用于检测产β-内酰胺酶的细菌的存在的新方法
技术领域
本发明涉及用于通过其产生β-内酰胺酶的能力检测样品或培养基中耐受β-内酰胺类抗生素的细菌的存在的方法。
背景技术
β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、单胺菌素类、头孢菌素类和碳青霉烯类,是通过抑制肽聚糖的合成起作用的抗生素。这些是在一般实践和医院医学中通常用于严重感染的一线治疗的分子。β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环的酶。这是耐受β-内酰胺类抗生素的最常见机制。根据Ambler(Ambler,R.P.Philos.Trans.R.Soc.London SerB,1980,289,321-331),β-内酰胺酶被分为4类:
A:青霉素酶,包括超广谱β-内酰胺酶(ESBL)
B:金属酶
C:头孢菌素酶
D:苯唑西林酶
在肠道细菌中,超广谱β-内酰胺酶(下文中称为ESBL)或高产头孢菌素酶的产生是目前耐受第三代头孢菌素类(下文中称为C3G),如作为氧基亚氨基-头孢菌素类的头孢噻肟、头孢曲松或头孢他啶的主要机制。作为唯一的第四代头孢菌素(下文中称为C4G),头孢吡肟被ESBL水解,但是通常不被头孢菌素酶水解。青霉素类也被水解,但碳青霉烯类不被水解。ESBL的活性可以被克拉维酸、他唑巴坦或舒巴坦(青霉素酶抑制剂)抑制。头孢菌素酶的活性可以被氯唑西林抑制。碳青霉烯酶(根据Ambler可以属于A、B和D类的酶)是水解碳青霉烯类、但通常也水解青霉素类和头孢菌素类的酶。
快速、准确地检测耐受第三代头孢菌素类、是ESBL的或高产头孢菌素酶的或碳青霉烯酶的产生者的细菌对患者管理至关重要。其应使合适的抗生素治疗建立。在不存在产生酶的情况下,该酶水解C3G,后者可以用于一线治疗,否则将必须求助于碳青霉烯类。在这种情况下,还必须确定这些细菌是否产生碳青霉烯酶。
目前,用于检测产β-内酰胺酶细菌的常规技术基于抗菌谱的实施和双纸片协同试验的应用,其能够证明在青霉素酶抑制剂的存在下对C3G的敏感性的恢复。不考虑其功效,实施该技术需要培养和分离细菌的预备步骤,这意味着在β-内酰胺酶的产生可检测之前延迟至少24小时。
产β-内酰胺酶的细菌的存在还可以通过分子生物学方法来证明,例如使用PCR和/或测序来检测编码β-内酰胺酶的基因。尽管它们可以实现对编码例如ESBL的基因进行特异性表征,但是由于从复杂样品预先提取DNA而使这些实验室技术昂贵,且花费相当长的时间。
因此,在医疗卫生领域中迫切需要开发一种有效、快速和廉价的方法来检测产β-内酰胺酶的细菌的存在,以检测耐受β-内酰胺类抗生素的细菌菌株的存在。
Nordmann等人(J.Clin.Microbiol.,2012,50,3016-3022)描述了用于检测产ESBL细菌的方法,该方法涉及使用头孢噻肟和pH颜色指示剂。该方法基于以下事实:头孢噻肟的β-内酰胺环的水解导致形成羧酸官能团,因此导致反应介质的酸化。通过使用颜色指示剂来显现介质pH的改变。
不考虑其功效和速度,该方法首先需要分离细菌菌株的限制步骤。
另一种比色法包括使用头孢硝噻,其是一种显色头孢菌素,可以被所有β-内酰胺酶水解,由此使颜色从黄色变为红色(O’Callaghan等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1972,1,283-288)。下面的图解1示出了头孢硝噻的β-内酰胺环被β-内酰胺酶水解。最近,基于相同的原理,已经提出了称为HMRZ-86的另一种显色头孢菌素(Hanaki等人,Antimicrob.Agents Chemother.,2004,53,888-889),用于检测耐受C3G的细菌菌株。
但是,这种方法再次需要使用先前分离的细菌菌株来实现比色检测。该方法不能直接用在具有可能干扰头孢硝噻水解的比色检测的着色的复杂样品上。再者,这种方法涉及在取临床样品与递送结果之间至少24小时的延迟。
近年来,也已经提出了MALDI-TOF质谱法技术,用于在产β-内酰胺酶菌株的存在下在孵育β-内酰胺类抗生素后检测其水解产物(Hrabák等人J.Clin.Microbiol.2011,49,3222-3227;Sparbier等人,J.Clin.Microbiol.,2012,50,927-937)。但是,这种实验室技术也必须用预先分离的菌株来实施,仍然是昂贵的,并且需要有资格的人员来解析质谱。
此外,等人(Electrochemistry Communication 38(2014)131-133)拥有电流型生物传感器,其通过对与青霉素G被青霉素酶水解成青霉噻唑酸相关的介质的pH改变的安培测量来检测青霉素G。由于青霉素G和青霉噻唑酸不是电活性的,在起氧化还原介体作用的钴的存在下进行安培测量。
Chen等人(Int.J.Electrochem.Sci.,7(2012)7948-7959)描述了在黑暗中在70℃下加热头孢氨苄的无氧碱性溶液之后实现其水解后电化学检测头孢氨苄的方法。该文献中描述的头孢氨苄的水解产物(β-内酰胺环的C-C=O键断裂)在非常特殊的极端环境下产生,并且不能通过用β-内酰胺酶孵育头孢氨苄来获得,在这种情况下在酰胺键的水平下裂解β-内酰胺环。
迄今为止,现有技术没有描述具有电活性性质的β-内酰胺酶的任何底物或具有电活性性质的由β-内酰胺酶水解所获得的任何产物。
现在,本发明人已经发现,某些β-内酰胺酶的底物和/或它们被β-内酰胺酶水解的产物具有电活性性质。
发明内容
因此,在本文中,本发明的目的是提供一种电化学方法,该方法能够在不预先分离细菌菌株的情况下快速和有效地测定样品中产β-内酰胺酶的细菌的存在。
本发明涉及用于体外测定可能含有产β-内酰胺酶的细菌的样品中所述细菌的存在的方法,其包括以下步骤:
(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物,特别是作为β-内酰胺酶的底物的具有电化学特性的β-内酰胺抗生素,更特别是头孢菌素的培养基中孵育所述样品,
(b)应用电化学分析手段以确定产β-内酰胺酶的细菌的存在。
本发明基于如下事实:β-内酰胺酶的某些底物可以在它们已经被β-内酰胺酶水解后以电化学方法检测。
特别地,可以以电化学方法检测β-内酰胺酶对β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环的水解。
在本发明的上下文中,具有电化学特性的β-内酰胺抗生素特别是头孢菌素,更特别为头孢硝噻或化合物HMRZ-86((6R,7R)-7-[[2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-[(1-羧基-1-甲基乙氧基)亚氨基]乙酰基]氨基]-1-氮杂-3-[2-(2,4-二硝基苯基)乙烯基]-8-氧代-5-硫杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸三氟乙酸酯的E异构体)。
在本发明的上下文中,这样的具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物还可以是由Bio-rad销售的βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)。
头孢硝噻可以被所有类型的β-内酰胺酶水解,而化合物HMRZ-86只能被耐受C3G,即产生ESBL、高产头孢菌素类和碳青霉烯酶的细菌降解。βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)只被产碳青霉烯酶的细菌水解。
