CN113249434A - 同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测产超广谱β‑内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,属于生物医药技术领域。本发明的检测方法由快速初筛和深入检测两个阶段组成,快速初筛阶段,对待测菌是否产β‑内酰胺酶进行快速判断,当待测菌为产β‑内酰胺酶时,开始深入检测,对待测菌是否产超广谱β‑内酰胺酶和碳青霉烯酶进行分析,当待测菌是产碳青霉烯酶耐药菌时,进一步对所产碳青霉烯酶的种类进行检测,当待测菌是非碳青霉烯酶产生菌时,继续对该菌是否产ESBL酶进行检测、判断。本方法可在一个小时左右对待测菌株完成青霉素耐药性分析、产ESBL分析、产碳青霉烯酶分析及所产碳青霉烯酶亚类分析。并且对产ESBL菌和碳青霉烯酶菌的检测灵敏性相对于ESBL NDP法和Carba NP法提高10倍左右。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,同时检测超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法。
背景技术
抗生素耐药性已对公共卫生安全造成严重威胁。细菌产生抗生素耐药性的主要机制有:菌壁孔蛋白突变导致抗生素进入细胞减少、抗生素作用的靶位点发生修饰而使抗生素失去功能、产生促进抗生素外排出胞外的系统和产生可对抗生素发生水解作用的酶类。β-内酰胺抗生素是目前临床最常使用的抗菌药物之一。该类抗生素可以进一步分为青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类及单环类四大亚类。
广泛的使用β-内酰胺类抗生素,使得细菌产生了各类β-内酰胺酶,从而对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加。据估计目前产生耐药性的革兰氏阴性菌中70%是由于产生了可水解β-内酰胺抗生素的β-内酰胺酶。由于广谱β-内酰胺酶(ESBL)和碳青霉烯酶能够高效水解具有广谱抗菌活性的β-内酰胺抗生素,因此临床治疗产这两类酶的耐药菌最具挑战性(Tooke, C.L.,P.Hinchliffe,E.C.Bragginton,C.K.Colenso,V.H.A.Hirvonen,Y.Takebayashi,and J. Spencer.2019.beta-Lactamases and beta-LactamaseInhibitors in the 21st Century.J Mol Biol 431: 3472-3500.)。如ESBL可有效水解如头孢曲松及头孢吡肟等三代、四代头孢菌素类抗生素,但对头孢西丁等头霉素无水解活性;而碳青霉烯酶则可对所有β-内酰胺类抗生素都有水解活性。ESBL通过酶内丝氨酸功能基团对β-内酰胺进行水解,代表性的ESBL有CTX-M家族、 TEM家族及SHV家族等。碳青霉烯酶通过酶内丝氨酸功能基团或金属Zn2+对β-内酰胺进行水解,KPC家族和NDM家族分别是丝氨酸功能基团依赖和Zn2+功能基团依赖碳青霉烯酶的代表。
β-内酰胺酶抑制剂(BLI)可使β-内酰胺酶失活从而有效抑制产β-内酰胺酶细菌的耐药性,提高β-内酰胺抗生素的治疗效率。目前临床治疗中已经广泛使用的β-内酰胺酶抑制剂主要有β-内酰胺类、二氮杂双环辛烷化合物类(DBO)及硼酸类(Tooke,C.L.,P.Hinchliffe,E.C. Bragginton,C.K.Colenso,V.H.A.Hirvonen,Y.Takebayashi,andJ.Spencer.2019. beta-Lactamases and beta-Lactamase Inhibitors in the 21stCentury.J Mol Biol 431:3472-3500.)。三类抑制剂的代表性抑制剂分别为他唑巴坦、阿维巴坦(Avi)及法朋巴坦。其中他唑巴坦为 ESBL的有效抑制剂、但对碳青霉烯酶无抑制作用;阿维巴坦对ESBL和以丝氨酸为功能基团的碳青霉烯酶都具有很好的抑制活性,但对以Zn2+为功能基团的碳青霉烯酶无效。另外EDTA 是一种以Zn2+为功能基团的碳青霉烯酶的有效抑制剂,但对以丝氨酸为功能基团的β-内酰胺酶却无效。而阿维巴坦和EDTA联合应用则几乎对所有β-内酰胺酶活性具有高效抑制作用。利用这些β-内酰胺酶抑制剂的选择性抑制活性可以帮助判断待测β-内酰胺酶的种类及水解特性。
检测产超广谱β-内酰胺酶或碳青霉烯酶的耐药菌可以分为基因型检测和表型检测两大类。基因型检测,可以在耐药表型不清楚的情况下,对导致耐药发生的相关基因进行分析。其优点是检测速度快、灵敏;其缺点是只能对序列已知的耐药相关基因进行检测,对新出现的耐药相关基因或未注释的耐药基因突变体的检测会出现遗漏,对检测结果的分析、解读需具有较好基础知识的专业人员。在表型检测类诸多方法中,基于菌培养的检测方法,如纸片扩散检测(K-B法)、E检测及碳青霉烯灭活方法等被广泛使用,并仍然是抗生素耐药检测的标准参考方法。这些测试具有检测成本低且易于操作的优点,但这些测试的主要缺点是检测时间长,在获得纯培养菌后还需24小时到48小时才能获得检测结果,而且在某些情况下精确度较低。最近,通过基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)的直接目标微滴生长分析(DOT-MGA)可以在4小时内获得测试细菌的最低抑菌浓度结果。然而,在紧急的临床治疗中,如败血症,仍然需要更及时地检测产ESBL或碳青霉烯酶的耐药菌。
近期发展的比色检测和基质辅助激光去吸收/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)水解方法可相对更快速地检测超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。比色法中的ESBLs NDP法和Carba NP法分别是检测产ESBL和碳青霉烯酶耐药菌的方法,这类检测可用纯培养菌(单菌落或血培养产物)在2小时内完成产超广谱β-内酰胺酶或碳青霉烯酶耐药菌的检测(Nordmann,P.,L. Dortet,and L.Poirel.2012.Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.J Clin Microbiol 50:3016-3022.),(Nordmann,P.,L.Poirel,and L.Dortet. 2012.Rapid detection ofcarbapenemase-producing Enterobacteriaceae.Emerg Infect Dis 18: 1503-1507.);基质辅助激光去吸收/电离飞行时间质谱水解方法通过分析待测菌与抗生素共孵育一段时间后反应体系中抗生素的减少及抗生素水解产物的增加来确定待测菌是否产ESBL 或是碳青霉烯酶。根据待测菌的种类不同该方法可以用纯培养菌为检测样品在1-2.5小时内完成产ESBL或碳青霉烯酶耐药的分析(Burckhardt,I.,and S.Zimmermann.2011.Usingmatrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometryto detect carbapenem resistance within 1to 2.5hours.J Clin Microbiol 49:3321-3324.)。以上两类方法对于大多数细菌菌株都具有良好的检测敏感性和检测特异性。但是这两类方法由于在检测过程中具有只能使用单一的肟基头孢菌素或碳青霉烯抗生素作为底物的固有局限性,因此无法在短时间内同时对产ESBL和碳青霉烯耐药菌进行检测。因此发展新方法以实现对临床治疗威胁巨大的产ESBL和碳青霉烯酶耐药菌同时进行快速检测具有重要治疗指导意义。
