BR112013033082B1 - Método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra - Google Patents

Método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra Download PDF

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Abstract

resumo da patente de invenção para: “método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra”. a presente invenção se refere a um método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra, o método compreende as etapas de: a) realizar a lise das células em uma amostra de teste, a fim de obter uma suspensão enzimática, b) reagir uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes, o referido kit de reagente compreendendo: - um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas, - um indicador de cor de ph, o qual vai mudar de cor quando o ph da mistura reacional é compreendido entre 6,4 e 8,4, em que a mudança de cor após a etapa b) indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra de teste. a invenção também se refere a um kit de reagentes, para uma placa de microtitulação e as suas utilizações na detecção da presença de produtores de carbapenemase em uma amostra de teste.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: “MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE EM UMA AMOSTRA.
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra.
Antecedentes da Invenção
Bactérias isoladas produtoras de carbapenemase (isto é, produtoras de carbapenemase) estão cada vez mais identificadas em todo o mundo (1 - 3). Sua detecção precoce está se tornando um grande problema na área da microbiologia clínica, a fim de evitar a sua propagação e preservar a eficácia das carbapenemase que estão se tornando o antibiótico de último recurso para o tratamento de infecções graves (4) . Com efeito, carbapenemases estão geralmente associados a muitos outros determinantes não resistentes a beta-lactâmicos que dão origem a resistência a múltiplos fármacos e fármacos análgésicos. Além disso, devido à atual população mudar e viajar, o reconhecimento precoce dos produtores de carbapenemase está se tornando obrigatório seja qual for a política ou a taxa de infecções hospitalares multirresistentes a antibióticos.
A grande maioria das carbapenemases adquiridas pertencem a três das quatro classes conhecidas de betalactamases, ou seja, Ambler declasse A, Ambler de classe B (metalo-beta-lactamases (MBLs)) e Ambler de classe D (oxacillinases (OXAs)). Estas três classes de carbapenemases conferem resistência clínica significativa para carbapenemase ou diminuição a susceptibilidade aos carbapenêmicos (1 - 4). Consequentemente, as bactérias isoladas produtoras de carbapenemase destas três classes foram envolvidas tanto em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade.
A propagação das três classes distintas de carbapenemases varia significativamente em todo o mundo. Por exemplo, os produtores de KPC (Ambler de classe A) são identificados principalmente nas Américas e na Europa do Sul, enquanto o IMP, VIM, NDM-1 (Ambler de classe B) são amplamente identificado em todo o mundo com um reservatório principal para NDM-1 no subcontinente indiano. Quanto as enzimas semelhantes a Oxa-48 (Ambler de classe D) são identificadas pelo menos nas partes do sul e do leste da costa do Mediterrâneo e, mais recentemente, na Europa (5).
Atualmente, existem dois tipos de métodos para a detecção de produtores carbapenemase. Primeiro, as técnicas baseadas em fenotípicos para produção in vivo de carbapenemase, tais como o Etest® e o Hodge-Test podem ser usadas (4). O Etest® é uma técnica quantitativa para determinar a susceptibilidade antimicrobiana de muitos microrganismos. O sistema compreende um gradiente predefinido de antibiótico que é usado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC), em ug mL, de diferentes agentes antimicrobianos contra os microrganismos testados como no meio de ágar usando a incubação durante a noite. Tal como para o Hodge-teste, a produção carbapenemase é detectada quando o isolado produz a enzima e permite o crescimento da cepa susceptível de carbapenemase para um disco cabapenem. O resultado do Hodge-teste é uma reentrância de características semelhante a trevo. Infelizmente, porém, essas técnicas baseadas em fenotípicas não são sensíveis nem específicas o suficiente. Em muitos casos, também, os falsos positivos foram relatados. Alternativamente, pode ser utilizada uma técnica de detecção molecular de genes carbapenemase. Esta técnica, no entanto, continua a ser muito cara e requer um alto grau de especialização. A desvantagem final é que ambas as técnicas baseadas em fenotípicas e técnica de detecção molecular são demoradas (12 a 24 h) e, portanto, não cumprem os requisitos clínicos solicitados a implementar medidas preventivas de isolamento para evitar o desenvolvimento de surtos nosocomiais (4).
Trabalhos anteriores têm realizado identificação da beta-lactamase usando um cromogênico, como nitrocefina e CENTA (6, 7) . No entanto, estas moléculas de substrato cromogênico não pode detectar especificamente carbapenemases; detectam qualquer beta-lactamase independentemente do seu perfil de hidrólise. Quanto à-Bteste Cica, este ensaio utiliza a cromogênico HMRZ-86, juntamente com os inibidores específicos. Embora este teste possa detectar produtores de MBL, que impõe uma nova etapa da cultura. Com efeito, o agente patogênico deve primeiro ser isolado em um meio não-seletivo apropriado, antes de ser testado. Em seguida, apenas uma colônia isolada é utilizada, a fim de evitar a contaminação e assegurar que o organismo esteja puro. Outros ensaios, tais como ensaios e testes iodométrico, acidimétrico usam benzilpenicilina como substratos têm sido usados, mas também não são específicos para a detecção de carbapenemases (6). Finalmente, as técnicas que utilizam o imipenem contendo agar de amido também têm sido utilizados para detectar a actividade de MBL (8). No entanto, esta última técnica requer a extração de proteínas, purificação parcial beta-lactamase, a migração de eletroforese, bem como um amplo conhecimento do campo de beta-lactamase. Por isso, é demorado e é normalmente reservada apenas para fins de investigação.
Para facilitadora a detecção de produtores de carbapenemases no campo da microbiologia clínica, o requerente desenvolveu um novo método baseado em uma técnica ácido-colorimétrico simples. Este método se baseia no conceito de que por hidrólise do anel de beta-lactama de um substrato carbapenemase, os carbapenemases geram um grupo carboxil, o qual, por sua vez acidifica um meio. A acidez resultante desta hidrólise é, em seguida, identificada por uma mudança de cor de um indicador de cor pH (9).
Este método ajuda a diferenciar os produtores carbapenemase daqueles que são resistentes ao carbapenema resultante de mecanismos mediados não-carbapenemase, como os mecanismos combinados de resistência (por exemplo, defeito de permeabilidade da membrana externa, superprodução de cefalosporinases, clavulânico-ácido inibido ESBL ...) ou a partir de cepas expressando βlactamase de amplo espectro sem atividade carbapenemase (ESBLs, plasmídeo e cefalosporinases codificado do cromossomo) (10).
Resultados interpretáveis são obtidos dentro de um curto espaço de tempo, o qual é crucial na concepção de medidas de contenção para os produtores de carbapenemase. Ele elimina a necessidade de usar o Etest® ou a técnica
Hodge-Test, as quais, como mencionado anteriormente, não são nem específicas nem sensíveis e que precisam de umas 18h adicionais antes de se obter resultados interpretáveis.
Este método oferece uma solução para a detecção rápida, confiável e acessível de qualquer tipo de produtores de carbapenemases. Além disso, ele é específico e sensível. Também pode ser submetido a um processo de industrialização, de tal forma que possa ser implementado em qualquer laboratório de microbiologia clínica em todo o mundo, sem a carga de trabalho adicional significativa para os técnicos de laboratório.
Além disso, no campo da epidemiologia, a utilização deste método pode ser de ajuda adicional quando se pretende selecionar rapidamente cepas que devem ser testadas por PCR e sequenciadas para a identificação de genes carbapenemase. Sumário da Invenção
A presente invenção se refere a um método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra, o método compreende as etapas de:
a) realizar a lise das células em uma amostra de teste, a fim de obter uma suspensão enzimática;
b) reagir uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes compreendendo o referido kit de reagente
- um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas,
- Um indicador de cor de pH que muda de cor quando o pH da mistura da reação está compreendido entre 6,4 e 8,4 em que uma mudança de cor após a etapa b) indica a presença
de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra de
teste.
A presente invenção também se refere a um kit de reagentes, que compreende um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um indicador de cor de pH e sua utilização na detecção da presença de produtores de carbapenemase em uma amostra de teste.
A invenção também se refere a uma placa de microtitulação compreendendo um poço ou uma série de poços que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas,
a sua utilização na detecção da presença de produtores de
carbapenemase em uma amostra de teste e, eventualmente, utilizar na determinação da classe específica de carbapenemase presente em uma amostra de teste.
Descrição Detalhada da Invenção
Definições:
Tal como aqui utilizado, amostra de teste significa qualquer material sólido ou líquido a ser testado, o qual podem conter bactérias produtoras de carbapenemase. Tipicamente, uma colônia de bactérias pode ser isolada a partir de tal material. A amostra de teste preferida é uma amostra biológica.
Tal como aqui utilizado, amostra biológica significa qualquer amostra biológica obtida de um sujeito. Exemplos de amostras biológicas incluem tais fluidos, tecidos, amostras de células, etc. amostras biológicas preferidas são o sangue total, soro, plasma ou urina.
Tal como aqui utilizado, sujeito significa um mamífero, tal como um roedor, um felino, um canino, e um primata. De preferência, um sujeito, de acordo com a invenção é um ser humano.
Tal como aqui utilizado, indicador de cor de pH é um composto químico halocrômico que é adicionado em pequenas quantidades a uma solução, de modo que o pH da solução / meio possa ser determinado visualmente. O indicador faz com
que a cor da solução / meio mude, dependendo do pH.
Tal como aqui utilizado, suspensão enzimática
significa que a etapa de lise celular (passo a) do método,
de acordo com a invenção) ajuda a liberar as enzimas que
estão presentes no interior das células da amostra de ensaio, obtendo-se, assim, uma suspensão enzimática.
Tal como aqui utilizado, fração significa que a totalidade ou parte da suspensão enzimática obtida na etapa a) do método, de acordo com a invenção é feita de modo a reagir com o kit de reagente na etapa b). Tipicamente, uma fração, de acordo com a invenção é uma parte da suspensão enzimática. De preferência, uma fração, de acordo com a invenção é de 10 pL a 50 pL.
Tal como aqui utilizado, um kit significa um produto que compreende um número de componentes diferentes, como um produto de combinação para utilização separada, simultânea ou sequencial no método da invenção. De preferência, os componentes são um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas, um indicador de cor de pH, opcionalmente, um ativador de carbapenemase e, opcionalmente, um inibidor de carbapenemase.
Método de detecção:
Como mencionado anteriormente, a detecção precoce de bactérias produtoras de carbapenemase está se tornando um grande problema na área de microbiologia clínica, a fim de evitar a sua propagação e preservar a eficácia dos carbapenemas que estão se tornando o antibiótico de último recurso para o tratamento de infecções graves.