本发明人已经首次证明,β-内酰胺酶的某些底物,特别是某些β-内酰胺类抗生素,如头孢硝噻或化合物HMRZ-86的电化学特性与这些水解的底物的电化学特性截然不同。例如,水解的头孢硝噻是能够产生特定的阳极氧化电流的电活性产物,所述特定的阳极氧化电流可以通过电化学方法来测量。水解的头孢硝噻的氧化在不同于其中出现对应于头孢硝噻的氧化的所述阳极电流的电位范围的电位范围内产生阳极电流。由此,水解的头孢硝噻的特异性阳极电流可以用作指示被β-内酰胺酶水解的头孢硝噻的存在的分析响应。
现有技术中已经开发的方法需要预先培养细菌至少24小时,与现有技术中已经开发的方法不同,本发明中描述的方法在实施电化学测量之前在孵育样品仅几小时,特别是1至4小时之后就能够检测产β-内酰胺酶细菌存在或不存在。
作为一个实例,采用含有头孢硝噻的培养基的孵育样品的时间通常为5至30分钟。
含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物的培养基可以是向其添加该β-内酰胺酶的电活性底物的缓冲的培养基。作为一个实例,所述缓冲的培养基可以是浓度为100mM的pH 7的磷酸盐缓冲液。
“β-内酰胺酶”是指能够水解β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环的一类酶。青霉素类、头孢菌素类、单胺菌素和碳青霉烯类是β-内酰胺抗生素的四个类别。
基于它们的催化特性和它们对某些底物的亲和力以及它们对某些类型的β-内酰胺酶抑制剂的敏感性,主要的β-内酰胺酶如下:青霉素酶、诱导型头孢菌素酶、高产头孢菌素酶、超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。
“青霉素酶”是指水解氨基、羧基和脲基青霉素类的酶。它们被青霉素酶抑制剂抑制,所述青霉素酶抑制剂是克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦。
“诱导型头孢菌素酶”是指水解氨基青霉素类和第1代和/或第2代头孢菌素类的酶。它们对青霉素酶抑制剂的作用不敏感;另一方面,它们被氯唑西林抑制。编码头孢菌素酶的基因的表达可以通过诱导剂来诱导,所述诱导剂特别可以是β-内酰胺抗生素。
“高产头孢菌素酶”是指水解氨基青霉素类,羧基和脲基青霉素类,第1代、第2代、第3代或甚至第4代头孢菌素类的酶。它们对青霉素酶抑制剂的作用不敏感;但是,它们被氯唑西林抑制。这些酶的表达被去阻遏,并导致大量产生这些酶。
“超广谱β-内酰胺酶(ESBL)”是指水解氨基、羧基和脲基青霉素类,第1代、第2代、第3代和第4代头孢菌素类,并且对青霉素酶抑制剂的抑制敏感的酶。
“碳青霉烯酶”是指对碳青霉烯类,但是通常也对青霉素类和第1代、第2代、第3代和第4代头孢菌素类具有水解活性的酶。
根据本发明,β-内酰胺酶特别地可以由以下的革兰氏阴性菌产生:
i)肠杆菌科的,特别是埃希氏菌属(特别是大肠杆菌)、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、泛菌属、哈夫尼菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。
ii)非发酵的,特别是假单胞菌属(特别是铜绿假单胞菌)、寡养单胞菌属和无色杆菌属。
iii)不动杆菌属(特别是鲍氏不动杆菌)。
在特定的实施方案中,本发明的前述方法在实施步骤(a)之前进一步包括用于浓缩可能含有细菌的样品中存在的细菌的步骤。细菌例如可以通过过滤或离心来浓缩。
在特定实施方案中,本发明的前述方法的步骤(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物的培养基中实施,所述底物特别是具有电化学特性的β-内酰胺抗生素,特别是头孢硝噻、化合物HMRZ-86或βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)。本领域技术人员将知晓如何选择所述底物的合适浓度。
根据本发明,用于实施本发明的电化学分析手段可以是电位测量、阻抗测量、电量测量或安培测量。
在有利的实施方案中,电化学分析通过安培测量来实施。
“安培测量”是指测量作为工作电极与参比电极之间建立的电位差的函数的电流。
可以通过已知的电流测量技术,优选地通过电位扫描伏安法来测量电流,所述电位扫描伏安法可以是线性、循环、脉冲的或电位阶跃类型的,如计时电流分析法。
在本发明的特别有利的实施方案中,通过循环伏安法或线性伏安法测量水解的β-内酰胺酶底物的存在。
实施这些技术需要可具有两个或甚至三个电极的设置,即包括工作电极、参比电极和任选地包括辅助电极(对电极)的设置。该工作电极可以基于碳或基于贵金属或基于金属氧化物,其表面充当电子转移的位点。参比电极是其电位恒定的电极,使得能够向工作电极施加精确限定的电位。参比电极可以是Ag/AgCl电极。对电极能够建立与工作电极的电流通路,可以用惰性材料如铂或碳制得。本领域技术人员基于他的一般知识将知晓如何选择和组合适当的电极。
关于制造电极的方法,丝网印刷技术是优选的,尽管也可以设想其它工业制造方法如轮转凹印、喷墨印刷或任选的光刻法。通过丝网印刷获得的电极是特别合适的,因为它们可以以低成本大量制造,因此可以任选地一次性使用。此外,它们的几何形状以及它们的尺寸可以容易地改变。这些电极可以以传感器形式丝网印刷,并任选地结合在微孔板或实现细菌悬浮液的过滤和用头孢硝噻或另一种具有电化学特性的β-内酰胺酶底物孵育的其它载体或系统的孔底部处。
在特定实施方案中,用丝网印刷的传感器实施安培测量。这样能够以几微升的量级的小溶液体积来进行测量。
在特定实施方案中,用涉及三种电极的装置实施安培测量:Ag/AgCl参比电极、碳制成的工作电极和碳制成的对电极。
在另一特定实施方案中,用包括Ag/AgCl参比电极、碳制成的工作电极和碳制成的对电极的丝网印刷的传感器来实施安培测量。
通过在电位范围内存在阳极氧化电流且缺乏所述水解的底物的对照不存在所述电流来指示水解的底物,例如水解的头孢硝噻的存在。
当水解的底物,特别是水解的β-内酰胺抗生素,例如水解的头孢硝噻通过循环伏安法进行测量时,其存在通过限定电位范围内对水解底物具有特异性的阳极氧化电流的峰来指示。
例如,当使用Ag/AgCl参比电极在含有例如头孢硝噻的中性pH的缓冲液中通过循环伏安法进行检测时,与对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极氧化峰值电流相关的强度包括在+0.1V至+0.5V之间、特别是+0.2V至+0.4V之间、更特别+0.23V至+0.33V之间的电位范围内测得。
特别地,当在含有头孢硝噻的pH 7的磷酸盐缓冲液中通过循环伏安法进行检测时,与水解的头孢硝噻的氧化的阳极氧化相关的峰值电流位于相对于Ag/AgCl的+0.3V处。
当使用另一类型的参比电极和/或另一反应介质来实施本发明的方法时,本领域技术人员基于他的一般知识将知晓如何计算或确定该电位范围。
由于通过电化学方法来检测水解的底物,例如水解的头孢硝噻或水解的化合物HMRZ-86的存在,本发明中描述的方法证实对分析有色或浑浊的样品特别有利,无需预处理,能够借助廉价的、具有减小的尺寸的、并任选地是便携式的设备以良好的灵敏性提供定量测量。
可以通过本发明的方法分析的样品可以是生物样品、环境来源的样品或食品样品。
生物样品特别可以是血液样品、尿液样品、组织样品或肺样品。
环境来源的样品可以是废水、医院废水、处理过的废水或源于废水处理的污泥,以及来自湿法或干法甲烷化反应器的残余物(消化物)。
