JP6748701B2 - βラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための新規な方法 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
本発明は、試料または培地において、βラクタム系抗生物質に対して耐性である細菌の存在をそのβラクタマーゼを産生する能力によって検出するための方法に関する。
ペニシリン、モノバクタム、セファロスポリンおよびカルバペネムを含む、βラクタム系抗生物質は、ペプチドグリカンの合成を阻害することによって作用する抗生物質である。これらは、一般診療と病院医療の両方において重篤な感染の第一選択治療でしばしば使用される分子である。βラクタマーゼは、βラクタム系抗生物質のβラクタム環を加水分解する酵素である。これは、βラクタム系抗生物質に対する耐性の最も一般的な機構である。Ａｍｂｌｅｒ（Ａｍｂｌｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒ Ｂ，１９８０，２８９，３２１−３３１）によれば、前記βラクタマーゼは４つの群に分類される：
Ａ：基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）をはじめとするペニシリナーゼ
Ｂ：金属酵素
Ｃ：セファロスポリナーゼ
Ｄ：オキサシリナーゼ
腸内細菌において、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（以下、ＥＳＢＬという）の、または過剰産生セファロスポリナーゼの産生は、現在、オキシイミノセファロスポリンである第三世代セファロスポリン（以下、Ｃ３Ｇという）、例えばセフォタキシム、セフトリアキソンまたはセフタジジムなどに対する耐性の主な機構である。唯一の第四世代セファロスポリン（以下、Ｃ４Ｇと呼ぶ）であるセフェピムは、ＥＳＢＬによって加水分解されるが、通常セファロスポリナーゼによっては加水分解されない。ペニシリンも加水分解されるが、カルバペネムは加水分解されない。ＥＳＢＬの活性は、クラブラン酸、タゾバクタムまたはスルバクタム（ペニシリナーゼ阻害剤）によって抑制することができる。セファロスポリナーゼの活性は、クロキサシリンによって抑制することができる。カルバペネマーゼ（ＡｍｂｌｅｒによるファミリーＡ、ＢおよびＤに属しうる酵素）は、カルバペネムを加水分解するが、通常ペニシリンおよびセファロスポリンも加水分解する酵素である。
第三世代セファロスポリンに対して耐性のある細菌、ＥＳＢＬまたは過剰産生セファロスポリナーゼの産生株、あるいはカルバペネマーゼを速く正確に検出することは、患者管理に極めて重要である。それは適した抗生物質療法の確立を導くはずである。Ｃ３Ｇを加水分解する酵素が産生されない場合、Ｃ３Ｇを第一選択治療で使用することができるが、そうでなければ、カルバペネムを用いることが必要となる。この例では、これらの細菌がカルバペネマーゼを産生するかどうかを判断することも必要である。
現在、βラクタマーゼ産生細菌を検出するために使用される従来技法は、アンチバイオグラムの実施と、ペニシリナーゼ阻害剤の存在下でＣ３Ｇに対する感受性の回復を実証することを可能にするダブルディスクシナジー試験の適用に基づく。その有効性に関わらず、この技法の実施には細菌を培養および分離する予備段階が必要とされ、それはβラクタマーゼの産生が検出可能になる前に少なくとも２４時間の遅れがあることを意味する。
βラクタマーゼ産生細菌の存在は、分子生物学の方法によって、例えばβラクタマーゼをコードする遺伝子を検出するためにＰＣＲおよび／または配列決定を用いることによっても実証されることができる。それらは例えばＥＳＢＬをコードする遺伝子の特異的な特徴づけを可能にするかもしれないが、これらの検査手技は高価であり、複合試料からＤＮＡを予備抽出するために相当長い時間がかかる。
そのため、医療の分野において、βラクタム系抗生物質に耐性である細菌株の存在を検出するために、βラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための、効果的で急速で安価な方法を緊急に開発する必要がある。
Ｎｏｒｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２，５０，３０１６−３０２２）は、セフォタキシムとｐＨ変色指示薬の使用を伴う、ＥＳＢＬ産生細菌を検出するための方法を記載する。この方法は、セフォタキシムのβラクタム環の加水分解がカルボン酸官能基の形成を導き、そのために、反応媒質の酸性化を導くという事実に基づく。培地のｐＨの変化は、変色指示薬の使用によって視覚化される。
その有効性および速度にもかかわらず、この方法は、最初に、細菌株を分離する制限的な工程を必要とする。
別の比色分析アプローチは、発色性セファロスポリンであるニトロセフィンを使用することからなる。ニトロセフィンは全てのβラクタマーゼによって加水分解されることができ、従って黄色から赤色への色変化をもたらす（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９７２，１，２８３−２８８）。下の化１は、βラクタマーゼによるニトロセフィンのβラクタム環の加水分解を示す。最近になって、同じ原理に基づいて、Ｃ３Ｇに耐性の細菌株を検出するために、ＨＭＲＺ−８６と呼ばれる別の発色性セファロスポリン（Ｈａｎａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００４，５３，８８８−８８９）が提案された。
しかし、この方法は、比色検出を可能にするために以前に分離された細菌株をもう一度使用することを必要とする。この方法は、ニトロセフィンの加水分解の比色検出を妨げるおそれのある呈色を有する複合試料に直接用いることができない。前と同じように、この方法は、臨床試料を採取してから結果を届けるまでの間に少なくとも２４時間の遅れを含む。
近年、βラクタマーゼ産生株の存在下でのβラクタム系抗生物質のインキュベーション後のβラクタム系抗生物質の加水分解生成物を検出するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析技法も提案された（Ｈｒａｂａｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１，４９，３２２２−３２２７；Ｓｐａｒｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２，５０，９２７−９３７）。しかし、この検査手技は、以前に分離された菌株でも実施されなければならず、なお高価であり、質量スペクトルを解釈するための有資格者を必要とする。
さらに、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ３８（２０１４）１３１−１３３）は、培地のｐＨ変化のアンペロメトリック測定によってペニシリンＧを検出するためのアンペロメトリックバイオセンサを、ペニシリナーゼによるペニシリンＧのペニシラン酸への加水分解と結び付けた。ペニシリンＧおよびペニシラン酸は電気的に活性でないので、アンペロメトリック測定は、レドックスメディエイターの役割を果たすコバルトの存在下で実行される。
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，７（２０１２）７９４８−７９５９）は、セファレキシンの酸素を含まないアルカリ溶液を暗所で７０℃にて加熱した後に達成される、セファレキシンをその加水分解後に電気化学的に検出するための方法を記載する。その文書に記載されるセファレキシンの加水分解の生成物（βラクタム環のＣ−Ｃ＝Ｏ結合を切断）は、かなり特異的な極端な条件下で生成され、セファレキシンをβラクタマーゼとともにインキュベートすることによって得ることができず、その場合はアミド結合のレベルでβラクタム環を切断する。
現在まで、先行技術には、電気的に活性な性質をもつ、βラクタマーゼのどんな基質も、またはβラクタマーゼによる加水分解から得られるどんな生成物も記載されていない。
現在、本発明者らは、βラクタマーゼのある特定の基質および／またはβラクタマーゼによるそれらの加水分解の生成物が、電気的に活性な性質をもつことを見出した。
この文脈で、本発明の目的は、従って細菌株を事前に分離せずに試料中のβラクタマーゼ産生細菌の存在を迅速かつ効果的に決定することのできる電気化学的方法を提供することである。
本発明は、βラクタマーゼ産生細菌の、前記細菌を含んでいる可能性のある試料中での存在をインビトロで判定するための方法に関し、以下の工程：
（ａ）電気化学的性質を有するβラクタマーゼの基質、特に電気化学的性質を有するβラクタム系抗生物質、より詳細にはセファロスポリンをβラクタマーゼの基質として含有する培地中で前記試料をインキュベートする工程、
（ｂ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定するための電気化学的分析手段を適用する工程を含む。
本発明は、βラクタマーゼのある特定の基質は、それらがβラクタマーゼによって加水分解された後に電気化学的に検出されることができるという事実に基づく。
特に、βラクタマーゼによるβラクタム系抗生物質のβラクタム環の加水分解は、電気化学的に検出されることができる。
本発明の文脈において、電気化学的性質を有するβラクタム系抗生物質は、特にセファロスポリン、より詳細にはニトロセフィンまたは化合物ＨＭＲＺ−８６（（６Ｒ，７Ｒ）−トリフルオロアセテート７−［［２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−［（１−カルボキシ−１−メチルエトキシ）イミノ］アセチル］アミノ］−１−アザ−３−［２−（２，４−ジニトロフェニル）エテニル］−８−オキソ−５−チアビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸のＥ異性体）である。
本発明の文脈において、電気化学的性質を有するβラクタマーゼのそのような基質は、Ｂｉｏ−ｒａｄにより販売されているβＣＡＲＢＡ（商標）キットの基質（試薬Ｒ２）であってよい。
ニトロセフィンは、全ての種類のβラクタマーゼによって加水分解されることができるが、化合物ＨＭＲＺ−８６は、Ｃ３Ｇに耐性である細菌；すなわち、ＥＳＢＬ、過剰産生セファロスポリンおよびカルバペネマーゼを産生する細菌によってのみ分解される。βＣＡＲＢＡ（商標）キットの基質（試薬Ｒ２）は、カルバペネマーゼ産生細菌によってのみ加水分解される。