Como solução para este problema, o Requerente tem desenvolvido um método rápido, confiável e acessível para detectar qualquer tipo de produtores de carbapenemases.
Por conseguinte, a presente invenção se refere a um método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra, o método compreende as etapas de:
a) realizar a lise das células em uma amostra de teste a fim de obter uma suspensão enzimática;
b) reagir uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes, o referido kit de reagentes compreendendo
- um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas,
- um indicador de cor de pH que muda de cor quando o pH da mistura da reação está compreendido entre 6,4 e 8,4, em que uma mudança de cor, após a etapa b) indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra teste.
O método da invenção se baseia no conceito de que por hidrólise do anel de beta-lactama de um substrato carbapenemase, os carbapenemases geram um grupo carboxil, o qual, por sua vez acidifica em um meio, geralmente um meio não tamponado. A acidez resultante desta hidrólise é, em seguida, identificada por uma mudança de cor de um indicador de cor de pH. Uma mudança de cor indica a presença de uma carbapenemase.
Tipicamente, um caldo é inoculado com uma cepa de ensaio (obtida a partir de uma amostra de teste) e incubada num agitador rotativo. Em seguida, a cultura foi centrifugada e o sedimento ressuspenso em tampão de lise, agitado e incubado adicionalmente (de modo semelhante, um protocolo de lise direta, conhecido de um técnico versado no assunto, pode ser aplicado usando colônias bacterianas cultivadas em meio de cultura sólido). Depois de incubação suficiente, a suspensão (isto é, suspensão enzimática) é centrifugada e o sobrenadante é removido e colocado em gelo. Uma pequena fração deste sobrenadante é misturado com um kit de reagentes, o qual compreende um substrato de carbapenemase e um indicador de cor de pH. A mistura de compostos do kit de reagente e a suspensão enzimática testada é ainda incubada a uma temperatura e durante um período de tempo suficiente, de tal modo que uma mudança de cor é observada. Uma mudança de cor indica a presença de uma carbapenemase. A alteração de cor pode ser obtida mais cedo como 5 minutos após o início da incubação. Na maioria dos casos, um tempo de incubação de 30 minutos é suficiente para a obtenção de um franco de mudança de cor para os produtores de carbapenemase.
Tipicamente, a utilização deste método pode ser de ajuda adicional quando se deseja selecionar rapidamente cepas que devem ser testadas por PCR e sequenciadas para a identificação de genes carbapenemase. Consequentemente, uma vez que a presença de produtores de carbapenemase foi determinada pelo presente método, outras técnicas de identificação conhecidos dos técnicos versados no assunto podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais a carbapenemase e / ou produtores de carbapenemase.
Tipicamente, uma vez que uma atividade de carbapenemase tenha sido detectada pelo método da invenção, esta atividade de carbapenemase pode ser ainda usada para detectar ou avaliar os novos inibidores de carbapenemase ou novas moléculas resistentes à atividade da carbapenemase. Neste último caso, a nova molécula a ser avaliada pode substituir a molécula substrato de carbapenemase contida no kit de reagente.
Tipicamente, o método, de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para detectar quaisquer bactérias produtoras de carbapenemase selecionada a partir do grupo que consiste em bactérias gram positivas e gram negativas. De preferência, as bactérias produtoras de carbapenemase são selecionadas a partir do grupo que
consiste em bactérias que são de importância clínica e
ainda, mais preferencialmente, a partir do grupo que
consiste em bactérias gram negativas, as quais são de
importância clínica.
Como usado aqui, as bactérias de importância clínica significa bactérias envolvidas em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade.
Tipicamente, as bactérias produtoras de carbapenemase são selecionadas entre os gêneros consistindo de Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacteriodes, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pandoreae, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Raoultella, Salmonella, Serratia, Shewanella, Shigella and Strenotrophomonas.
Tipicamente, as bactérias produtoras de carbapenemase são selecionadas a partir do grupo consistindo de Acinetobacter baumannii, Aeromonas junii, Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pandoraea pnomenusa, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Stenotrophomonas maltophilia, Ralstonia picketti and Shewanella algae.
Tipicamente, as bactérias produtoras de carbapenemase Ambler de Classe A são selecionados a partir do grupo consistindo das espécie Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica e Serratia marcescens, as bactérias produtoras de carbapenemase Ambler Classe B são selecionados a partir do grupo consistindo das espécies Acinetobacter baumannii, Aeromonas junii, Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus rettgeri, Proteus vulgaris, Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Stenotrophomonas maltophilia, e as bactérias produtoras de carbapenemase Ambler classe D são selecionadas a partir do grupo que consiste nas espécies de Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pandoraea pnomenusa, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia picketti e Shewanella algae.
De acordo com a presente invenção, as bactérias produtoras de carbapenemase são, preferencialmente, selecionadas de entre os gêneros consistindo de Acinetobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas e Shewanella, e, ainda mais preferencialmente, selecionada a partir do grupo constituído por Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa.
Tal como é aqui utilizado, de acordo com a presente invenção, um substrato de carbapenemase é um que é selecionado de entre o grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas.
Tipicamente, o carbapenemos é selecionado a partir do grupo que consiste em Biapenem, ertapenem, doripenem, imipenem, meropenem, tebipenem e panipenem.
Tipicamente, a cefamicina é selecionada a partir do grupo que consiste em moxalactam e cefoxitina. As cefamicinas são particularmente interessantes para a detecção de carbapenemases de Ambler Classe B (11).
De preferência, o substrato é carbapenemase imipenem.
Tipicamente, a concentração de substrato de
carbapenemase utilizado no kit de reagentes está
compreendida entre 0,1 mg / ml e 10 mg / ml, mais
preferencialmente, entre 1 mg / ml e 5 mg / ml e, ainda mais preferencialmente, entre 2 mg / ml e 3 mg / ml.
De acordo com a invenção, o indicador de cor de pH irá mudar de cor quando o pH da mistura da reação estiver compreendido entre 6,4 e 8,4, de preferência, entre 6,6 e 7,5 .
Tipicamente, a concentração do indicador de cor de pH utilizado no kit de reagentes está compreendido entre 0,01% e 1%, mais preferencialmente, entre 0,03% e 0,08%, e ainda, mais preferencialmente, entre 0,05% e 0,06%.
Tipicamente, o técnico versado no assunto é capaz de selecionar um indicador de cor de pH adequado para esta reação de hidrólise. Uma lista de indicadores de pH que podem ser utilizados na presente invenção podem ser encontrados no CRC Handbook of Chemistry and Physics: A Ready-reference Book of Chemical and Physical Data, 91st Revised ed. (1 de junho de 2010), CRC Press Inc. Por exemplo, o indicador de cor de pH utilizado na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 6,8-dinitro-2,4 - (1H) quinazolinadiona (pH: 6,4 a 8,0), amarelo brilhante (pH: 6,6 a 7,8), vermelho de fenol (pH: 6,6 a 8,0) e vermelho neutro (pH: 6,8 a 8,0).
De preferência, o indicador de cor de pH utilizado na presente invenção é o vermelho de fenol e, quando é utilizado uma mudança de cor de vermelho para amarelo, indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra de teste.
Tipicamente, a reação na etapa b) é realizada ao longo de um período de tempo suficiente para se observar uma mudança de cor. Preferivelmente, a mudança de cor é observada visualmente num período de tempo compreendido entre 5 minutos e 120 minutos, de preferência, entre 10 e 60 minutos, mais preferivelmente, entre 20 e 40 minutos. Alternativamente, a identificação da mudança de cor pode ser automatizada, utilizando, por exemplo, um fotômetro.
Tipicamente, a reação na etapa b) é realizada a uma temperatura compreendida entre 15° C e 40° C, preferivelmente, entre 20° C e 37° C, mais preferivelmente, entre 35° C e 37° C.
Com base em estudos moleculares, carbapenemases podem ainda ser divididas em dois tipos: enzimas serina que possuam um radical serina no sítio ativo (Ambler Classe B, C, e D), e MBLs (Ambler classe B) , que exigem, geralmente cátions bivalentes de zinco, como co-fatores para a atividade da enzima de metal facilitando, deste modo a hidrólise do anel bicíclico beta-lactamo (12).
Assim, de acordo com uma outra concretização da invenção, a fim de aumentar a sensibilidade do método, o kit de reagentes compreende ainda um ativador de carbapenemase, o qual é selecionado de entre o grupo consistindo de cátions bivalentes ou os seus sais, e suas misturas.
Tipicamente, no caso de carbapenemases de Ambler classe B, o ativador é um cátion bivalente ou seu sal selecionado a partir do grupo que consiste de manganês, cobalto, níquel, cádmio, mercúrio, zinco e suas misturas (ver Biochem J. 1974; 143 (1) : 129 - 35 e no Journal of Biological Chemistry vol. 285, NO. 7, 4570 - 4577). De preferência, o ativador de carbapenemase é zinco.
Tipicamente, a concentração do ativador de carbapenemase presente no kit de reagentes está compreendida entre 0,01 mM e 1 mM, mais preferencialmente, entre 0,05 mM e 0,5 mM e ainda, mais preferencialmente, entre 0,08 mM e 0,12 mM.
Tipicamente, um caldo é inoculado com uma cepa de ensaio (obtida a partir de uma amostra de teste) e incubada num agitador rotativo. Em seguida, a cultura foi centrifugada e o sedimento ressuspenso em tampão de lise, agitado e depois incubado. Depois de incubação suficiente, a suspensão (isto é, suspensão enzimática) é centrifugada e o sobrenadante é removido e colocado em gelo. Uma pequena fração deste sobrenadante é misturada com um kit de reagentes, que compreende um substrato carbapenemase, um indicador de cor pH e um ativador carbapenemase. A mistura de compostos do kit de reagente e a suspensão enzimática testada é ainda incubada a uma temperatura e durante um período de tempo suficiente, de tal modo que uma mudança de cor é observada. Uma mudança de cor indica a presença de um carbapenemase. A alteração de cor pode ser obtida mais cedo, tal como 5 minutos após o início da incubação. Na maioria dos casos, um tempo de incubação de 30 minutos é suficiente para a obtenção de um franco de mudança de cor para os produtores de carbapenemase.
Em uma concretização preferida, é proporcionado um método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra biológica, o método compreendendo as etapas de:
a) realizar a lise das células em uma amostra biológica, a fim de obter uma suspensão enzimática,
b) reagir uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes, o referido kit de reagente compreendendo
- Imipenem como substrato carbapenemase,
- Vermelho de fenol como indicador de cor de pH e
- Zinco ou seu sal, como o ativador carbapenemase, em que uma mudança de cor de vermelho para amarelo, após a etapa b) indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra biológica.