酶热传感器作为一种流动注射量热生物传感器,可以通过检测酶催化反应过程中产生的热量而对反应体系中的酶或其底物进行定量分析(Ramanathan,K.,andB.Danielsson.2001. Principles and applications of thermal biosensors.BiosensBioelectron 16:417-423.)。在前期的研究中本专利发明人谢斌等人通过固相有青霉素酶的青霉素酶酶热传感器建立了一种快速、灵敏、简单检测牛奶中非法外源添加β-内酰胺酶的检测方法(Zhou,S.,Y.Zhao,M.Mecklenburg, D.Yang,and B.Xie.2013.A novelthermometric biosensor for fast surveillance of beta-lactamase activity inmilk.Biosens Bioelectron 49:99-104.),但该传感器由于固相的是青霉素酶,因此无法对头孢菌素类和碳青霉烯类β-内酰胺抗生素进行有效定量分析,也无法对菌中是否表达ESBL和碳青霉烯酶进行分析。在稍后的另一项研究中本专利发明人谢斌应用一个金属β-内酰胺酶(该酶的生产公司没有提供该酶的具体生物学信息)所制备的酶热传感器虽然在一定程度上改善了对一种碳青酶烯抗生素“亚胺培南”的检测活性,但总体检测活性仍不高,且对不同代次的头孢菌素的检测活性没有评价(Chen,Q.,A.Andersson,M.Mecklenburg,and B. Xie.2015.A biosensing strategy for the rapid detection andclassification of antibiotic resistance. Biosens Bioelectron 73:251-255.)。本专利发明人近期利用超级耐药菌产生的超级耐药酶“新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)”研制出NDM-1酶热传感器。该传感器对青霉素类、系列头孢菌素类及碳青霉烯类β-内酰胺抗生素都表现出高反应活性、且可实现有效定量分析(柳世超,李彬春,李深伟,吴长新,谢斌,孟庆来.2020.一种β-内酰胺类抗生素的酶热检测方法的建立.山西大学学报(自然科学版).)。
发明内容
针对目前检测方法耗时长,检测单一且限制较多的问题,本发明提供了一种同时检测超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法。
为了达到上述目的,本发明公开了一种利用该传感器同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,采用了以下技术方案:
一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,包括以下步骤:
步骤1,对待测菌的单菌落取菌,加入到上样缓冲液内,轻轻吹散并重悬,然后加入等体积的细菌裂解试剂,轻吹混匀并室温下处理,最后将处理后的产物离心,吸取上清液,即为菌落裂解液;
步骤2,将青霉素G、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品A+E;将青霉素G、菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:0.2:5.6混合制备成样品A+H;将头孢西丁、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品B+E;将头孢曲松、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品C+E;将美罗培南、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品D+E;将美罗培南、菌落裂解液、阿维巴坦和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:5.8混合制备成样品D+F;将美罗培南、菌落裂解液、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:5.8混合制备成样品D+G;将美罗培南、菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:0.2:5.6混合制备成样品D+H;然后将样品A+E、样品A+H、样品B+E、样品C+E、样品D+E、样品D+F、样品D+G和样品D+H共同组成菌落液处理组,进行预处理;
将菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:8混合制备成样品E;将菌落裂解液、阿维巴坦和上样缓冲液以体积比为2:0.2:7.8混合制备成样品F;将菌落裂解液、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:0.2:7.8混合制备成样品G;将菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:0.2:0.2:7.6混合制备成样品H;然后将样品E、样品F、样品G和样品 H共同组成背景组,进行预处理;将菌落液处理组和背景组中的各样品再用上样缓冲液稀释 8~12倍;优选为稀释10倍;
步骤3,在步骤1对菌落进行裂解及步骤2以菌落裂解液对抗生素进行预处理的过程中,将青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南分别和上样缓冲液以体积比2:8混合制备成样品A、B、C和D,共同组成无菌落液处理组;将样品A、B、C和D用上样缓冲液稀释8~ 12倍,优选为10倍体积,稀释成500μL。把稀释后A、B、C和D样品泵入NDM-1酶热传感器,分析青霉素G、头孢西丁、头孢曲松和美罗培南在无菌落液预处理情况下最初信号强度。
本发明内容中所涉及的样品名称及其组成成份如表1所示;
表1,各样品名称与其成分组成
步骤4,先将步骤2稀释后的样品A+E和样品E泵入NDM-1酶热传感器检测A+E中青霉素G存留量及样品E中菌落裂解液在无抗生素存条件下通过NDM-1酶热传感器时所产生的背景信号强度,再结合样品A中无菌落液预处理时青霉素G的信号强度进行计算。若样品 A+E中青霉素G的水解率≥20%,则初步判定该菌为产β-内酰胺酶耐药菌,继续进行深入检测步骤,按步骤5进行,对该菌是否产ESBL和碳青霉烯酶进行分析;若样品A+E中青霉素 G的水解率<20%,后续则按步骤8进行;
步骤5,将步骤2稀释后的样品D+E泵入NDM-1酶热传感器,检测样品中美罗培南的存留量,再结合步骤3稀释后样品D中无菌落液预处理时美罗培南的最初量和步骤4稀释后的样品E的菌落液背景信号强度进行计算;若样品D+E中美罗培南的水解率≥20%,判定该菌为产碳青霉烯酶耐药菌,后续则按步骤6进行,进一步对所产碳青霉烯酶的种类进行检测,而不再对其是否产ESBL酶进行判断;若样品D+E中美罗培南的水解率<20%,后续则按步骤7进行,对该菌是否产ESBL酶进行检测;
步骤6,将步骤2中稀释后的样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品F、样品G和样品 H泵入NDM-1酶热传感器,检测样品D+F,D+G和D+H中美罗培南的存留量及背景组样品 F、G和H的背景信号强度,再结合步骤3中稀释后样品D美罗培南的最初量及步骤5中样品D+E仅用菌落液预处理后美罗培南的存留量的进行计算。若样品D+F中美罗培南的水解率显著小于样品D+E和样品D+G,而与样品D+H没有显著差异,且样品D+E和样品D+H 水解率≥20%,则判定该菌为产丝氨酸依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+G中美罗培南的水解率显著小于样品D+E和样品D+F,而与样品D+H没有显著差异,且样品D+E和样品 D+F水解率≥20%,则判定该菌为产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+H中美罗培南的水解率均显著低于样品D+E、样品D+F和样品D+G中美罗培南的水解率,且样品D+E、样品D+F和样品D+G水解率≥20%,则判定该菌为同时产丝氨酸依赖和产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;
步骤7,将步骤2中稀释后的样品B+E和样品C+E分别泵入NDM-1酶热传感器检测两个样品中头孢西丁和头孢曲松的剩余量,结合步骤3中样品B和样品C最初的头孢西丁和头孢曲松量及步骤4中样品E菌落液的背景信号进行计算,若样品B+E头孢西丁的水解率<20%,同时样品C+E中头孢曲松的水解率≥20%,则判定该菌为产广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药菌;
步骤8,将步骤2中稀释后的样品A+H泵入NDM-1酶热传感器,检测样品中青霉素G的水解率;若样品A+H中青霉素G的水解率显著低于样品A+E的水解率,则后续按步骤4-7 继续进行分析,若样品A+H中青霉素G的水解率与样品A+E中青霉素G的水解率没有显著差异,判定该菌为非产β-内酰胺酶菌。
进一步,所述步骤1中上样缓冲液为含有50mM HEPES,150mM NaCl,10μM ZnSO4及pH为7.5的缓冲液;所述步骤1中细胞裂解试剂为Thermo公司B-PERⅡ细菌裂解液,细菌裂解试剂体积与菌落重悬液体积相同。
进一步,所述步骤1中室温处理的时间为3-10min,优选地为5min;离心处理的离心力 13000~15000g,优选地为15000g;离心处理的时间为3min。
进一步,所述步骤2中将菌落液处理组和背景组中的各个样品再用上样缓冲液稀释的终体积为400-600μL,优选地为500μL。
进一步,所述步骤3~8中NDM-1酶热传感器的工作温度设置为30℃;放大器放大倍数为100倍。