食品样品可以是动物来源,更特别为禽类来源如家禽的产物和副产物,其可以含有耐受β-内酰胺酶的细菌。
特别地,本发明的方法包括以下步骤:
(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物,特别是β-内酰胺抗生素的培养基中孵育可能含有所述细菌的样品,
(b)分别对步骤(a)结束时获得的前述培养基和对阴性对照应用安培测量,
(c)通过比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的对应于水解的底物,特别是水解的β-内酰胺抗生素的氧化的阳极电流的强度值和所测得的阴性对照的阳极电流的强度值来确定产β-内酰胺酶细菌的存在。
根据本发明,阴性对照是在不存在样品的情况下含有所述底物的培养基。
更特别地,本发明的方法包括以下步骤:
(a)在含有头孢硝噻的培养基中孵育可能含有所述细菌的样品,
(b)分别对在步骤(a)结束时获得的前述培养基和对阴性对照应用安培测量,
(c)通过比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流的强度值和所测得的阴性对照的阳极电流的强度值来确定产β-内酰胺酶细菌的存在。
应用于所述阴性对照的安培测量能够指示与水解的头孢硝噻的氧化无关的任何电流。
在安培测量的过程中,通过相对于在相同范围内测得的对照的阳极电流,在限定的电位范围内阳极电流的出现或提高来指示水解的头孢硝噻的存在。
此外,本发明中描述的方法提供了定量样品中的产β-内酰胺酶细菌的可能性。
事实上,通过水解的底物,特别是水解的头孢硝噻的氧化所产生的阳极电流的强度与水解的头孢硝噻的量定量地成比例。当底物的量过量时,水解的底物的量也与所述底物水解中涉及的β-内酰胺酶的量成比例,也与产生这些酶的细菌的量成比例。因此,通过比较对水解的底物具有特异性的阳极电流的强度值与参比值,在校准曲线上读取,能够确定产β-内酰胺酶的细菌的量。
本发明的特定实施方案既能够确定可能含有产β-内酰胺酶细菌的样品中产β-内酰胺酶细菌的存在,又能够对其定量。
在该实施方案中,在确定产β-内酰胺酶的细菌的存在之后,该方法进一步包括由比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的阳极电流强度值与相同条件下建立的校准曲线所组成的步骤。
所述校准曲线通过含有已知量的产β-内酰胺酶细菌的参照样品的连续稀释来建立,并通过任何常规方法,例如在培养基上计数或实时PCR来预先确定。
在特定实施方案中,本发明涉及能够确定和定量可能含有产β-内酰胺酶细菌的样品中所述细菌的方法,所述方法包括:
(a)在含有具有电化学特性的β-内酰胺酶的底物,特别是β-内酰胺抗生素的培养基中孵育可能含有所述细菌的样品,
(b)分别对在步骤(a)结束时获得的前述培养基和对阴性对照应用安培测量,
(c)通过比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的对应于水解的底物,特别是水解的β-内酰胺抗生素的氧化的阳极电流的强度值和所测得的阴性对照的阳极电流的强度值来确定产β-内酰胺酶细菌的存在;
(d)比较所测得的在步骤(a)结束时获得的前述培养基的阳极电流强度值与相同条件下建立的用来定量所述细菌的校准曲线。
根据具有电化学特性的底物的特异性,可以实施本发明的方法以在体外特异性地确定产生一种或多种类型的β-内酰胺酶的细菌的存在。
在特定实施方案中,本发明的方法能够在体外确定耐受第三代头孢菌素的细菌的存在并对其定量,所述方法在步骤(a)中使用仅被超广谱β-内酰胺酶、高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶水解的β-内酰胺抗生素,特别是化合物HMRZ-86((6R,7R)-7-[[2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-[(1-羧基-1-甲基乙氧基)亚氨基]乙酰基]氨基]-1-氮杂-3-[2-(2,4-二硝基苯基)乙烯基]-8-氧代-5-硫杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸三氟乙酸酯的E异构体)。
在另一特定实施方案中,本发明的方法能够在体外确定产碳青霉烯酶的细菌的存在并对其定量,所述方法在步骤(a)中使用仅被碳青霉烯酶水解的底物,特别是由Bio-rad销售的βCARBATM试剂盒的底物(试剂R2)。
在另一特定实施方案中,使用头孢硝噻和至少一种其它β-内酰胺抗生素和至少一种β-内酰胺酶的抑制剂,本发明的方法还能够区分可能含有前述细菌的样品中由前述细菌产生的β-内酰胺酶的类型。
事实上,本发明人发现,在一系列分别含有对一种类型的β-内酰胺酶具有特异性的底物和任选地含有对一种类型的β-内酰胺酶具有特异性的抑制剂的培养基中,产生不同类型的β-内酰胺酶的细菌在实施安培测量时可以分别得到在水解的头孢硝噻的阳极电流强度方面具有特异性的表现。
该实施方案的优点之一是其能够区分复杂的、有色的基质中的β-内酰胺酶,而无需预先分离细菌。
更特别地,本发明的方法另外能够区分可能含有前述细菌的样品中由前述细菌产生的β-内酰胺酶的类型,所述β-内酰胺酶选自青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶、诱导型头孢菌素酶、高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶,所述方法包括以下步骤:
(a)在培养基A、培养基B和培养基C中,
任选地在培养基B’、培养基C’、培养基D、培养基E中平行孵育前述样品的一部分:
-培养基A是基础培养基,
-培养基B是补充有第三代头孢菌素的基础培养基,且
-培养基C是补充有头孢菌素和青霉素酶抑制剂的基础培养基,和
-培养基B’是补充有不同于培养基B中存在的第三代头孢菌素的第三代头孢菌素的基础培养基;
-培养基C’是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B’;
-培养基D是补充有头孢菌素和头孢菌素酶抑制剂的基础培养基,且
-培养基E是补充有碳青霉烯的基础培养基,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)中的孵育结束时获得的前述培养基;
(c)向在步骤(b)结束时获得的前述培养基应用安培测量手段,以确定产β-内酰胺酶细菌的存在和区分β-内酰胺酶的类型。
根据本发明,基础培养基可以是常规用于孵育细菌的任何类型的培养基,如LB培养基(Luria Bertani肉汤)、TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)或BHI(脑心浸液)。
在特定实施方案中,在实施步骤(b)之前和在步骤(a)之后,本发明的前述方法进一步包括浓缩培养基中存在的细菌的步骤,以提供更显著的催化响应。细菌可以例如通过过滤或通过离心来浓缩。
根据本发明,所述第三代头孢菌素选自头孢噻肟、头孢他啶和头孢曲松;所述碳青霉烯选自厄他培南、亚胺培南或美罗培南。
根据本发明,所述青霉素酶抑制剂特别地选自克拉维酸、他唑巴坦或舒巴坦;所述头孢菌素酶抑制剂特别是氯唑西林。
培养基B或B’能够抑制产生青霉素酶或诱导型头孢菌素酶的细菌的生长。
培养基C或C’能够抑制产生青霉素酶或超广谱β-内酰胺酶的细菌的生长。在特定实施方案中,培养基C是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B。