De acordo com uma concretização, a fim de identificar especificamente a classe de carbapenemase que está presente na amostra de teste, se uma carbapenemase Ambler de Classe A, B ou D, um inibidor de carbapenemase pode ser usado.
Tipicamente, o inibidor de carbapenemase pode ser mono-específico para uma classe de carbapenemase. Por exemplo, os inibidores de carbapenemase são selecionados a partir do grupo que consiste de ácido clavulânico, Tazobactam, Sulbactam, e ácido aminofenilborônico para carbapenemases Ambler classe A, e selecionado de entre o grupo consistindo de 1 - 10 fenantrolina, ácido dipicolínico, compostos tióis (tais como, o ácido mercaptopropiônico e ácido tioglicólico) e EDTA para carbapenemases de Ambler classe B (12 - 17).
Em uma concretização preferida, o inibidor monoespecífico de carbapenemase para carbapenemases de classe Ambler A é tazobactam.
Em uma concretização preferida, o inibidor monoespecífico de carbapenemase para carbapenemases de Ambler classe B é o EDTA, mais preferencialmente, EDTA associado com uma depleção de ZnS04. De fato, a atividade do EDTA é reforçada por uma depleção de cátions divalentes.
Tipicamente, o inibidor de carbapenemase pode ser bi específico para mais do que uma classe de carbapenemase, tal como, por exemplo NXL-104, a qual é bi-específico para carbapenemases de Ambler classes A e D (12-17).
Tipicamente, a concentração do inibidor de carbapenemase mono-específico para carbapenemases de Ambler classe A (tal como, por exemplo, tazobactam) está compreendida entre 0,1 mg / ml e 10 mg / ml, mais preferencialmente, entre 1 mg / ml e 5 mg / ml e ainda, mais preferencialmente, entre 2 mg / ml e 3 mg / ml.
Tipicamente, a concentração de inibidor monoespecífico de carbapenemase para carbapenemases de Ambler classe B (tais como, por exemplo, EDTA), esteja compreendida entre 0,001 M e 0,5 M, mais preferencialmente, entre 0,001 M e 0,01 M e, ainda, mais preferencialmente, em 0,005 M.
Tipicamente, a concentração de inibidor de carbapenemase bi-específico para carbapenemases de Ambler classes A e D (tal como, por exemplo, NXL-104) está compreendida entre 0,05 mg / ml e 10 mg / ml, mais preferencialmente, entre 1 mg / ml e 8 mg / ml e, ainda mais preferivelmente, entre 3 mg / L e 5 mg / ml.
Tipicamente, a fim de identificar a classe de carbapenemase pode-se utilizar uma placa de microtitulação de 96 poços e dividir a placa em quatro seções. Em uma primeira seção, a presença de carbapenemases pode ser detectada, de acordo com o método da invenção, tal como descrito anteriormente. Em uma segunda seção, carbapenemases de Ambler classe A podem ser detectadas através da adição de um inibidor de carbapenemase para carbapenemases de classe A. Em uma terceira seção, carbapenemases de Ambler classe B podem ser detectadas pela adição de um inibidor de carbapenemase para carbapenemases da classes B (eventualmente, com uma depleção de ZnS04) . Finalmente, em uma quarta seção, carbapenemases de Ambler classe D podem ser detectadas, através da adição de um inibidor de carbapenemase para carbapenemases de classe D. Dependendo do inibidor de carbapenemase usado, o técnico versado no assunto é capaz, em seguida, por simples dedução estabelecer o Ambler classe específica (s) de carbapenemase que é (estão) presente na amostra de teste.
Tipicamente, o inibidor de carbapenemase pode ser parte do próprio dispositivo de reagentes e, assim, adicionado ao mesmo tempo que o substrato de carbapenemase, o indicador de cor de pH e, opcionalmente, o ativador de carbapenemase.
Alternativamente, o inibidor de carbapenemase pode ser separado do kit de reagente e, assim, adicionado simultaneamente ou sequencialmente com o kit de reagentes e / ou a amostra de teste (fração da suspensão enzimática).
Assim, o método, de acordo com a invenção foi realizado em todas as quatro seções, isto é, com ou sem os inibidores de carbapanemase, a comparação é estabelecida entre os resultados obtidos após realização do método, tal como descrito acima e os resultados obtidos após a realização do mesmo método em que um inibidor de carbapenemase foi também adicionado.
Kit de Reagente:
De acordo com um outro aspecto da invenção, proporciona-se um kit de reagentes, que compreende um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um indicador de cor de pH.
De acordo com uma concretização da invenção, o kit de reagentes pode também compreender um ativador de carbapenemase. Assim, o kit de reagentes pode incluir um substrato de carbapenemase, um indicador de cor de pH e um ativador carbapenemase.
De acordo com uma concretização da invenção, o kit de reagentes pode ainda compreender um inibidor de carbapenemase. Assim, o kit de reagentes pode incluir um substrato de carbapenemase, um indicador de cor de pH, um ativador de carbapenemase e um inibidor de carbapenemase.
4
O substrato de carbapenemase, indicador de cor de pH, ativador de carbapenemase e o inibidor de carbapenemase são como definidos anteriormente no presente pedido de patente.
Tipicamente, o kit de reagente é utilizado para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra, de acordo com o método da presente invenção.
Tipicamente, quando o inibidor específico de carbapenemase está presente no kit de reagentes, a classe específica correspondente da carbapenemase, se Ambler classe A, B ou D, pode ser determinada.
Placas de Microtitilação:
De acordo com um outro aspecto da invenção, proporciona-se uma placa de microtitulação compreendendo um poço ou uma série de poços que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas.
Tipicamente, a placa de microtitulação pode ainda compreender:
- um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor de carbapenemase Ambler de classe A;
- um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor de carbapenemase Ambler classe B (eventualmente, com uma depleção de ZnS04) ; e
- um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor de carbapenemase Ambler de classe D.
A placa de microtitulação pode conter também um poço de controle ou uma série de poços de controle, os quais podem ser ensaiados e comparados com as amostras de teste.
Tipicamente, a placa de microtitulação é uma placa de microtitulação de 96 poços.
Outras do que as placas de microtitulação de dispositivos podem ser utilizadas para esta finalidade. Por exemplo, pode ser usado um papel mata-borrão, no qual o dispositivo de reagentes (isto é, o substrato de carbapenemase e o indicador de cor de pH) foi incorporado. Depois da adição da suspensão enzimática ao papel absorvente, pode-se observar se o papel muda de cor ou não. Da mesma forma, podem ser utilizadas galerias de plástico. Com efeito, o kit de reagentes pode ser incluído nessas galerias de plástico e, em seguida, após a adição da suspensão enzimática para estas galerias pode-se observar a
existência de uma mudança de cor ou não.
Para que o método da invenção a ser realizado, um
indicador de cor de pH, um ativador de carbapenamase
opcional e uma fração da suspensão enzimática a ensaiar são
adicionados a cada poço da placa de microtitulação. Por conseguinte, é proporcionada a utilização de uma placa de microtitulação para a detecção da presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra de teste, de acordo com o método da presente invenção, em que a cada poço é adicionado, pelo menos, um indicador de cor de pH e uma fração da suspensão enzimática a ser testada. A placa de microtitulação é particularmente bem adequada para determinar a classe específica de carbapenemase presente em uma amostra de teste.
Normalmente, se o indicador de cor de pH está estável, o poço ou uma série de poços da placa de microtitulação podem também compreender o indicador de cor de pH com o substrato de carbapenemase ou com o substrato de carbapenemase e o inibidor de carbapenemase, antes de realizar o método da invenção. Alternativamente, se o indicador de cor de pH não é estável, este pode ser adicionado ao poço ou a série de poços em seguida.
Tipicamente, um ativador de carbapenemase também pode ser adicionado ao poço ou uma série de poços da placa de microtitulação com o substrato de carbapenemase ou com o substrato de carbapenemase e o inibidor de carbapenemase antes de realizar o método da invenção. Alternativamente, um carbapenemase pode ser adicionado ao poço ou uma série de poços em seguida.
O substrato de carbapenemase, o indicador de cor de pH, o ativador de carbapenemase e o inibidor de carbapenemase são como definidos anteriormente no presente pedido de patente.
De acordo com uma concretização, alguns dos componentes, como, por exemplo, o substrato de carbapenemase e o inibidor de carbapenemase (quando presente), podem ser diretamente ligados a uma superfície sólida da placa de microtitulação. Neste caso, os componentes restantes (isto é, o indicador de cor de pH e o ativador de carbapenemase opcional) são adicionados ao substrato de carbapenemase ligados à superfície e para o inibidor de carbapenemase ligados à superfície (quando
presente) na placa de microtitulação com a amostra de
teste.
De acordo com uma concretização, a placa de
microtitulação, assim, como cada um dos elementos
utilizados para realizar o método da invenção pode ser fechada dentro de um recipiente individual e todos os diversos recipientes podem ser colocados dentro de um único kit, juntamente com instruções para observar se bactérias produtoras de carbapenemase podem ser encontradas na amostra de teste.
Breve Descrição dos Desenhos
A invenção será ainda ilustrada na vista da figura e exemplos seguintes.
A Figura 1 mostra os resultados para o método de detecção de produtores de carbapenemase, em que os produtores de carbapenemase (números escurecidos) são como se segue: E. cloacae KPC-2 (1), E. coli COL KPC-2 (2), K. pneumoniae H1516-6 COL KPC-2 (3), K. pneumoniae BIC OXA-48 (4), K. pneumoniae CHA OXA-48 (5), E. cloacae TUR OXA-48 (6), E. coli HAN OXA-48 (7), K. pneumoniae OMA OXA-181 (8), P. rettgeri RAP OXA-181 (9), K. pneumoniae UK NDM-1 (10), K. pneumoniae 1 OMA NDM-1 (11), E. coli 271 AUS NDM-1 (12), C. freundii STE NDM-1 (13), E. coli MAD VIM-1 (14), K. pneumoniae MAD IMP-13 (15).
Sem produtores de carbapenemase (números branqueados) são como se segue: K. pneumoniae CTX-M-15 (16), E. cloacae CTX-M-15 (17), E. coli CTX-M-14 (18), K. pneumoniae 6299 OXA-163 (19), E. coli VEB-1 (20), E. coli ACC-1 (21), K. pneumoniae DHA-2 (22), E. coli Ec13 SYD CMY-2 (23), E. coli VMC CMY-10 (24), E. cloacae ARF superexpressando AmpC (25),
E. cloacae CON superexpressando AmpC (26), K. pneumoniae COO deficiência de porina (27), K. pneumoniae BER deficiência de porina (28), cepa-selvagem E. coli J53 (29), cepa-selvagem K. pneumoniae CIP53153 (30).