进一步,所述步骤2预处理条件为室温~37℃,孵育10~60min,优选在37℃孵育15min。
进一步,所述步骤2和步骤3中,样品A+E、样品A+H、样品B+E、样品C+E、样品 D+E、样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品A、样品B、样品C和样品D在预处理前青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南浓度均相同,为2000~5000mg/L,优选地为2000mg/L。
进一步,所述步骤2中样品F、样品H、样品D+F和样品D+H中阿维巴坦的浓度为25mg/L;样品G、样品H、样品D+G和样品D+H中EDTA的浓度为290mg/L。
进一步,若水解率≥20%认为该菌对相应抗生素有水解作用;若水解率<20%则认为该菌对相应抗生素无水解作用。
进一步,本发明内容中所提及的“显著性”指的是两样品数值以t检验进行比较后样品间差异的p值<0.05。
进一步,所述抗生素水解率计算方法:抗生素水解百分率(%)=[抗生素在无菌落液处理组中的电信号-(抗生素在菌落液处理组中以含有某背景样品的菌落液处理后电信号-背景组某背景样品的电信号)]/抗生素在无菌落液处理组中的电信号x100。
本方法的检测原理为:如图1本发明检测方法的原理示意图所示,NDM-1酶热传感器对β-内酰胺抗生素进行检测的主要元件是固相有大量重组NDM-1酶的酶柱,当β-内酰胺类抗生素通过蠕动泵流入NDM-1酶柱时,酶柱内大量的NDM-1酶可以对β-内酰胺抗生素快速进行水解、并释放出热量,释放的热量将由酶柱上方的超敏感热敏电阻进行检测。抗生素的浓度越高则检测到热信号就越高。以含有β-内酰胺酶的菌落裂解液上清对一组抗生素进行预处理后,酶对相应抗生素的水解活性将与处理后剩余抗生素的浓度呈反比,再用NDM-1酶热传感器对处理后各样品中剩余的抗生素(菌落液处理组)及没有预处理的抗生素(无菌落液处理组)进行检测,就可评价出该病原菌中产生的β-内酰胺酶针对某一特定抗生素的相对水解活性。由于ESBL和碳青霉烯酶都存在对其酶活性进行鉴定的一组特征性β-内酰胺抗生素,因此根据对一组特征性的抗生素在用菌落裂解液处理前后存在数量的变化就可对ESBL和碳青霉烯酶是否在待测菌中表达进行判断。
在本发明中一组包括青霉素G、头孢西丁(头霉素类)、头孢曲松(三代头孢菌素)和美罗培南(碳青霉烯类)的抗生素分别与待测病原菌单菌落裂解液或上样缓冲液进行共孵育,其中抗生素与菌落裂解液或含有抑制剂的菌落裂解液共孵育样品为菌落液处理组;抗生素与上样缓冲液共孵育样品为无菌落液处理组;另外菌落裂解液及含有抑制剂的菌落裂解液组成背景组。共孵育(或称为预处理)15min后,用NDM-1酶热传感器对菌落液处理组和无菌落液处理组中各样品中抗生素进行分析。由于无菌落液处理组各抗生素样品中抗生素没有发生水解,所以水解百分率为0%。同时根据检测数值计算菌落液处理组各抗生素样品中抗生素水解百分率%(相对于无菌落液处理组各抗生素样品)。
由于菌落裂解液中存在一些细菌相关的蛋白及脂类成份及菌落裂解试剂相关成分,当抗生素与这些成分混合在一起的时候有时会微弱地降低酶热传感器对这些抗生素的检测效率从而导致检测信号有少量地减少,这样在计算抗生素在菌落裂解液处理后的水解率时根据待测菌的菌体成分不同会计算出少量的假水解率(一般情况下<10%,水平因不同菌株而不同)。这种情况在检测不产β-内酰胺酶菌株时也存在,且用EDTA和AVI共处理也无法消除。为排除这种假阳性,本方法把水解率20%设定阈值,其中≥20%的水解率为阳性水解,<20%的水解率为阴性水解。
由于碳青霉烯酶对青霉素类、头霉素类、三代头孢菌素和碳青霉烯抗生素都有水解活性,因此当菌落裂解液与青霉素G、头孢西丁、头孢曲松和美罗培南共孵育后各抗生素水解百分率≥20%时可判断待测菌为产碳青霉烯酶。另外阿维巴坦基本可对所有以丝氨酸为活性功能基团的碳青霉烯酶活性进行有效抑制;而EDTA则可对金属Zn2+为活性功能基团的碳青霉烯酶活性进行有效抑制,因此通过在待测样品组中加入EDTA、阿维巴坦或EDTA/阿维巴坦可进一步对所产碳青霉烯酶的功能基团种类进行判断。
由于ESBL对青霉素类、三代头孢菌素具有水解活性,但对头霉素类和碳青霉烯类抗生素没有水解活性。因此当菌落裂解液与青霉素G及头孢曲松共孵育后两种抗生素水解百分率≥20%,同时菌落裂解液与头孢西丁及美罗培南共孵育后两种抗生素水解百分率<20%时可判断待测菌为产ESBL。
由于产碳青霉烯酶耐药菌相对于产ESBL耐药菌具有更广泛的耐药谱,对于产碳青霉烯酶耐药菌的治疗方案对于产ESBL耐药菌也同样有效,因此在本方法中优先对碳青霉烯酶进行检测。如果待测菌通过检测确定为不产碳青霉烯酶耐药菌,那么再继续对该菌是否为产 ESBL进行检测。
与现有技术相比本发明具有以下优点:
本方法利用NDM-1酶热传感器对β-内酰胺抗生素高效、广谱的分析能力,结合ESBL或碳青霉烯酶对一组β-内酰胺抗生素的特征性水解图谱,以及不同β-内酰胺酶抑制剂对β-内酰胺酶功能基团的选择性抑制活性而建立了一种可以对经纯培养产生的单菌落同时进行产 ESBL和碳青霉烯酶耐药性分析的方法;
本方法根据待测耐药酶的种类不同可在1小时左右对待测菌株完成青霉素耐药性分析、产ESBL分析、产碳青霉烯酶分析及所产碳青霉烯酶亚类分析。并且对产ESBL菌和碳青霉烯酶菌的检测灵敏性相对于ESBL NDP法和Carba NP法提高10倍左右。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理示意图;
图2为EDTA对NDM-1酶热传感器检测NDM-1酶水解美罗培南活性的影响分析;
图3为阿维巴坦(AVI)对NDM-1酶热传感器检测CTX-M-14酶水解头孢曲松活性的影响分析;
图4为他唑巴坦(TAZ)对NDM-1酶热传感器检测CTX-M-14酶水解头孢曲松活性的影响分析;
图5为ESBLs NDP方法(A)与NDM-1酶热传感器(B、C)法对一株产ESBL耐药菌的检测敏感性比较;
图6为Carba NP方法(A)与NDM-1酶热传感器(B)法对一株产碳青霉烯酶耐药菌的检测敏感性比较;
图7为本发明建立的应用NDM-1酶热传感器快速、同时检测产ESBL和碳青霉烯酶耐药菌方法的流程图;
图8为用耐药基因型和耐药表型确定的23株临床菌株对NDM-1酶热传感器同时检测产 ESBL和碳青霉烯酶耐药菌的检测准确性进行回顾性评价;
图9为应用NDM-1酶热传感器检测法对一株青霉素敏感菌株(A)和一株产金属依赖碳青霉烯酶耐药菌(B)分别进行检测时所有相关检测反应的真实反应峰图。
具体实施方式
为了确定NDM-1酶热传感检测法是否可应用于检测产碳青霉烯酶和ESBL耐药菌,本发明首先通过实施例1~3评价(1)NDM-1酶热传感器是否可有效检测碳青霉烯酶和ESBL对其特征性水解底物美罗培南(一种碳青霉烯类抗生素)和头孢曲松(三代头孢类抗生素)的水解;(2)进一步评价各种β-内酰胺酶抑制剂(BLI)是否适合与NDM-1酶热传感器检测法联合应用以对碳青霉烯酶和ESBL酶活性进行确定,如果适合则要进一步确定各BLI可有效抑制碳青霉烯酶和ESBL水解美罗培南和头孢曲松的浓度。
适合与NDM-1酶热传感器检测法联合应用以确定碳青霉烯酶和ESBL酶活性的BLI需满足以下两个条件:
1.NDM-1酶热传感器法可有效检测该BLI对碳青霉烯酶对美罗培南或ESBL对头孢曲松水解的抑制;
2.该BLI被NDM-1酶热传感器检测时其自身不会产生明显的热信号,或随着BLI浓度的增加,BLI经NDM-1酶热传感器检测时只产生微弱的、固定强度的热信号。
从而在碳青霉烯酶与美罗培南或ESBL对头孢曲松预处理反应体系中存在该BLI时,该 BLI不会对NDM-1酶热传感器检测预处理物中剩余的抗生素产生明显的信号干扰,以保证检测的准确、可靠。
实施例1
评价NDM-1酶热传感器检测重组NDM-1酶水解美罗培南的有效性;金属依赖碳青霉烯酶抑制剂EDTA对NDM-1酶热传感器检测重组NDM-1酶活性的影响。
一、实验材料
重组NDM-1酶(实验室自制,纯度>95%,对美罗培南的单位水解活性为378000IU/L)、青霉素、美罗培南购自索莱宝公司、上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4浓度为10μM/L、HEPES浓度为50mM/L、NaCl浓度为150mM/L)。
二、实验仪器
NDM-1酶热传感器
三、NDM-1酶热传感器检测
根据表2用上样缓冲液配置以下各组实验样品,每个反应体系为50μL,室温孵育15min,之后用上样缓冲液稀释至500μL,用蠕动泵将上述样品泵入NDM-1酶热传感器,采集并记录电信号值。
四、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对两样品的检测信号数值进行比较,p<0.05代表两样品的检测信号数值差异显著。图中*,**和***分别表示P<0.05,0.01 和0.001。
表2
五、实验结果