培养基D能够抑制产生诱导型或高产头孢菌素酶的细菌的生长。
培养基E能够抑制产生除碳青霉烯酶之外的任何β-内酰胺酶的细菌的生长。
使用培养基B、B’、C和C’能够区分对第三代头孢菌素,例如头孢噻肟敏感,但是耐受另一种第三代头孢菌素,例如头孢他啶的产ESBL细菌,或反之亦然。
在培养基A、B、C和任选地在培养基B’、C’、D和E中分别孵育同一样品的部分后,由源于这些部分的细菌产生的β-内酰胺酶是不同的。本发明能够通过安培法显示这种差别,所述安培法通过对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流强度值来指示被这些β-内酰胺酶水解的头孢硝噻的量。
值iA、iB、iB’、iC、iC’、iD和iE分别是所测得的来自培养基A、B、B’、C、C’、D和E的细菌的对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流的强度值。
在本发明的方法的上下文中,青霉素酶通过以下特征来表征:存在对水解的头孢硝噻具有特异性的电流,其由源于培养基A、源于培养基B和任选地源于培养基B’的细菌获得,并且不存在对源于培养基C和任选地源于培养基C’的细菌具有特异性的电流。值iA可以低于或高于值iB和任选地低于或高于值iB’。
ESBL通过以下特征来表征:高强度的对水解的头孢硝噻具有特异性的阳极电流,其分别由源于培养基A、源于培养基B和任选地源于培养基B’的细菌获得,并且不存在源于培养基C和任选地源于培养基C’的细菌的该特异性电流。值iB和任选的iB’接近值iA。
诱导型头孢菌素酶通过以下特征来表征:对水解的头孢硝噻具有特异性的阳极电流,其由源于培养基A、B和任选的B’、C和任选的C’的细菌获得,iA<iB<iC且任选地iA<iB’<iC’,并且不存在源于培养基D的细菌的该特异性电流。
高产头孢菌素酶通过以下特征来表征:高强度的对水解的头孢硝噻具有特异性的阳极电流,其由源于培养基A的细菌获得,分别存在源于培养基B和源于培养基C、任选地源于培养基B’和源于培养基C’的细菌的该特异性电流,iB>iC且任选地iB’>iC’,并且不存在源于培养基D的细菌的该特异性电流。
碳青霉烯酶通过以下特征来表征:存在对水解的头孢硝噻具有特异性的阳极电流,其由来自于培养基A、B和任选的B’、C和任选的C’、D和E的细菌获得。
在更特别的实施方案中,本发明涉及用于确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在如前定义的培养基A、培养基B和培养基C中平行孵育前述样品的一部分,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基,
(c)向步骤(b)结束时获得的前述培养基应用安培测量手段,以确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在。
在另一更特别的实施方案中,本发明涉及用于确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在如前定义的培养基A、培养基B、培养基B’、培养基C和培养基C’中平行孵育前述样品的一部分,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基,
(c)向在步骤(b)结束时获得的前述培养基应用安培测量手段,以确定产生超广谱β-内酰胺酶的细菌的存在。
使用培养基B、B’、C和C’能够区分对第三代头孢菌素敏感,但耐受另一种第三代头孢菌素的产ESBL细菌。
在特定实施方案中,培养基B是补充有头孢噻肟的培养基A;培养基B’是补充有头孢他啶的培养基A;培养基C是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B;培养基C’是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B’。
在另一特定实施方案中,培养基B是补充有头孢他啶的培养基A;培养基B’是补充有头孢噻肟的培养基A;培养基C是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B;培养基C’是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B’。
在本发明的上下文中,使用这些培养基能够区分对头孢噻肟敏感,但是耐受头孢他啶,或耐受头孢噻肟,但是对头孢他啶敏感的产ESBL细菌。
有利地,为了确定产β-内酰胺酶细菌的存在和区分β-内酰胺酶的类型,所述方法包括以下步骤:
(a)在培养基A、培养基B、培养基B’、培养基C和培养基C’中,并且任选地在培养基D、培养基E中平行孵育前述样品的一部分:
-培养基A是基础培养基,
-培养基B和培养基B’是分别补充有不同的第三代头孢菌素的基础培养基,
-培养基C和培养基C’分别是补充有青霉素酶抑制剂的培养基B和B’,
-培养基D是补充有头孢菌素和头孢菌素酶抑制剂的基础培养基,和
-培养基E是补充有碳青霉烯的基础培养基,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基;
(c)向在步骤(b)结束时获得的前述培养基应用安培测量手段,以确定产β-内酰胺酶细菌的存在和区分β-内酰胺酶的类型。
根据另一更特别的实施方案,本发明的方法能够确定和区分可能含有产β-内酰胺酶细菌的样品中的产β-内酰胺酶细菌,所述方法包括以下步骤:
(a)在如前定义的培养基A、培养基B、培养基C、培养基D、培养基E中、任选地在培养基B’和培养基C’中平行孵育前述样品的一部分,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基;
(c)分别向在步骤(b)结束时获得的前述培养基和阴性对照应用安培测量,
(d)通过比较所获得的在培养基A中培养的部分的对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流强度值与所获得的阴性对照的电流强度值来确定前述样品中产β-内酰胺酶细菌的存在,和
(e)通过比较所获得的在培养基A、B、C、D和E以及任选地在B’和C’中平行培养的部分的前述阳极电流强度的各个值和所获得的参照细菌菌株的各个值,区分所述样品中由前述细菌产生的β-内酰胺酶的类型。
“参照细菌菌株”是指产生其类型已经被鉴定的β-内酰胺酶的细菌菌株。
在甚至更特别的实施方案中,本发明的方法在步骤(e)之后进一步包括步骤(f),所述步骤(f)通过比较对应于被所述β-内酰胺酶水解的头孢硝噻的阳极电流强度值和相同条件下建立的校准曲线能够对在步骤(e)中区分的产生β-内酰胺酶的细菌定量。
根据下式计算对应于被超广谱β-内酰胺酶水解的头孢硝噻的阳极电流强度值:iB-iC。
根据下式计算对应于被高产头孢菌素酶水解的头孢硝噻的阳极电流强度值:iB-iD。
对应于被碳青霉烯酶水解的头孢硝噻的阳极电流强度值对应于值iE。
更有利地,使用含有底物和对β-内酰胺酶亚类具有特异性的抑制剂的另外的培养基,本发明的方法甚至可以区分产生β-内酰胺酶亚类的细菌。
使用含有碳青霉烯和对碳青霉烯酶亚类具有特异性的抑制剂的另外的培养基,本发明的方法特别地可以区分产生碳青霉烯酶亚类的细菌。
区分是基于碳青霉烯酶亚类对某些类型的抑制剂的特异敏感性。例如,金属-β-内酰胺酶是根据Ambler属于B类的碳青霉烯酶的亚类,对EDTA或对巯基乙酸敏感,而根据Ambler分类的A类碳青霉烯酶对克拉维酸和对硼酸敏感。
