamasas seleccionadas entre las penicilinasas, las betalactamasas de espectro extendido, las cefalosporinasas inducibles, las cefalosporinasas hiperproducidas y las carbapenemasas, producidas por dichas bacterias en una muestra que puede contenerlas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar, en paralelo, una fracción de dicha muestra en:
un medio de cultivo A, un medio de cultivo B y un medio de cultivo C:
- siendo el medio de cultivo A un medio de cultivo de base,
- siendo el medio de cultivo B un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina de 3a generación, y
- siendo el medio de cultivo C un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina y un inhibidor de la penicilinasa, y
eventualmente en un medio de cultivo B', un medio de cultivo C', un medio de cultivo D y un medio de cultivo E:
- siendo el medio de cultivo B' un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina de 3a generación diferente de la presente en el medio B;
- siendo el medio de cultivo C' el medio de cultivo B' suplementado con un inhibidor de las penicilinasas;
- siendo el medio de cultivo D un medio de cultivo de base suplementado con una cefalosporina y un inhibidor de las cefalosporinasas, y
- siendo el medio de cultivo E un medio de cultivo de base suplementado con un carbapenem, (b) incubar, en paralelo, dichos medios de cultivo obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina.
7. Método según la reivindicación 6, para determinar la presencia de bacterias productoras de una betalactamasa de espectro extendido, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar, en paralelo, una fracción de dicha muestra en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B y un medio de cultivo C, y eventualmente en un medio de cultivo B' y un medio de cultivo C', según la reivindicación 6,
(b) incubar, en paralelo, dichos medios de cultivo obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina.
8. Método según la reivindicación 6, para determinar y discriminar las bacterias productoras de betalactamasas en una muestra que las puede contener, que comprende las siguientes etapas:
(a) incubar, en paralelo, una fracción de dicha muestra en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo C, un medio de cultivo D, un medio de cultivo E, eventualmente un medio B' y un medio C', según la reivindicación 6,
(b) incubar, en paralelo, dichos medios de cultivo obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar una medida amperométrica a dichos medios obtenidos al final de la etapa (b) y a un control negativo, respectivamente,
a) determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en dicha muestra comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada obtenida para la fracción cultivada en el medio de cultivo A con el valor de la intensidad de la corriente obtenida para el control negativo, y
(d) discriminar el tipo de betalactamasas producidas por dichas bacterias en dicha muestra, comparando los valores respectivos de la intensidad de dicha corriente anódica obtenidos para las fracciones cultivadas en paralelo en los medios de cultivo A, B, C, D y E, eventualmente B' y C' con los valores respectivos obtenidos para una cepa bacteriana de referencia.
9. Método según la reivindicación 8, que comprende además una etapa (f) después de la etapa (e) que permite cuantificar las bacterias productoras de la betalactamasa discriminada en la etapa (e) comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la nitrocefina hidrolizada por dicha betalactamasa con una curva de calibración establecida en las mismas condiciones.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8-9, para discriminar el tipo de betalactamasas y eventualmente precisar la subfamilia de carbapenemasas producidas por dichas bacterias en una muestra que puede contenerlas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a) incubar, en paralelo, una fracción de dicha muestra en un medio de cultivo A, un medio de cultivo B, un medio de cultivo C, un medio de cultivo D, un medio de cultivo E y un medio de cultivo F, y eventualmente un medio de cultivo medio de cultivo B' y un medio de cultivo C',
siendo los medios A, B, B', C, C', D y E según la reivindicación 6,
siendo el medio de cultivo F un medio de cultivo de base suplementado con un carbapenem y un inhibidor específico de una subfamilia de carbapenemasas;
(b) incubar, en paralelo, dichos medios de cultivo obtenidos al final de la incubación de la etapa (a) en un medio que contiene nitrocefina,
(c) aplicar una medida amperométrica a dichos medios obtenidos al final de la etapa (b) y a un control negativo, respectivamente,
(d) determinar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas en dicha muestra comparando el valor de la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada obtenida para la fracción cultivada en el medio de cultivo A con el valor de la intensidad de la corriente obtenido para el control negativo,
(e) discriminar el tipo de betalactamasas producidas por dichas bacterias en dicha muestra, comparando los respectivos valores de la intensidad de dicha corriente anódica obtenidos para las fracciones cultivadas en paralelo en los medios de cultivo A, B, C, D, E y F, y eventualmente los medios de cultivo B' y C', con los valores respectivos obtenidos para una cepa bacteriana de referencia.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la intensidad de la corriente anódica correspondiente a la oxidación de la nitrocefina hidrolizada en un tampón de pH neutro se mide en un intervalo de potenciales comprendido entre 0,1 V y 0,5 V frente a Ag/AgCl, en particular entre 0,2 V y 0,4 V frente a Ag/AgCl, más particularmente entre 0,23 V y 0,33 V frente a Ag/AgCl.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado por que una cefalosporina de 3a generación se selecciona entre el grupo que comprende la cefotaxima, la ceftazidima y la ceftriaxona; que un inhibidor de la penicilinasa es el ácido clavulánico, el tazobactam o el sulbactam; que dicho inhibidor de las cefalosporinasas es la cloxacilina; que un carbapenem es el ertapenem, el imipenem o el meropenem; que un inhibidor de las carbapenemasas se selecciona entre el EDTA, el ácido mercaptoacético, el ácido borónico o el ácido clavulánico.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho método se utiliza para determinar y cuantificar in vitro la presencia de bacterias resistentes a una cefalosporina de 3a generación y que el medio utilizado en la etapa (a) contiene una betalactamina hidrolizada únicamente por las betalactamasas de espectro extendido, las cefalosporinasas hiperproducidas y las carbapenemasas.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho método se utiliza para determinar y cuantificar in vitro la presencia de bacterias productoras de carbapenemasas y que el medio utilizado en la etapa (a) contiene un sustrato que solo es hidrolizado por las carbapenemasas.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha muestra se selecciona entre una muestra biológica, una muestra de origen ambiental o una muestra alimentaria.
ES16717283T 2015-04-03 2016-04-01 Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas Active ES2907298T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1552928A FR3034523B1 (fr) 2015-04-03 2015-04-03 Nouvelle methode pour detecter la presence de bacteries productrices de beta-lactamases.
PCT/EP2016/057284 WO2016156605A1 (fr) 2015-04-03 2016-04-01 Nouvelle methode pour detecter la presence de bacteries productrices de beta-lactamases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2907298T3 true ES2907298T3 (es) 2022-04-22

