CN105861630A - 用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括步骤:a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含‑碳青霉烯酶底物,选自碳青霉烯和头霉素,‑pH颜色指示剂,当反应混合物的pH为6.4‑8.4时,所述pH颜色指示剂将改变颜色,其中步骤b)后的颜色变化表示所述测试样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。本发明还涉及试剂盒、涉及微量滴定板以及涉及它们在检测样品中存在碳青霉烯酶产生者中的用途。

Description

用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法
本申请是申请日为2012年6月21日、申请号为201280030398.2、发明名称为“用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法。
发明背景
在全世界越来越多地鉴定产生碳青霉烯酶的细菌分离物(即碳青霉烯酶产生者)(1-3)。它们的早期检测成为预防其传播并且保存成为用于治疗严重感染的最后依靠的抗生素的碳青霉烯的功效的临床微生物学范围的主要问题(4)。事实上,碳青霉烯酶通常与许多产生多药耐药性和泛耐药性的其他非β内酰胺耐药决定因素相关。此外,由于现有人群的交换和移动,碳青霉烯酶产生者的早期识别成为强制性的,无论多药耐药的医院感染采取哪一种抗生素政策或速度。
大多数已获得的碳青霉烯酶属于β内酰胺酶的四种已知种类的三种,即安布勒A类、安布勒B类(金属β内酰胺酶(MBL))和安布勒D类(苯唑西林酶(OXA))。这三类碳青霉烯酶为碳青霉烯赋予显著的临床耐药性或为碳青霉烯赋予降低的易感性(1-4)。因此,来自这三类碳青霉烯酶的产生碳青霉烯酶的细菌分离物已经同时涉及医院和社区获得性感染。
三类不同的碳青霉烯酶的传播在全世界显著不同。例如,KPC产生者(安布勒A类)大多数在美国和南欧鉴定,而IMP、VIM、NDM-1(安布勒B类)在全世界广泛鉴定,其中NDM-1的主库在印度次大陆。至于OXA-48-样酶(安布勒D类),其至少在地中海海岸的南部和东部且最近在欧洲鉴定(5)。
目前,存在两种检测碳青霉烯酶产生者的方法。第一,可以使用体内产生碳青霉烯酶的基于表型的技术,例如和“Hodge测试”(4)。是一种测定许多微生物的抗菌易感性的定量技术。该系统包含用于测定抗微生物的不同的抗菌剂的最低抑菌浓度(MIC,μg/mL)的预定义的抗生素梯度,所述最低抑菌浓度在琼脂培养基上采用过夜培养来测试。至于“Hodge测试”,当分离物产生酶并允许碳青霉烯易感菌株向着碳青霉烯圆盘生长时,检测到碳青霉烯酶产生。“Hodge测试”的结果是特有的苜蓿叶样缺口。然而,令人遗憾地,这些基于表型的技术既不灵敏也不足以特异性。在很多情况下,已经报告假阳性。或者,可以使用用于碳青霉烯酶的分子检测技术。然而,该技术仍然相当昂贵,且需要极度的专业知识。基于表型的技术和分子检测技术的最终缺点都是它们是耗时的(12到24h),因此不满足实施避免医院疾病爆发的发展的预防分离测量所需的临床要求(4)。
之前的工作采用显色头孢菌素例如头孢硝噻吩和CENTA进行β内酰胺酶鉴定(6,7)。然而,这些显色底物分子不能特异性检测碳青霉烯酶;它们检测任何β内酰胺酶,不管其水解特征。至于Cica-β测试,该测试采用显色头孢菌素HMRZ-86以及特异性抑制剂。尽管该测试可以检测MBL产生者,但是它还需要培养步骤。事实上,病原体首先必须在适当的非选择性培养基上分离,然后进行测试。然后,仅使用分离的菌落以避免污染和确保生物体是纯的。已经使用其他测试,例如采用苄青霉素作为底物的碘量滴定的测试和酸量滴定的测试,但是对于检测碳青霉烯酶也是非特异性的(6)。最后,采用包含淀粉琼脂的亚胺培南的技术也用于检测MBL活性(8)。然而,这最后一种技术需要蛋白质萃取、部分β内酰胺酶纯化、电泳迁移以及β内酰胺酶领域的广泛知识。因此,它是耗时的且通常仅保留用于研究目的。
为促进临床微生物学领域内碳青霉烯酶产生者的检测,申请人开发了一种基于简单的酸比色技术的新方法。该方法基于以下概念:通过水解碳青霉烯酶底物的β内酰胺环,碳青霉烯酶产生羧基,其反过来酸化介质。然后,由该水解产生的酸性通过pH颜色指示剂的颜色变化来鉴定(9)。
该方法帮助区分碳青霉烯酶产生者和由非碳青霉烯酶介导的机制例如联合耐药性机制(例如外膜渗透性缺陷、头孢菌素酶的过度产生、克拉维酸抑制的ESBL...)产生的碳青霉烯耐药的那些或区分碳青霉烯酶产生者和表达广谱β内酰胺酶而不具有碳青霉烯酶活性的菌株(ESBL、质粒和染色体编码的头孢菌素酶)(10)。
可解释的结果在非常短的时间内获得,当设计碳青霉烯酶产生者的容量测量时,这是关键的。它消除了采用或“Hodge测试”技术的需要,如之前所提及,所述技术既不特异性也不灵敏,且其在获得可解释的结果之前需要另外的18个小时。
该方法提供了一种检测任何类型的碳青霉烯酶产生者的快速、可靠和可负担的方法。此外,它是特异性和灵敏的。它也可以经历产业化过程,使得其可在全世界任何临床微生物学实验室中进行,而实验室技术人员无需大量额外的工作量。
此外,在流行病学领域,当需要快速选择应该通过PCR测试并测序从而鉴定碳青霉烯酶基因的菌株时,使用该方法可能是进一步有用的。
发明概述
本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括步骤:a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含