结果如图2所示,NDM-1酶热传感器可以有效检测重组NDM-1酶对美罗培南的水解(空白柱相对于点柱),而四个不同浓度的EDTA(黑柱)都没有背景信号,最后在重组NDM-1酶存在及不存在的条件下NDM-1酶热传感器检测美罗培南和各浓度EDTA混合物所产生的电信号没有显著性差异(左斜线柱相对于横线柱)。这些数据表明NDM-1酶热传感器可以有效检测重组NDM-1酶对美罗培南的水解,所测4个浓度的EDTA本身被NDM-1酶热传感器检测时没有背景信号,且EDTA在4个检测浓度条件下都可完全抑制NDM-1对美罗培南的水解。因此EDTA适合与NDM-1酶热传感器检测法联合应用以检测金属依赖的碳青霉烯酶活性,且确定浓度为290mg/L的EDTA溶液为本研究使用抑制浓度。
实施例2
评价NDM-1酶热传感器检测CTX-M-14(一种代表性的ESBL酶)水解头孢曲松的有效性;丝氨酸依赖β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦(AVI)对NDM-1酶热传感器检测CTX-M-14酶活性的影响。
一、实验材料
CTX-M-14基因编码序列(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)、体外无细胞蛋白表达试剂盒(TnT SP6 Hight-Yield Wheat Germ Protein Expression System,Promega)、青霉素、头孢曲松购自索莱宝、上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4浓度为10μM、HEPES浓度为50 mM、NaCl浓度为150mM)
二、CTX-M-14的体外表达
CTX-M-14是ESBL的一种。使用Promega提供的体外无细胞蛋白表达试剂盒进行表达。具体步骤如下:
以合成的CTX-M-14基因为模板,利用聚合酶链式反应,扩增出带有SP6启动子的CTX-M-14基因。经过琼脂糖凝胶电泳验证所扩增的基因,验证大小正确后进行PCR产物回收。
首先,将PCR产物放置于1.5mL EP管中,加入PCR产物体积1/10的pH 5.2、3M的CH3COONa溶液,上下颠倒混匀;然后,加入4μL的DNA mate溶液,吹吸混匀,接着加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,吹吸混匀;4℃,12000rpm离心15min,弃掉上清,加入1mL-20℃预冷的70%乙醇,轻微震荡洗涤沉淀;然后4℃,12000rpm离心5min,去掉上清,置于超净台中干燥3min,加入30μL DEPC水,吹吸混匀,测定回收产物的浓度。
从-80℃取出分装好的30μLSP6 High-Yield Wheat Germ Master Mix置于冰上解冻,然后加入5-10μg PCR回收产物,加入DEPC水使其终体积为50μL,轻轻混匀,置于25℃金属浴中孵育2h,所得产物即为CTX-M-14,-20℃保存。
经分光光度计(安捷伦)检测,体外表达的CTX-M-14酶在30℃及含有10μM Zn2+,pH值为7.0的PBS缓冲液的条件下,对青霉素的单位水解活性为482.63IU/L。
三、NDM-1酶热传感器分析
根据表3用上样缓冲液配置各组实验样品,每个反应体系为50μL,室温孵育15min。之后用上样缓冲液稀释至500μL。用蠕动泵将上述样本泵入NDM-1酶热传感器,采集并记录电信号值。
四、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对两样品的检测信号数值进行比较,p<0.05代表两样品的检测信号数值差异显著。图中*,**和***分别表示P<0.05,0.01 和0.001。
表3
、实验结果
结果如图3所示,NDM-1酶热传感器可以有效检测CTX-M-14对头孢曲松的水解(空白柱相对于点柱)。而阿维巴坦本身只有微弱的背景信号产生,且信号强度不随浓度增加而增加 (黑柱)。最后阿维巴坦在浓度为125、250和500mg/L条件下都可完全抑制CTX-M-14对头孢曲松的水解(左斜线柱相对于横线柱)。这些数据表明NDM-1酶热传感器可以有效检测CTX-M-14对头孢曲松的水解。阿维巴坦(AVI)适合与NDM-1酶热传感器检测法联合应用以检测ESBL酶活性。
实施例3
评价丝氨酸依赖β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦(TAZ)对NDM-1酶热传感器检测CTX-M-14 酶活性的影响。
一、实验材料
无细胞体系体外表达的CTX-M-14(方法见实施例2)、头孢曲松和他唑巴坦购自索莱宝、上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4浓度为10μM、HEPES浓度为50mM、NaCl浓度为150mM)
二、NDM-1酶热传感器分析
根据表4用上样缓冲液配置以下各组实验样品,每个反应体系为50μL,室温孵育15min。之后用上样缓冲液稀释至500μL。用蠕动泵将上述样本泵入NDM-1酶热传感器,采集并记录电信号值。
三、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对两样品的检测信号数值进行比较,p<0.05代表两样品的检测信号数值差异显著。图中*,**和***分别表示P<0.05,0.01 和0.001。
表4
四、实验结果
结果如图4所示,他唑巴坦(TAZ)在浓度为25和50mg/L条件下都可完全抑制CTX-M-14 对头孢曲松的水解(左斜线柱相对于横线柱)。但是随着抑制剂TAZ浓度的升高,NDM-1酶热传感器对TAZ的检测信号也逐渐升高,且背景信号值较高。因此TAZ不满足上述与 NDM-1酶热传感器检测法联合应用以检测ESBL酶活性的条件。
综上所述,NDM-1酶热传感器可以有效检测碳青霉烯酶对碳青霉烯抗生素的水解以及ESBL对三代头孢菌素的水解。另外,EDTA和AVI适合与NDM-1酶热传感器检测法联合应用以检测碳青霉烯酶和ESBL酶活性。
ESBL NDP方法和Carba NP方法是近年来建立的、分别用于检测产ESBL耐药菌和碳青霉烯酶耐药菌的两种标准方法。相对于传统的菌培养方法具有检测简单、快速、灵敏的特征,可在两小时内完成检测。两种检测方法的抗生素底物分别是噻孢霉素(cefotaxime)和亚胺培南(Imipenem)。其检测原理是在含有噻孢霉素或亚胺培南的弱碱性(pH 7.8)反应体系中指示剂酚红呈红色,待测细菌裂解液加入后当裂解液内存在ESBL或是碳青霉烯酶时,这两种酶将水解噻孢霉素或亚胺培南,从而导致反应体系pH值降低,当降低到中性或酸性时酚红颜色将变成黄色,而当菌裂解液中不存在ESBL或碳青霉烯酶时,反应体系将一直保持红色。从而可通过反应后反应体系的颜色来判定待测菌是否产ESBL或是碳青霉烯酶。为评价 NDM-1生物传感器检测法对产ESBL或碳青霉烯酶耐药菌的检测灵敏性,本发明在实施例4 和实施例5中分别以ESBL NDP法和Carba NP法为参考方法,以含有相同菌数量的菌裂解液为检测对象,平行比较NDM-1酶热传感器检测法和ESBL NDP法或Carba NP法的检测灵敏性。
实施例4
以ESBL NDP方法为参考方法,对本发明所应用的NDM-1酶热传感器检测法检测产ESBL耐药菌的灵敏性进行评价和比较。
我们以一株产ESBL酶(但不产碳青霉烯酶)临床耐药菌株为检测对象,以一株不产β- 内酰胺酶的大肠杆菌EC600为阴性对照,以ESBLs NDP方法为参考评价方法,评价NDM-1酶热传感器法可检测该耐药菌降解噻孢霉素(一种三代头孢菌素抗生素)的临界数量。
一、实验材料
以一株产ESBL临床耐药菌为实验菌株,以一株不产ESBL和碳青霉烯酶的大肠杆菌EC600为阴性对照菌株。以上两种菌株均为发明人实验室保存。上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4浓度为10μM、HEPES浓度为50mM、NaCl浓度为150mM)、B-PERII菌裂解液(ThermoFisher)、酚红、噻孢霉素和BHI培养基购自索莱宝公司。
二、细菌裂解液的制备
将待测菌株接种于青霉素G(2μg/mL)抗性的BHI液体培养基、阴性对照菌株EC600接种于BHI液体培养基中,37℃,220r/min摇床中过夜培养。次日,待其生长到OD600值为0.8-1.2时,各取少量菌液通过系列稀释培养法检测菌落形成单位浓度(CFU/mL),剩余菌液待测菌株和阴性对照菌株各取1mL,5000g离心10min,后去掉上清,用50μL上样缓冲液将细菌重悬,然后加入等体积的B-PERⅡ菌裂解液,吹吸混匀,孵育5min,将孵育后的产物15000g离心3min,取上清即为细菌裂解液。