Family

ID=53483994

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16717283T Active ES2907298T3 (es) 2015-04-03 2016-04-01 Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10718006B2 (es)
EP (1) EP3278095B1 (es)
JP (1) JP6748701B2 (es)
CN (1) CN107660233B (es)
BR (1) BR112017021186B1 (es)
ES (1) ES2907298T3 (es)
FR (1) FR3034523B1 (es)
WO (1) WO2016156605A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018181997A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立大学法人大阪大学 カルバペネマーゼ産生菌の検出方法
US11957690B2 (en) 2018-07-16 2024-04-16 Brown University Chromogenic beta-lactamase substrate
WO2020254711A1 (es) * 2019-06-21 2020-12-24 Servicio Andaluz De Salud Kit y método de detección rápida de bacterias resistentes a las combinaciones de antibiótico b-lactámico con un inhibidor de b-lactamasa, y de la resistencia de expectro extendido a los b-lactámicos en aislados clínicos
CN113249434A (zh) * 2021-05-07 2021-08-13 山西大学 同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法
CN113912626B (zh) * 2021-08-24 2023-03-21 南开大学 耐超广谱β-内酰胺类和头孢菌素类抗生素病菌探针及其合成方法与应用
WO2023054231A1 (ja) * 2021-09-29 2023-04-06 日東電工株式会社 電気化学測定用混合試薬