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Método (Teste ácido-colorimétrico) de acordo com a invenção
Trinta e seis isolados produtores de carbapenemase de várias espécies de enterobactérias da coleção de capa do requerente e de origem mundial foram incluídos no estudo (Tabela 1). Estas cepas tinham sido previamente caracterizadas pelo seu teor de beta-lactamase, a nível molecular.
A coleta de amostras também continha uma série de isolados com sensibilidade reduzida a carbapenens por mecanismos baseados sem carbapenemase ou por não produtores de carbapenemase de betalactamase de amplo espectro frequentemente identificados entre os isolados clínicos (Tabela 2).
Antes de realizar o método da invenção, testes de susceptibilidade foram realizados por determinação dos valores de concentração inibitória mínima (CIM) pelo Etest® (AB bioMérieux; Solna, Suécia) em placas de agar MuellerHinton a 37° C e os resultados dos testes de susceptibilidade foram registrados de acordo com as diretrizes Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modificados em Junho de 2010 (18) . Os pontos de interrupção para imipenem são S â 1 pg/ml (suscetibilidade) e R > 4 pg/ml (resistente). Quanto àqueles para ertapenem, são S â 0,25 pg/ml e R > 1 pg/ml (ver Tabelas 1 e 2).
As amostras foram submetidas ao processo da presente invenção como se segue.
ml de caldo de tripticase de soja foram inoculados com duas colônias da cepa de teste, as quais foram incubadas durante 3 horas a 37° C em um agitador rotativo. Em seguida, a cultura foi centrifugada a 10.000 g a 4° C durante 15 min. O sedimento foi ressuspenso em Tris-HCL 20 mM de tampão de lise (B-PERII, Reagente de extração de proteína bacteriana, Thermo Scientific, Pierce), centrifugado durante 1 min e depois incubado à temperatura ambiente durante 30 min. Para a obtenção de uma extração de proteínas de alta qualidade a partir de culturas de sangue, o preciptado bacteriano é ressuspenso em tampão de lise (BPERII, Reagente de extração de proteína bacteriana, ThermoScientific Pierce) e, em seguida, transferido em tubos microesfera (UltraClean tubos de isolamento bacteriano de kit de DNA Bead (laboratórios MO BIO) e a lise mecânica de bactérias é obtida por agitação vigorosa de tubos microesferas utilizando um adaptador vórtice durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Esta suspensão bacteriana foi centrifugada a 10.000 g a 4° C durante 5 min. e os sobrenadante foram removidos e colocados em gelo. 30 μΐ destes sobrenadantes de suspensão (isto é, suspensão enzimática) foram misturados em um poço de uma placa de 96 poços com 100 μΐ de uma solução de 1 ml fabricada de 3 mg de imipenem mono-hidratado, solução vermelho fenol de pH 7,5 e ZnS04 0,1 mM (ou seja, o kit de reagente).
A solução de vermelho de fenol utilizado pelo Requerente foi feita tendo em 2,2 ml de uma solução de fenol de pH 8 concentrado (feito a partir de uma mistura de vermelho de fenol a 0,5% em água destilada), ao qual o Requerente adicionou 16,6 ml de água destilada. O valor de pH foi então ajustado para 7,5 por adição de gotas de solução de NaOH a 1 N.
As misturas do kit de reagente e a suspensão enzimática testada foram incubadas a 37° C durante 1 h. Suspensões de cepas bacterianas que produzem ou não carbapenemases (controles positivos e negativos) foram também testadas, de acordo com o método da invenção. A cor dos poços mudou de vermelho para amarelo para todas as cepas testadas produzindo qualquer tipo de carbapenemases, enquanto poços correspondentes aos extratos de bactérias de isolados que não produzem carbapenemases permaneceram vermelho, seja qual era o nível de suscetibilidade a carbapenens (Figura 1. Veja também as Tabelas 1 e 2 para os resultados). A mudança de cor do vermelho para o amarelo foi obtida tão cedo quanto 5 min após o início da incubação para os produtores KPC. Na maioria dos casos, um tempo de incubação de 30 minutos foi suficiente para a obtenção de uma mudança de cor para os produtores carbapenemase. A mudança de cor embora ainda positiva foi menos franco com diversos isolados, tal como vários produtores IMP e VIM. O teste foi conduzido como um estudo cego por uma pessoa que não sabia o que bem compreendeu os produtores carbapenemase. Todos os testes foram realizados em triplicata, com resultados altamente reprodutíveis.
Exemplo 2 - Detecção Rápida de Enterobacteriaceae Produtoras de carbapenemase
Resumo
O teste Carba NP foi desenvolvido para uma identificação rápida de qualquer produtor de carbapenemase em Enterobacteriaceae. Este teste bioquímico usando colônias bacterianas isoladas é baseado na hidrólise in vitro de um carbapenem, imipenem. Foi 100% sensível e específico em comparação com técnicas baseadas em moleculares. Esta técnica rápida (menos de 2 h) e de baixo custo pode ser implementado em qualquer laboratório. Constitui-se uma verdadeira mudança de paradigma para controlar a propagação mundial de produtores carbapenemase. Estudo
Cento e sessenta e dois cepas produtoras de carbapenemase de várias espécies de enterobactérias isoladas de diversas amostras clínicas (culturas de sangue, urina, saliva, ...) a partir de nossa própria coleção de cepas e de origem mundial, foram incluídas no estudo (Tabela 3). Esta coleção de cepas também incluiu quarenta e seis cepas sendo totalmente suscetível a carbapenemas ou que mostram uma diminuição da suscetibilidade a carbapenens como consequência de mecanismos não baseados em carbapenemase (Tabela 4). Antibiogramas foram realizados para todas as cepas em agar Mueller-Hinton (BioRad, Marnesla-Coquette, França), de acordo com as diretrizes do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; TwentySecond Informational Supplement. M100-S22. Wayne (PA), USA: CLSI; 2012). O teste Carba NP (carbapenemase NordmannPoirel) foi realizado como se segue. Uma dose calibrada (10 pl) da cepa testada diretamente recuperada a partir de antibiograma foi ressuspensa em um tampão de lise de 20 mM
Tris-HCl (B-PERII, Reagente de extracção de proteína bacteriana, Thermo Scientific, Pierce), centrifugada durante 1 min e ainda incubada à temperatura ambiente durante 30 min. Esta suspensão bacteriana foi centrifugada a 10,000 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Trinta pl do sobrenadante, correspondente à suspensão bacteriana enzimática foi misturada em um poço de uma placa de 96 poços com 100 pl de uma solução de 1 ml fabricado de 3 mg de imipenem mono-hidratado (Sigma, Saint Quentin Fallavier, França), pH 7,8 solução de vermelho de fenol e 0,1 mM de ZnS04 (Merck Millipore, Guyancourt, França). A solução de vermelho de fenol utilizado foi preparada tomando 2 ml de uma solução de vermelho de fenol (Merck Millipore) de 0,5% p / v para o que 16,6 ml de água destilada foram adicionados. O valor de pH foi então ajustado para 7,8 por adição de gotas de NaOH 1 N. Mistura da solução de vermelho de fenol e a suspensão enzimática a ser testado foi incubada a 37° C para um máximo de 2 h. Os resultados do teste foram interpretados por técnicos que desconheciam a identidade das amostras.
Todas as cepas foram previamente caracterizadas pelo seu teor de β-lactamase, a nível molecular. Concentração Inibitória Mínima de carbapenem foram determinadas usando o Etesl® (AB bioMérieux, Solna, Suécia) e os resultados foram registrados de acordo com as diretrizes Norte-Americana (CLSI), atualizada em 2011.
Usando o teste Carba NP, a cor dos poços virou de vermelho para laranja ou amarelo (Figura 2) para todas as cepas testadas produzindo carbapenemases (Tabela 3), enquanto que os poços que correspondem aos extratos de isolados bacterianos que não produzem carbapenemase permaneceu vermelho, independentemente, do seu nível de suscetibilidade ao carbapenem (Tabela 4). A mudança de cor do vermelho para o amarelo foi obtida tão cedo quanto 5 a 10 minutos após o início da incubação para os produtores KPC. Na maioria dos casos, 30 min de incubação foi
suficiente para a obtenção de uma mudança de cor para os
produtores carbapenemase. A especificidade do teste e
sensibilidade foram ambos em 100%, em comparação com a
identificação de base molecular dos genes carbapenemase tomados como um padrão de ouro. Todos os testes foram realizados em triplicata, os quais produziram resultados idênticos e reproduzíveis.
O teste Carba NP perfeitamente diferencia produtores carbapenemase (Tabela 3) a partir de cepas que foram resistentes a carbapenem, devido a mecanismos não mediados por carbapenemase, tais como mecanismos combinados de resistência (defeito de permeabilidade da membrana exterior associados com a superprodução de cefalosporinase e / ou BLEEs) ou a partir de cepas que são suscetíveis carbapenem, mas manifestaram β-lactamase de amplo espectro sem atividade carbapenemase (ESBL, plasmídeo e cefalosporinases codificado do cromossomo) (Tabela 4). Resultados positivos interpretáveis foram obtidos em menos de 2 horas, o tempo total que é único, tornando possível a implementação de medidas de contenção rápida para limitar a propagação de produtores carbapenemase.
Conclusões
O teste Carba NP tem vários benefícios. É barato, rápido, reprodutível e altamente sensível e específico, eliminando a necessidade de outras técnicas para a identificação dos produtores carbapenemase que são menos sensíveis e específicos ou demorados. Usando este teste exato irá melhorar significativamente a detecção de pacientes infectados ou colonizados com os produtores de carbapenemase. O teste Carba NP foi rotineiramente executado no nosso departamento e está a dar excelentes resultados (dados não mostrados). Além disso, diminuiu significativamente a carga de trabalho de técnicos de laboratório e simplificou o manejo clínico dos produtores de carbapenemase potenciais.