经系列稀释培养法测定实验菌和阴性对照菌的菌落形成单位浓度分别为5.9x109CFU/mL 和4.8x109 CFU/mL。对实验菌的细菌裂解液进行2倍系列稀释,使10μL稀释的细菌裂解液中分别含有由5.9×108、3.0×108、1.5×108、7.4×107、3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU实验菌裂解产出的裂解液;对阴性对照菌制备的细菌裂解液进行稀释,使10μL稀释的细菌裂解液中含有由5.9×108CFU阴性对照菌裂解产出的裂解液。
三、ESBLs NDP方法检测菌裂解释放的ESBL酶对噻孢霉素的反应
以0.5%酚红液稀释噻孢霉素至终浓度为3000mg/L(pH值7.8),90μL/孔加入到96孔板多个孔中。这些孔分为2组进行实验,分别为阴性对照菌组及实验菌组。其中阴性对照菌组为1孔,加入10μL阴性对照菌裂解稀释液(含5.9×108CFU对照菌裂解液);其中实验菌组为7孔,加入10μL实验菌裂解稀释液,分别含有5.9×108、3.0×108、1.5×108、7.4×107、3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU实验菌裂解产出的裂解液。另外实验另设一孔为不含噻孢霉素的空白对照孔,体积为100μL,含pH值为7.8的0.5%酚红液和10μL实验菌裂解稀释液(产自5.9×108CFU实验菌裂解液)。37℃孵育30min,拍照记录颜色变化,若噻孢霉素与酶发生水解反应则颜色由红色变为黄色。
四、NDM-1酶热传感器检测菌裂解释放的酶对噻孢霉素的反应
用上样缓冲液稀释噻孢霉素至3000mg/L,以90μL/管加入到1.5mL微量离心管中。这些管分为3组进行实验,分别为阴性对照菌组、实验菌组及无菌液对照组。其中阴性对照菌组为1管,加入10μL阴性对照菌裂解稀释液(含5.9×108CFU对照菌裂解液);其中实验菌组为7管,加入10μL实验菌裂解稀释液,分别含有5.9×108、3.0×108、1.5×108、7.4×107、3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU实验菌裂解产出的裂解液;其中无菌液对照组加入10μL上样缓冲液。另外实验另设一组只含菌裂解稀释液但不含噻孢霉素的空白对照样品,体积为100 μL,含90μL上样缓冲液和10μL实验菌或阴性对照菌裂解稀释液。其中实验菌裂解稀释液分别含有5.9×108、3.0×108、1.5×108、7.4×107、3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU实验菌裂解产出的裂解液,阴性对照菌裂解稀释液含有5.9×108CFU阴性对照菌产出的裂解液。实验中含有噻孢霉素的样品每次反应设置三个重复。37℃孵育30min,用样品稀释液将各管液体稀释至500μL,用NDM-1酶热传感器对各样品进行检测,采集并记录电信号值。
五、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对两样品间噻孢霉素水解率进行比较,p<0.05代表两样品的噻孢霉素水解率差异显著。*,**和***分别表示P<0.05,0.01 和0.001。
六、实验结果
以NDM-1酶热传感器检测实验菌或阴性对照菌裂解稀释液各样品中噻孢霉素水解率的计算方法为噻孢霉素水解率(%)=[噻孢霉素样品电信号值-(菌裂解液预处理噻孢霉素样品电信号值-菌裂解液样品电信号值)]/噻孢霉素样品电信号值×100%。为了有效排除低水平假水解反应导致结果判定错误(具体原因如说明书中本方法检测原理部分第3段所述),在本发明中把水解率20%设定阈值,其中≥20%的水解率为阳性水解,<20%的水解率为阴性水解。
ESBLs NDP方法结果显示空白对照样品没有颜色变化;实验组中菌数值为5.9×108、 3.0×108、1.5×108CFU的实验菌细菌裂解液样品孔颜色由红色变为黄色,菌数为7.4×107CFU 的实验菌细菌裂解液样品孔颜色由红色变为橙红色,而菌数为3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU 的实验菌株细菌裂解稀释液样品孔颜色仍为红色;无菌落液处理组阴性对照细菌裂解稀释液样品也保持红色,没有颜色变化(如图5.A)。这些数据表明ESBL NDP方法在实验菌裂解稀释液与噻孢霉素反应半小时后对实验菌的检测敏感性为1.5×108CFU。NDM-1酶热传感器检测各样品的真实反应电信号峰图见图5.B,其结果显示,NDM-1酶热传感器在检测5.9×108、 3.0×108、1.5×108、7.4×107、3.7×107、1.8×107、9.2×106CFU的实验菌裂解稀释液对噻孢霉素的处理样品时都能检测到>20%的噻孢霉素水解率,但含有5.9×108CFU阴性对照菌裂解液与噻孢霉素处理的样品噻孢霉素平均水解率为8%(如图5.C)。这些数据表明NDM-1酶热传感器可对低至9.2×106CFU实验菌内的ESBL介导的噻孢霉素水解进行有效检测。
这些数据表明,NDM-1酶热传感器能检测到更少细菌裂解所释放的酶与噻孢霉素的反应,检测敏感性为ESBLs NDP方法的16倍。综上所述,对一株产ESBL酶耐药菌的检测,NDM-1酶热传感器法与ESBLs NDP法相比,具有更显著的检测敏感性。
实施例5
以Carba NP方法为参考方法,对本发明所应用的NDM-1酶热传感器检测法检测产碳青霉烯酶耐药菌的灵敏性进行评价和比较。
我们以一株产碳青霉烯酶临床耐药菌株为检测对象,以一株不产碳青霉烯酶的大肠杆菌 EC600为阴性对照,以Carba NP方法为参考评价方法,评价NDM-1酶热传感器法可检测该耐药菌降解亚胺培南(一种碳青霉烯类抗生素)的临界数量。
一、实验材料
以一株产碳青霉烯酶临床耐药菌为实验菌株,以一株不产碳青霉烯酶的大肠杆菌EC600 为阴性对照菌株。以上两种菌株均为发明人实验室保存。上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4 浓度为10μM、HEPES浓度为50mM、NaCl浓度为150mM)、B-PERII菌裂解液(ThermoFisher)、酚红、亚胺培南和BHI培养基购自索莱宝公司。
二、菌落裂解液的制备
将实验菌株接种于美罗培南(2μg/mL)抗性的BHI液体培养基、阴性对照菌株EC600接种于BHI液体培养基中,37℃,220r/min摇床中过夜培养。次日,待其生长到OD600值为0.8-1.2时,各取少量菌液通过系列稀释培养法检测菌落形成单位浓度(CFU/mL),在实验菌株和阴性对照菌株的剩余菌液中各取1mL,5000g离心10min,去掉上清,然后加入50μL 的上样缓冲液将细菌重悬,然后加入50μL的B-PERⅡ菌裂解液,吹吸混匀,孵育5min,将孵育后的产物15000g离心3min,取上清即为细菌裂解液。
经系列稀释培养法测定实验菌和阴性对照菌的细菌浓度分别为4.2×1010CFU/mL和 4.8×109CFU/mL,对实验菌的细菌裂解液进行2倍系列稀释,使10μL稀释的细菌裂解液中分别含有由4.3×109、2.2×109、1.1×109、5.4×108、2.7×108、1.3×108、6.6×107CFU实验菌裂解产出的裂解液;对阴性对照菌制备的细菌裂解液进行稀释,使10μL稀释的细菌裂解液中含有由5.9×108CFU对照菌裂解产出的裂解液。
三、Carba NP方法检测菌裂解释放的酶对亚胺培南的反应
以0.5%酚红液稀释亚胺培南至终浓度为3000mg/L(pH值7.8),90μL/孔加入到96孔板多个孔中。这些孔分为2组进行实验,分别为阴性对照菌组及实验菌组。其中阴性对照菌组为1孔,加入10μL阴性对照菌裂解稀释液(含5.9×108CFU阴性对照菌裂解液);其中实验菌组为7孔,加入10μL实验菌裂解稀释液,分别含有4.3×109、2.2×109、1.1×109、5.4×108、 2.7×108、1.3×108、6.6×107CFU实验菌裂解产出的裂解液。另外实验另设一孔为不含亚胺培南的空白对照孔,体积为100μL,含pH值为7.8的0.5%酚红液和10μL实验菌裂解稀释液 (产自4.3×109CFU实验菌裂解液)。37℃孵育30min,拍照记录颜色变化,若亚胺培南与酶发生水解反应则颜色由红色变为黄色。
四、NDM-1酶热传感器检测菌裂解释放的酶对亚胺培南的反应
用上样缓冲液稀释亚胺培南至3000mg/L,以90μL/管加入到1.5mL微量离心管中。这些管分为3组进行实验,分别为阴性对照菌组、实验菌组及无菌液对照组。其中阴性对照菌组为1管,加入10μL对照菌裂解稀释液(含5.9×108CFU对照菌裂解液);其中实验菌组为7管,加入10μL实验菌裂解稀释液,分别含有4.3×109、2.2×109、1.1×109、5.4×108、2.7×108、 1.3×108、6.6×107CFU实验菌裂解产出的裂解液;其中无菌液对照组加入10μL上样缓冲液。另外实验另设一组只含菌裂解稀释液但不含噻孢霉素的空白对照样品,体积为100μL,含90 μL上样缓冲液和10μL实验菌或对照菌裂解稀释液。其中实验菌裂解稀释液分别含有 4.3×109、2.2×109、1.1×109、5.4×108、2.7×108、1.3×108、6.6×107CFU实验菌裂解产出的裂解液,对照菌裂解稀释液含有5.9×108CFU对照菌产出的裂解液。实验中含有亚胺培南的样品每次反应设置三个重复。37℃孵育30分钟,用样品稀释液将各管液体稀释至500μL,用 NDM-1酶热传感器对各样品进行检测,采集并记录电信号值。