-碳青霉烯酶底物,选自碳青霉烯和头霉素,
-pH颜色指示剂,当反应混合物的pH为6.4-8.4时,所述pH颜色指示剂将改变颜色,
其中步骤b)后的颜色变化表示所述测试样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。
本发明也涉及试剂盒,包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物和pH颜色指示剂,以及所述试剂盒在检测测试样品中存在碳青霉烯酶产生者的用途。
本发明也涉及微量滴定板,其包含孔或一系列孔,所述孔包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物,和所述微量滴定板在检测测试样品中存在碳青霉烯酶产生者的用途以及所述微量滴定板在最终测定存在于测试样品中的碳青霉烯酶的具体种类的用途。
发明详述
定义:
如本文所使用,“测试样品”是指可包含产生碳青霉烯酶的细菌的待测试的任何液体或固体材料。通常,细菌菌落可与这种材料分离。优选的“测试样品”是生物样品。
如本文所使用,“生物样品”是指从受试者获得的任何生物样品。这种“生物样品”的实例包括体液、组织、细胞样品等。优选的“生物样品”是全血、血清、血浆或尿。
如本文所使用,“受试者”表示哺乳动物,例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选根据本发明的“受试者”是人。
如本文所使用,“pH颜色指示剂”是卤色化化合物,其以少量添加至溶液中,使得溶液/介质的pH可以肉眼测定。指示剂引起溶液/介质的颜色基于pH而改变。
如本文所使用,“酶悬液”是指根据本发明方法的细胞裂解步骤(步骤a)促进存在于所述测试样品的细胞内的酶解放,从而获得“酶悬液”。
如本文所使用,“部分”是指采用根据本发明方法的步骤a)中获得的酶悬液的全部或部分以与步骤b)的试剂盒反应。通常,根据本发明的“部分”是一部分酶悬液。优选地,根据本发明的“部分”是10μL到50μL。
如本文所使用,“试剂盒”是指包含多种不同的组分作为组合产品用于在本发明方法中单独、同时或连续使用的产品。优选地,所述组分是选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂、任选的碳青霉烯酶激活剂和任选的碳青霉烯酶抑制剂。
检测方法:
如之前所提及,产生碳青霉烯酶的细菌的早期检测成为预防其传播并且保存成为用于治疗严重感染的最后依靠的抗生素的碳青霉烯的功效的临床微生物学范围的主要问题。
作为该问题的一种方法,申请人开发了一种检测任何类型的碳青霉烯酶产生者的快速、可靠和可负担的方法。
因此,本发明涉及用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括步骤:a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含
-碳青霉烯酶底物,选自碳青霉烯和头霉素,
-pH颜色指示剂,当反应混合物的pH为6.4-8.4时,所述pH颜色指示剂将改变颜色,
其中步骤b)后的颜色变化表示所述测试样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。
本发明方法基于以下概念:水解碳青霉烯酶底物的β内酰胺环,碳青霉烯酶产生羧基,其反过来酸化介质,通常为无缓冲介质。然后,由该水解产生的酸性通过pH颜色指示剂的颜色变化来鉴定。颜色变化表明存在碳青霉烯酶。
通常,培养基用测试菌株(由测试样品获得)接种,并在旋转振荡器上培养。然后,将培养物离心并将沉淀重悬于裂解缓冲液中,涡流震荡并进一步培养(类似地,可采用在固体培养基上生长的细菌菌落应用本领域技术人员已知的直接裂解方案)。充分培养之后,将悬液(即酶悬液)离心,去除上清液并置于冰上。将一小部分该上清液与包含碳青霉烯酶底物和pH颜色指示剂的试剂盒混合。将由试剂盒和测试的酶悬液组成的混合物进一步在某温度下培养足量时间,使得观察到颜色变化。颜色变化表明存在碳青霉烯酶。颜色变化可早在开始培养后的5分钟获得。在大多数情况下,30分钟培养时间足以获得碳青霉烯酶产生者的明显的颜色变化。
通常,当需要快速选择应该通过PCR测试并测序从而鉴定碳青霉烯酶基因的菌株时,使用该方法可能是进一步有用的。因此,一旦通过本方法确定碳青霉烯酶产生者的存在,本领域技术人员已知的其他鉴定技术可用于进一步表征碳青霉烯酶和/或碳青霉烯酶产生者。
通常,一旦通过本发明方法检测到碳青霉烯酶活性,该碳青霉烯酶活性可进一步用于发现或评价耐碳青霉烯酶活性的新的碳青霉烯酶抑制剂或新分子。在后一种情况下,待评价的新分子可以替换试剂盒中所包含的碳青霉烯酶底物分子。
通常,根据本发明的方法可用于检测任何选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的产生碳青霉烯酶的细菌。优选地,产生碳青霉烯酶的细菌选自临床重要的细菌,甚至更优选选自临床重要的革兰氏阴性菌。
如本文所使用,“临床重要”的细菌是指参与医院和社区获得性感染的细菌。通常,产生碳青霉烯酶的细菌选自不动细菌属(Acinetobacter)、产气单孢菌属(Aeromonas)、杆菌属(Bacillus)、柠檬细菌属(Bacteriodes)、肠杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、Pandoreae、变形杆菌属(Proteus)、普罗菲登菌属(Providencia)、假单胞细菌属(Pseudomonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、兰奥尔菌属(Raoultella)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、海洋产电菌属(Shewanella)、志贺氏杆菌属(Shigella)和Strenotrophomonas。