本発明者らは、βラクタマーゼのある特定の基質、特にある特定のβラクタム系抗生物質、例えばニトロセフィンまたは化合物ＨＭＲＺ−８６などの電気化学的性質が、これらの加水分解された基質の電気化学的性質とは全く異なることを初めて実証した。例えば、加水分解されたニトロセフィンは、電気化学的方法によって測定可能な特異的なアノード酸化電流を生成することのできる電気的に活性な生成物である。加水分解されたニトロセフィンの酸化は、ニトロセフィンの酸化に対応する前記アノード電流が現れるのとは異なる電位範囲でアノード電流を生成する。従って、加水分解されたニトロセフィンに特異的な前記アノード電流は、βラクタマーゼによって加水分解されたニトロセフィンの存在を示す分析的応答として使用されることができる。
事前に細菌を少なくとも２４時間培養する必要のある、先行技術で既に開発された方法とは対照的に、本発明に記載される方法は、電気化学的測定を実施する前に、ほんの数時間、特に１〜４時間の試料のインキュベーションの後に、βラクタマーゼ産生細菌の存在または不在を検出することを可能にする。
一例として、ニトロセフィンを含有する培地での試料のインキュベーション時間は、一般に５〜３０分である。
電気化学的性質を有するβラクタマーゼの基質を含有する培地は、βラクタマーゼの電気的に活性な基質が添加された、緩衝された培地であってよい。前記緩衝された培地は、一例として、濃度１００ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液であってよい。
「βラクタマーゼ」は、βラクタム抗生物質のβラクタム環を加水分解することのできる酵素のファミリーを意味する。ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタムおよびカルバペネムが、βラクタム抗生物質の４つのファミリーである。
それらの触媒性およびある特定の基質に対するそれらの親和性ならびにβラクタマーゼ阻害剤のある特定の種類に対するそれらの感受性に基づいて、主なβラクタマーゼは、次の通りである：ペニシリナーゼ、誘導型セファロスポリナーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼ、基質特異性拡張型βラクタマーゼ、およびカルバペネマーゼ。
「ペニシリナーゼ」は、アミノペニシリン、カルボキシペニシリンおよびウレイドペニシリンを加水分解する酵素類を意味する。ペニシリナーゼは、クラブラン酸、タゾバクタムおよびスルバクタムである、ペニシリナーゼ阻害剤によって阻害される。
「誘導型セファロスポリナーゼ」は、アミノペニシリンおよび第一世代および／または第二世代セファロスポリンを加水分解する酵素類を意味する。誘導型セファロスポリナーゼは、ペニシリナーゼ阻害剤の作用に感受性ではない；一方、それらはクロキサシリンによって阻害される。セファロスポリナーゼをコードする遺伝子の発現は、インデューサーによって誘導されることがあり、それは特にβラクタム系抗生物質でありうる。
「過剰産生セファロスポリナーゼ」は、アミノペニシリン、カルボキシペニシリンおよびウレイドペニシリン、第一世代、第二世代、第三世代または第四世代のセファロスポリンを加水分解する酵素類を意味する。過剰産生セファロスポリナーゼは、ペニシリナーゼ阻害剤の作用に感受性ではない；しかし、それらはクロキサシリンによって阻害される。これらの酵素の発現の抑制が解除されると、これらの酵素の豊富な産生がもたらされる。
「基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）」は、アミノペニシリン、カルボキシペニシリンおよびウレイドペニシリン、第一世代、第二世代、第三世代および第四世代のセファロスポリンを加水分解し、ペニシリナーゼ阻害剤の抑制に対して感受性である酵素類を意味する。
「カルバペネマーゼ」は、カルバペネムへの加水分解活性を有するが、通常、ペニシリンならびに第一世代、第二世代、第三世代および第四世代のセファロスポリンへの加水分解活性も有する酵素を意味する。
本発明によれば、前記βラクタマーゼは、特に、以下のグラム陰性細菌によって産生されることができる：
ｉ）腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科の、特にエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属。
ｉｉ）非発酵性、特にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（特に緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）およびアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）。
ｉｉｉ）アシネトバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）（特にＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ））。
特定の実施形態では、前述の本発明の方法は、工程（ａ）を実施する前に、細菌を含んでいる可能性のある試料に存在する細菌を濃縮するための工程をさらに含む。細菌は、例えば、濾過または遠心分離によって濃縮されてよい。
特定の実施形態では、前述の本発明の方法の工程（ａ）は、電気化学的性質を有するβラクタマーゼの基質、特に電気化学的性質を有するβラクタム系抗生物質、特にニトロセフィン、化合物ＨＭＲＺ−８６またはβＣＡＲＢＡ（商標）キットの基質（試薬Ｒ２）を含有する培地中で実施される。当業者であれば、前記基質に適した濃度を選択する方法が分かるであろう。
本発明によれば、本発明を実施するための電気化学的分析手段は、電位差測定、インピーダンス測定、電量測定またはアンペロメトリック測定であってよい。
有利な実施形態では、前記電気化学的分析は、アンペロメトリック測定によって実施される。
「アンペロメトリック測定」は、作用電極と基準電極との間に確立された電位差の関数としての電流の測定を意味する。
電流は、公知のアンペロメトリック技術によって、好ましくは電位走査ボルタンメトリーによって測定することができ、電位走査ボルタンメトリーは、リニア、サイクリック、パルス、または電位ステップの種類のボルタンメトリー、例えばクロノアンペロメトリーなどであってよい。
本発明の特に有利な実施形態では、加水分解されたβラクタマーゼ基質の存在は、サイクリックまたはリニアボルタンメトリーによって測定される。
これらの技法の実施には、２または３の電極を有することのできる構成、すなわち、作用電極、基準電極および随意に補助電極（カウンター電極）を含む構成が必要とされる。その表面が電子移動のための場所として役立つ作用電極は、炭素に基づくか、または貴金属に基づくか、または金属酸化物に基づくものであってよい。基準電極は、その電位が一定である電極であり、正確に規定された電位を作用電極に加えることを可能にする。基準電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極であってよい。作用電極とともに電流の通路を確立することを可能にするカウンター電極は、不活性材料、例えば白金または炭素などで作製されてよい。当業者であれば、その一般知識に基づいて適切な電極を選択し、組み合わせる方法が分かるであろう。
電極の製造方法に関して、スクリーン印刷技術が好ましいが、グラビア印刷、インクジェット印刷または随意にフォトリソグラフィなどのその他の工業的製造方法も想定されうる。スクリーン印刷によって得られる電極は、低コストで大量生産することができ、そのため随意に使い捨てでありうるので、特に適している。さらに、その幾何学的形状ならびにその大きさは簡単に変化させることができる。これらの電極は、センサの形状でスクリーン印刷されてよく、随意にマイクロプレートのウェルの底またはその他の支持体または系に組み込まれて、細菌懸濁液の濾過およびニトロセフィンまたは電気化学的性質を有するβラクタマーゼの別の基質とのインキュベーションを可能にすることができる。
特定の実施形態では、アンペロメトリック測定は、スクリーン印刷されたセンサで実施される。これにより、数マイクロリットルの少量の溶液で測定を実行することが可能になる。
特定の実施形態では、アンペロメトリック測定は、３つの電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極、炭素でできた作用電極および炭素でできたカウンター電極を含む装置で実施される。
もう１つの特定の実施形態では、アンペロメトリック測定は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極、炭素でできた作用電極および炭素でできたカウンター電極を含むスクリーン印刷されたセンサで実施される。
加水分解された基質、例えば加水分解されたニトロセフィンの存在は、電位範囲のアノード酸化電流が存在すること、および前記加水分解された基質を含まない対照に関して前記電流が存在しないことによって示される。
加水分解された基質、特に加水分解されたβラクタム系抗生物質、例えば加水分解されたニトロセフィンが、サイクリックボルタンメトリーによる測定を受けると、その存在は、所定の電位範囲の加水分解された基質に特異的なアノード酸化電流のピークによって示される。
例えば、検出が、例えばニトロセフィンを含有する中性ｐＨの緩衝液中のＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極を使用するサイクリックボルタンメトリーによって実行される場合、加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応する、アノード酸化のピーク電流に関連する強度は、＋０．１Ｖ〜＋０．５Ｖの間からなる電位範囲、特に＋０．２Ｖ〜＋０．４Ｖの間、より詳細には＋０．２３Ｖ〜＋０．３３Ｖの間の電位範囲で測定される。
特に、検出が、ニトロセフィンを含有するｐＨ７のリン酸緩衝液中でサイクリックボルタンメトリーによって実行される場合、加水分解されたニトロセフィンの酸化に関連するアノード酸化のピーク電流は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．３Ｖに位置する。
別の種類の基準電極および／または別の反応媒質が本発明の方法の実施に使用される場合、当業者であれば、その一般知識に基づいてこの電位範囲を計算するかまたは特定する方法が分かるであろう。
加水分解された基質、例えば加水分解されたニトロセフィンまたは加水分解された化合物ＨＭＲＺ−８６の存在は電気化学的方法によって検出されるので、本発明に記載される方法は、予備的処置なしで着色されたかまたは濁った試料を分析するのに特に有利であることが分かり、小型化された、随意に携帯式の安価な設備を用いて、良好な感受性で数量化された測定を提供する可能性がある。