五、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对两样品间亚胺培南水解率进行比较,p<0.05代表两样品的亚胺培南水解率差异显著。*,**和***分别表示P<0.05,0.01 和0.001。
六、实验结果
以NDM-1酶热传感器检测实验菌或阴性对照菌裂解稀释液各样品中亚胺培南水解率的计算方法为亚胺培南水解率(%)=[亚胺培南样品电信号值-(菌裂解液预处理亚胺培南样品电信号值-菌裂解液样品电信号值)]/亚胺培南样品电信号值×100%。在本发明中把水解率20%设定阈值,其中≥20%的水解率为阳性水解,<20%的水解率为阴性水解。具体原因如说明书中本方法检测原理部分第3段所述。
Carba NP方法结果显示空白对照组没有颜色变化;实验组中菌数值分别为4.3×109、 2.2×109的临床菌株细菌裂解液与亚胺培南发生了水解反应,颜色由红色变为黄色;无菌落液处理组阴性对照细菌裂解液样品孔仍为红色,没有颜色变化(如图6A)。这些数据表明Carba NP方法在实验菌裂解液与亚胺培南反应半小时后对实验菌的检测敏感性为2.2×109CFU。 NDM-1酶热传感器检测结果显示,NDM-1酶热传感器在检测4.3×109、2.2×109、1.1×109、 5.4×108、2.7×108CFU的实验菌裂解稀释液对亚胺培南的处理样品时都能检测到>20%的亚胺培南水解率,但含有5.9×108CFU对照菌裂解液与亚胺培南处理的样品亚胺培南平均水解率为7%(如图6B)。另外,对于接入1.3×108、6.6×107CFU这两个剂量实验菌裂解稀释液的样品,两个样品的亚胺培南水解率虽然高于对照菌裂解稀释液处理亚胺培南样品的水解率,但是由于这两个样品间的水解率没有显著性差异,所以很难判断这两个样品中亚胺培南是否发生了真正的水解,因此对于实验菌裂解稀释液可以发生有效降解亚胺培南的细菌数量确定为 2.7×108CFU。这些数据表明NDM-1酶热传感器可对低至2.7×108CFU的实验菌内的碳青霉烯酶介导的亚胺培南水解进行有效检测。
这些数据表明,NDM-1酶热传感器检测法相对于Carba NP法对于一株产碳青霉烯酶耐药菌的检测灵敏性提高8倍以上。
实施例6
NDM-1酶热传感器检测法检测准确性测试:将13株表型和基因型预先确定的ESBL或碳青霉烯酶产生菌和10株青霉素敏感菌株(表5)单菌落进行裂解、裂解稀释液与抗生素进行处理,并对处理后产物以NDM-1酶热传感器进行检测,确定该菌株是否产β-内酰胺酶,如果是的话并进一步确定所产β-内酰胺酶是否为ESBL或碳青霉烯酶。
表5 23株临床来源耐药菌株耐药相关背景信息
一、实验材料
本实施例中所使用的菌株样品R1-R13、S1-S10受赠于山西省儿童医院。这些临床菌株通过VITEK 2system(bioMérieux,France)进行药敏实验初步判定菌株R1-R3为产ESBL耐药菌,菌株R4-R13为产碳青霉烯酶耐药菌,菌株S1-S10为青霉素类抗生素敏感型耐药菌。对于菌株R1-R13又通过分子生物学方法和纸片扩散法对ESBL和碳青霉烯酶的基因型和耐药表型进行确认。最后通过协同抑制试验对碳青霉烯酶的功能基团类型进行检测,确认出R4-R7为产丝氨酸类碳青霉烯酶耐药菌,R8-R13为产金属类碳青霉烯酶耐药菌。这些临床耐药菌株的耐药背景信息详见表5。
上样缓冲液(pH值为7.5、ZnSO4浓度为10μM、HEPES浓度为50mM、NaCl浓度为150mM)、B-PER II菌裂解液(Thermo Fisher)、青霉素G、美罗培南、头孢西丁、头孢曲松、BHI培养基购自索莱宝公司,阿维巴坦购自MCE公司,EDTA购自上海生工公司。
二、菌落裂解液的制备
分别用10μL接种环在新鲜的、长有经敏感性分析,预先确定的青霉素敏感菌(S1-S10) 的菌培养皿或在新鲜的、长有经纸片扩散法和PCR法鉴定,预先确定的ESBL或碳青霉烯酶产生菌(R1-R13)的菌培养皿上挑取待测菌一环,然后加入50μL上样缓冲液,轻吹将菌吹散重悬,然后加入50μL的B-PERⅡ菌裂解液,吹吸混匀,室温孵育5min,将孵育后的产物15000g离心3min,上清即为细菌菌落裂解液。
三、NDM-1酶热传感器分析
根据图7示意流程图应用NDM-1酶热传感器对临床菌株是否产ESBL和碳青霉烯酶同时进行检测,详细步骤如下:
1)将青霉素G与菌落裂解液,青霉素G与菌落裂解液、阿维巴坦及EDTA在上样缓冲液中混合制备成样品A+E和A+H;将头孢西丁与菌落裂解液,头孢曲松与菌落裂解液在上样缓冲液中混合制备成样品B+E和C+E;将美罗培南与菌落裂解液,美罗培南与菌落裂解液及阿维巴坦,美罗培南与菌落裂解液及EDTA,美罗培南与菌落裂解液、阿维巴坦及EDTA 在上样缓冲液中混合制备成样品D+E,D+F,D+G和D+H,组成菌落液处理组。将菌落裂解液,菌落裂解液与阿维巴坦,菌落裂解液与EDTA,菌落裂解液与阿维巴坦及EDTA在上样缓冲液中混合制备成样品E,F,G和H,组成背景组。以上菌落液处理组和背景组中各样品体积均为50μL,样品中青霉素G、头孢曲松、头孢西丁及美罗培南的浓度均为2000mg/L;阿维巴坦的浓度为25mg/L;EDTA的浓度为290mg/L。各样品在37℃孵育15min后用上样缓冲液稀释至终体积500μL。
2)在制备菌落裂解液和1)中以菌落裂解液对抗生素进行预处理的过程中,将青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南与上样缓冲液进行稀释到50μL,浓度均为2000mg/L,分别组成样品A、B、C和D,组成无菌落液处理组。用上样缓冲液把样品A、B、C、D稀释到 500μL,再把样品A、B、C和D的稀释液泵入NDM-1酶热传感器,检测青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南在无菌落裂解预处理情况下反应信号值。
3)将步骤1)中的样品A+E稀释液和样品E稀释液泵入NDM-1酶热传感器,检测样品A+E中青霉素G存留量及样品E中菌落裂解液在无抗生素存在条件下通过NDM-1酶热传感器时所产生的背景信号强度,再结合样品A中无菌落液预处理时青霉素G的信号强度进行计算。若样品A+E中青霉素G的水解率≥20%,则初步判定该菌为产β-内酰胺酶耐药菌,继续进行深入检测步骤,按步骤4进行,对该菌是否产ESBL和碳青霉烯酶进行分析;若样品 A+E中青霉素G的水解率<20%,后续则按步骤7)进行;
4)将步骤1)稀释后的样品D+E泵入NDM-1酶热传感器,检测美罗培南在用菌落裂解液预处理后美罗培南的存留量,再结合步骤2)稀释后样品D中无菌落液预处理时美罗培南的反应信号值和步骤1)稀释后的样品E的菌落液背景信号强度进行计算。若样品D+E中美罗培南的水解率≥20%,判定该菌为产碳青霉烯酶耐药菌,后续则按步骤5)进行,进一步对所产碳青霉烯酶的种类进行检测,而不再对其是否产ESBL酶进行判断;若样品D+E中美罗培南的水解率<20%,后续则按步骤6进行,对该菌是否产ESBL酶进行检测;
5)将步骤1)中稀释后的样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品F、样品G和样品H 泵入NDM-1酶热传感器,检测样品D+F,D+G和D+H中美罗培南的存留量及背景组各样品中的背景信号强度,再结合步骤2)中稀释后样品D美罗培南的反应信号值及步骤4)中样品 D+E仅用菌落液预处理后美罗培南的存留量进行计算。若样品D+F中美罗培南的水解率显著小于样品D+E和样品D+G,而与样品D+H没有显著差异,且样品D+E和样品D+H水解率≥20%,则判定该菌为产丝氨酸依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+G中美罗培南的水解率显著小于样品D+E和样品D+F,而与样品D+H没有显著差异,且样品D+E和样品D+F水解率≥20%,则判定该菌为产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+H中美罗培南的水解率均显著低于样品D+E、样品D+F和样品D+G中美罗培南的水解率,且样品D+E、样品D+F 和样品D+G水解率≥20%,则判定该菌为同时产丝氨酸依赖和产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;
6)将步骤1)中稀释后的样品B+E和样品C+E分别泵入NDM-1酶热传感器检测两个样品中头孢西丁和头孢曲松的剩余量,结合步骤2)样品B和样品C中头孢西丁和头孢曲松在无菌落液预处理时的检测信号值及步骤3)样品E中菌落液的背景信号进行计算,若样品B+E头孢西丁的水解率<20%,同时样品C+E中头孢曲松的水解率≥20%,则判定该菌为产ESBL酶耐药菌;