Este teste pode ser utilizado, por exemplo, para testar diretamente (i) a partir de bactérias obtidas de antibiograma de cultura de sangue, e / ou (ii) colônias bacterianas cultivadas em meios de cultura, antes do teste de sensibilidade aos antibióticos. Para a administração de antibióticos em bactérias isoladas diretamente a partir dessas amostras clínicas, o ganho de tempo para a detecção dos produtores carbapenemase deverá ser de pelo menos 24 h. Também poderia ser utilizado para a identificação rápida de isolados que são resistentes a carbapenemos e / ou às cefalosporinas de espectro amplo, obtidas a partir de rastreio de bactérias multirresistentes recuperadas a partir de fezes. Isso seria de extrema importância para a prevenção de surtos. O uso do teste Carba NP pode apoiar novos desenvolvimento de antibióticos facilitando a inscrição do paciente em ensaios clínicos principais. Este teste usado como um teste de produção caseira pode contribuir para a rede de vigilância global.
Os resultados do teste Carba NP podem eficientemente selecionar as cepas de serem testadas por PCR e / ou submetidas a sequenciamento para uma identificação detalhada dos genes carbapenemase. Finalmente, outra área de uso do teste poderia ser em países de baixa renda, que são conhecidos por serem grandes reservatórios de produtores de carbapenemase. Ele oferece, pela primeira vez, uma solução amigável para a detecção de um dos componentes principais da resistência a múltiplas drogas em Enterobacteriaceae. Utilização do teste Carba NP irá contribuir para uma melhor administração dos carbapenemos, alterando o paradigma dos controles de produtores carbapenemase em todo o mundo.
Exemplo 3 - Detecção rápida de Pseudomonas SSP produtores de carbapenemase.
Resumo
Resistência de carbapenêmicos em Pseudomonas spp. está relacionada principalmente à diminuição da permeabilidade da membrana externa ou à expressão de carbapenemases. Atualmente, detecção de carbapenemases se baseia em técnicas a base moleculares ou fenotípicas, em que não são suficientemente sensíveis ou específicas ou são caras. Além disso, essas técnicas são demoradas e, portanto, de interesse clínico limitado. Uma nova técnica, o teste Carba NP, com base na hidrólise in vitro de um carbapenem, foi aqui avaliada para detectar a produção de carbapenemase em Pseudomonas spp. Ela foi testada com 36 carbapenemase e 72 produtores não carbapenemase. O teste Carba NP foi específico e sensível (100% e 94,4%, respectivamente), e rápida (menos de 2 horas). Esta técnica de baixo custo pode ser implementada em qualquer laboratório de microbiologia clínica mundial. Ela oferece uma técnica confiável para a identificação dos produtores de carbapenemase de Pseudomonas spp., e, portanto, uma ferramenta muito útil para evitar a sua propagação nosocomial.
MÉTODOS
Coleção de Cepas
Trinta e seis isolados produtores de carbapenemase pertencentes a várias espécies de Pseudomonas isoladas de diferentes amostras clínicas (hemoculturas, urina, saliva, etc ..) de nossa coleção de cepas e sendo de origem global, foram incluídas neste estudo (Tabela 5). As cepas tinham sido previamente caracterizadas pelo seu teor de βlactamase, a nível molecular. Esta coleção também continha 72 amostras representativas dos principais fenótipos de resistência β-lactâmicos e diversidade β-lactamase identificados em Pseudomonas spp. (Incluindo BLEEs de PER,VEB, BEL-, SHV-, oxa-tipos TEM-e) (Tabela 6). Além disso, a maioria dessas cepas eram resistentes aos carbapenêmicos. Testes de susceptibilidade
Teste de sensibilidade foi realizado utilizando o Etest® (bioMérieux; La Balmes-les-Grottes, França) em placas de ágar Mueller-Hinton (Becton Dickinson, Le Pont de Chaix, França), a 37° C e os resultados foram registrados, de acordo com as diretrizes Norte-Americana (CLSI), atualizada em 2012. Os pontos de interrupção para imipenem, meropenem e doripenem são os seguintes; susceptibilidade (S) < 2, e resistência (R) > 8 mg / ml.
Teste Carba NP
O teste Carba NP foi realizado, tal como anteriormente detalhado em cepas cultivadas em placas de agar MuellerHinton (Becton Dickinson) a 37° C durante 18 a 22h (7) . Este teste se baseia na detecção bioquímica da hidrólise do anel β-lactamo de um carbapenem, imipenem, seguido de mudança de cor do indicador de pH. Resumidamente, uma dose calibrada (10 pl) da cepa testada diretamente recuperada a partir de antibiograma foi ressuspensa em um tampão de lise de 20 mM Tris-HCl (B-PER II, Reagente de extração de proteína bacteriana, Thermo Scientific, Pierce), centrifugado para 1 min e depois incubado à temperatura ambiente durante 30 min. Esta suspensão bacteriana foi centrifugada a 10,000 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Trinta pl do sobrenadante, correspondente à suspensão bacteriana enzimática, foi misturado em um poço de uma placa de 96 poços com 100 pl de uma solução de 1 ml fabricado de 3 mg de imipenem mono-hidratado (Sigma, SaintQuentin-Fallavier, França) pH 7.8 de solução de vermelho fenol e 0,1 mM de ZnS04 (Merck Millipore, Guyancourt, França). Mistura da solução de vermelho de fenol e a suspensão enzimática a ser testada foi incubada a 37° C durante um máximo de 2 h. Os resultados do teste foram interpretados por técnicos que desconheciam a identidade das amostras.
RESULTADOS
Usando o teste Carba NP, a cor dos poços alterou de vermelho para laranja ou amarela para todos os isolados produtores de carbapenemase, com a exceção de vários produtores do tipo GES que não foram detectados (Tabela 5). Poços correspondentes a extratos de isolados bacterianos que não produzem carbapenemase permaneceram vermelho (negativo) independentemente do seu nível de resistência a carbapenem (Tabela 6) . Na maioria dos casos, um tempo de incubação de 30 minutos foi suficiente para a obtenção de uma mudança de cor para os produtores carbapenemase. A especificidade e sensibilidade do teste foram encontrados como sendo 100% e 94,4%, respectivamente. Todos os testes foram realizados em triplicata, os quais produziram resultados idênticos e reproduzíveis. Curiosamente, uma atividade carbapenemase foi detectada nos dois produtores de carbapenemase (PIM-1 produtora de P. stutzeri PB207 e P. putida NTU 92/99,) que eram basicamente susceptível a carbapenems, de acordo com as diretrizes NCCLS (Tabela 5).
O teste Carba NP diferencia os produtores carbapenemase (Tabela 5) a partir desses isolados sendo carbapenem resistentes devido mecanismos mediados à nãocarbapenemas, tais como os mecanismos combinados de resistência (defeito na permeabilidade da membrana externa + / - associado com a superprodução de cefalosporinase e / ou BLEEs) (Tabela 6).
DISCUSSÃO
Como relatado anteriormente em Enterobacteriaceae (ver exemplo 2), o teste Carba NP tem várias vantagens para a detecção de atividade em carbapenemase em não fermentadores, tais como em Pseudomonas spp. O teste Carba NP elimina a necessidade de detecção in vivo de atividade carbapenemase (teste Hodge) e de técnicas de fenotipagem baseada em inibidores de β-lactamase (ácido borônico para KPC, EDTA para MBL) que ambas requerem até 24 a 72 horas para ser realizada. Além disso, a inibição da atividade βlactamase são mais difíceis de prova em que a P. aeruginosa em Enterobacteriaceae, devido à baixa permeabilidade de membrana externa de P. aeruginosa. O uso de tais técnicas de inibição baseada pode falha na detecção de atividade carbapenemase mesmo entre os verdadeiros produtores carbapenemase (Picao et al. Clin. Microbiol. 46:2028-2037). O teste Carba NP diferencia claramente carbapenemase de produtores não carbapenemase entre carbapenem de P.
aeruginosa resistente. Ela também pode detectar a atividade carbapenemase entre carbapenemase produtores que permanecem suscetíveis a carbapenem. O teste Carba NP é a primeira técnica disponível para identificar produtores carbapenemase com tão elevada especificidade, sensibilidade e rapidez (menos do que 2 h). No entanto, a ausência de detecção de carbapenemases do tipo GES tem que ser considerado, especialmente, em regiões geográficas com alta prevalência (isto é, Brasil, África do Sul). Esta falta de detecção dos derivados GES específicos pode ser devido à sua fraca atividade carbapenemase intrínseca. Com efeito, carbapenemases do tipo GES são análogos de ponto mutante de BLEEs do tipo GES. Eles não conferem (em uma E. coli do tipo selvagem, por exemplo) uma franca resistência aos carbapenêmicos (faixa kCat / Km de 0, 02-0,26 μΜ-1 . S-1), ao contrário, por exemplo, para MBLs que conferem uma muito maior nível de resistência carbapenemase (geralmente k cat/ Km > 1 μΜ-1 ) . Além disso, a importância clínica real da atividade carbapenemase do tipo GES varia como fonte de resistência in vivo para as carbapenemas (terapêutico) manteve-se a ser avaliada.
Temos agora rotineiramente implementado o teste Carba
NP em nosso departamento. Ele tem sido usado para a busca de atividade carbapenemase entre os isolados com qualquer ligeira diminuição da susceptibilidade aos carbapenêmicos entre os não fermentadores. Ele forneceu excelentes resultados e reprodutíveis. Os resultados deste teste Carba NP são usados para selecionar as cepas para mais testes por PCR e sequenciamento, quando é necessária uma identificação precisa do gene carbapenemase.
Usando este teste exato seria útil para a detecção de pacientes infectados ou colonizados com os produtores de carbapenemase, que é de extrema importância para uma melhor administração de antibiótico e prevenção de surtos. Utilização do teste Carba NP pode ser interessante em particular para UTI e pacientes com queimaduras, onde P. aeruginosa multi-resistente são comuns. Ele oferece uma solução sem custo para a detecção de produtores de carbapenemase e impedindo a sua propagação, tendo em vista que eles podem abrigar esses genes carbapenemase em plasmídeos que podem se espalhar. Além disso, o controle de produtoras de carbapenemase Pseudomonas spp. é importante quando se considera que muitos desses genes de carbapenemase são compartilhados com Enterobacteriaceae. Digno de nota, o teste Carba NP também poderia ser utilizado para implementar um sistema de vigilância de produtoras de carbapenemase Pseudomonas spp. em escala mundial.
Tabela 1. Trinta e seis produtores carbapenemase de várias espécies de enterobactérias foram estudados segundo o método da invenção.