本発明の方法によって分析されることのできる試料は、生体試料、環境起源試料、または食物試料であってよい。
生体試料は、特に、血液試料、尿試料、組織試料または肺試料であってよい。
環境起源試料は、廃水、病院廃水、処理済み廃水または廃水処理からのスラッジ、ならびに湿潤または乾燥メタン化反応器からの残渣（消化物（ｄｉｇｅｓｔａｔｅｓ））であってよい。
食物試料は、βラクタマーゼ耐性細菌を含むことのある、動物起源の、より詳細には家禽などの鳥類起源の生成物および副生成物であってよい。
特に、本発明の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前記細菌を含んでいる可能性のある試料を、電気化学的性質を有するβラクタマーゼの基質、特にβラクタム系抗生物質を含有する培地中でインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定された、加水分解された基質、特に加水分解されたβラクタム系抗生物質の酸化に対応するアノード電流の強度の値と、陰性対照について測定されたアノード電流の強度の値とを比較することによって判定する工程。
本発明によれば、陰性対照は、試料の非存在下で前記基質を含有する培地である。
より詳細には、本発明の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前記細菌を含んでいる可能性のある試料を、ニトロセフィンを含有する培地中でインキュベートする工程
（ｂ）工程（ａ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定された、加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値と、陰性対照について測定されたアノード電流の強度の値とを比較することによって判定する工程。
前記陰性対照に適用したアンペロメトリック測定は、加水分解されたニトロセフィンの酸化に関連していないどんな電流も示すことができる。
アンペロメトリック測定の間、加水分解されたニトロセフィンの存在は、所定の電位範囲内のアノード電流の出現または同じ範囲内で測定された対照のアノード電流と比較した増加によって示される。
さらに、本発明に記載される方法は、試料中のβラクタマーゼ産生細菌を定量化する可能性を提供する。
実際に、加水分解された基質、特に加水分解されたニトロセフィンの酸化によって生成されたアノード電流の強度は、加水分解されたニトロセフィンの量と量的に比例している。基質の量が過剰である場合、加水分解された基質の量は、前記基質の加水分解に関わるβラクタマーゼの量、ならびにこれらの酵素を産生する細菌の量にも比例している。従って、加水分解された基質に特異的なアノード電流の強度の値と、検量線から読み取った基準値とを比較することによって、βラクタマーゼ産生細菌の量を決定することが可能である。
本発明の特定の実施形態は、βラクタマーゼ産生細菌を含んでいる可能性のある試料においてβラクタマーゼ産生細菌の存在を判定すること、およびそれらを定量化することを可能にする。
この実施形態では、該方法は、βラクタマーゼ産生細菌の存在の判定の後、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定されたアノード電流の強度の値と、同じ条件下で確立された検量線とを比較することからなる工程をさらに含む。
前記検量線は、既知量のβラクタマーゼ産生細菌を含有する基準試料の段階希釈によって確立され、任意の従来法、例えば培地での計数またはリアルタイムＰＣＲなどによって事前に決定される。
特定の実施形態では、本発明は、βラクタマーゼ産生細菌を含んでいる可能性のある試料において前記細菌の判定および定量化を可能にする方法に関し、前記方法は以下の：
（ａ）前記細菌を含んでいる可能性のある試料を、電気化学的性質を有するβラクタマーゼの基質、特にβラクタム系抗生物質を含有する培地中でインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程、
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定された、加水分解された基質、特に加水分解されたβラクタム系抗生物質の酸化に対応するアノード電流の強度の値と、陰性対照について測定された、アノード電流の強度の値とを比較することによって判定する工程；
（ｄ）前記細菌を定量化するために、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定されたアノード電流の強度の値と、同じ条件下で確立された検量線とを比較する工程を含む。
電気化学的性質を有する基質の特異性に応じて、本発明の方法は、１またはそれ以上の種類のβラクタマーゼを産生する細菌の存在をインビトロで特異的に判定するために実行されてよい。
特定の実施形態では、本発明の方法は、第三世代セファロスポリンに耐性である細菌の存在をインビトロで判定および定量化することを可能にし、前記方法は、工程（ａ）において、基質特異性拡張型βラクタマーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼによってのみ加水分解されるβラクタム系抗生物質、特に化合物ＨＭＲＺ−８６（（６Ｒ，７Ｒ）−トリフルオロアセテート７−［［２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−［（１−カルボキシ−１−メチルエトキシ）イミノ］アセチル］アミノ］−１−アザ−３−［２−（２，４−ジニトロフェニル）エテニル］−８−オキソ−５−チアビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸のＥ異性体）を実装する。
別の特定の実施形態では、本発明の方法は、カルバペネマーゼ産生細菌の存在をインビトロで判定および定量化することを可能にし、前記方法は、工程（ａ）において、カルバペネマーゼによってのみ加水分解される基質、特にＢｉｏ−ｒａｄより販売されているβＣＡＲＢＡ（商標）キットの基質（試薬Ｒ２）を使用する。
ニトロセフィンおよび少なくとも１つのその他のβラクタム系抗生物質およびβラクタマーゼの少なくとも１つの阻害剤を使用する別の特定の実施形態では、本発明の方法は、前述の細菌を含んでいる可能性のある試料中でその細菌によって生成されたβラクタマーゼの種類を区別することも可能にする。
実際に、本発明者らは、ある種類のβラクタマーゼに特異的な基質および随意にある種類のβラクタマーゼに特異的な阻害剤をそれぞれ含有する一連の培地において、異なる種類のβラクタマーゼを産生する細菌は、それぞれ、アンペロメトリック測定を実行する場合に、加水分解されたニトロセフィンのアノード電流の強度に関して特異的なプロフィールを与える可能性があることを見出した。
この実施形態の利点の１つは、それが、細菌を事前に分離せずに、複雑で着色されたマトリックス中のβラクタマーゼを区別することを可能にすることである。
より詳細には、本発明の方法は、前述の細菌を含んでいる可能性のある試料においてその細菌によって産生される、ペニシリナーゼ、基質特異性拡張型βラクタマーゼ、誘導型セファロスポリナーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼから選択されるβラクタマーゼの種類を区別することをさらに可能にし、前記方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前述の試料の一部を、培地Ａ、培地Ｂおよび培地Ｃ：
−培地Ａは、基本培地であり、
−培地Ｂは、第三世代セファロスポリンを添加した基本培地であり、かつ
−培地Ｃは、セファロスポリンおよびペニシリナーゼ阻害剤を添加した基本培地である：中で、かつ
随意に、培地Ｂ’、培地Ｃ’、培地Ｄ、培地Ｅ：
−培地Ｂ’は、培地Ｂ中に存在するものとは異なる第三世代セファロスポリンを添加した基本培地であり；
−培地Ｃ’は、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂ’であり；
−培地Ｄは、セファロスポリンおよびセファロスポリナーゼ阻害剤を添加した基本培地であり、かつ
−培地Ｅは、カルバペネムを添加した基本培地である：中で、
並行してインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）のインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程；
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定し、βラクタマーゼの種類を区別するために、アンペロメトリック手段を、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地に適用する工程。
本発明によれば、基本培地は、細菌をインキュベートするために慣習的に使用されるどんな種類の培地であってもよく、例えばＬＢ培地（ルリア・ベルターニブロス）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）またはＢＨＩ（ブレイン・ハート・インフュージョン）などであってよい。
特定の実施形態では、工程（ｂ）の実施の前および工程（ａ）の後に、本発明の前述の方法は、より重要な触媒応答を与えるために、培地に存在する細菌を濃縮するための工程をさらに含む。細菌は、例えば、濾過によるかまたは遠心分離によって濃縮されてよい。
本発明によれば、前記第三世代セファロスポリンは、セフォタキシム、セフタジジムおよびセフトリアキソンから選択される；前記カルバペネムは、エルタペネム、イミペネムまたはメロペネムから選択される。
本発明によれば、前記ペニシリナーゼ阻害剤は、特に、クラブラン酸、タゾバクタムまたはスルバクタムから選択される；前記セファロスポリナーゼ阻害剤は、特にクロキサシリンである。
培地ＢまたはＢ’は、ペニシリナーゼまたは誘導型セファロスポリナーゼを産生する細菌の増殖を阻害することを可能にする。
培地ＣまたはＣ’は、ペニシリナーゼまたは基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌の増殖を阻害することを可能にする。特定の実施形態では、培地Ｃは、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂである。
培地Ｄは、誘導型または過剰産生セファロスポリナーゼを産生する細菌の増殖を阻害することを可能にする。
培地Ｅは、カルバペネマーゼを除くβラクタマーゼを産生する細菌の増殖を阻害することを可能にする。