7)将步骤1)中稀释后的样品A+H泵入NDM-1酶热传感器,检测菌落裂解液中存在抑制剂阿维巴坦和EDTA的情况下青霉素G的水解率。若样品A+H中青霉素G的水解率显著低于样品A+E的水解率,则后续按步骤4)到6)继续进行分析,若样品A+H中青霉素G 的水解率与样品A+E中青霉素G的水解率没有显著差异,判定该菌为非产β-内酰胺酶菌。
四、统计分析
应用Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计分析,应用t检验对菌落裂解液预处理的抗生素样品和抑制剂/菌落裂解液共预处理的抗生素样品间抗生素水解率进行比较,p<0.05代表两样品间的抗生素水解率差异显著。*,**和***分别表示P<0.05,0.01和0.001。
五、实验结果
所测抗生素水解率按如下公式进行计算,抗生素水解百分率(%)=[抗生素在无菌落液处理组中的电信号-(抗生素在菌落液处理组中以含有某背景样品的菌落液处理后电信号-背景组某背景样品的电信号)]/抗生素在无菌落液处理组中的电信号x100。若水解率≥20%认为该菌对相应抗生素有水解作用;若水解率小于20%则认为该菌对相应抗生素无水解作用。
先将上述临床菌株的菌落裂解液按上述方法步骤1)进行预孵育。在预孵育的过程中将青霉素G(样品A)、头孢西丁(样品B)、头孢曲松(样品C)及美罗培南(样品D)按照上述方法步骤2)进行检测,这四个抗生素上样时无特定的顺序。
当青霉素G与临床S1-S10菌株菌落裂解液预处理样品(样品A+E),S1-S10菌株菌落裂解液样品(样品E)通过蠕动泵泵入NDM-1酶热传感器时,结合步骤2)中测得的样品A反应信号值,计算出S1-S10样品中各个菌落裂解液对青霉素G的水解率在1%-9%之间,均<20%;随后将青霉素G与S1-S10菌株菌落裂解液(S1-S10)及EDTA/阿维巴坦共预处理样品(样品A+H),S1-S10菌株裂解液与EDTA/阿维巴坦预处理样品(样品H)通过蠕动泵泵入 NDM-1酶热传感器,计算出S1-S10菌株菌裂解液在用阿维巴坦和EDTA抑制剂预处理条件下对青霉素G的水解率在0%-6%之间,与无阿维巴坦和EDTA抑制剂预处理条件下相同菌裂解对青霉素G的水解率没有显著差异。因此10株青霉素敏感菌株对青霉素G低水平的水解率为假水解率。(如表6、图8A)。根据该检测结果可以判定S1-S10菌株不产β-内酰胺酶。图 9A为应用NDM-1酶热传感器检测法对一株青霉素敏感菌株进行检测时所有相关检测反应的真实反应峰图。
当青霉素G与临床菌株R1-R13的菌落裂解液的预处理样品(样品A+E),R1-R13菌株菌落裂解液样品(样品E)以NDM-1酶热传感器进行检测时,结合步骤2)中测得的样品A 反应信号值,计算出各菌株菌落裂解液对青霉素G的水解率在47%-100%之间,均>20%;随后将美罗培南与R1-R13菌株菌落裂解液的预处理样品(样品D+E)通过蠕动泵泵入NDM-1 酶热传感器时,检测到R1-R3菌落裂解液对美罗培南的水解率均为0%,R4-R13菌落裂解液对美罗培南的水解率在45%-100%之间,均>20%。根据该检测结果可以判定R1-R3菌株为不产碳青霉烯酶的青霉素耐药菌株,R4-R13菌株为产碳青霉烯酶的青霉素耐药菌株。
其后将R1-R3菌落裂解液分别与头孢西丁及头孢曲松的预处理样品(样品B+E和样品 C+E)通过蠕动泵泵入NDM-1酶热传感器检测,观察到R1-R3菌落裂解液对头孢西丁的水解率在0%-4%之间,均<20%,对头孢曲松的水解率在80%-90%之间,均>20%,从而鉴定出R1-R3菌株为产ESBL耐药菌(如表7、图8B)。
将R4-R13菌株菌落裂解液分别与阿维巴坦(样品F),EDTA(样品G),阿维巴坦/EDTA(样品H),美罗培南/阿维巴坦(样品D+F),美罗培南/EDTA(样品D+G),美罗培南/阿维巴坦 /ETDA(样品D+H)的预处理样品液通过蠕动泵泵入NDM-1酶热传感器时,检测到R4-R7 菌落裂解液对美罗培南的水解率在阿维巴坦存在或EDTA/阿维巴坦共存在的条件下在 2%-14%之间,均<20%;在EDTA存在的条件下,美罗培南的水解率在50%-90%之间,对美罗培南的水解率没有显著影响,因此鉴定R4-R7为产丝氨酸依赖的碳青霉烯酶耐药菌(如表8、图8C)。检测到R8-R13菌落裂解液对美罗培南的水解率在EDTA存在条件下或EDTA/ 阿维巴坦共同存在条件下在1%-17%之间,均<20%;在阿维巴坦存在的条件下,美罗培南水解率在50%-100%之间,对美罗培南的水解率没有显著影响,因此鉴定R8-R13为产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌(如表9、图8D)。图9B为应用NDM-1酶热传感器检测法对一株产金属依赖碳青霉烯酶耐药菌进行检测时所有相关检测反应的真实反应峰图。
对于不产β-内酰胺酶菌的检测整个检测过程中:(1)菌落裂解及菌落裂解液上清的获取需8min;(2)菌落裂解液与各类抗生素预处理15min;在制备菌落裂解液和菌落裂解液与抗生素预处理的23分钟内,可以应用NDM-1酶热传感器完成对青霉素G(样品A)、头孢西丁 (样品B)、头孢曲松(样品C)及美罗培南(样品D)4个抗生素在无菌落液预处理条件下反应信号的检测,由于NDM-1酶热传感器对一个样品的检测时间约为5min,那么对4个抗生素的检测共需20min。(3)之后还需应用NDM-1酶热传感器完成对样品A+E、E、A+H 及H共4个样品用时20分钟的检测。由于对无菌落液处理组的青霉素G、美罗培南、头孢曲松和头孢西丁四个抗生素的检测是在裂解菌落和以菌落液对抗生素进行预处理的过程中同步进行无需额外花费时间,因此应用NDM-1酶热传感器完成不产β-内酰胺酶菌的检测整个过程一共需要8+15+20=43min。
对于产ESBL耐药菌的检测整个检测过程中:(1)菌落裂解及菌落裂解液上清的获取需 8min;(2)菌落裂解液与各类抗生素预处理15min;在制备菌落裂解液和菌落裂解液与抗生素预处理的23分钟内,可以应用NDM-1酶热传感器完成对青霉素G(样品A)、头孢西丁(样品B)、头孢曲松(样品C)及美罗培南(样品D)4个抗生素在无菌落液预处理条件下反应信号的检测,由于NDM-1酶热传感器对一个样品的检测时间约为5min,那么对4个抗生素的检测共需20min。(3)之后还需应用NDM-1酶热传感器完成对样品A+E、E、D+E、B+E 及C+E共5个样品25分钟的检测。由于对无菌落液处理组的青霉素G、美罗培南、头孢曲松和头孢西丁四个抗生素的检测是在裂解菌落和以菌落液对抗生素进行预处理的过程中同步进行无需额外花费时间,因此应用NDM-1酶热传感器完成产ESBL耐药菌的检测整个过程一共需要8+15+25=48min。
对于产碳青霉烯酶耐药菌的检测整个检测过程中:(1)菌落裂解及菌落裂解液上清的获取需8min;(2)菌落裂解液与各类抗生素预处理15min;在制备菌落裂解液和菌落裂解液与抗生素预处理的23分钟内,可以应用NDM-1酶热传感器完成对青霉素G(样品A)、头孢西丁(样品B)、头孢曲松(样品C)及美罗培南(样品D)4个抗生素在无菌落液预处理条件下反应信号的检测,由于NDM-1酶热传感器对一个样品的检测时间约为5min,那么对4个抗生素的检测共需20min。(3)之后还需应用NDM-1酶热传感器完成对样品A+E、E、D+E、 D+F、D+G、D+H、F、G和H共9个样品45分钟的检测。由于对无菌落液处理组的青霉素 G、美罗培南、头孢曲松和头孢西丁四个抗生素的检测是在裂解菌落和以菌落液对抗生素进行预处理的过程中同步进行无需额外花费时间,因此应用NDM-1酶热传感器完成产碳青霉烯酶耐药菌的检测并判断出碳青霉烯酶的活性功能基团的检测过程一共需要8+15+45=68 min。
综上所述,NDM-1酶热传感器检测产ESBL或碳青霉烯酶细菌所用时间在1个小时左右,表明该方法检测时间短,且检测灵敏度和特异性均为100%。
表6临床菌株S1-S10对抗生素的水解率
表7临床菌株R1-R3对抗生素的水解率
表8临床菌株R4-R7对抗生素的水解率
表9临床菌株R8-R13对抗生素的水解率
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述,以便于本技术领的技术人员理解本发明,但应该清楚,本发明不限于具体实施方式的范围,对本技术领域的普通技术人员来讲,只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内,这些变化是显而易见的,一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (10)
1.同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤1,对待测菌的单菌落取菌,加入到上样缓冲液内,轻轻吹散并重悬,然后加入等体积细菌裂解试剂,轻吹混匀并室温下处理,最后将处理后的产物离心,吸取上清液,即为菌落裂解液;