通常,产生碳青霉烯酶的细菌选自鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas junii)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、奥克西托克雷白氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、摩根摩根菌(Morganella morganii)、潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、雷特格氏变形杆菌(Proteus rettgeri)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、铜绿色极毛杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、灵杆菌(Serratia marcescens)、弗累克斯讷氏杆菌(Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia picketti)和希瓦氏菌藻(Shewanella algae)。
通常,安布勒A类产生碳青霉烯酶的细菌选自以下种:弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、奥克西托克雷白氏杆菌、克雷白氏杆菌、铜绿色极毛杆菌、沙门氏菌和灵杆菌,安布勒B类产生碳青霉烯酶的细菌选自以下种:鲍氏不动杆菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽胞杆菌、脆弱拟杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、奥克西托克雷白氏杆菌、克雷白氏杆菌、摩根摩根菌、雷特格氏变形杆菌、普通变形杆菌、斯氏普罗威登斯菌、铜绿色极毛杆菌、灵杆菌、弗累克斯讷氏杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌,和安布勒D类产生碳青霉烯酶的细菌选自以下种:鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、克雷白氏杆菌、潘多拉菌、铜绿色极毛杆菌、皮氏罗尔斯顿菌和希瓦氏菌藻。
根据本发明,产生碳青霉烯酶的细菌优选选自以下属:不动细菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏杆菌属、假单胞细菌属和海洋产电菌属,并且甚至更优选地选自鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、克雷白氏杆菌和铜绿色极毛杆菌。
如本文所使用,根据本发明,碳青霉烯酶底物是选自碳青霉烯和头霉素的一种底物。
通常,碳青霉烯选自比阿培南、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、泰比培南和帕尼培南。
通常,头霉素选自拉氧头孢和头孢甲氧霉素。在检测安布勒B类的碳青霉烯酶中头霉素是特别值得注意的。
优选地,碳青霉烯酶底物是亚胺培南。
通常,用于试剂盒的碳青霉烯酶底物的浓度为0.1mg/ml-10mg/ml,更优选1mg/ml-5mg/ml,甚至更优选2mg/ml-3mg/ml。
根据本发明,当反应混合物的pH为6.4-8.4,优选6.6-7.5时,pH颜色指示剂将改变颜色。
通常,用于试剂盒的pH颜色指示剂的浓度为0.01%-1%,更优选0.03%-0.08%,甚至更优选0.05%-0.06%。
通常,本领域技术人员能够选择用于该水解反应的合适的pH颜色指示剂。可用于本发明的pH指示剂的列表可以在CRC Handbook of Chemistry and Physics:A Ready-reference Book of Chemical and Physical Data,91st Revised ed.(June 1st 2010),CRC Press Inc中发现。例如,用于本发明的pH指示剂可以选自:6,8-二硝基-2,4-(1H)喹唑二酮(pH:6.4-8.0)、亮黄(pH:6.6-7.8)、酚红(pH:6.6-8.0)和中性红(pH:6.8-8.0)。
优选地,用于本发明的pH颜色指示剂是酚红,且当使用它时,从红到黄的颜色变化指示测试样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。
通常,步骤b)的反应在足以观察到颜色变化的时期内进行。优选地,在5分钟-120分钟,优选在10-60分钟,更优选在20-40分钟的时期内肉眼观察到颜色变化。或者,颜色变化的鉴定例如通过使用光度计来自动化。
通常,步骤b)的反应在15℃-40℃、优选20℃-37℃、更优选35℃-37℃的温度下进行。
基于分子研究,碳青霉烯酶可以进一步分为两种类型:在活性部位具有丝氨酸部分的丝氨酸酶(安布勒B、C和D类)和需要二阶阳离子通常是锌作为酶活性的金属共因子,从而促进二环β内酰胺环的水解的MBL(安布勒B类)(12)。
因此,根据本发明的进一步的实施方式,为了增加方法的灵敏性,所述试剂盒进一步包含碳青霉烯酶激活剂,其选自二阶阳离子或其盐、及其混合物。