培地Ｂ、Ｂ’、ＣおよびＣ’の使用は、１つの第三世代セファロスポリン、例えばセフォタキシムに対して感受性が高いが、別の第三世代セファロスポリン、例えばセフタジジムに耐性であるか、または逆もまた同じである、ＥＳＢＬ産生細菌を区別することを可能にする。
１つの同一の試料の一部の培地Ａ、Ｂ、Ｃ、および随意に培地Ｂ’、Ｃ’、ＤおよびＥ中でのそれぞれのインキュベーションの後、これらの一部に由来する細菌によって産生されるβラクタマーゼは異なる。本発明は、加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値によって、これらのβラクタマーゼによって加水分解されたニトロセフィンの量を示すアンペロメトリック法によって、この違いを示すことを可能にする。
値ｉＡ、ｉＢ、ｉＢ’、ｉＣ、ｉＣ’、ｉＤ、およびｉＥは、培地Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、ＤおよびＥ由来の細菌についてそれぞれ測定された、加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値である。
本発明の方法の文脈において、ペニシリナーゼは、培地Ａ由来、培地Ｂ由来および随意に培地Ｂ’由来の細菌について得た、加水分解されたニトロセフィンに特異的な電流の存在、ならびに培地Ｃ由来および随意に培地Ｃ’由来の細菌の特異的電流の不在により特徴付けられる。値ｉＡは、値ｉＢおよび随意にｉＢ’よりも低くてもよいし高くてもよい。
ＥＳＢＬは、培地Ａ由来、培地Ｂ由来および随意に培地Ｂ’由来の細菌についてそれぞれ得た、加水分解されたニトロセフィンに特異的な高い強度のアノード電流、ならびに培地Ｃ由来および随意に培地Ｃ’由来の細菌のこの特異的な電流の不在により特徴付けられる。値ｉＢおよび随意にｉＢ’は、値ｉＡに近い。
誘導型セファロスポリナーゼは、培地Ａ、Ｂおよび随意にＢ’、Ｃおよび随意にＣ’由来の細菌について得た、ｉＡ＜ｉＢ＜ｉＣおよび随意にｉＡ＜ｉＢ’＜ｉＣ’である、加水分解されたニトロセフィンに特異的なアノード電流、ならびに、培地Ｄに由来の細菌のこの特異的な電流の不在により特徴付けられる。
過剰産生セファロスポリナーゼは、培地Ａに由来する細菌について得た加水分解されたニトロセフィンに特異的な高い強度のアノード電流、ｉＢ＞ｉＣおよび随意にｉＢ’＞ｉＣ’である、培地Ｂおよび培地Ｃ、随意に培地Ｂ’および培地Ｃ’にそれぞれ由来する細菌のこの特異的な電流の存在、ならびに培地Ｄ由来の細菌のこの特異的な電流の不在により特徴付けられる。
カルバペネマーゼは、培地Ａ、Ｂおよび随意にＢ’、Ｃおよび随意にＣ’、ＤおよびＥ由来の細菌について得た、加水分解されたニトロセフィンに特異的なアノード電流の存在により特徴付けられる。
さらに特定の実施形態では、本発明は、基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌の存在を判定するための方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
（ａ）以前に定義されるように、前述の試料の一部を培地Ａ、培地Ｂおよび培地Ｃ中で並行してインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）でのインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程、
（ｃ）基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌の存在を判定するために、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地にアンペロメトリック手段を適用する工程。
別のさらに特定の実施形態では、本発明は、基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌の存在を判定するための方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
（ａ）以前に定義されるように、前述の試料の一部を培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｂ’、培地Ｃおよび培地Ｃ’中で並行してインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）でのインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程、
（ｃ）基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌の存在を判定するために、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地にアンペロメトリック手段を適用する工程。
培地Ｂ、Ｂ’、ＣおよびＣ’の使用は、１つの第三世代セファロスポリンに対して感受性が高いが、別の第三世代セファロスポリンに耐性であるＥＳＢＬ産生細菌を区別することを可能にする。
特定の実施形態では、培地Ｂは、セフォタキシムを添加した培地Ａであり；培地Ｂ’は、セフタジジムを添加した培地Ａであり；培地Ｃは、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂであり；培地Ｃ’は、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂ’である。
別の特定の実施形態では、培地Ｂは、セフタジジムを添加した培地Ａであり；培地Ｂ’は、セフォタキシムを添加した培地Ａであり；培地Ｃは、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂであり；培地Ｃ’は、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂ’である。
本発明の文脈においてこれらの培地の使用は、セフォタキシムに感受性が高いがセフタジジムに耐性であるか、またはセフォタキシムに耐性があるがセフタジジムに感受性が高いかのいずれかのＥＳＢＬ産生細菌を識別することが可能になる。
有利には、βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定し、βラクタマーゼの種類を区別するための前記方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前述の試料の一部を、培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｂ’、培地Ｃおよび培地Ｃ’：
−培地Ａは、基本培地であり、
−培地Ｂおよび培地Ｂ’は、それぞれ、異なる第三世代セファロスポリンを添加した基本培地であり、
−培地Ｃおよび培地Ｃ’は、それぞれ、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地ＢおよびＢ’である：中で、
かつ、随意に、培地Ｄ、培地Ｅ：
−培地Ｄは、セファロスポリンおよびセファロスポリナーゼ阻害剤を添加した基本培地であり、かつ
−培地Ｅは、カルバペネムを添加した基本培地である：中で、
並行してインキュベートする工程
（ｂ）工程（ａ）のインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程；
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定し、βラクタマーゼの種類を区別するために、アンペロメトリック手段を、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地に適用する工程。
別のさらに特定の実施形態によれば、本発明の方法は、βラクタマーゼ産生細菌を、それらを含んでいる可能性のある試料中で判定および区別することを可能にし、前記方法は以下の工程を含む：
（ａ）以前に定義されるように、前述の試料の一部を、培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｃ、培地Ｄ、培地Ｅ、随意に培地Ｂ’および培地Ｃ’中で並行してインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）のインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照に、それぞれ、アンペロメトリック測定を適用する工程
（ｄ）培地Ａで培養された一部について得た加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値と、陰性対照について得た電流の強度の値とを比較することによって、前述の試料中のβラクタマーゼ産生細菌の存在を判定する工程、
（ｅ）培地Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、随意にＢ’およびＣ’で並行して培養した一部について得た前述のアノード電流の強度のそれぞれの値と、基準細菌株について得たそれぞれの値とを比較することによって、前記試料中で前述の細菌によって産生されたβラクタマーゼの種類を区別する工程。
「基準細菌株」は、その種類が既に同定されているβラクタマーゼを産生する細菌株を意味する。
さらにより特定の実施形態では、本発明の方法は、工程（ｅ）の後に、前記βラクタマーゼによって加水分解されたニトロセフィンに対応するアノード電流の強度の値と、同じ条件下で確立された検量線とを比較することによって、工程（ｅ）で区別したβラクタマーゼを産生する細菌を定量化することを可能にする、工程（ｆ）をさらに含む。
基質特異性拡張型βラクタマーゼによって加水分解されたニトロセフィンに対応するアノード電流の強度の値は、次式に従って計算される：ｉＢ−ｉＣ。
過剰産生セファロスポリナーゼによって加水分解されたニトロセフィンに対応するアノード電流の強度の値は、次式に従って計算される：ｉＢ−ｉＤ。
カルバペネマーゼによって加水分解されたニトロセフィンに対応するアノード電流の強度の値は、値ｉＥに一致する。
より有利には、本発明の方法は、基質および、βラクタマーゼのサブファミリーに特異的な阻害剤を含有するさらなる培地を使用して、βラクタマーゼサブファミリーを産生する細菌を区別することさえできる。
本発明の方法は、特に、カルバペネムおよびカルバペネマーゼのサブファミリーに特異的な阻害剤を含有するさらなる培地を使用して、カルバペネマーゼサブファミリーを産生する細菌を区別することができる。
区別は、ある特定の種類の阻害剤に対するカルバペネマーゼサブファミリーの特異的な感受性に基づく。例えば、メタロβラクタマーゼは、ＡｍｂｌｅｒによればファミリーＢに属するカルバペネマーゼのサブファミリーであり、ＥＤＴＡまたはメルカプト酢酸に対して感受性が高いが、Ａｍｂｌｅｒ分類によればファミリーＡのカルバペネマーゼは、クラブラン酸およびボロン酸に対して感受性が高い。