步骤2,将青霉素G、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品A+E;将青霉素G、菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:0.2:5.6混合制备成样品A+H;将头孢西丁、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品B+E;将头孢曲松、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品C+E;将美罗培南、菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:2:6混合制备成样品D+E;将美罗培南、菌落裂解液、阿维巴坦和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:5.8混合制备成样品D+F;将美罗培南、菌落裂解液、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:5.8混合制备成样品D+G;将美罗培南、菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:2:0.2:0.2:5.6混合制备成样品D+H;然后将样品A+E、样品A+H、样品B+E、样品C+E、样品D+E、样品D+F、样品D+G和样品D+H共同组成菌落液处理组,进行预处理;
将菌落裂解液和上样缓冲液以体积比为2:8混合制备成样品E;将菌落裂解液、阿维巴坦和上样缓冲液以体积比为2:0.2:7.8混合制备成样品F;将菌落裂解液、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:0.2:7.8混合制备成样品G;将菌落裂解液、阿维巴坦、EDTA和上样缓冲液以体积比为2:0.2:0.2:7.6混合制备成样品H;然后将样品E、样品F、样品G和样品H共同组成背景组,进行预处理;将菌落液处理组和背景组中的各样品再用上样缓冲液稀释8~12倍;
步骤3,在步骤1对菌落进行裂解及步骤2以菌落裂解液对抗生素进行预处理的过程中,将青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南分别和上样缓冲液以体积比2:8混合制备成样品A、B、C和D,共同组成无菌落液处理组;将样品A、B、C和D用上样缓冲液稀释8~12倍;然后将稀释后的样品分别泵入NDM-1酶热传感器,记录样品A、B、C和D在无菌落裂解液预处理时的反应信号;
步骤4,先将步骤2稀释后的样品A+E和样品E泵入NDM-1酶热传感器,检测A+E中青霉素G存留量及样品E中菌落裂解液在无抗生素存条件下通过NDM-1酶热传感器时所产生的背景信号强度,再结合样品A中无菌落液预处理时青霉素G的信号强度进行计算;若样品A+E中青霉素G的水解率≥20%,则初步判定该菌为产β-内酰胺酶耐药菌,继续进行深入检测步骤,按步骤5进行,对该菌是否产广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶进行分析;若样品A+E中青霉素G的水解率<20%,后续则按步骤8进行;
步骤5,将步骤2稀释后的样品D+E泵入NDM-1酶热传感器,检测样品中美罗培南的存留量,再结合步骤3稀释后样品D中无菌落液预处理时美罗培南的最初量和步骤4稀释后的样品E的菌落液背景信号强度进行计算;若样品D+E中美罗培南的水解率≥20%,判定该菌为产碳青霉烯酶耐药菌,后续则按步骤6进行,进一步对所产碳青霉烯酶的种类进行检测,而不再对其是否产广谱β-内酰胺酶进行判断;若样品D+E中美罗培南的水解率<20%,后续则按步骤7进行,对该菌是否产广谱β-内酰胺酶进行检测;
步骤6,将步骤2中稀释后的样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品F、样品G和样品H泵入NDM-1酶热传感器,检测样品D+F,D+G和D+H中美罗培南的存留量及背景组样品F、G和H的背景信号强度,再结合步骤3中稀释后样品D美罗培南的最初量及步骤5中样品D+E仅用菌落液预处理后美罗培南的存留量的进行计算;若样品D+F中美罗培南的水解率统计分析后小于样品D+E和样品D+G,而与样品D+H没有统计学差异,且样品D+E和样品D+H水解率≥20%,则判定该菌为产丝氨酸依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+G中美罗培南的水解率统计分析后小于样品D+E和样品D+F,而与样品D+H没有统计学差异,且样品D+E和样品D+F水解率≥20%,则判定该菌为产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;若样品D+H中美罗培南的水解率均在统计分析后低于样品D+E、样品D+F和样品D+G中美罗培南的水解率,且样品D+E、样品D+F和样品D+G水解率≥20%,则判定该菌为同时产丝氨酸依赖和产金属依赖的碳青霉烯酶耐药菌;
步骤7,将步骤2中稀释后的样品B+E和样品C+E分别泵入NDM-1酶热传感器,检测两个样品中头孢西丁和头孢曲松的剩余量,结合步骤3中样品B和样品C最初的头孢西丁和头孢曲松量及步骤4中样品E菌落液的背景信号进行计算,若样品B+E头孢西丁的水解率<20%,同时样品C+E中头孢曲松的水解率≥20%,则判定该菌为产广谱β-内酰胺酶耐药菌;
步骤8,将步骤2中稀释后的样品A+H泵入NDM-1酶热传感器,检测样品中青霉素G的水解率;若样品A+H中青霉素G的水解率统计分析后低于样品A+E的水解率,则后续按步骤4-7继续进行分析,若样品A+H中青霉素G的水解率与样品A+E中青霉素G的水解率没有统计学差异,判定该菌为非产β-内酰胺酶菌。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤1中上样缓冲液为含有50mM HEPES,150mM NaCl,10μM ZnSO4及pH为7.5的缓冲液;所述步骤1中细胞裂解试剂为B-PERⅡ细菌裂解液。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤1中室温处理的时间为3-10min;离心处理的离心力13000-15000g,离心处理的时间为3min。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤2中将菌落液处理组和背景组中的样品A+E、样品A+H、样品B+E、样品C+E、样品D+E、样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品E、样品F、样品G和样品H再用上样缓冲液稀释到终体积为400-600μL;所述步骤3中无菌落液处理组中样品A、B、C和D终体积为400-600μL。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤3~8中NDM-1酶热传感器的工作温度设置为30℃,其中放大器放大倍数为100倍。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤2预处理条件为室温~37℃,孵育10~60min。
7.根据权利要求6所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤2和步骤3中,样品A+E、样品A+H、样品B+E、样品C+E、样品D+E、样品D+F、样品D+G、样品D+H、样品A、样品B、样品C和样品D中青霉素G、头孢西丁、头孢曲松及美罗培南在预处理前浓度相同,浓度为2000~5000mg/L。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述步骤2中样品F、样品H、样品D+F和样品D+H中阿维巴坦的浓度为25mg/L;样品G、样品H、样品D+G和样品D+H中EDTA的浓度为290mg/L。
9.根据权利要求8所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:若水解率≥20%认为该菌对相应抗生素有水解作用;若水解率小于20%则认为该菌对相应抗生素无水解作用。
10.根据权利要求9所述的一种同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法,其特征在于:所述抗生素的水解率计算公式为:
抗生素水解百分率(%)=[抗生素在无菌落液处理组中的电信号-(抗生素在菌落液处理组中以含有某背景样品的菌落液处理后电信号-背景组某背景样品的电信号)]/抗生素在无菌落液处理组中的电信号x100。
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