通常,就安布勒B类碳青霉烯酶而言,所述激活剂是选自下组的二阶阳离子或其盐:锰、钴、镍、镉、汞、锌及其混合物(see Biochem J.1974;143(1):129-35and theJournal of Biological Chemistry vol.285,NO.7,4570-4577)。优选地,碳青霉烯酶激活剂是锌。
通常,存在于试剂盒中的碳青霉烯酶激活剂的浓度为0.01mM-1mM,更优选0.05mM-0.5mM,甚至更优选0.08mM-0.12mM。
通常,培养基用测试菌株(由测试样品获得)接种,并在旋转振荡器上培养。然后,将培养物离心并将沉淀重悬于裂解缓冲液中,涡流震荡并进一步培养。充分培养之后,将悬液(即酶悬液)离心,去除上清液并置于冰上。将一小部分该上清液与包含碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂和碳青霉烯酶激活剂的试剂盒混合。将由试剂盒和测试的酶悬液组成的混合物进一步在某温度下培养足量时间,使得观察到颜色变化。颜色变化表明存在碳青霉烯酶。颜色变化可早在开始培养后的5分钟获得。在大多数情况下,30分钟培养时间足以获得碳青霉烯酶产生者的明显的颜色变化。
在优选实施方式中,提供了用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括步骤:a)在生物样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含
-亚胺培南作为碳青霉烯酶底物,
-酚红作为pH颜色指示剂,和
-锌或其盐作为碳青霉烯酶激活剂,
其中步骤b)后颜色从红变成黄表示所述生物样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。
根据一种实施方式,为了特异性鉴别存在于测试样品中的碳青霉烯酶的种类,不管安布勒A、B或D类碳青霉烯酶,使用碳青霉烯酶抑制剂。
通常,碳青霉烯酶抑制剂可以是对于一种碳青霉烯酶而言是单特异性的。例如,对于安布勒A类碳青霉烯酶,碳青霉烯酶抑制剂选自克拉维酸、他唑巴坦、舒巴坦、和氨基苯基硼酸,和对于安布勒B类碳青霉烯酶,选自1-10菲咯啉、吡啶二羧酸、硫醇化合物(例如巯基丙酸和巯基乙酸)和EDTA(12-17)。
在优选的实施方式中,安布勒A类碳青霉烯酶的单特异性碳青霉烯酶抑制剂是他唑巴坦。
在优选的实施方式中,安布勒B类碳青霉烯酶的单特异性碳青霉烯酶抑制剂是EDTA,更优选与ZnSO4贫化有关的EDTA。事实上,EDTA活性通过二阶阳离子的贫化而增强。
通常,对于一种以上的碳青霉烯酶,碳青霉烯酶抑制剂可以是双特异性的,例如NXL-104,其对于安布勒B类碳青霉烯酶而言是双特异性的。
通常,安布勒A类碳青霉烯酶的单特异性碳青霉烯酶抑制剂(例如他唑巴坦)的浓度为0.1mg/ml-10mg/ml,更优选1mg/ml-5mg/ml,甚至更优选2mg/ml-3mg/ml。
通常,安布勒B类碳青霉烯酶的单特异性碳青霉烯酶抑制剂(例如EDTA)的浓度为0.001M-0.5M,更优选0.001M-0.01M,甚至更优选为0.005M。
通常,安布勒A和D类碳青霉烯酶的双特异性碳青霉烯酶抑制剂(例如NXL-104)的浓度为0.05mg/ml-10mg/ml,更优选1mg/ml-8mg/ml,甚至更优选3mg/L-5mg/ml。
通常,为了鉴别碳青霉烯酶的类型,可以使用96孔微量滴定板并将板分成四个部分。在第一部分,碳青霉烯酶的存在可根据之前描述的本发明方法来检测。在第二部分,安布勒A类碳青霉烯酶可通过添加A类碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制剂来检测。在第三部分,安布勒B类碳青霉烯酶可通过添加B类碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制剂(最后用ZnSO4贫化)来检测。最后,在第四部分,安布勒D类碳青霉烯酶可通过添加D类碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制剂来检测。基于所使用的碳青霉烯酶抑制剂,然后本领域技术人员能够通过简单推导来建立存在于测试样品中的碳青霉烯酶的具体的安布勒类型。
通常,碳青霉烯酶抑制剂可以是试剂盒本身的一部分,因此与碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂和任选的碳青霉烯酶激活剂同时添加。
或者,碳青霉烯酶抑制剂可以与试剂盒分开,因此同时或相继添加至试剂盒和/或测试样品(部分酶悬液)。
曾经,根据本发明的方法在所有四个部分中进行,也就是说,含或不含碳青霉烯酶抑制剂,在进行如上所述的方法后获得的结果和在进行进一步添加碳青霉烯酶抑制剂的相同方法后获得的结果之间建立比较。
试剂盒
根据本发明的另一个方面,提供一种试剂盒,其包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物和pH颜色指示剂。
根据本发明的实施方式,所述试剂盒可以进一步包含碳青霉烯酶激活剂。因此,所述试剂盒可以包含碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂和碳青霉烯酶激活剂。
根据本发明的实施方式,所述试剂盒可以进一步包含碳青霉烯酶抑制剂。因此,所述试剂盒可以包含碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂、碳青霉烯酶激活剂和碳青霉烯酶抑制剂。
碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂、碳青霉烯酶激活剂和碳青霉烯酶抑制剂如本专利申请之前所定义。
通常,所述试剂盒用于检测根据本发明方法的样品中产生碳青霉烯酶的细菌的存在。
通常,当具体的碳青霉烯酶抑制剂存在于试剂盒中时,可以测定相应的碳青霉烯酶的具体种类,不管是安布勒A、B或D类。
微量滴定板:
根据本发明的另一个方面,提供一种微量滴定板,包含孔或一系列孔,所述孔包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物。
通常,所述微量滴定板可以进一步包含:
-孔或一系列孔,其包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒A类碳青霉烯酶抑制剂;
-孔或一系列孔,其包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒B类碳青霉烯酶抑制剂(最后用ZnSO4贫化);
-孔或一系列孔,其包含选自碳青霉烯和头霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒D类碳青霉烯酶抑制剂。
微量滴定板还可以包含可以分析并与测试样品比较的对照孔或一系列对照孔。
通常,微量滴定板是96孔微量滴定板。
除了微量滴定板的装置可用于该目的。例如,可以使用其中已经结合了试剂盒(即碳青霉烯酶底物和pH颜色指示剂)的吸墨水纸。将酶悬液添加至吸墨水纸后,可以观察该纸是否改变颜色。类似地,可以使用塑料槽。事实上,试剂盒可以容纳在这些塑料槽中,然后,将酶悬液添加至这些槽后,可以观察是否存在颜色变化。
为了进行本发明方法,将pH颜色指示剂、任选的碳青霉烯酶激活剂和一部分待测试酶悬液添加至微量滴定板的各孔。随后,提供使用微量滴定板检测根据本发明方法的测试样品中产生碳青霉烯酶的细菌的存在,向各孔添加至少pH颜色指示剂和一部分待测试酶悬液。所述微量滴定板尤其非常适合于测定存在于测试样品中的碳青霉烯酶的具体种类。
通常,如果pH颜色指示剂是稳定的,在进行本发明方法前,微量滴定板的孔或一系列孔还可以包含pH颜色指示剂和碳青霉烯酶底物或pH颜色指示剂和碳青霉烯酶底物和碳青霉烯酶抑制剂。或者,如果pH颜色指示剂是不稳定的,其可随后添加至孔或一系列孔。
通常,也可以在进行本发明方法前将碳青霉烯酶激活剂和碳青霉烯酶底物或将碳青霉烯酶激活剂和碳青霉烯酶底物和碳青霉烯酶抑制剂添加至微量滴定板的孔或一系列孔。或者,碳青霉烯酶可随后添加至孔或一系列孔。
碳青霉烯酶底物、pH颜色指示剂、碳青霉烯酶激活剂和碳青霉烯酶抑制剂如本专利申请之前所定义。
根据一种实施方式,一些组分例如碳青霉烯酶底物和碳青霉烯酶抑制剂(当存在时)可以直接结合微量滴定板的固体表面。在这种情况下,将剩余组分(即pH颜色指示剂和任选的碳青霉烯酶激活剂)添加至含有测试样品的微量滴定板中的表面结合的碳青霉烯酶底物和添加至表面结合的碳青霉烯酶抑制剂(当存在时)。
根据一种实施方式,可以将用于进行本发明方法的微量滴定板以及每一种组件放入单个容器内,且将所有多个容器置于连同用于观察是否可以在测试样品中发现产生碳青霉烯酶的细菌的说明书的单个包装内。
本发明将进一步通过以下附图和实施例来说明。
附图说明
图1:检测碳青霉烯酶产生者的方法的结果。
碳青霉烯酶产生者(加黑数字)如下:阴沟肠杆菌KPC-2(1)、大肠杆菌COL KPC-2(2)、克雷白氏杆菌H1516-6COL KPC-2(3)、克雷白氏杆菌BIC OXA-48(4)、克雷白氏杆菌CHAOXA-48(5)、阴沟肠杆菌TUR OXA-48(6)、大肠杆菌HAN OXA-48(7)、克雷白氏杆菌OMA OXA-181(8)、雷特格氏变形杆菌RAP OXA-181(9)、克雷白氏杆菌UK NDM-1(10)、克雷白氏杆菌1OMA NDM-1(11)、大肠杆菌271AUS NDM-1(12)、弗氏柠檬酸杆菌STE NDM-1(13)、大肠杆菌MAD VIM-1(14)、克雷白氏杆菌MAD IMP-13(15)。
不产生碳青霉烯酶者(加白数字)如下:克雷白氏杆菌CTX-M-15(16)、阴沟肠杆菌CTX-M-15(17)、大肠杆菌CTX-M-14(18)、克雷白氏杆菌6299OXA-163(19)、大肠杆菌VEB-1(20)、大肠杆菌ACC-1(21)、克雷白氏杆菌DHA-2(22)、大肠杆菌Ec13SYD CMY-2(23)、大肠杆菌VMC CMY-10(24)、阴沟肠杆菌ARF过表达AmpC(25)、阴沟肠杆菌CON过表达AmpC(26)、克雷白氏杆菌COO孔蛋白缺乏(27)、克雷白氏杆菌BER孔蛋白缺乏(28)、大肠杆菌53野生型(29)、克雷白氏杆菌CIP53153野生型(30)。
具体实施方式
实施例1:方法:根据本发明的(酸-比色试验)
将申请人自己的菌株收集和全世界来源的多种肠杆菌种类的三十六种产生碳青霉烯酶的分离物纳入该研究(表1)。预先表征了这些菌株的分子水平的β内酰胺酶含量。
菌株收集也包含一系列通过非基于碳青霉烯酶的机制或通过产生临床分离物中通常鉴别的非碳青霉烯酶广谱的β内酰胺酶而对碳青霉烯的敏感性降低的分离物(表2)。
在进行本发明方法之前,通过在37℃下在Mueller-Hinton琼脂平板上通过(AB bioMérieux;Solna,Sweden)测定最低抑菌浓度(MIC)值来进行易感性测试,易感性测试的结果根据2010年6月修改的临床和实验室标准研究所(CLSI)指南来记录(18)。亚胺培南的断点是S≤1μg/ml(易感性),以及R≥4μg/ml(耐药性)。至于厄他培南的断点,它们是S≤0.25μg/ml和R≥1μg/ml(参见表1和2)。