本発明によれば、カルバペネマーゼ阻害剤は、ＥＤＴＡ、メルカプト酢酸、ボロン酸、またはクラブラン酸から選択される。
別の有利な実施形態では、本発明の方法は、それらを含んでいる可能性のある試料において、βラクタマーゼの種類を区別し、随意に、前述の細菌によって産生されるカルバペネマーゼのサブファミリーを特定することを可能にし、前記方法は以下の工程を含む：
（ａ）前述の試料の一部を、
−以前に定義されるように、培地Ａ、培地Ｂおよび培地Ｃ中で、かつ
−随意に、培地Ｂ’、培地Ｃ’、培地Ｄ、培地Ｅ、および培地Ｆ中で、並行してインキュベートする工程、培地Ｂ’、Ｃ’、Ｄ、Ｅは以前に定義される通りであり、培地Ｆは、カルバペネムおよびカルバペネマーゼのサブファミリーに特異的な阻害剤を添加した基本培地である；
（ｂ）工程（ａ）の終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程；
（ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定し、βラクタマーゼの種類を区別するために、電気化学的分析手段を、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地に適用する工程。
培地Ｆは、カルバペネマーゼのサブファミリーに特異的な前述の阻害剤に対して感受性が高いカルバペネマーゼの種類を産生する細菌の増殖を阻害することを可能にする：ＥＤＴＡおよびメルカプト酢酸は、ファミリーＢの特異的阻害剤であり、一方、ボロン酸およびクラブラン酸は、ファミリーＡの特異的阻害剤である。
特に有利な実施形態では、βラクタマーゼの種類を区別し、随意に、前述の細菌によって産生されるカルバペネマーゼのサブファミリーを規定するための本発明の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）前述の試料の一部を、以前に定義されるような培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｃ、培地Ｄ、培地Ｅ、および培地Ｆ中で、かつ、随意に、以前に定義されるような培地Ｂ’および培地Ｃ’中で、並行してインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）のインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照に、それぞれ、アンペロメトリック測定を適用する工程
（ｄ）培地Ａで培養された前記一部について得た加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値と、陰性対照について得た電流の強度の値とを比較することによって、前述の試料中のβラクタマーゼ産生細菌の存在を判定する工程、
（ｅ）培地Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ、随意にＢ’およびＣ’で並行して培養した前記一部について得た前述のアノード電流の強度のそれぞれの値と、基準細菌株について得たそれぞれの値とを比較することによって、前記試料中で前述の細菌によって産生されたβラクタマーゼの種類を区別する工程。
本発明の方法は、βラクタム抗生物質のファミリーの新規な抗生物質の開発において、特に異なるβラクタマーゼに関して分子の安定性を調査するために、使用されることができる。
本発明は、以下に記載される図および実施例によってさらに詳細に説明される。
図１：１０分間のインキュベーションの後の、ＥＳＢＬの非存在下（点線）および存在下（実線）でのＰＢＳ中のニトロセフィンの５００μＭ溶液について得た、サイクリックボルタモグラム（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）を示す図である。
図２：ＥＳＢＬの検量線（ｌｏｇ−ｌｏｇ）を示す図である。その量は、本発明によるサイクリックボルタンメトリーの方法によって（Ａ、□）、そして分光光度測定法によって（Ｂ、Ｏ）求められる。分析的応答は、ＰＢＳ中で調製されたニトロセフィンの５００μＭ溶液でＥＳＢＬを１０分間インキュベートした後に記録される。反応混合物がＰＢＳで５倍に希釈された後、分光光度測定が実行される。値Ｒは、電流の応答に、または光学濃度にそれぞれ対応し、ＥＳＢＬの非存在下で得た値（ｉ０＝５０±５ｎＡ；ＯＤ０＝０．０９７±０．００８）で正規化されている。標準偏差は、２つの測定の標準誤差を表す。
図３：遠心分離（１ｍＬ；７０００ｇ；１０分）およびＰＢＳ中のニトロセフィンの５００μＭ溶液５０μＬでの１０分間のペレットのインキュベーションの後の、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを含有する培地中で３７℃で４．５時間培養された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＳＢＬ＋（Ａ）およびＥＳＢＬ−（Ｂ）についてスクリーン印刷されたセンサ上に記録されたボルタンメトリー曲線（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）を示す図である。
図４：４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムだけを含有する（Ａ）かまたは１０μｇ．ｍＬ−１のクラブラン酸カリウムを添加した培地で培養され、その後、ＰＢＳ中のニトロセフィンの５００μＭ溶液中５０μＬで１０分間のペレットのインキュベーションの工程の前に遠心分離された（１ｍＬ；７０００ｇ；１０分）、大腸菌株ＥＳＢＬ＋についてスクリーン印刷されたセンサに記録されたサイクリックボルタモグラム（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）を示す図である。
図５：４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを添加したＬＢ培地中での３７℃で３．５時間のインキュベーション後のＥＳＢＬ＋株の検量線を示す図である。細菌培養液の段階希釈後、１０ｍＬ量を二度繰り返して濾過する。濾過の後に回収された細菌は、ＰＢＳ中のニトロセフィンの５００μＭ溶液８０μＬで１０分間インキュベートされる。ｘ軸は、濾過の後に回収した細菌の数と一致する。エラーバーは、２回の実験の標準偏差を表す。白色の四角形（□）は、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムと１０μｇ．ｍＬ−１のクラブラン酸で培養したＥＳＢＬ＋株からなる陰性対照を表す。白色の円（○）は、加水分解されていないニトロセフィン由来のシグナルに一致する。
図６：原廃水（■）の３つの試料および以前にオートクレーブ処理した水（□）の３つの試料で実行した、ＥＳＢＬを産生する大腸菌株の検量線を示す図である。値ｉ（ｎＡ）は、陰性対照の測定値をそれから引いた細菌数について記録された、加水分解されたニトロセフィンの酸化ピークの電流に一致する。
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ：異なる種類のβラクタマーゼについて記録され、医学的試料（血液培養物、分離株）においてβラクタマーゼを区別するために使用される、加水分解されたニトロセフィンの酸化電流（μＡ）のプロフィールを示す図である。
図８：５０μＬのＨＭＲＺ−８６（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）での３０分間のインキュベーションの後の、βラクタマーゼを産生しない株（Ｋ１２）、誘導型セファロスポリナーゼを産生する株、ペニシリナーゼを産生する株、ＥＳＢＬを産生する株、過剰産生セファロスポリナーゼを産生する株、カルバペネマーゼを産生する株をそれぞれ含有する、６つの液体培養物（ｖ＝５０μＬ）について記録されたサイクリックボルタモグラム（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）を示す図である。
図９：オートクレーブ処理廃水の試料中において、記号■および●によってそれぞれ表される、ＥＳＢＬ（ＣＴＸ−Ｍ１５型）を産生する２つの大腸菌株で実行した較正の曲線を示す図である。値ｉ（ｎＡ）は、平均値２３５±１５ｎＡ（△）の陰性対照の測定値をそれから引いた、ＨＭＲＺ−８６の酸化のピーク電流に一致する。
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ：各々の図は、ＥＳＢＬを産生する株、過剰産生セファロスポリナーゼを産生する株およびカルバペネマーゼを産生する株とともにそれぞれ３７℃で３０分間インキュベートしたＣａｒｂａ−Ｓ（３０μＬ）の３つの溶液について記録された、サイクリックボルタモグラム（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）を示す図である。図１０Ａ：カルバペネマーゼＯＸＡ−４８を産生する株。図１０Ｂ：ＯＸＡ−４８型のカルバペネマーゼ＋ＣＴＸ−Ｍを産生する株。図１０Ｃ：ＮＤＭ−１型のカルバペネマーゼを産生する株。図１０Ｄ：ＫＰＣ−２型のカルバペネマーゼを産生する株。
実施例Ｉ：ニトロセフィンを基質として使用する、βラクタマーゼ産生細菌の同定
１．材料および方法
１．１．試薬および溶液
リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１００ｍＭ；ｐＨ＝７．０）および全ての水溶液は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ １８−ＭΩ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で調製する。
ルリアブロス（ＬＢ、１０ｇ．Ｌ−１のバクトトリプトン、５ｇ．Ｌ−１のバクト酵母抽出物、５ｇ．Ｌ−１のＮａＣｌ）を含む培地を、実験室で調製し、１２０℃のオートクレーブ処理によって滅菌する。
ニトロセフィンは、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（参照番号４８４４００）より購入する。ニトロセフィンの１０−２Ｍの保存液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製した後、５０μＬアリコートの形態で−２０℃で貯蔵される。
セフォタキシムのナトリウム塩（参照番号Ｃ７０３９−１００ｍｇ）およびクラブラン酸カリウム（参照番号３３４５４−１００ｍｇ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより供給される。１ｍｇ．ｍＬ−１の保存液は、ＰＢＳ中で毎日調製される。