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641623A (en) * 1995-01-04 1997-06-24 Martin; Mark T. Electrochemiluminescence assay
DK1557473T3 (da) * 2002-10-29 2009-05-04 Hanaki Hideaki Reagenssammensætning til at skelne beta-lactamaser, kit og fremgangsmåde dermed
DE10311315A1 (de) * 2003-03-14 2004-09-30 Apibio Sas Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Biomolekülen
US20050069901A1 (en) * 2003-09-29 2005-03-31 Eppendorf Ag Method for detecting microbial antibiotic resistance
JP5628677B2 (ja) 2007-10-19 2014-11-19 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ベータ−ラクタマーゼの検出のための方法および組成物
FR2956868B1 (fr) * 2010-03-01 2014-01-10 Bio Rad Pasteur Procede rapide de detection d'enzymes et de microorganismes
WO2012175637A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for detecting the presence of carbapenemase-producing bacteria in a sample
CN104160034A (zh) * 2011-11-18 2014-11-19 国家医疗保健研究所 用于检测样品中存在产生广谱β-内酰胺酶的细菌的方法
WO2015193501A1 (en) * 2014-06-19 2015-12-23 Université Catholique de Louvain Method for detecting enzyme activity hydrolyzing beta-lactam ring antimicrobial agents

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017021186B1 (pt) 2021-06-08
JP2018514227A (ja) 2018-06-07
CN107660233B (zh) 2021-10-15
EP3278095A1 (fr) 2018-02-07
US20180105862A1 (en) 2018-04-19
EP3278095B1 (fr) 2021-12-01
US10718006B2 (en) 2020-07-21
WO2016156605A1 (fr) 2016-10-06
FR3034523A1 (fr) 2016-10-07
JP6748701B2 (ja) 2020-09-02
FR3034523B1 (fr) 2020-01-17
BR112017021186A2 (pt) 2018-07-03
CN107660233A (zh) 2018-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2907298T3 (es) Nuevo método para detectar la presencia de bacterias productoras de betalactamasas
KR100444250B1 (ko) 전기화학발광분석법
CA2837246C (en) Method for detecting the presence of carbapenemase-producing bacteria in a sample
Gholap et al. Chemiluminescence detection of hydrogen sulfide release by β-lactamase-catalyzed β-lactam biodegradation: Unprecedented pathway for monitoring β-lactam antibiotic bacterial resistance
JP2014533951A (ja) 試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための方法
Rochelet et al. Amperometric detection of extended-spectrum β-lactamase activity: application to the characterization of resistant E. coli strains
Chantemesse et al. A nitrocefin-based amperometric assay for the rapid quantification of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli in wastewaters
Zhuang et al. Advances in the detection of β-lactamase: A review
JP7479433B2 (ja) クラスａ型カルバペネマーゼ産生菌の検出方法および検出用多ウェルプレート
Betelli et al. A voltammetric test for the rapid discrimination of β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in blood cultures
US20170138944A1 (en) Method for detecting enzyme activity hydrolyzing beta-lactam ring antimicrobial agents
JP2016182066A (ja) β−ラクタマーゼの検出法
WO2006043558A1 (ja) 細菌が産生するβ－ラクタマーゼのクラスを識別する方法
Nguyen et al. New trimodal phenotypic reporter of extended-spectrum β-lactamase activity
CN103512871B (zh) 一种细菌耐药性荧光检测方法及其诊断试剂盒
Lee et al. Colorimetric assay for β-lactamase activity using cocktail of penicillin and 4-(2-pyridylazo) resorcinol (PAR)–2Hg2+ complex
JP6214188B2 (ja) β−ラクタマーゼ検出方法
Shumyantseva et al. Electrochemical sensor for the detection of serine β-lactamase catalytic activity
JPS61249400A (ja) β−ラクタマ−ゼの定量測定法及びそれに用いる素材
Lathakumari et al. Next-Gen Nano Biosensor Technologies to Monitor Carbapenem Resistance for Personalized Medicine
JPWO2018181997A1 (ja) カルバペネマーゼ産生菌の検出方法