Colorimetric test + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Acquired beta-lactamases CM ό Z CM ό Z CM ό Z LO É X 1— o + ω 1- + CM O o z co X o OXA-48 + TEM-1 I OXA-48 + CTX-M-15 | co X o co X o OXA-48 + SHV-5 I co X o OXA-48 + CTX-M-15 | OXA-181 + CTXM-15 + OXA-1 | | OXA-181 + CTX-M-15 | X o + co X o NDM-1 + CTX-M-15 + CMY-4 + OXA-1 | NDM-1 + CTX-M-15 + OXA-1 + OXA-9 + OXA-10 + CMY16 | NDM-1 + CTX-M-15 + OXA-1 + OXA-9 | NDM-1 + OXA-1 | NDM-1 + OXA-1 + CTX-M-15 + CMY-6 + TEM-1 I NDM-1 + OXA-1 + CTX-M-15 I NDM-1 + OXA-1 + CMY-30 + TEM-1 | NDM-1 + OXA-1 + OXA-10 + CMY-16 | | NDM-1 + CTX-M-15 + TEM-1 | NDM-1 + OXA-1 + OXA-2 + CTX-M-15 + TEM-1 I | NDM-1 + CTX-M-15 | NDM-1 + OXA-1 + CMY-6 | | NDM-1 + OXA-1 + OXA-9+ CXA-10 +CTX-M-15 + TEM-1 | s Q Z s Q Z VIM-1 + CTX-M-3 | σ> έ VIM-1 + CTX-M-3 | co
MICs (gg/ml) | 1— cc LU CD CM ΙΌ co CM 00 Λ CM - CO CM - LO LO CM - CM CM CO CM CO CM CO Λ CM CO Λ CM CO Λ CO CM CO CO CO CO CM CO Λ CM CO Λ CM CO Λ CO CM CO LO CM CM CO Λ co CM
1 - CM CD LO LO CM - - LO LO - LO LO - CO CD CM CO Λ CM CO Λ CM CO Λ CD CD CD CM CO Λ CM CO Λ CM CO Λ CM CO LO - CM CO Λ LO LO
Isolates \ E. cloacae (V) E. coli PSP | E. coli COL (2) | K. pneumoniae H1516-6 COL (3) z Q O υ LU K. pneumoniae BIC (4) K. pneumoniae CHA (5) K. pneumoniae EGY K. pneumoniae BEL K. pneumoniae RAM δ oc =) H Φ TO O TO O O LU E. coli HAN (7) | E. coli BOU | K. pneumoniae OMA (8) K. pneumoniae HOL P. rettgeri RAP (9) | K. pneumoniae UK (10) K. pneumoniae 6759 GEN K. pneumoniae 1 OMA (11) K. pneumoniae 2 OMA K. pneumoniae 7 AFR K. pneumoniae IND E coli 5649 GEN | E coli RIC | E coli 271 AUS (12) | E coli ALL | CO CO CC Φ TO O TO O O LU P. stuartii C. freundii STE (13) K. pneumoniae SAB K. pneumoniae DIN E coli MAD (14) | I Q O υ LU K. pneumoniae MAD E coli MAD | K. pneumoniae MAD (15)
o z OXA-48 OXA-181 Q Z I
SHBOnaOHd S3SVIA13N3dVaaVO > MICs de imipenem (IMP) e ertapenem (ETP), beta-lactamases adquiridos e resultados do teste colorimétrico são mostrados.
> (**) os números em negrito e entre parênteses correspondem aos números na Figura 1.
Tabela 2. Isolados com sensibilidade reduzida a carbapenemos por mecanismos não baseados em carbapenemase ou por produção de não carbapenemase β-lactamases de amplo espectro foram estudados segundo o método da invenção.
Colorimetric test
Acquired beta-lactamases ΙΌ s X Ι- Ο ΙΌ s X Ι- Ο ΙΌ s X Ι- Ο S X Ι- Ο OXA-163 OXA-163 CO LU > co LU > ό o
MICs (pg/ml) 1— tc LU CD Ó CD Ó 90’0 0,06 CD Ó CD Ó CD | 0.06 I CD
CD Ó CD Ó 90’0 90’0 CD Ó CD O CD | 0.06 CD
Isolates K. pneumoniae (16) E. cloacae (17) E. coll FOR CO 8 LU LO CO CM 22 8 03 LU K. pneumoniae 6299 (19) E. cloacae \ E. coll (20) P. mirabilis
ESBL
SHBOnaOHd 3SVIAI3
ό o DHA-2 CMY-2 s o o o O CTX-M-15 + SHV-28 TEM
0.06 CD | 0.06 I | 0.06 I LO LO Ó LO Ó LO Ó LO Ó 0.06 CD Ó
0,06 CD I 0,06 | 0.06 0.38 0.38 LO Ó LO Ó LO Ó 0.06 CD Ó
8 LU K. pneumoniae (22) \ E. coll Ec13 SYD (23) \ E. coll VMC (24) oc 8 KJ LU E. cloacae BLA E. cloacae CON (26) K. pneumoniae COO (27) K. pneumoniae BER (28) E coli J53 (29) K. pneumoniae CIP53153(30)
Plasmid mediated cephalosporinase Overexpression of chromosomal cephalosporinase Porin deficiency associated with ESBL Wild-type
]N3dVaHVO-NON
7 y —> MICs de imipenem (IMP) e ertapenem (ETP), beta-lactamases adquiridos e resultados do teste colorimétrico são mostrados.
> (**) Os números em negrito e entre parênteses correspondem aos números na Figura 1.
Tabela 3. Isolados de Enterobactérias clínicas produtoras de carbapenemase submetidos ao teste Carba NP.
Ambler class Carbapenemase tipo Espécie β-lactamase n Faixa MICs (mg/L) Teste Carba NP
IMP ERT MER
CLASS A KPC-tipo K. pneumoniae KPC-2 27 0.5 to >32 4 to >32 1 to >32 +
KPC-3 3 0.5 to 8 4 to >32 1 to 8 +
K. ozonae KPC-3 1 >32 >32 2 +
E. coli KPC-2 5 0.5 to 4 0.5 to >32 0.5 to 2 +
E. cloacae KPC-2 7 1 to 24 1.5 to 32 0.75 to 16 +
E. aerogenes KPC-2 1 8 >32 8 +
C. freundii KPC-2 2 8 to >32 1.5 to >32 1.5 to 3 +
S. marcescens KPC-2 2 >32 >32 >32 +
Salmonella spp. KPC-2 1 4 1 0.25 +
NMC-A E. cloacae NMC-A 1 16 >32 16 +
SME-tipo S. marcescens SME-1 1 32 4 12 +
SME-2 1 32 4 12 +
GES-tipo E. cloacae GES-5 1 >32 >32 >32 +
IMI-tipo E. asburiae IMI-2 1 >32 >32 >32 +
CLASS B NDM-tipo K. pneumoniae NDM-1 16 0.5 to >32 2 to >32 1 to >32 +
NDM-4 1 >32 >32 >32 +
E. coli NDM-1 7 1 to 16 3 to >32 1 to 16 +
E. cloacae NDM-1 1 2 16 2 +
C. freundii NDM-1 1 >32 >32 >32 +
P. stuartii NDM-1 1 12 0.38 1.5 +
P. rettgeri NDM-1 1 3 0.5 1.5 +
VIM-tipo K. pneumoniae VIM-1 15 0.5 to >32 0.5 to >32 0.38 to >32 +
VIM-19 1 8 16 4 +
E. coli VIM-1 2 1.5 to 3 0.38 to 1.5 0.5 to 1 +
VIM-2 2 2 to 4 0.5 to 1.5 0.38 to 0.5 +
VIM-19 1 8 16 4 +
E. cloacae VIM-1 4 1 to >32 0.38 to >32 0.5 to >32 +
S. marcescens VIM-2 1 >32 >32 >32 +
IMP-tipo K. pneumoniae IMP-1 5 0.5 to 8 2 to 4 1 to 8 +
IMP-8 2 0.5 to 1 0.5 to 1 0.5 +
E. coli IMP-1 2 0.5 3 to 4 0.5 to 1 +
IMP-8 1 6 8 3 +
E. cloacae IMP-1 12 8 to >32 >32 2 to >32 +
IMP-8 2 0.75 to 1.5 0.5 to 1 0.5 to 1 +
S. marcescens IMP-1 2 8 to >32 >32 2 to >32 +
IMP-11 1 8 >32 2 +
CLASS D OXA-48 tipo K. pneumoniae OXA-48 15 0.38 to >32 0.38 to >32 0.38 to >32 +
OXA-181 2 0.5 to 1 2 to 4 0.5 to 1 +
E. coli OXA-48 6 0.38 to 3 0.5 to 16 0.12 to 1 +
E. cloacae OXA-48 3 0.5 to 1 0.5 to 16 0.5 to 1.5 +
P. rettgeri OXA-181 1 8 1 2 +
Faixa de concentrações de inibição mínimas (MICs) de imipenem (IMP), ertapenem (TRE) e meropenem (MER) são mostrados, carbapenemase adquiriu, bem como os resultados do teste de Carba NP. Carbapenemases são de KPC-tipo, NMCA, PME-tipo, GES-tipo, o IMI-tipo, NDM-tipo, VIM-tipo, IMPtipo e OXA-48 tipo.
Tabela 4. Isolados clínicos de Enterobactérias Não produtores de carbapenemase submetidos ao teste Carba NP
Espécie β-lactamase n Faixa MICs (mg/L) Teste Carba NP
IMP ERT MER
ESBLs K. pneumoniae CTX-M-3 1 0.12 0.12 0.12
CTX-M-14 1 0.12 0.12 0.12
CTX-M-15 3 0.12 0.12 0.12
E. coli CTX-M-1 1 0.12 0.12 0.12
CTX-M-3 1 0.12 0.12 0.12
CTX-M-14 2 0.12 0.12 0.12
CTX-M-15 2 0.12 0.12 0.12
VEB-1 1 0.12 to 0.25 0.12 0.12
E. cloacae CTX-M-15 3 0.12 0.12 0.12
VEB-1 1 0.12 0.12 0.12
Plasmídio mediado AmpC ou AmpC cromossomal + permeabilida de da membrane K. pneumoniae DHA-1 1 >32 >32 >32
DHA-2 1 0.12 0.5 0.12
E. coli Extended spectrum cephalosporinase 1 0.12 0.12 0.12
CMY-2 1 0.12 0.12 0.12
CMY-10 1 0.12 0.38 0.12
DHA-1 1 0.12 0.12 0.12
ACC-1 1 0.12 0.12 0.12
Overexpressed cephalosporinase 1 16 >32 2
P. mirabilis ACC-1 1 0.25 0.12 0.12
E. cloacae Overexpressed cephalosporinase 7 0.12 to 16 1 to >32 0.12 to >32
E. aerogenes Overexpressed cephalosporinase 1 1 4 0.75
diminuída M. morganii Overexpressed cephalosporinase 2 1.5 to 2 0.12 0.5
ESBL + permeabilida de da membrane diminuída bility K. pneumoniae CTX-M-15 8 0.25 to 8 1 to >32 1 to >32
SHV-28 1 1 4 1
SHV-2a 1 0.25 2 0.38
E. sakazaki CTX-M-15 1 0.25 1.5 0.25
C. freundii TEM-3 1 1 8 1
Faixa de concentrações mínimas de inibição (MICs) de
imipenem (IMP), ertapenem (TRE) e meropenem (MER) são
mostrados, e os resultados do teste rápido Carba, β-
lactamase de amplo espectro de β-lactamases (ESBL), cromossômica e AmpCs cefalosporinase sao mediada por plasmídeo adquirido.