根据本发明,碳青霉烯酶抑制剂选自EDTA、巯基乙酸、硼酸或克拉维酸。
在另一有利的实施方案中,本发明的方法能够区分β-内酰胺酶的类型,并任选地确定可能含有碳青霉烯酶的样品中由前述细菌产生的碳青霉烯酶的亚类,所述方法包括以下步骤:
(a)-在如前限定的培养基A、培养基B和培养基C中,并且
-任选地在培养基B’、培养基C’、培养基D、培养基E和培养基F中,
平行孵育前述样品的一部分,培养基B’、C’、D、E如前限定,培养基F是补充有碳青霉烯和对碳青霉烯酶亚类具有特异性的抑制剂的基础培养基;
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的培养结束时获得的前述培养基,
(c)向步骤(b)结束时获得的前述培养基应用电化学分析手段,以确定产β-内酰胺酶细菌的存在和区分β-内酰胺酶的类型。
培养基F能够抑制产生对前述抑制剂敏感的碳青霉烯酶类型的细菌的生长,前述抑制剂对碳青霉烯酶的亚类具有特异性:EDTA和巯基乙酸是B类的特异性抑制剂,而硼酸和克拉维酸是A类的特异性抑制剂。
在特别有利的实施方案中,用于区分β-内酰胺酶的类型和任选地限定由前述细菌产生的碳青霉烯酶亚类的本发明的方法包括以下步骤:
(a)在如前限定的培养基A、培养基B、培养基C、培养基D、培养基E和培养基F以及任选地在如前限定的培养基B’和培养基C’中平行孵育前述样品的一部分,
(b)在含有头孢硝噻的培养基中平行孵育在步骤(a)的孵育结束时获得的前述培养基,
(c)分别对在步骤(b)结束时获得的前述培养基和阴性对照应用安培测量,
(d)通过比较所获得的在培养基A中培养的部分的对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流强度值与所获得的阴性对照的电流强度值来确定所述样品中产β-内酰胺酶的细菌的存在,
(e)通过比较所获得的培养基A、B、C、D、E和F以及任选地在B’和C’中平行培养的部分的前述阳极电流强度的各个值与所获得的参照细菌菌株的各个值,区分所述样品中由前述细菌产生的β-内酰胺酶的类型。
本发明的方法可用于开发β-内酰胺抗生素类的新型抗生素,特别是用于研究该分子对不同的β-内酰胺酶的稳定性。
通过下面给出的附图和实施例更详细地说明本发明。
附图说明
图1:在孵育10分钟后在不存在ESBL(虚线)和存在ESBL(实线)的情况下获得的500μM头孢硝噻的PBS溶液的循环伏安图(v=50mV.s-1)。
图2:ESBL的校准曲线(log-log),通过根据本发明的循环伏安法(A,)和通过分光光度法(B,O)确定ESBL的量。用在PBS中制备的500μM头孢硝噻溶液孵育ESBL 10分钟后记录分析响应。在进行分光光度法测量之前,将反应混合物在PBS中稀释5倍。值R分别对应于电流响应或光密度,采用在不存在ESBL的情况下获得的值归一化(i0=50±5nA;OD0=0.097±0.008)。标准偏差表示两种测量的标准误差。
图3:在丝网印刷的传感器上记录的大肠杆菌菌株ESBL+(A)和ESBL-(B)的伏安曲线(v=50mV.s-1),所述大肠杆菌菌株ESBL+和ESBL-在离心(1毫升;7000g;10分钟)并用50μL的500μM头孢硝噻的PBS溶液孵育团粒10分钟之后,在含有4μg.mL-1头孢噻肟的培养基中在37℃下培养4.5小时。
图4:用丝网印刷的传感器记录的大肠杆菌菌株ESBL+的循环伏安图(v=50mV.s-1),所述大肠杆菌菌株ESBL+在仅含有4μg.mL-1的头孢噻肟(A)或补充有10μg.mL-1的克拉维酸钾的培养基中培养,随后离心(1毫升;7000g;10分钟),随后是用50μL的500μM头孢硝噻的PBS溶液孵育团粒10分钟的步骤。
图5:在补充有4μg.mL-1头孢噻肟的LB培养基中在37℃下孵育3.5小时后ESBL+菌株的校准曲线。在连续稀释细菌培养物后,过滤10毫升的体积,一式两份。过滤后回收的细菌用80μL的500μM头孢硝噻的PBS溶液孵育10分钟。x轴对应于过滤后回收的细菌的数量。误差条表示两次试验的标准偏差。空心方块代表由使用4μg.mL-1头孢噻肟和10μg.mL-1克拉维酸培养的ESBL+菌株组成的阴性对照。空心圆形(○)对应于来自未水解的头孢硝噻的信号。
图6:在未经处理的废水的三个样品(■)和预先高压灭菌处理过的水的三个样品中完成的产生ESBL的大肠杆菌菌株的校准曲线。值i(nA)对应于针对细菌计数记录的水解的头孢硝噻的氧化峰的电流,所述细菌计数中已经减去测得的阴性对照的细菌计数。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F:记录的不同类型的β-内酰胺酶水解的头孢硝噻的氧化电流(μA)的曲线,用于区分医学样品(血液培养物,分离的菌株)中的β-内酰胺酶。
图8:在用50μL的HMRZ-86(0.5mM的PBS溶液)孵育30分钟后,记录的六种液体培养物(v=50μL)的循环伏安图(v=50mV.s-1),所述六种液体培养物分别含有不产生β-内酰胺酶的菌株(K12)、产生诱导型头孢菌素酶的菌株、产生青霉素酶的菌株、产生ESBL的菌株、产生高产头孢菌素酶的菌株、产生碳青霉烯酶的菌株。
图9:在高压灭菌的废水的样品中,用分别由符号■和●表示的两种产生ESBL的大肠杆菌菌株(CTX-M15型)完成的校准曲线。值i(nA)对应于HMRZ-86的氧化的峰电流,已经从中减去测得的阴性对照的值,阴性对照具有235±15nA(Δ)的平均值。
图10A、10B、10C、10D:各个图显示分别用产生ESBL的菌株、产生高产头孢菌素酶的菌株和产生碳青霉烯酶的菌株在37℃下孵育30分钟记录的三种Carba-S溶液(30μL)的循环伏安图(v=50mV.s-1)。图10A:产生碳青霉烯酶的菌株OXA-48。图10B:OXA-48+CTX-M型产生碳青霉烯酶的菌株。图10C:NDM-1型产生碳青霉烯酶的菌株。图10D:KPC-2型产生碳青霉烯酶的菌株。
具体实施方式
实施例I:使用头孢硝噻作为底物鉴定产β-内酰胺酶的细菌
1.材料和方法
1.1.试剂和溶液
磷酸盐缓冲液(PBS;100mM;pH=7.0)和所有水溶液用Milli-Q 18-MΩ水(Millipore提纯系统)制备。
在实验室中制备培养基,其包含Luria肉汤(LB,10g.L-1的Bacto胰蛋白胨,5g.L-1的Bacto酵母提取物,5g.L-1的NaCl),并通过高压蒸汽处理在120℃下灭菌。
头孢硝噻购自Merck Millipore(Reference 484400)。以二甲亚砜(DMSO)制备10- 2M的头孢硝噻的储备溶液,并随后以50μL等份的形式储存在-20℃下。
头孢噻肟的钠盐(Reference C 7039-100毫克)和克拉维酸钾(Reference 33454-100毫克)由Sigma-Aldrich供应。每天以PBS制备1mg.mL-1的储备溶液。
ESBL由在第戎大学医院中心(Dijon University Hospital Centre)的细菌学实验室(Bacteriology Laboratory)中分离的大肠杆菌菌株(1485;CTX-M-1型)提取。
大肠杆菌菌株K12和产ESBL大肠杆菌菌株(MIAE6690)来自于法国国家农业研究院(French National Institute for Agricultural Research,INRA)的第戎(Dijon)中心保藏的菌株。这些菌株的样品以含有50%细菌悬浮液和50%甘油(v/v)的500μL等份的形式储存在-80℃下。
1.2.测量仪器和电极
1.2.1.用于证明概念