菌株按照以下进行本发明方法。
用测试菌株的两个菌落接种10ml胰蛋白酶解酪蛋白大豆培养基,并在37℃下在旋转振荡器上培养3小时。然后,将培养物以10,000g在4℃下离心15分钟。将沉淀重悬于Tris-HCL 20mM裂解缓冲液(B-PERII,Bacterial Protein Extraction Reagent,ThermoScientific,Pierce),涡流震荡1分钟,再在室温下培养30分钟。为从血培养物获得高质量的蛋白质萃取,将细菌沉淀重悬于裂解缓冲液(B-PERII,Bacterial Protein ExtractionReagent,ThermoScientific Pierce),然后转移至MicroBead管(超净细菌DNA分离试剂盒珠管(MO BIO laboratories),并在室温下采用涡流震荡器进行30分钟通过剧烈搅拌微珠管获得细菌的机械裂解。
将细菌悬液以10,000g在4℃下离心5分钟。将上清液去除并置于冰上。将30μl的该悬液的上清液(即酶悬液)在96孔托盘的孔中与由3mg亚胺培南一水化物、pH7.5的酚红溶液和ZnSO4 0.1mM组成的1ml溶液(即试剂盒)的100μl混合。
申请人所使用的酚红溶液通过以下方法制备:取2.2mlpH为8的浓缩酚溶液(由0.5%酚红在蒸馏水中的混合物制备),向其中添加16.6ml蒸馏水。然后通过添加1N NaOH液滴将pH值调节至7.5。
将试剂盒和测试的酶悬液的混合物在37℃下培养1小时。还根据本发明方法测试产生或不产生碳青霉烯酶的细菌菌株悬液(阳性和阴性对照)。对于产生任何种类的碳青霉烯酶的所有测试菌株,孔的颜色从红转为黄,而对应于不产生碳青霉烯酶的分离物的细菌提取物的孔仍然是红色,不管对于碳青霉烯的敏感性水平(图1,结果也参见表1和2)。对于KPC产生者而言,从红到黄的颜色变化早在培养开始后的5分钟获得。在大多数情况下,30分钟培养时间足以获得碳青霉烯酶产生者的明显的颜色变化。对于若干分离物例如若干IMP和VIM产生者而言,颜色变化尽管仍是阳性的,但较不明显。该测试作为盲研究通过不知道那哪个孔包含碳青霉烯酶产生者的人来进行。所有测试以高度可重复结果一式三份地进行。
实施例2:产生碳青霉烯酶的肠杆菌的快速检测
摘要
开发Carba NP测试用于快速鉴定肠杆菌中任何碳青霉烯酶产生者。采用分离的细菌菌落的这种生物化学测试基于碳青霉烯亚胺培南的体外水解。与分子基技术相比,其是100%灵敏和特异性的。这种快速(小于2小时)和廉价的技术可在任何实验室中进行。其构成用于控制全世界碳青霉烯酶产生者的传播模式的真实改变。
研究
将从来自我们自己的菌株收集和全球来源的多种临床样品(血培养物、尿、唾液...)分离的多种肠杆菌种类的一百六十二个产生碳青霉烯酶的菌株纳入该研究(表3)。该菌株收集也包括对碳青霉烯充分敏感或由于非碳青霉烯酶基机制显示对碳青霉烯的敏感性降低的四十六个菌株(表4)。在Mueller-Hinton琼脂(Biorad,Marnes-la-Coquette,France)上根据CLSI指南(Clinical and Laboratory Standards Institute.PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing;Twenty-SecondInformational Supplement.M100-S22.Wayne(PA),USA:CLSI;2012)对所有菌株进行抗菌谱研究。按照如下进行Carba NP(Carbapenemase Nordmann-Poirel)测试。将直接从抗菌谱回收的测试菌株的一剂校准的剂量(10μl)重悬于Tris-HCl 20mM裂解缓冲液(B-PERII,Bacterial Protein Extraction Reagent,Thermo Scientific,Pierce),涡流震荡1分钟,再在室温下培养30分钟。将该细菌悬液以10,000xg在室温下离心5分钟。30μl上清液,相当于酶的细菌悬液,在96孔托盘的孔中与由3mg亚胺培南一水化物(Sigma,Saint-QuentinFallavier,France)、pH7.8的酚红溶液和0.1mM ZnSO4(Merck Millipore,Guyancourt,France)组成的1ml溶液的100μl混合。所使用的酚红溶液通过以下方法制备:取2ml 0.5%w/v的酚红(Merck Millipore)溶液,向其中添加16.6ml蒸馏水。然后通过添加1NNaOH液滴将pH值调节至7.8。待测试的酚红溶液和酶悬液的混合物在37℃下最多2小时。测试结果通过不了解样品性质的技术人员来解释。
预先表征了所有菌株的分子水平的β内酰胺酶含量。采用(AB bioMérieux;Solna,Sweden)测定碳青霉烯的最低抑菌浓度,并根据如2011年更新的US指南(CLSI)记录结果。
采用Carba NP测试,对于产生碳青霉烯酶的所有测试菌株(表3),孔的颜色从红转为橙或黄(图2),而对应于不产生碳青霉烯酶的分离物的细菌提取物的孔仍然是红色,不管对于碳青霉烯的敏感性水平(表4)。对于KPC产生者而言,从红到黄的颜色变化早在培养开始后的5-10分钟获得。在大多数情况下,30分钟培养时间足以获得碳青霉烯酶产生者的明显的颜色变化。与碳青霉烯酶基因作为金本位的分子基鉴定相比,测试的特异性和灵敏性都为100%。所有测试一式三份地进行,获得相同和可重复的结果。