Tabela 5. Detecção de atividade carbapenemase em produtores de carbapenemase utilizando o teste Carba NP
Ambler Class Tipo de Carbapenemase espécies β-lactamase MIC (pg/l) Carba NP test
IMP MER
A KPC P. aeruginosa COL KPC-2 >32 >32 +
P. aeruginosa P13 KPC-2 >32 >32 +
P. aeruginosa PA-2 KPC-2 >32 >32 +
P. aeruginosa PA-3 KPC-2 >32 >32 +
GES P. aeruginosa GW-1 GES-2 3 1 -
P. aeruginosa P35 GES-5 >32 >32 -
B VIM P. aeruginosa P0510 VIM-1 >32 >32 +
P. fluorescens COU VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa REZ VIM-2 >32 >32 +
P. putida 9335 VIM-2 >32 >32 +
P. stutzeri P511503100 VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa BY25753 VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa V919005 VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa AK5493 VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa KA-209 VIM-2 >32 >32 +
P. putida NTU 91/99 VIM-2 >32 >32 +
P. aeruginosa CAS VIM-4 >32 >32 +
P. aeruginosa JAC VIM-4 >32 >32 +
IMP P. aeruginosa 12870 IMP-1 12 >32 +
P. stutzeri PB207 IMP-1 2 4 +
P. putida NTU 92/99 IMP-1 1 0.19 +
P. aeruginosa IMP-1 >32 >32 +
P. aeruginosa 0607097 IMP-2 >32 >32 +
P. aeruginosa ITA IMP-13 >32 >32 +
NDM P. aeruginosa 453 NDM-1 >32 >32 +
P. aeruginosa 353 NDM-1 >32 >32 +
GIM P. aeruginosa 73-12198 GIM-1 3 0.19 +
P. aeruginosa 73-15574 GIM-1 >32 >32 +
P. aeruginosa 73-15553A GIM-1 >32 >32 +
P. aeruginosa 73-5674 GIM-1 >32 >32 +
AIM P. aeruginosa WCH2677 AIM-1 >32 >32 +
P. aeruginosa WCH2813 AIM-1 >32 >32 +
P. aeruginosa WCH2837 AIM-1 >32 >32 +
SPM P. aeruginosa 16 SPM-1 >32 >32 +
DIM P. stutzeri 13 DIM-1 >32 >32 +
BIC P. fluorescens BIC-1 >32 4 +
Tabela 6. Resultados do teste Carba NP de Pseudomonas spp nao produtoras de carbapenemase
Mecanismo de resistência Espécie Determinants de resistência MIC (pg/l) Teste Carba NP
IMP MER
Tipo selvagem P. aeruginosa 76110 none 0.75 0.19
P. aeruginosa PU21 none 1.5 0.75
P. aeruginosa ATCC 27853 none 2 0.25
P. aeruginosa PA01 none 1 0.5
P. putida CIP 55-5 none 0.5 3
Super produção de AmpC P. aeruginosa 3-12 overexpression of chromosomal AmpC 3 0.25
P. aeruginosa VED overexpression of chromosomal AmpC 0.12 0.19
Effluxo P. aeruginosa PA01 Mex C/D-OprJ >32 4
P. aeruginosa PT629 Mex A/B-OprM 1.5 1.5
P. aeruginosa PA01 Mex X/Y-OprM 1.5 0.75
Deficiência de porina P. aeruginosa PA01 OprM deficient 0.75 0.5
P. aeruginosa H729 OprD deficient >32 6
P. aeruginosa PaeB-02 OprD deficient 4 4
P. aeruginosa PaeB-05 OprD deficient 16 8
P. aeruginosa PaeB-30 OprD deficient 8 8
P. aeruginosa PaeB-31 OprD deficient 16 8
Deficiência P. aeruginosa PaeB-19 OprD deficient + 4 4
de porina + Effluxo MexA/B-OprM
P. aeruginosa PaeB-29 OprD deficient + MexA/B-OprM + MexX/Y-OprM 16 32 -
P. aeruginosa PaeB-01 OprD deficient + MexX/Y-OprM + MexC/D-OprJ 4 8 -
Deficiência de porina + super produção de AmpC P. aeruginosa PaeB-03 OprD deficient + AmpC 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-12 OprD deficient + AmpC 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-13 OprD deficient + AmpC 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-14 OprD deficient + AmpC 16 4 -
P. aeruginosa PaeB-16 OprD deficient + AmpC 32 4 -
P. aeruginosa PaeB-23 OprD deficient + AmpC 32 16 -
P. aeruginosa PaeB-25 OprD deficient + AmpC 8 8 -
P. aeruginosa PaeB-26 OprD deficient + AmpC 4 4 -
P. aeruginosa PaeB-32 OprD deficient + AmpC 64 16 -
Deficiência de porina + super produção de AmpC + Effluxo P. aeruginosa PaeB-04 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM 16 16 -
P. aeruginosa PaeB-24 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM 32 32 -
P. aeruginosa PaeB-28 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM 16 4 -
P. aeruginosa PaeB-15 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-21 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM 16 32 -
P. aeruginosa PaeB-22 OprD deficient + AmpC + MexC/D- OprJ 8 4 -
P. aeruginosa PaeB-06 OprD deficient + AmpC + MexX/YOprM + MexC/D- OprJ 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-07 OprD deficient + AmpC + MexX/YOprM + MexC/D- OprJ 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-08 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM + MexC/D- 16 8 -
OprJ
P. aeruginosa PaeB-09 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM + MexC/DOprJ 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-11 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM + MexC/DOprJ 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-17 OprD deficient + AmpC + MexX/Y- OprM + MexC/D- OprJ 32 8 -
P. aeruginosa PaeB-18 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM + MexX/Y- OprM 64 64 -
P. aeruginosa PaeB-27 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM + MexX/Y- OprM 32 64 -
P. aeruginosa PaeB-10 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM + MexC/D- OprJ 16 8 -
P. aeruginosa PaeB-20 OprD deficient + AmpC + MexA/B- OprM + MexC/D- OprJ 16 8 -
ESBL P. aeruginosa F6R7 GES-1 1 0.75
P. aeruginosa DEJ GES-9 2 1
P. aeruginosa RNL-1 PER-1 6 6
P. aeruginosa A2O6 PER-2 13 3
P. aeruginosa A5O6 PER-8 1.5 0.38
P. aeruginosa A7O6 PER-10 6 1
P. aeruginosa A3O6 PER-11 3 1.5
P. aeruginosa A8O6 PER-12 >32 12
P. aeruginosa A4O6 PER-13 12 3
P. aeruginosa E3O6 PER-19 >32 12
P. aeruginosa E1O6 PER-21 0.25 0.016
P. aeruginosa C2O7 PER-26 >32 8
P. aeruginosa C1O7 PER-27 >32 >32
P. aeruginosa 15 VEB-1 2 1.5
P. aeruginosa 51170 BEL-1 1 0.5
P. aeruginosa 0602-52025 SHV2a 1.5 3
P. aeruginosa 1782 SHV-5 2 2
P. aeruginosa SHAM TEM-4 3 0.75
P. aeruginosa PU21 OXA-2 2 1
P. aeruginosa PAO38 OXA-4 0.016 0.19
P. aeruginosa PU 21 OXA-IO 2 1.5
P. aeruginosa PU 21 OX A-11 3 1.5
P. aeruginosa NAJ OXA-13 2 1.5
P. aeruginosa PU 21 OXA-14 2 2
P. aeruginosa MUS OXA-18 + OXA-20 >32 >32
P. aeruginosa ED OXA-28 2 0.75
P. aeruginosa PIC OXA-31 >32 1.5
P. aeruginosa PG 13 OXA-32 >32 12
*AmpC sublinhado corresponde a superexpressão de AmpC cromossômico Deficiência de OprD, superexpressão de AmpC e superprodução de sistema de efluxo foram previamente caracterizados por qRT-PCR (12).
Referências
Ao longo deste pedido, várias referências descrevem o estado da técnica à qual esta invenção pertence. As revelações destas referências são aqui incorporadas por referência na presente descrição.
1. Queenan, A. M., and K. Bush. 2007. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin. Microbiol. Rev. 20 : 440-458.
2. Nordmann, P., G. Cuzon, and T. Naas. 2009. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect. Dis. 9:228-236.
3. Poirel, L., J. D. Pitout, and P. Nordmann. 2007. Carbapenemases: molecular diversity and clinical
consequences . Future Microbiol. 2:501-512 .
4. Miriagou V, G. Cornaglia, M. Edelstein, I. Galani, C.
G. Giske, M. Gniadkowski, E. Malamou-Lada, L . Martinez-
Martinez, F. Navarro, P. Nordmann, L. Peixe, S . Pournaras,
G. M. Rossolini, A. Tsakris, A. Vatopoulos, and R. Canton. 2010. Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues. Clin. Microbiol. Infect. 16:112-122
5. Carrer, A., L. Poirel, H. Eraksoy, A. A. Cagatay, S. Badur, and P. Nordmann. 2008. Spread of OXA-48-positive carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates in Istanbul, Turkey. Antimicrob. Agents Chemother. 52:29502954.
6. Livermore D. M., and D. F. J. Brown. 2001. Detection of β-lactamase-mediated resistance. J. Antimicrob. Chemother. 48: suppl. S1, 59-64.
7. Bebrone C, C. Moali, F. Mahy, S. Rival, J.-D. Docquier, G.-M. Rossolini, J. Fastrez, R. F. Pratt, J.-M. Frère, and M. Galleni. 2001. CENTA as a chromogenic substrate for studying β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 45:1868-1871.
8. Massidda O., G. M. Rossolini, and G. Satta. 1991. The Aeromonas hydrophila cphA gene: molecular heterogeneity among class B metallo^-lactamases. J. Bacteriol. 173:46114617.
9. Shannon K., and I. Phillips. 1980. β-Lactamase detection by three simle methods; intralactam, nitrocefin and acidimetric. J. Antimicrob. Chemother. 6:617-621.