ＥＳＢＬは、ディジョン大学病院センター（Ｄｉｊｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｎｔｒｅ）の細菌学研究所（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において単離された大腸菌株から抽出された（１４８５；ＣＴＸ−Ｍ−１型）。
大腸菌株Ｋ１２およびＥＳＢＬ産生大腸菌株（ＭＩＡＥ６６９０）は、フランス国立農学研究所（ＩＮＲＡ）のディジョンセンターの株のコレクションに由来する。これらの株の試料は、５０％の細菌懸濁液および５０％のグリセロール（ｖ／ｖ）を含有する５００μＬアリコートの形態で、−８０℃で貯蔵される。
１．２．計測器および電極
１．２．１．概念実証用
電気化学的測定は、ＧＰＥＳソフトウェア（バージョン４．９）によって制御されるＰＧＳＴＡＴ１２ Ａｕｔｏｌａｂポテンシオスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ）を用いて実行される。
センサは、カーボンインク（Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ（登録商標）ＰＦ４０７Ａ、Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ）を含む手動スクリーン印刷機（Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｉｍｐｒｉｍｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ、Ｂａｇｎｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）によって調製される。一連の６つのセンサは、スクレイパーを使用してインクをスクリーン枠（１２０ワイヤ／ｃｍ）に通過させることによって、軟質ポリエステルフィルムの上に印刷される。乾燥工程（６５℃で１時間）の後、センサは周囲温度で貯蔵される。
各々のセンサは、作用電極およびカウンター電極からなる。センサの作用領域（７．０７ｍｍ２）は、接着剤のリングで区切られ、そのリングは電気化学的セルを定義することもできる。アンペロメトリック測定を実行するために、ポテンシオスタットに接続されたコネクタ（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ）にセンサを挿入した後、分析する溶液の２０μＬの滴をセンサの表面に堆積させる。基準電極を構成する、塩化銀沈殿物（Ａｇ／ＡｇＣｌ）で被覆した銀線を浸漬させた後、サイクリックボルタンメトリー（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）によって周囲温度で測定を実行する。
１．２．２ 血液試料中のβラクタマーゼの区別およびＥＳＢＬ産生株の定量化用：
ボルタンメトリー測定（ｖ＝５０ｍＶ．ｓ−１）は、コンピュータのＵＳＢポートからの電力供給を備えたＰＳＴＡＴ ｍｉｎｉ ９１０携帯型ポテンシオスタット（Ｍｅｔｈｒｏｈｍ）に事前に接続され、ＰＳＴＡＴソフトウェア（バージョン１．０）によって制御されるＤｒｏｐｓｅｎｓ（ＤＲＰ−１１０）によって供給されるスクリーン印刷された炭素センサに溶液の３０μＬの滴を堆積させることによって実行される。
１．３．βラクタマーゼ活性のアンペロメトリック検出
５μＬのＥＳＢＬ溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１００ｍＭ；ｐＨ＝７．０）中０．５ｍＭニトロセフィン溶液４５μＬを含有するポリプロピレンチューブに入れる。暗所で周囲温度で１０分間のインキュベーションステップの後、２０μＬの混合物を取り、スクリーン印刷された炭素センサの表面に移す。次に、基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を予め堆積させた２０μＬの溶液に浸漬させ、サイクリックボルタンメトリー測定を次の通り進めることによって実行する：５０ｍＶ．ｓ−１の速度で−０．４Ｖ〜１．２Ｖの間の電位走査。
約＋０．３Ｖで現れる酸化ピークは、ニトロセフィンのβラクタム環の加水分解によって生じ、試料中のβラクタマーゼを同定するための分析的応答として選択されることができる。
１．４．ニトロセフィンを用いるＥＳＢＬ活性のアンペロメトリックおよび比色分析測定
４５μＬのニトロセフィン溶液（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）を、予めＰＢＳに希釈した５μＬのＥＳＢＬ溶液を含有するポリプロピレンチューブに入れる。反応混合物を暗所で周囲温度で１０分間インキュベートする。次に、酵素反応の生成物をアンペロメトリーおよび分光光度測定によって検出する。上に述べたようなボルタンメトリー測定を実行するために、２０μＬの混合物をスクリーン印刷された炭素センサの表面に移すことによって電気化学的測定を実行する。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋０．３Ｖで測定された酸化ピーク電流の強度は分析的応答として選択される。分光光度的な検出には、溶液をＰＢＳ中（５倍に）希釈し、その後、使い捨てのキュベット（Ｒａｔｉｏｌａｂ（登録商標）Ｑ−ＶＥＴＴＥＳセミミクロ、第２７１２１２０番）にピペットで移した後、ＤＵ（登録商標）８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でλ＝５２０ｎｍでの吸光度測定を実行する。
１．５．βラクタマーゼ産生株の検出
βラクタマーゼを産生しない大腸菌株Ｋ１２（ＥＳＢＬ−）１０μＬおよびＥＳＢＬを産生する大腸菌株ＭＩＡＥ６６９０（ＥＳＢＬ＋）１０μＬを、セフォタキシム（４μｇ．ｍＬ−１）を添加したＬＢ培地１０ｍＬを含有するチューブ中で、３７℃で４．５時間、並行して培養する。次に、１ｍＬの各々の細菌懸濁液をポリプロピレンチューブに移し、７０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、５０μＬ量のニトロセフィン溶液（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）をチューブに入れ、細菌ペレットとともに暗所で周囲温度で１０分間インキュベートする。次に、液体を吸引し、スクリーン印刷されたセンサの上に移して、１．３．項に述べたようなボルタンメトリー測定を実行する。
１．６．血液培養物における第三世代セファロスポリンに耐性の菌株の同定
ディジョン大学地域病院センターの細菌学研究所（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｉｊｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｎｔｒｅ）によって供給される血液培養物は、主に好気性微生物の試験に適したバクテック（商標）ボトルで、または主に嫌気性細菌を増殖させることを特に目的とするＢａｃｔｅｃ（商標）ボトルで培養された血液試料である。
１０μＬ量の試料を、ＬＢ培地（培地Ａ）１０ｍＬを含有するチューブ、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを添加したＬＢ培地（培地Ｂ）１０ｍＬを含有するチューブならびに４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムおよび１００μｇ．ｍＬ−１のクラブラン酸を添加したＬＢ培地（培地Ｃ）１０ｍＬを含有するチューブに並行して導入する。撹拌を伴う３７℃で２時間のインキュベーション工程の後、各々のチューブの内容物５ｍＬをシリンジによって取り出し、その後、０．４５μｍの孔径をもつ膜（ＨＶＬＰ、１３ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を装備した手動濾過装置（Ｓｗｉｎｎｅｘ（登録商標）、１３ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過する。次に、各々のフィルタをポリスチレン製マイクロプレート（２４ウェルプレート、Ｃｅｌｌｓｔａｒ（登録商標）、６６２１６０）のウェルの底部に設置し、その中に８０μＬのニトロセフィン溶液（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）を次に導入し、暗所で周囲温度で１０分間インキュベートさせる。
４０μＬの各々の混合物を取り、コンピュータのＵＳＢポートからの電力供給を備えたＰＳＴＡＴ ｍｉｎｉ ９１０携帯型ポテンシオスタット（Ｍｅｔｈｒｏｈｍ）に事前に接続され、ＰＳＴＡＴソフトウェア（バージョン１．０）によって制御されるスクリーン印刷された炭素センサ（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ、ＤＲＰ−１１０）の表面に移す。リニアボルタンメトリー測定は、５０ｍＶ．ｓ−１の速度で−０．１Ｖ〜１．２Ｖの間のリニア電位走査によって実行される。
約＋０．３Ｖで現れる、ニトロセフィンのβラクタム環の加水分解に関連するピーク電流（ｉ）は、分析的応答として選択される。各々の試料インキュベーション条件（培地Ａ、Ｂ、Ｃ）について測定した電流ｉの値を比較することによって、その菌株がセフォタキシム加水分解酵素を産生することができるかどうかについて結論を出すことが可能である。
１．７．廃水における基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生株の定量化
１．７．１．精製作業から得られる水中のＥＳＢＬ産生大腸菌の検量線の作成
１０μＬのＥＳＢＬ産生大腸菌株ＭＩＡＥ６６９０を、セフォタキシム（４μｇ．ｍＬ−１）を添加したＬＢ培地１０ｍＬを含有するチューブ中で４２℃で撹拌しながら一晩培養する。このようにして得られた培養物中の細菌の濃度（Ｓ０）は、トリプトン（１０ｇ．Ｌ−１）およびＮａＣｌ（５ｇ．Ｌ−１）を含有するＴＳ培地で段階希釈を行い、その後、寒天培地（３５．６ｇ．Ｌ−１トリプトン Ｂｉｌｅ Ｘ−グルコース、４ｍｇ．Ｌ−１セフォタキシム）を含有するディッシュの上に溶液を広げることによって求められる。
培養物Ｓ０を、事前にオートクレーブ処理された、精製作業から得られる水（生水または処理水）の試料に系列希釈し（希釈係数は１０〜１０８の間からなる）、１ｍＬの溶液量をポリプロピレンチューブに準備する。