Carba NP测试完美地将碳青霉烯酶产生者(表3)与由于非碳青霉烯酶介导的机制例如联合耐药机制(与头孢菌素酶和/或ESBL的过度产生相关的外膜渗透性缺陷)而耐碳青霉烯的菌株区分开,或将碳青霉烯酶产生者(表3)与对碳青霉烯敏感但表达广谱β内酰胺酶而不具有碳青霉烯酶活性的菌株(ESBL、质粒和染色体编码的头孢菌素酶)(表4)区分开。在小于2小时的总时间内获得可解释的阳性结果,其是独特的,使得可以实施快速容量测量以限制碳青霉烯酶产生者的传播。
结论
Carba NP测试具有多种益处。它是廉价、快速和高度灵敏和特异性的,去除了其他耗时且不那么灵敏或特异性的鉴定碳青霉烯酶产生者的技术的需要。采用该精确的测试将显著改进感染有或移植有碳青霉烯酶产生者的患者的检测。Carba NP测试已经在我们的部门中常规实施并获得优异的结果(数据未显示)。此外,它显著降低了实验室技术人员的工作量并简化了潜在的碳青霉烯酶产生者的临床管理。
该测试例如可用于直接测试(i)从血培养物的抗菌谱获得的细菌,和/或(ii)在抗菌素易感性测试之前在培养基上生长的细菌菌落。对于从那些临床样品中直接分离的细菌的抗生素管理者而言,预期检测碳青霉烯酶产生者的时间增益将为至少24小时。它也可用于快速鉴定耐碳青霉烯和/或耐从粪便回收的多药耐药细菌的筛选获得的广谱头孢菌素的分离物。这对于预防疾病爆发而言将是非常重要的。使用Carba NP测试可以通过促进在关键的临床试验中的患者募集而支持新抗生素的开发。用作本地设计测试的该测试可以促进全球监测网络。
来自Carba NP测试的结果可以有效选择待进一步通过PCR测试和/或进行测序以详细鉴定碳青霉烯酶基因的菌株。最后,使用该测试的另一区域可以是已知是碳青霉烯酶产生者的大贮库的低收入乡村。它首次提供了用于检测肠杆菌科中的多药耐药性的主要成分的友好方案。使用Carba NP测试将通过改变控制全世界碳青霉烯酶产生者的模式而促进碳青霉烯的良好管理。
实施例3:快速检测产生碳青霉烯酶的假单胞细菌属
摘要
假单胞细菌属中碳青霉烯耐药性主要与外膜渗透性降低有关,或与碳青霉烯酶的表达有关。目前,碳青霉烯酶检测取决于不够灵敏或特异性或昂贵的表型基或分子基技术。此外,那些技术是耗时的,因此限制了临床重要性。本文已经评价了基于碳青霉烯的体外水解的新技术,Carba NP测试来检测假单胞细菌属中的碳青霉烯酶的产生。用36种碳青霉烯酶和72种非碳青霉烯酶产生者来测试。Carba NP测试是特异性和灵敏的(分别为100%和94.4%),以及快速的(小于2小时)。该成本效益的技术可以在全世界任何临床微生物学实验室中实施。它为鉴定产生碳青霉烯酶的假单胞细菌属提供安全的技术,因此对于预防其在医院的传播而言是非常有用的工具。
方法
菌株收集
将从来自我们的菌株收集和全球来源的多种临床样品(血培养物、尿、唾液等)分离的属于若干假单胞细菌属种类的三十六个产生碳青霉烯酶的分离物纳入该研究(表5)。预先表征了菌株的分子水平的β内酰胺酶含量。该收集也包含代表在假单胞细菌属中鉴别的主要β内酰胺耐药性表型和β内酰胺酶多样性的特征的72个菌株。(包括PER-、VEB-、BEL-、SHV-、TEM-和OXA-类型的ESBL)(表6)。此外,大多数这些菌株耐碳青霉烯。
易感性测试
在37℃下在Mueller-Hinton琼脂平板(Becton Dickinson,Le Pont de Chaix,France)上采用(bioMérieux;La Balmes-les-Grottes,France)进行易感性测试,并根据2012年更新的US指南(CLSI)记录结果。亚胺培南、美罗培南和多利培南的断点如下:易感性(S)≤2,和耐药性(R)≥8μg/ml。
Carba NP测试
如之前所详细描述,在37℃下在Mueller-Hinton琼脂平板(Becton Dickinson)上生长的菌株上进行Carba NP测试(7)。该测试基于检测碳青霉烯亚胺培南的β内酰胺环的水解,然后pH指示剂的颜色变化。简言之,将直接从抗菌谱回收的测试菌株的一剂校准的剂量(10μl)重悬于Tris-HCl 20mM裂解缓冲液(B-PERII,Bacterial Protein ExtractionReagent,Thermo Scientific,Pierce),涡流震荡1分钟,再在室温下培养30分钟。将该细菌悬液以10,000xg在室温下离心5分钟。30μl上清液,相当于酶的细菌悬液,在96孔托盘的孔中与由3mg亚胺培南一水化物(Sigma,Saint-Quentin Fallavier,France)、pH7.8的酚红溶液和0.1mM ZnSO4(Merck Millipore,Guyancourt,France)组成的1ml溶液的100ul混合。所使用的酚红溶液通过以下方法制备:取2ml 0.5%w/v的酚红(Merck Millipore)溶液,向其中添加16.6ml蒸馏水。然后通过添加1N NaOH液滴将pH值调节至7.8。待测试的酚红溶液和酶悬液的混合物在37℃下最多2小时。测试结果通过不了解样品性质的技术人员来解释。
结果
采用Carba NP测试,对于产生碳青霉烯酶的所有分离物(除未检测出的若干GES型产生者之外),孔的颜色从红转为橙或黄(表5)。对应于不产生碳青霉烯酶的分离物的细菌提取物的孔仍然是红色(阴性),不管对于碳青霉烯的耐药性水平(表6)。在大多数情况下,30分钟培养时间足以获得碳青霉烯酶产生者的明显的颜色变化。发现该测试的特异性和灵敏性分别为100%和94.4%。所有测试一式三份地进行,获得相同和可重复的结果。有意思的是,在根据CLSI指南基本上对碳青霉烯敏感的两种碳青霉烯酶产生者(产生IMP-1的P.stutzeri PB207和P.putida NTU 92/99)中检测到碳青霉烯酶活性。
Carba NP测试将碳青霉烯酶产生者(表5)与由于非碳青霉烯酶介导的机制例如联合耐药机制(与头孢菌素酶和/或ESBL的过度产生相关的外膜渗透性缺陷+/-)而耐碳青霉烯的那些分离物(表6)区分开。