采用通过GPES软件(版本4.9)控制的PGSTAT12Autolab恒电位器(Metrohm)来进行电化学测量。
传感器用手动丝网印刷机(Circuit Imprimé Bagneux,France)以碳素墨水( PF 407A,Acheson Colloids)制备。通过用刮刀使墨水穿过丝网框架(120根丝线/厘米)在柔性聚酯膜上印刷一系列的6个传感器。在干燥步骤(65℃下1小时)后,将传感器储存在环境温度下。
每个传感器包括工作电极和对电极。传感器的工作面积(7.07mm2)由粘结剂环界定,其还能够限定电化学电池。为了进行安培测量,将传感器插在连接到恒电位器的连接器(Dropsens)中,随后在传感器表面上沉积20μL的待分析溶液液滴。在浸没构成参比电极的涂有氯化银沉淀物的银线(Ag/AgCl)后,通过循环伏安法(v=50mV.s-1)在环境温度下进行测量。
1.2.2用于区分血液样品中的β-内酰胺酶和产ESBL菌株的定量:
通过在预先连接到PSTAT mini 910便携式恒电位器(Methrohm)的由Dropsens供应的丝网印刷的碳传感器(DRP-110)上沉积30微升溶液液滴来进行伏安法测量(v=50mV.s-1),通过电脑的USB端口供电,并由PSTAT软件(版本1.0)控制。
1.3.β-内酰胺酶活性的安培检测
在含有45μL的0.5mM头孢硝噻的磷酸盐缓冲液(PBS;100mM;pH=7.0)溶液的聚丙烯管中放入5μL的ESBL溶液。在环境温度下在黑暗中孵育10分钟的步骤之后,取20μL混合物并转移到丝网印刷的碳传感器的表面上。随后将参比电极(Ag/AgCl)浸没在预先沉积的20μL溶液中,并通过如下进程来进行循环伏安法测量:以50mV.s-1的速率在-0.4V和1.2V之间电位扫描。
出现在大约+0.3V的氧化峰源自头孢硝噻的β-内酰胺环的水解,并可以被选择作为鉴别样品中β-内酰胺酶的分析响应。
1.4.使用头孢硝噻对ESBL活性的安培和比色测量
在含有5μL预先在PBS中稀释的ESBL溶液的聚丙烯管中放入45μL的头孢硝噻溶液(0.5mM的PBS溶液)。在环境温度下在黑暗中孵育反应混合物10分钟。随后通过电流分析法和分光光度法检测酶促反应的产物。电化学测量通过将20μL的混合物转移到丝网印刷的传感器的表面上从而进行如上所述的伏安法测量来进行。选择相对于Ag/AgCl在大约+0.3V处测得的氧化峰电流的强度作为分析响应。对于分光光度法检测,溶液在PBS中稀释(5倍),随后用移液管移至一次性的比色皿( Q-VETTES semimicro,No.2712120)中,随后用800分光光度计(Beckman Coulter)在λ=520nm处进行吸光度测量。
1.5.检测产β-内酰胺酶菌株
在含有10毫升的补充有头孢噻肟(4μg.mL-1)的LB培养基的试管中在37℃下平行培养10μL不产生β-内酰胺酶的大肠杆菌菌株K12(ESBL-)和10μL产ESBL的大肠杆菌菌株MIAE6690(ESBL+)4.5小时。随后将1毫升各细菌悬浮液转移至聚丙烯管,并在7000g下离心10分钟。除去上清液后,将50μL体积的头孢硝噻溶液(0.5mM的PBS溶液)放入该管中并用细菌团粒在环境温度下在黑暗中孵育10分钟。随后吸出液体并转移到丝网印刷的传感器上以进行如段落1.3中所述的伏安法测量。
1.6.鉴别血液培养物中耐受第三代头孢菌素类的菌株
由第戎大学医院中心(Dijon University Regional Hospital Centre)的细菌学实验室(Bacteriology Laboratory)供应的血液培养物是已经在适于测试主要为需氧的微生物的BactecTM瓶中或在专门用于生长主要为厌氧的细菌的BactecTM瓶中培养的血液样品。
将10μL体积的样品平行引入含有10毫升LB培养基(培养基A)、10毫升补充有4μg.mL-1的头孢噻肟的LB培养基(培养基B)和10毫升补充有4μg.mL-1的头孢噻肟和100μg.mL-1的克拉维酸的LB培养基(培养基C)的管中。在搅拌下在37℃下2小时的孵育步骤后,用注射器取5毫升各个管的内容物,随后使用装备有孔尺寸为0.45微米的膜(HVLP,13mm,Millipore)的手动过滤装置(13mm,Millipore)过滤。随后将每个过滤器放置在聚苯乙烯微孔板(24孔板,662160)的孔底部,随后向其中引入80μL的头孢硝噻溶液(0.5mM的PBS溶液),并令其在环境温度下在黑暗中孵育10分钟。
取40μL的各个混合物,并转移到预先连接到PSTAT mini 910便携式恒电位器(Methrohm)的丝网印刷的碳传感器(Dropsens,DRP-110)的表面上,由电脑的USB端口供电,并由PSTAT软件(版本1.0)控制。通过以50mV.s-1的速率由-0.1V至1.2V的线性电位扫描来进行线性伏安法测量。
与头孢硝噻的β-内酰胺环的水解相关的出现在大约+0.3V的峰电流(i)被选择作为分析响应。通过比较针对每种样品孵育条件(培养基A、B、C)测得的电流的值i,能够得出菌株能否能够产生头孢噻肟水解酶的结论。
1.7.废水中的产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的菌株的定量
1.7.1.构建来自净化工程的水中产ESBL大肠杆菌的校准曲线
在含有10毫升补充有头孢噻肟(4μg.mL-1)的LB培养基的管中在搅拌下在42℃下培养10μL的产ESBL大肠杆菌菌株MIAE6690过夜。通过在含有胰蛋白胨(10g.L-1)和NaCl(5g.L-1)的TS培养基中进行连续稀释并随后在含有琼脂培养基(35.6g.L-1Tryptone Bile X-glucose,4mg.L-1头孢噻肟)的培养皿上铺展该溶液来测定由此获得的培养物中的细菌浓度(S0)。
在预先高压灭菌过的来自净化工程的水(未处理的或处理过的)的样品中连续稀释培养物S0(稀释因子包括在10至108之间),在聚丙烯管中制备1毫升的溶液体积。
随后将500μL的这些预先稀释的溶液(稀释因子包括在104至108之间)分别引入含有25毫升补充有4μg.mL-1的头孢噻肟的LB培养基的管中,并在搅拌下在42℃下孵育4小时。将用于进行细菌菌株稀释的、500μL体积的来自净化工程的水(未处理的或处理过的)的预先高压灭菌过的样品在相同条件下孵育(阴性对照)。随后用注射器从每个管一式两份取10毫升体积,随后使用装备有孔尺寸为0.45微米的膜(HVLP,13mm,Millipore)的手动过滤装置(13mm,Millipore)分别过滤。每个过滤器随后放置在聚苯乙烯微孔板(24孔板,Reference:662160)的孔底部,随后向其中引入80μL的头孢硝噻溶液(0.5mM的PBS溶液),并令其在环境温度下在黑暗中孵育15分钟。
取40μL的各孔的内容物,并转移到预先连接到PSTAT mini 910便携式恒电位器(Methrohm)上的丝网印刷的碳传感器(Dropsens,DRP-110)的表面上,并如段落1.6中所述进行线性伏安法测量。
1.7.2.来自净化工程的水的样品中的产ESBL菌株的检测
使用不锈钢过滤坡道(Sartorius Combisart)在孔尺寸为0.45微米的膜(HVLP,47mm,Millipore)上一式两份过滤一定体积的废水(1-10毫升)和处理过的水(20-100毫升)。对于每个样品,将所述膜之一放入含有25毫升补充有4μg.mL-1的头孢噻肟的LB培养基(培养基B)的管中,而第二个膜浸没在含有25毫升补充有4μg.mL-1的头孢噻肟和10μg.mL-1的克拉维酸的LB培养基(培养基C)的管中。所有管在搅拌下在42℃下孵育4小时,随后如1.7.1中所述过滤它们的内容物并在头孢硝噻的存在下进行分析。