次に、これらの以前に希釈した溶液（希釈係数は１０４〜１０８の間からなる）５００μＬを、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを添加したＬＢ培地２５ｍＬを含有するチューブに別々に導入し、４２℃で撹拌しながら４時間インキュベートする。５００μＬ量の、細菌株の希釈液を作製するために使用された、精製作業から得られる水（生水または処理水）の以前にオートクレーブ処理された試料を同じ条件下でインキュベートする（陰性対照）。次に、１０ｍＬの量を各々のチューブからシリンジで二度繰り返して取り、次に０．４５μｍの孔径をもつ膜（ＨＶＬＰ、１３ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を装備した手動濾過装置（Ｓｗｉｎｎｅｘ（登録商標）、１３ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて別々に濾過する。次に、各々のフィルタをポリスチレン製マイクロプレート（２４ウェルプレート、Ｃｅｌｌｓｔａｒ（登録商標）、参照番号：６６２１６０）のウェルの底部に設置し、その中に８０μＬのニトロセフィン溶液（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）を次に導入し、暗所で周囲温度で１５分間インキュベートさせる。
４０μＬの、各々のウェルの内容物を取り、ＰＳＴＡＴ ｍｉｎｉ ９１０携帯型ポテンシオスタット（Ｍｅｔｈｒｏｈｍ）に事前に接続された、スクリーン印刷された炭素センサ（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ、ＤＲＰ−１１０）の表面に移して、１．６．項に述べたようにリニアボルタンメトリー測定を実行する。
１．７．２．精製作業から得られる水の試料におけるＥＳＢＬ産生株の検出
廃水量（１〜１０ｍＬ）および処理水量（２０〜１００ｍＬ）を、ステンレス鋼製濾過ランプ（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｍｐ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｍｂｉｓａｒｔ）を使用して０．４５μｍ孔径をもつ膜（ＨＡＷＰ、４７ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で二度繰り返して濾過する。各々の試料には、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを添加したＬＢ培地（培地Ｂ）２５ｍＬを含有するチューブに膜の１つを入れ、一方、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムと１０μｇ．ｍＬ−１のクラブラン酸を添加したＬＢ培地（培地Ｃ）２５ｍＬを含有するチューブにもう１つを浸漬させる。全てのチューブを４２℃で撹拌しながら４時間インキュベートした後、それらの内容物を濾過し、１．７．１．に示されるようにニトロセフィンの存在下で分析する。
所与試料について、培地ＢおよびＣでのインキュベーションのために約０．３Ｖで測定されたピーク電流の強度をそれぞれｉＢおよびｉＣと呼ぶ。ＥＳＢＬ産生株の量は、電流ｉ＝ｉＢ−ｉＣの値から、検量線（１．７．１．）を使用して計算される。
２．結果
２．１．加水分解されたニトロセフィンの電気化学特性評価
ニトロセフィンを豊富な量の基質特異性拡張型βラクタマーゼによって加水分解させた。ニトロセフィン（Ｓ）およびその加水分解形態（Ｐ）のボルタンメトリー挙動を、スクリーン印刷された炭素系電極を使用するサイクリックボルタンメトリーによって調査した。ニトロセフィンおよび加水分解されたニトロセフィンの両方は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋１．０Ｖで不可逆性のアノード酸化のピーク（ａ１）を有する。このピークは、ジヒドロチアジン基のチオール基の酸化またはセファロスポリン誘導体に特異的なその他の官能基に起因しうる。ニトロセフィンと対照的に、加水分解されたニトロセフィン（Ｐ）は、十分に確立され、約＋０．３Ｖの低いアノード電位に観察される不可逆性のアノード酸化ピーク（ａ２）を生成する（図１）。ａ２ピークの存在は、加水分解されたニトロセフィンの存在を示し、従って基質特異性拡張型βラクタマーゼの活性を示すための分析的応答として選択されることができる。
２．２．ＥＳＢＬの活性の測定
ＥＳＢＬの活性を、分光光度測定およびニトロセフィンを使用するボルタンメトリー測定によって並行して測定した。各々の一連の実験は、ＥＳＢＬの濃度を変えることによって実行され、本発明の電気化学的方法および分光光度測定法によって得た検量線（ｌｏｇ−ｌｏｇ）が図２に示される。各々の測定値は、ＥＳＢＬの非存在下で得られたシグナルに対して正規化される。ボルタンメトリー方法によって得た検量線は、この方法が分光光度測定法に近い感度でＥＳＢＬの活性の定量的検出を可能にすることを示す。さらに、本発明のボルタンメトリー方法は、より広い領域の直線性を提供する。分光光度測定の再現性とボルタンメトリー測定の再現性は類似している。
２．３．サイクリックボルタンメトリーによる測定による大腸菌のＥＳＢＬ産生株の検出
ＥＳＢＬ産生細菌を検出するためのボルタンメトリー方法の能力を評価するために、十分に特徴づけられた遺伝子型をもつ大腸菌の２つの株を選択した。１つはＥＳＢＬの産生株（ＥＳＢＬ＋）であり、もう１つはＥＳＢＬを産生しない株（ＥＳＢＬ−）である。最初に、４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを含有するＬＢ培地で２つの株を培養する。遠心分離工程の後、これらの２つの株のそれぞれの細菌ペレットを、基質としてニトロセフィンとともにインキュベートする。図３は、それぞれ、ＥＳＢＬ＋株（曲線Ａ）およびＥＳＢＬ−株（曲線Ｂ）について得たボルタンメトリー応答を示す。曲線Ａは、ＥＳＢＬ＋株によるニトロセフィンのβラクタム環の触媒加水分解に関連する、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋０．４Ｖのアノードピークを有するが、ＥＳＢＬ−株についてピークは記録されない。この結果は、それぞれ、ＥＳＢＬ＋株およびＥＳＢＬ−株について得た、０．９３４および０．００２の光学濃度の値とかなり一致する。セフォタキシムを添加した培地および抗生物質を含まない培地も、ボルタンメトリー測定に付した。特異的シグナルはこれらの２つの培地について電位範囲内［Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．１〜０．６Ｖ］で観察されず、それによりＬＢ培地もセフォタキシムもボルタンメトリー検出に干渉しないことが確認される。
２．４．ＥＳＢＬ産生細菌の区別
過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼもセフォタキシムを加水分解することができるので、これらの酵素を産生する細菌もセフォタキシムの存在下で陽性の応答をすることができる。基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する細菌と過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼを産生する細菌とを区別するために、一方がセフォタキシムを抗生物質として含有し、他方がＥＳＢＬの阻害剤としてクラブラン酸カリウムをさらに含有する、２つの培地で同時に細菌を培養した。細菌を回収した後、細菌ペレットを基質としてニトロセフィンとともにインキュベートした。サイクリックボルタンメトリーによって記録されたボルタンメトリー曲線を図４に表す。ニトロセフィンの加水分解によって生じるアノードピークは、セフォタキシムとともに培養したＥＳＢＬ＋株について観察されが（曲線Ａ）、クラブラン酸カリウムの存在下で培養した同じ株にはシグナルは記録されなかった（曲線Ｂ）。この結果により、ＥＳＢＬ産生細菌の存在が確認される。
大腸菌数は、それぞれ、阻害剤を添加した培養について８０ＣＦＵ．ｍＬ−１であり、阻害剤を含まない培養について１．８×１０８ＣＦＵ．ｍＬ−１であるので、この結果は、選択培地での大腸菌数について得た値と一致する。
２．５．βラクタマーゼ産生細菌の定量化
ＥＳＢＬ産生細菌の定量のための本発明の方法の能力を、セフォタキシムとともにインキュベートした、５×１０４〜５×１０７ＣＦＵ．ｍＬ−１のＥＳＢＬ＋大腸菌の培養物の段階希釈によって評価した。図５の検量線は、広い領域の線形性を有し、想定されるＥＳＢＬ産生細菌株の定量を可能にする。高濃度のＥＳＢＬ産生細菌に観察される平坦域は、最初に存在する全てのニトロセフィンが加水分解されていることを示唆する。
２．６．原廃水またはオートクレーブ処理した廃水におけるβラクタマーゼ産生細菌の定量化
ＥＳＢＬ産生大腸菌の検量線を、原廃水の試料および事前にオートクレーブ処理した水の試料について１．７．１．項に記載される方法によって確立する。これらの検量線は、原水中および本発明の方法によって処理された水中のＥＳＢＬ産生細菌をそれぞれ定量化するために使用される。表１および２に示されるように、本発明の方法によって得られる結果は、細菌を計数することによって得られる結果と一致する。
表１：コート・ドール（Ｃｏｔｅ ｄ’Ｏｒ）での５つの精製作業からの原水（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）中のＥＳＢＬ産生株（ＣＦＵ．Ｌ−１）の判定
表２：コート・ドール（Ｃｏｔｅ ｄ’Ｏｒ）での５つの精製作業からの処理水（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）中のＥＳＢＬ産生株（ＣＦＵ．Ｌ−１）の判定
２．７．βラクタマーゼの判定
臨床試料から得た、異なる種類のβラクタマーゼ（ペニシリナーゼ、ＣＴＸ−Ｍ型のＥＳＢＬ、誘導型セファロスポリナーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼ）を産生する５つの細菌株を、本発明の方法によって分析した。
各々の細菌株、ならびに陰性対照を、３つの異なる培地で（培地Ａ、ＢおよびＣ）それぞれインキュベートした：培地ＡはＬＢ培地であり、培地Ｂは４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを含有するＬＢ培地であり、培地Ｃは４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムと１００μｇ．ｍＬ−１のクラブラン酸を含有するＬＢ培地である。細菌懸濁液をＳｗｉｎｎｅｘ（登録商標）で濾過した後、細菌を回収した濾過膜を、５００μＭのニトロセフィン８０μＬとともに暗所で１０分間インキュベートした。