10. Thomson, K. S. 2010. Extended-spectrum β-lactamase, AmpC and carbapenemase issues. J. Clin. Microbiol. 48:10191025.
11. Pluquet E., et al. 2011. A Sensitive and Specific Phenotypic Assay for Metallo-Beta-Lactamases Detection in Enteriobacteria using Moxalactal Disk Supplemented with EDTA (MOX-EDTA Disk Method), J. Clin. Microbiol., published online ahead of print on May 4th, 2011.
12. Walsh, T.R. et al. (2005) Metallo-beta-lactamases: the quiet before the storm? Clin. Microbiol. Rev. 18, 306325
13. Franklin C., L. Liolios, and Y. Peleg. 2006. Phenotypic detection of carbapenem-susceptible metallo-βlactamase-producing Gram-negative bacilli in the clinical laboratory. J. Clin. Microbiol. 44:3139-3140.
14. Kimura S., Y. Ishii, and K. Yamaguchi. 2005. Evaluation of dipicolonic acid for detection of IMP - or VIM-type metallo β-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 53:241-244.
15. Migliavacca R., J.-D. Docquier, C. Mugnaioli, G. Amicosante, R. Daturi, K. Lee, G. M. Rossolini, L. Pagani. 2002. Simple microdilution test for detection of metallo-βlactamase production in Pseudomonas aeruginosa. J. Clin.
Microbiol. 40:4388-4390.
16. Giske et al. 2011. A sensitive and speciific phenotypic assay for detection of metallo-L-lactamases and KPC in Klebsiella pneumoniae with the sued of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid , dipicolinic acid and cloxacillin . Clin Microbiol Infect , 17 : 552-556.
17. Livermore et al. 2011. Activities of NXL-104 combinations with ceftazidime and aztreonam against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae . Antimicrob. Agents Chemother; 55 ; 390-394.
18. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI M100-S20U. Update June 2010. Clinical and
Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra, método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) realizar lise das células em uma amostra de teste, a fim de obter uma suspensão enzimática;
    b) reagir de uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes, o dito kit de reagente compreendendo
    - um substrato carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas, e
    - um indicador de cor pH que mudam de cor quando o pH da mistura da reação está compreendido entre 6,4 e 8,4, em que uma mudança de cor após a etapa b) indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra de teste, e em que a reação na etapa b) é realizada durante um período de tempo suficiente para observar uma mudança de cor, a mudança de cor é visualmente observada dentro de um período compreendido entre 5 minutos e 120 minutos.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é uma amostra biológica selecionada a partir do grupo que consiste em uma amostra de sangue e uma amostra de urina.
  3. 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as bactérias produtoras de carbapenemase são selecionadas de entre os gêneros consistindo de Acínetobacter, Aeromonas,
    Petição 870190088409, de 06/09/2019, pág. 40/53
    Bacillus, Bacteroides, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pandoreae, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Raoultella, Salmonella, Serratia, Shewanella, Shigella e Strenotrophomonas.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o kit de reagentes compreende ainda um ativador de carbapenemase selecionado de entre o grupo consistindo de cátions bivalentes ou os seus sais, e suas misturas.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de reação b) é realizada a uma temperatura compreendida entre 15° C e 40° C, de preferência, entre 20° C e 37° C, mais preferivelmente, entre 35° C e 37° C.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a mudança de cor é observada visualmente dentro de um período de tempo compreendido entre 10 e 60 minutos, mais preferivelmente, entre 20 e 40 minutos.
  7. 7. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as etapas de:
    a) realizar a lise das células em uma amostra biológica, a fim de obter uma suspensão enzimática,
    b) reagir uma fração da suspensão enzimática obtida na etapa a) com um kit de reagentes, o referido kit de reagente compreendendo
    - Imipenem como substrato carbapenemase,
    Petição 870190088409, de 06/09/2019, pág. 41/53
    - Vermelho de fenol como indicador de cor do pH e
    - Zinco ou seu sal, como o ativador de carbapenemase, em que uma mudança de cor de vermelho para amarelo, após a etapa b) indica a presença de bactérias produtoras de carbapenemase na amostra biológica.
  8. 8. Kit de reagente caracterizado pelo fato de que compreende um tampão de lise e kit reagente compreendendo um substrato carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um indicador de cor de pH, que muda de cor quando o pH é compreendido entre 6,4 e 8,4.
  9. 9. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ativador de carbapenemase selecionado de entre o grupo consistindo de cátions bivalentes ou os seus sais, e suas misturas.
  10. 10. Kit, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um inibidor de carbapenemase.
  11. 11. Uso do kit conforme definido pelas reivindicações 8 a 10 caracterizado pelo fato de que é para detectar a presença de bactérias produtoras de
    carbapenemase numa amostra conforme definido pelo método das reivindicações 1 a 7. 12. Kit compreendendo um tampão de lise e uma placa de microtitulação caracterizado pelo fato de que
    compreende um poço ou uma série de cavidades que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas,
    Petição 870190088409, de 06/09/2019, pág. 42/53
    - um indicador de cor de pH que muda de cor quando o pH está compreendido entre 6,4 e 8,4.
  12. 13. Kit, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a dita placa de microtitulação compreende ainda:
    - um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor de carbapenemase da Ambler classe A;
    - um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor carbapenemase de Ambler classe B; e
    - um poço ou uma série de poços, que compreendem um substrato de carbapenemase selecionado a partir do grupo consistindo de carbapenemos e cefamicinas e um inibidor de carbapenemase de Ambler classe D.
  13. 14. Uso do kit, conforme definido pela reivindicação 13 caracterizado pelo fato de que é para detectar a presença de bactérias produtoras de carbapenemase em uma amostra de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e / ou para determinar a classe específica de carbapenemase presente em uma amostra, em que a cada poço é adicionado, pelo menos, um indicador de cor de pH e uma fração da suspensão enzimática a ser testada.
  14. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, kit e seu uso, de acordo com qualquer
    Petição 870190088409, de 06/09/2019, pág. 43/53 uma das reivindicações 8 a 11 e kit e seu uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o carbapenem é selecionado a partir de o grupo que consiste em Biapenem, ertapenem, doripenem, imipenem, meropenem, panipenem tebipenem e, preferencialmente, imipenem, e a cefamicina é selecionada a partir do grupo que consiste em moxalactam e cefoxitina.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9481903B2 (en) 2013-03-13 2016-11-01 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for detection of cells using engineered transduction particles
JP6431035B2 (ja) 2013-03-13 2018-11-28 ジーンウィーブ バイオサイエンシズ，インコーポレイティド 非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーターシステム
JP6214188B2 (ja) * 2013-04-05 2017-10-18 栄研化学株式会社 β−ラクタマーゼ検出方法
US9407861B2 (en) 2013-08-16 2016-08-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. User interface tool kit for mobile devices
US9540675B2 (en) 2013-10-29 2017-01-10 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge and methods for detection of cells
EP3071965A1 (en) 2013-11-21 2016-09-28 Avails Medical, Inc. Electrical biosensor for detecting a substance in a bodily fluid, and method and system for same
CA2977634A1 (en) * 2014-04-15 2015-10-22 Cellex, Incorporated Methods and devices for detection of resistance to an enzyme inhibitor
FR3034523B1 (fr) * 2015-04-03 2020-01-17 Universite De Bourgogne Nouvelle methode pour detecter la presence de bacteries productrices de beta-lactamases.
JP6978408B2 (ja) 2015-08-25 2021-12-08 アバイルズ メディカル，インコーポレイテッド 流体試料中の生存微生物を検出する装置、システムおよび方法
US10351893B2 (en) 2015-10-05 2019-07-16 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge for detection of cells
EP3153589A1 (en) 2015-10-09 2017-04-12 Université de Fribourg Kit and methods for the rapid detection of the absence or presence of resistance to beta-lactam compounds in urine samples
GB201520977D0 (en) * 2015-11-27 2016-01-13 Mast Group Ltd Carbapenemase-producing bacteria detection method
EP3356511B1 (en) 2016-01-25 2022-04-27 Avails Medical, Inc. Methods for detecting viable infectious agents in a fluid sample using an electrolyte-insulator-semiconductor sensor
WO2017209839A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Avails Medical, Inc. Detecting viable infectious agents in a fluid sample and susceptibility of infectious agents to anti-infectives
CA3028733A1 (en) * 2016-06-27 2018-01-04 Becton, Dickinson And Company Compositions, methods, systems and/or kits for detecting antimicrobial resistance in bacteria
WO2018111234A1 (en) * 2016-12-13 2018-06-21 Avails Medical, Inc. DEVICES, SYSTEMS AND METHODS TO DETECT THE PRESENCE OF ß-LACTAM ANTIBIOTIC HYDROLYZING BACTERIA IN A SAMPLE
DE102017004606B3 (de) 2017-05-12 2018-11-15 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zum phänotypischen Nachweis von Carbapenemase und Carbapenemase-Bildnern
WO2019005296A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Avails Medical, Inc. APPARATUS, SYSTEMS AND METHODS FOR DETERMINING THE SENSITIVITY OF MICROORGANISMS TO ANTI-INFECTIOUS
GB201712671D0 (en) * 2017-08-07 2017-09-20 Mast Group Ltd Chromogenic Carbapenemase detection method
US11492653B2 (en) 2017-08-14 2022-11-08 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and kits for detecting antibiotic-inactivating factors
CN111182971B (zh) 2017-10-03 2022-08-30 阿威尔斯医疗公司 用于基于氧化还原反应测定微生物的浓度和微生物对抗感染剂的敏感性的装置、系统和方法
CN109722466B (zh) * 2019-01-30 2022-03-25 华南农业大学 一种运用ai模型快速检测产生碳青霉烯酶菌株的方法
CN110438214A (zh) * 2019-08-08 2019-11-12 皖南医学院弋矶山医院 Cre菌株碳青霉烯酶检测方法的性能评估方法
CN110904199A (zh) * 2019-11-22 2020-03-24 南方医科大学南方医院 检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒
CN113249434A (zh) * 2021-05-07 2021-08-13 山西大学 同时检测产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶细菌的方法
CN114487404B (zh) * 2021-12-28 2023-06-23 中国农业大学 用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6696239B1 (en) * 2000-04-20 2004-02-24 Biolog, Inc. Comparative phenotype analysis for assessment of biological active compounds such as antimicrobials
US8097434B2 (en) * 2007-10-19 2012-01-17 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of beta-lactamases
WO2010010083A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Alain Rambach Selective enrichment medium for carbapenem-resistant bacteria

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