对于给定的样品,对于在培养基B和C中的孵育,在大约0.3V处测得的峰电流强度分别指定为iB和iC。由电流值i=iB–iC并使用校准曲线(1.7.1)计算产ESBL菌株的量。
2.结果
2.1.水解的头孢硝噻的电化学表征
头孢硝噻被充足量的超广谱β-内酰胺酶水解。使用丝网印刷的碳基电极通过循环伏安法来研究头孢硝噻(S)及其水解形式(P)的伏安行为。头孢硝噻和水解的头孢硝噻均具有相对于Ag/AgCl在大约+1.0V处的不可逆的阳极氧化的峰(a1)。该峰可以归因于二氢噻嗪基团中硫醇基的氧化或归因于其它对头孢菌素衍生物有特异性的功能。不同于头孢硝噻,水解的头孢硝噻(P)生成界限分明的并在大约+0.3V的较低阳极电位处观察到的不可逆的阳极氧化的峰(a2)(图1)。a2峰的存在表明存在水解的头孢硝噻,因此可以选择作为分析响应用于证明超广谱β-内酰胺酶的活性。
2.2.ESBL的活性的测量
通过分光光度法测量和通过使用头孢硝噻的伏安法测量平行测量ESBL的活性。通过改变ESBL的浓度进行每一系列的试验,用本发明的电化学方法和分光光度法获得的校准曲线(log-log)显示在图2中。相对于在不存在ESBL的情况下获得的信号将每次测量归一化。通过伏安法获得的校准曲线表明该方法能够以接近分光光度法的灵敏度定量检测ESBL的活性。此外,本发明的伏安法提供了更宽的线性区域。分光光度法测量的重现性与伏安法测量类似。
2.3.通过循环伏安法的测量检测大肠杆菌的产ESBL菌株
为了评价伏安法用于检测产ESBL细菌的能力,选择两种具有充分表征的基因型的大肠杆菌菌株,其一是ESBL的产生者(ESBL+),另一种不产生ESBL(ESBL-)。首先将这两种菌株在含有4μg.mL-1头孢噻肟的LB培养基中培养。在离心步骤后,这两种菌株的各自的细菌团粒用头孢硝噻作为底物进行孵育。图3显示了分别获得的ESBL+菌株(曲线A)和ESBL-菌株(曲线B)的伏安响应。曲线A具有相对于Ag/AgCl在大约+0.4V处的阳极峰,该阳极峰与头孢硝噻的β-内酰胺环被ESBL+菌株催化水解相关,而就ESBL-菌株而言没有记录到峰。该结果分别与ESBL+菌株和ESBL-菌株获得的0.934和0.002的光密度值良好地吻合。还对补充有头孢噻肟的培养基和不含抗生素的培养基进行了伏安法测量。这两种培养基在电位范围[相对于Ag/AgCl的0.1-0.6V]内没有观察到特异性信号,这证实了LB培养基和头孢噻肟均不影响伏安法检测。
2.4.区分产ESBL细菌
由于高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶也能水解头孢噻肟,产生这些酶的细菌也能在头孢噻肟存在的情况下给出阳性响应。为了区分产生超广谱β-内酰胺酶的细菌和产生高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶的细菌,将细菌在两种培养基中同时培养,一种含有头孢噻肟作为抗生素,另一种另外含有克拉维酸钾作为ESBL的抑制剂。在回收细菌后,细菌团粒用头孢硝噻作为底物进行孵育。通过循环伏安法记录的伏安曲线显示在图4中。用头孢噻肟培养的ESBL+菌株观察到源自头孢硝噻的水解的阳极峰(曲线A),而在克拉维酸钾存在的情况下培养的相同菌株没有记录到信号(曲线B)。该结果证实了产ESBL细菌的存在。
该结果与选择性培养基上所获得的大肠杆菌计数的值良好地吻合,因为后者分别对补充有抑制剂的培养物而言为80CFU.mL-1,对不含抑制剂的培养基而言为1.8×108CFU.mL-1。
2.5.产β-内酰胺酶细菌的定量
通过由5×104至5×107CFU.mL-1连续稀释、用头孢噻肟孵育的ESBL+大肠杆菌培养物来评估本发明的方法定量测定产ESBL细菌的能力。图5中的校准曲线具有宽的线性区域,能够设想产ESBL细菌菌株的定量测定。在高浓度的产ESBL细菌处观察到的平台表明所有初始存在的头孢硝噻均被水解。
2.6.未处理的或高压灭菌的废水中的产β-内酰胺酶细菌的定量
通过段落1.7.1中描述的方法建立未处理的废水样品和预先高压灭菌处理过的水的样品的产ESBL大肠杆菌的校准曲线。这些校准曲线分别用于通过本发明的方法定量未处理的水和处理过的水中的产ESBL细菌。如表1和2中所示,用本发明的方法获得的结果与通过计数细菌获得的结果一致。
表1:来自 d’Or的5个净化工程(A、B、C、D、E)的未处理的水中的产ESBL菌株(CFU.L-1)的测定
表2:来自 d’Or的5个净化工程(A、B、C、D、E)的处理过的水中的产ESBL菌株(CFU.L-1)的测定
2.7.区分β-内酰胺酶
通过本发明的方法分析获自临床样品并产生不同类型的β-内酰胺酶(青霉素酶、CTX-M型的ESBL、诱导型头孢菌素酶、高产头孢菌素酶)的五种菌株。
每种菌株以及阴性对照分别在三种不同的培养基(培养基A、B和C)中孵育:培养基A是LB培养基,培养基B是含有4μg.mL-1头孢噻肟的LB培养基,培养基C是含有4μg.mL-1头孢噻肟和100μg.mL-1克拉维酸的LB培养基。在用过滤细菌悬浮液后,将在其上回收细菌的过滤膜在黑暗中用80μL的500μM的头孢硝噻孵育10分钟。
使用碳电极实施循环伏安法测量。这三种培养基的对应于水解的头孢硝噻的氧化的阳极电流峰分别指定为iA、iB和iC。
用产生各种β-内酰胺酶的菌株获得的结果显示在图7A至7F中。
图7A中的结果对应于含有不产生β-内酰胺酶的菌株的样品的响应(阴性)。
图7B和7C中的结果对应于两种青霉素酶。青霉素酶的催化活性通过存在获得的源于培养基A和B的细菌的水解的头孢硝噻的阳极电流和不存在来自培养基C的细菌的特异性阳极电流来表征。
诱导型头孢菌素酶(图7D)通过对应于以下标准的这三种培养基中获得的水解的头孢硝噻的阳极电流峰来表征:iA<1,iA<iB<iC,和iC>1。
CTX-M型的超广谱β-内酰胺酶(图7E)通过对应于以下标准的这三种培养基中获得的水解的头孢硝噻的阳极电流峰来表征:iA>3,iB>3和iC<0.2。
高产头孢菌素酶(图7F)通过对应于以下标准的这三种培养基中获得的水解的头孢硝噻的阳极电流峰来表征:iA>3,iA>iB>iC,和iC>1。
本发明的琼脂扩散抗菌谱和安培法分别用于区分血液培养物样品中的产β-内酰胺酶细菌。从下表3中呈现的结果可以看出,本发明的方法与抗菌谱的重叠程度为100%。
表3:获得抗菌谱(ATB)并实施本发明的电化学方法用于区分血液培养肉汤中的产β-内酰胺酶菌株后获得的结果的比较
*iA、iB和iC(μA)
还实施琼脂扩散抗菌谱和本发明的安培法用于在Drigalski乳糖琼脂上分离获自各种生物样品的产β-内酰胺酶细菌之后对其区分。表4中呈现的结果表明本发明的方法与抗菌谱的重叠程度为100%。
表4:在进行抗菌谱(ATB)并实施本发明的电化学方法用于区分在Drigalski培养基上预先分离的产β-内酰胺酶菌株之后获得的结果的比较
*iA、iB和iC(μA)
实施例II:使用化合物HMRZ-86作为底物鉴别耐受C3G的细菌
1.材料和方法:
1.1.试剂与溶液
化合物HMRZ-86由Kanto Chemical(Japan)合成并供应。在DMSO中制备10-2M的储备溶液,并以50μL等份的形式在-20℃下储存。
下表5中呈现的该实施例中使用的菌株来自于法国国家农业研究院(FrenchNational Institute for Agricultural Research,INRA)的第戎(Dijon)中心的冷冻保存的保藏菌株。
表5