讨论
如之前在肠杆菌科中所报告(参见实施例2),Carba NP测试对于在非发酵罐中例如在假单胞细菌属中检测碳青霉烯酶活性具有多种益处。Carba NP去除了都需要进行长达24-72小时的碳青霉烯酶活性的体外检测(Hodge测试)和基于β内酰胺酶抑制剂的表型技术(对于KPC为硼酸,对于MBL为EDTA)的需要。此外,由于铜绿色极毛杆菌的低的外膜渗透性,在铜绿色极毛杆菌中证实β内酰胺酶活性的抑制比在肠杆菌中更难。使用这种抑制基技术可能不能检测甚至是真实的碳青霉烯酶产生者中的碳青霉烯酶活性(Picao等.Clin.Microbiol.46:2028-2037)。Carba NP测试明确地将碳青霉烯酶与耐碳青霉烯的铜绿色极毛杆菌中的碳青霉烯酶产生者区分开。它也可以检测仍然对碳青霉烯敏感的碳青霉烯酶产生者中的碳青霉烯酶活性。Carba NP测试是第一种可用于鉴别碳青霉烯酶产生者的具有这样高度特异性、敏感性和快速(小于2小时)的技术。然而,不得不考虑到没有检测GES型碳青霉烯酶,特别是在具有高流行的地理区域(即巴西、南非)。没有检测那些特异性GES衍生物可能是由于它们的弱的固有碳青霉烯酶活性。事实上,GES型碳青霉烯酶的GES型ESBL的点突变体类似物。它们(例如在野生型大肠杆菌背景中)不赋予对碳青霉烯的明显耐药性(kcat/Km为0.02-0.26μM-1.s-1),与例如MBL相反,其赋予高得多的碳青霉烯酶耐药性水平(通常kcat/Km≥1μM-1.s-1)。此外,作为体外耐碳青霉烯的来源的GES型变种的碳青霉烯酶活性的真实的临床显著性(治疗失败)仍然待评价。
我们目前在我们的部门常规实施Carba NP测试。它已经用于调查在非发酵罐中对碳青霉烯酶的敏感性有任何略微降低的分离物中的碳青霉烯酶活性。它提供优异的和可重复的结果。该Carba NP测试的结果用于选择进一步通过PCR测试且当需要精确鉴定碳青霉烯酶基因时进行测序的菌株。
表3:进行Carba NP测试的产生碳青霉烯酶的临床肠杆菌分离物
显示亚胺培南(IMP)、厄他培南(ETP)和美罗培南(MER)的最低抑菌浓度范围、获得的碳青霉烯酶以及Carba NP测试的结果。碳青霉烯酶为KPC-型、NMC-A,SME-型、GES-型、IMI-型、NDM-型、VIM-型、IMP-型和OXA-48型。
表4:进行Carba NP测试的非产生碳青霉烯酶的临床肠杆菌分离物
显示亚胺培南(IMP)、厄他培南(ETP)和美罗培南(MER)的最低抑菌浓度范围和快速Carba NP测试的结果。β内酰胺酶是广谱β内酰胺酶(ESBL)、染色体和获得的质粒介导的头孢菌素酶AmpC。
表5:采用Carba NP测试检测碳青霉烯酶产生者的碳青霉烯酶活性
表6:不产生碳青霉烯酶的假单胞细菌属上的Carba NP测试的结果
*Underligned AmpC对应于染色体AmpC OprD缺乏的过表达、AmpC过表达和流出系统过产生之前通过qRT-PCR表征(12)。
参考文献
在整个申请中,多个参考文献描述了本发明所属领域的现状。因此这些参考文献的公开以引用方式引入本公开。
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Claims (7)

1.用于检测样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌的方法,所述方法包括步骤:
a)在测试样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;和
b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含
-碳青霉烯酶底物,选自碳青霉烯和头霉素,
-pH颜色指示剂,当反应混合物的pH为6.4-8.4时,所述pH颜色指示剂将改变颜色,
c)通过pH颜色指示剂的颜色变化检测由所述碳青霉烯酶底物的β内酰胺环的可能的水解产生的酸性。
2.权利要求1的方法,其中所述测试样品是选自血样和尿样的生物样品。
3.权利要求1或2的方法,其中所述产生碳青霉烯酶的细菌选自不动细菌属、产气单孢菌属、杆菌属、柠檬细菌属、肠杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏杆菌属、摩根氏菌属、Pandoreae、变形杆菌属、普罗菲登菌属、假单胞细菌属、雷尔氏菌属、兰奥尔菌属、沙门氏菌属、沙雷菌属、海洋产电菌属、志贺氏杆菌属和Strenotrophomonas。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述试剂盒还包含碳青霉烯酶激活剂,其选自二阶阳离子或其盐,及其混合物。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中所述其中步骤b)的反应在15℃-40℃、优选20℃-37℃、更优选35℃-37℃的温度下进行。
6.权利要求1-5任一项的方法,其中10-60分钟,更优选在20-40分钟的时期内肉眼观察到颜色变化。
7.权利要求1-6任一项的方法,其中所述方法包括步骤:
a)在生物样品上进行细胞裂解以获得酶悬液;
b)使一部分步骤a)中获得的酶悬液与试剂盒反应,所述试剂盒包含
-亚胺培南作为碳青霉烯酶底物,
-酚红作为pH颜色指示剂,和
-锌或其盐作为碳青霉烯酶激活剂,
其中步骤b)后颜色从红变成黄表示所述生物样品中存在产生碳青霉烯酶的细菌。
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