1.2.液体培养物中耐受C3G菌株的鉴别
每种冷冻保存的菌株在37℃下在10毫升LB培养基中培养,直到达到稳定期。
将50μL体积的培养液在50μL的0.5mM的HMRZ-86的PBS溶液的存在下在搅拌下在37℃下培养30分钟。取40μL反应混合物并转移到预先连接到STAT 8000P便携式恒电位器(Dropsens)的丝网印刷的碳传感器(Dropsens,DRP-110)的表面上,由电脑的USB端口供电,并由DropView 8400软件控制。通过以50mV.s-1的速率由-0.1V至1.2V的线性电位扫描来进行线性伏安法测量。与HMRZ-86的β-内酰胺环的水解相关的相对于Ag/AgCl在电位范围+0.2至+0.55V中出现的峰电流被选择作为分析响应。如果峰强度(i)具有高于500nA的值,则样品含有能够降解C3G的菌株。
1.3.形成高压灭菌废水样品中大肠杆菌的产ESBL菌株的校准曲线
用单一培养条件(补充有4μg.mL-1头孢噻肟的LB)实施实施例I的在1.7.1中描述的方案。过滤器用90μL的HMRZ-86(0.25mM的PBS溶液)在37℃下孵育30分钟。如上所述(段落1.2)通过线性伏安法进行测量。与HMRZ-86的β-内酰胺环的水解相关的相对于Ag/AgCl在电位范围+0.2至+0.55V中出现的峰电流被选择作为分析响应。其强度(i)与样品中存在的耐受C3G菌株的量成正比。
2.结果
2.1.HMRZ-86及其水解形式的电化学表征
分别使用耐受C3G或对C3G敏感的,即能或不能水解HMRZ-86分子的不同细菌菌株孵育HMRZ-86的溶液。
HMRZ-86及其水解形式的伏安响应显示在图8中。记录的使用C3G敏感菌株(不产生β-内酰胺酶,产生青霉素酶或诱导型头孢菌素酶)孵育的HMRZ-86的伏安图均具有相同的轮廓,具有相对于Ag/AgCl大约+0.2和+0.4V的两个强度极低的氧化波,其消失有利于HMRZ-86的水解形式的界限分明的氧化峰。更准确地说,HMRZ-86被产生ESBL和碳青霉烯酶的菌株水解导致相对于Ag/AgCl在大约+0.25V处具有非常特殊的氧化峰P1的产物(图8),而由HMRZ-86被产生高产头孢菌素酶的菌株水解所得的产物在相对于Ag/AgCl大约+0.5V处被特异性氧化,以获得峰P2(图8)。因此,峰P1或P2的存在指示存在水解的HMRZ-86,并且可以被选择作为检测耐受C3G的菌株的分析响应。此外,峰P2实现了产生高产头孢菌素酶的菌株的特异性鉴别。
2.2.耐受C3G的菌株的定量:高压灭菌废水中产ESBL菌株的校准曲线的实例
通过应用根据本实施例中描述的方案1.3.建立的校准曲线来评估本发明的方法用底物HMRZ-86来定量测定耐受C3G的细菌的能力。图9显示了获得的在预先高压灭菌的废水样品中接种的大肠杆菌(CTX-M15型)的两种产ESBL菌株的校准曲线。采用包括在10至1000个过滤细菌之间的线性区域,该方法能够设想具有良好灵敏度的对耐受C3G的菌株的定量。
实施例III:耐受碳青霉烯的细菌的鉴别
1.材料和方法:
1.1.试剂
下文称为“Carba-S”的底物及其稀释剂分别对应于由Biorad销售的βCARBATMTest试剂盒的试剂R2和R3。通过向R2添加550μL的R3来制备Carba-S溶液。
下表6中呈现的在该实施例中使用的菌株来自法国国家农业研究院(FrenchNational Institute for Agricultural Research,INRA)的第戎(Dijon)中心的冷冻保存的保藏菌株。
表6
1.2.由分离的菌落开始鉴别耐受碳青霉烯的菌株
在Muller Hinton琼脂上在37℃下培养每种冷冻保存的菌株。
在30μL的Carba-S溶液的存在下在37℃下在搅拌下孵育1μL接种环30分钟。取40μL反应混合物并转移到预先连接到STAT 8000P便携式恒电位器(Dropsens)的丝网印刷的碳传感器(Dropsens,DRP-110)的表面上,由电脑的USB端口供电,并由DropView 8400软件控制。通过以50mV.s-1的速率由-0.1V至1.2V的线性电位扫描来进行线性伏安法测量。与Carba-S的水解相关的相对于Ag/AgCl在大约+0.3-0.8V处出现的峰电流(i)被选择作为分析响应。存在强度高于200nA的峰(i)能够得出存在产碳青霉烯酶的菌株的结论。
2.2.结果:
2.1.从分离的菌落开始的底物Carba-S及其水解形式的电化学表征
分别使用对碳青霉烯类敏感或耐受碳青霉烯类,即能或不能降解Carba-S分子的不同细菌菌株孵育Carba-S的溶液,并用丝网印刷的传感器通过线性伏安法进行分析。
分别呈现了所记录的OXA 48、OXA 48+CTXM、KPC-2和NDM-1型的对碳青霉烯类敏感的菌落(ESBL和高产头孢菌素酶的产生者)和产碳青霉烯酶的菌落的伏安响应(图10A、10B、10C和10D)。伏安图的比较表明,仅有所记录的产碳青霉烯酶菌株的曲线具有一至三个氧化波,所述氧化波相对于Ag/AgCl在+0.2至+0.8V的电位范围内具有界限分明的峰。由此,采用伏安法测量,能够区分Carba-S与其降解产物,因此检测产碳青霉烯酶的菌株的存在。
实施例IV:对比结果
对比分析1
将本发明的电化学方法应用于分析一组40种产生不同β-内酰胺酶的菌株,并与β-LactaTMTest(Biorad)进行比较,其原理基于对耐受C3G菌株的定性比色检测。对于两种方法,在用底物HMRZ-86孵育细菌30分钟后获得表7中呈现的结果。根据供应商提出的对结果的解释,β-LactaTMTest能够以68%的一致性水平鉴别耐受C3G的菌株,而采用本发明的电化学方法获得95%的一致性水平。不同于比色法,电流分析法提供了测量电流数值的优点,这在一方面避免了对结果(中间色)的任何主观解释,另一方面实现了结果的可追溯性。
表7:液体培养物采用本发明的电化学方法获得的结果与采用分离的菌落根据供应商的建议实施的β-LactaTMTest获得的结果的比较。在两种情况下,在用底物HMRZ-86孵育30分钟后获取读数。
表7
a.黄色或橙色:阴性结果(不存在耐受C3G的菌株)。红色:阳性结果(存在耐受C3G的菌株)
b.i<490nA:阴性结果(不存在耐受C3G的菌株)。i>490nA:阳性结果(存在耐受C3G的菌株)。i=490nA的值对应于所获得的产生青霉素酶和诱导型头孢菌素酶的菌株的12次响应的平均值,向其加上3倍的标准偏差。
对比分析2
将本发明的电化学方法应用于分析一组28种产生ESBL、高产头孢菌素酶和碳青霉烯酶的菌株,并与β-CarbaTMTest(Biorad)进行比较,其原理基于耐受碳青霉烯的菌株的定性比色检测。对于两种方法,在用Carba-S底物孵育分离的菌落的1μL接种环30分钟后获得表8中呈现的结果。根据供应商提出的对结果的解释,β-CarbaTMTest能够以43%的一致性水平鉴别耐受碳青霉烯的菌株,而采用本发明的电化学方法获得100%的一致性水平。再者,由于电流的数值测量,本发明的电化学方法避免了对结果(中间色)的任何主观解释,并能够比通过比色法快得多地获得可靠的结果。
表8:采用本发明的电化学方法和采用根据供应商的建议应用的β-CarbaTMTest分析分离的菌落获得的结果的比较。在两种情况下,在用底物Carba-S孵育30分钟后取读数。
表8
a.黄色或橙色:阴性结果(不存在产生的碳青霉烯酶)。亮橙色或红色或紫色:阳性结果(存在产生的碳青霉烯酶)
b.i<195nA:阴性结果(不存在产生的碳青霉烯酶)。i>195nA:阳性结果(存在)。i=195nA的值对应于不产生碳青霉烯酶的菌株获得的10次响应的平均值,给其加上3倍的标准偏差。