サイクリックボルタンメトリーによる測定は、炭素電極を使用して実施された。これらの３つの培地の加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流のピークを、それぞれｉＡ、ｉＢおよびｉＣと呼ぶ。
様々なβラクタマーゼを産生する株によって得られる結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。
図７Ａの結果は、βラクタマーゼを産生しない（陰性）株を含む試料の応答と一致する。
図７Ｂおよび７Ｃの結果は２つのペニシリナーゼと一致する。ペニシリナーゼの触媒活性は、培地ＡおよびＢに由来する細菌について得た加水分解されたニトロセフィンのアノード電流の存在および培地Ｃ由来の細菌についての特異的アノード電流の不在を特徴とする。
誘導型セファロスポリナーゼ（図７Ｄ）は、以下の判定基準と一致する、これらの３つの培地で得た加水分解されたニトロセフィンのアノード電流のピークを特徴とする：ｉＡ＜１、ｉＡ＜ｉＢ＜ｉＣ、およびｉＣ＞１。
ＣＴＸ−Ｍ型の基質特異性拡張型βラクタマーゼ（図７Ｅ）は、以下の判定基準と一致する、これらの３つの培地で得た加水分解されたニトロセフィンのアノード電流のピークを特徴とする：ｉＡ＞３、ｉＢ＞３、およびｉＣ＜０．２。
過剰産生セファロスポリナーゼ（図７Ｆ）は、以下の判定基準と一致する、これらの３つの培地で得た加水分解されたニトロセフィンのアノード電流のピークを特徴とする：ｉＡ＞３、ｉＡ＞ｉＢ＞ｉＣ、およびｉＣ＞１。
寒天拡散アンチバイオグラムおよび本発明のアンペロメトリック方法は、血液培養試料においてβラクタマーゼ産生細菌を区別するためにそれぞれ使用される。下の表３に示される結果から分かるように、本発明の方法とアンチバイオグラムとの重複の程度は１００％である。
表３：血液培養液においてβラクタマーゼ産生株を区別するために、アンチバイオグラム（ＡＴＢ）を得、本発明の電気化学的方法を実施した後に得られた結果の比較
寒天拡散アンチバイオグラムおよび本発明のアンペロメトリック方法は、様々な生体試料から得たβラクタマーゼ産生細菌をドリガルスキーラクトース寒天で分離した後に区別するためにも実施される。表４に提示される結果は、本発明の方法とアンチバイオグラムの重複の程度が１００％であることを示す。
表４：以前にドリガルスキー培地で分離したβラクタマーゼ産生株を区別するために、アンチバイオグラム（ＡＴＢ）を実行し、本発明の電気化学的方法を実施した後に得られる結果の比較
実施例ＩＩ：化合物ＨＭＲＺ−８６を基質として使用するＣ３Ｇ耐性細菌の同定
１．材料および方法：
１．１．試薬および溶液
化合物ＨＭＲＺ−８６は、関東化学（日本）によって合成され、供給された。１０−２Ｍの保存液はＤＭＳＯ中で調製され、５０μＬアリコートの形態で−２０℃で貯蔵される。
この実施例で使用した株は、下の表５に提示されるが、フランス国立農学研究所（ＩＮＲＡ）のディジョンセンターの凍結保存株のコレクションに由来する。
１．２．液体培養におけるＣ３Ｇ耐性株の同定
各々の凍結保存株は、定常期が得られるまで１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で培養される。
５０μＬ量の培養液を、ＰＢＳ中０．５ｍＭのＨＭＲＺ−８６の溶液５０μＬの存在下で３７℃で撹拌しながら３０分間インキュベートする。４０μＬの反応混合物を取り、コンピュータのＵＳＢポートからの電力供給を備えたＳＴＡＴ８０００Ｐ携帯型ポテンシオスタット（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ）に事前に接続され、ＤｒｏｐＶｉｅｗ８４００ソフトウェアによって制御される、スクリーン印刷された炭素センサ（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ、ＤＲＰ−１１０）の表面に移す。リニアボルタンメトリー測定は、５０ｍＶ．ｓ−１の速度で−０．１Ｖ〜１．２Ｖの間のリニア電位走査によって実行される。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．２〜＋０．５５Ｖの電位範囲に現れる、ＨＭＲＺ−８６のβラクタム環の加水分解に関連するピーク電流は、分析的応答として選択される。ピーク（ｉ）の強度が５００ｎＡを上回る値を有する場合、試料はＣ３Ｇを分解することのできる株を含む。
１．３．オートクレーブ処理した廃水試料における大腸菌のＥＳＢＬ産生株の検量線の作製
実施例Ｉの１．７．１．に記載されるプロトコールを、１つの培養条件（４μｇ．ｍＬ−１のセフォタキシムを添加したＬＢ）で実施した。フィルタを９０μＬのＨＭＲＺ−８６（ＰＢＳ中０．２５ｍＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートする。測定は、上述（１．２項）の通りリニアボルタンメトリーによって実行される。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．２〜＋０．５５Ｖの電位範囲に現れる、ＨＭＲＺ−８６のβラクタム環の加水分解に関連するピーク電流は、分析的応答として選択される。その強度（ｉ）は、試料に存在するＣ３Ｇ耐性株の量に比例する。
２．結果
２．１．ＨＭＲＺ−８６およびその加水分解形態の電気化学特性評価
ＨＭＲＺ−８６の溶液を、Ｃ３Ｇに対して耐性であるかまたは感受性の高い、すなわちＨＭＲＺ−８６分子をそれぞれ加水分解することができるかまたはできない、異なる細菌株とともにインキュベートした。
ＨＭＲＺ−８６およびその加水分解形態のボルタンメトリー応答を図８に示す。Ｃ３Ｇ感受性株（βラクタマーゼを産生せず、ペニシリナーゼまたは誘導型セファロスポリナーゼを産生する）とともにインキュベートしたＨＭＲＺ−８６について記録されたボルタモグラムは全て、ＨＭＲＺ−８６の加水分解形態の明確な酸化ピークのために消失する、Ａｇ／ＡｇＣｌに対しておよそ＋０．２と＋０．４Ｖの非常に低い強度の酸化の２つの波をもつ同じプロフィールを有する。より正確には、ＥＳＢＬおよびカルバペネマーゼを産生する株によるＨＭＲＺ−８６の加水分解は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋０．２５Ｖで非常に特異的な酸化ピークＰ１（図８）を有する生成物をもたらすが、過剰産生セファロスポリナーゼを産生する株によるＨＭＲＺ−８６の加水分解から生じる生成物は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋０．５Ｖで特異的に酸化されて、ピークＰ２（図８）を与える。従って、ピークＰ１またはＰ２の存在は、加水分解されたＨＭＲＺ−８６の存在を示し、Ｃ３Ｇ耐性株を検出するための分析的応答として選択されることができる。さらに、ピークＰ２は、過剰産生セファロスポリナーゼを産生する株の特異的同定を可能にする。
２．２．Ｃ３Ｇ耐性株の定量化：オートクレーブ処理した廃水におけるＥＳＢＬ産生株の検量線の例
基質ＨＭＲＺ−８６をもつＣ３Ｇ耐性細菌の定量のための本発明の方法の能力を、本発明の実施例に記載されるプロトコール１．３．に従って確立された検量線を用いることによって評価した。図９は、以前にオートクレーブ処理した廃水の試料に接種した大腸菌の２つのＥＳＢＬ産生株（ＣＴＸ−Ｍ１５型）について得た検量線を示す。濾過された１０〜１０００の間の細菌からなる直線性の領域によって、この方法は、良好な感受性でＣ３Ｇ耐性株の定量化を想定することを可能にする。
実施例ＩＩＩ：カルバペネム耐性細菌の定量化
１．材料および方法：
１．１．試薬
下文で「Ｃａｒｂａ−Ｓ」と呼ばれる基質およびその希釈液は、Ｂｉｏｒａｄによって販売されるβＣＡＲＢＡ（商標）試験キットの試薬Ｒ２およびＲ３にそれぞれ一致する。Ｃａｒｂａ−Ｓ溶液は、５５０μＬのＲ３をＲ２に添加することによって調製される。
この実施例で使用した株は、下の表６に提示されるが、フランス国立農学研究所（ＩＮＲＡ）のディジョンセンターの凍結保存株のコレクションに由来する。
１．２．単離されたコロニーから出発するカルバペネム耐性株の同定
各々の凍結保存株を、ミュラー・ヒントン寒天で３７℃で培養する。
１μＬループを、３０μＬのＣａｒｂａ−Ｓ溶液の存在下３７℃で撹拌しながら３０分間インキュベートする。４０μＬの反応混合物を取り、コンピュータのＵＳＢポートからの電力供給を備えたＳＴＡＴ８０００Ｐ携帯型ポテンシオスタット（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ）に事前に接続され、ＤｒｏｐＶｉｅｗ８４００ソフトウェアによって制御される、スクリーン印刷された炭素センサ（Ｄｒｏｐｓｅｎｓ、ＤＲＰ−１１０）の表面に移す。リニアボルタンメトリー測定は、５０ｍＶ．ｓ−１の速度で−０．１Ｖ〜１．２Ｖの間のリニア電位走査によって実行される。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約＋０．３〜０．８Ｖで現れる、Ｃａｒｂａ−Ｓの加水分解に関連するピーク電流（ｉ）は、分析的応答として選択される。２００ｎＡを上回る強度をもつピーク（ｉ）の存在は、カルバペネマーゼ産生株が存在していると結論付けることを可能にする。
２．２．結果：
２．１．単離されたコロニーから出発する基質Ｃａｒｂａ−Ｓおよびその加水分解形態の電気化学特性評価
Ｃａｒｂａ−Ｓの溶液を、カルバペネムに感受性が高いかまたは耐性である、すなわち、Ｃａｒｂａ−Ｓ分子を分解することができるかまたはできない、異なる細菌株とともにそれぞれインキュベートし、スクリーン印刷されたセンサを用いるリニアボルタンメトリーによって分析した。
カルバペネムに対して感受性の高い（ＥＳＢＬおよび過剰産生セファロスポリナーゼの産生株）コロニーについて記録されたボルタンメトリー応答、ならびにＯＸＡ４８型、ＯＸＡ４８＋ＣＴＸＭ型、ＫＰＣ−２型およびＮＤＭ−１型のカルバペネマーゼ産生コロニーがそれぞれ示される（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄ）。ボルタモグラムの比較は、カルバペネマーゼ産生株について記録された曲線だけが、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．２〜＋０．８Ｖの電位範囲に明確なピークをもつ酸化の波を１〜３個有することを示す。従って、ボルタンメトリー測定を使用して、Ｃａｒｂａ−Ｓをその分解生成物と区別し、それによりカルバペネマーゼ産生株の存在を検出することが可能である。
実施例ＩＶ：比較結果
比較検定１
本発明の電気化学的方法を、様々なβラクタマーゼを産生する４０の株のパネルの分析に適用し、その原理がＣ３Ｇ耐性株の定性的な比色検出に基づくβ−Ｌａｃｔａ（商標）Ｔｅｓｔ（Ｂｉｏｒａｄ）と比較した。表７に示される結果は、両方の方法について基質ＨＭＲＺ−８６での細菌のインキュベーションの３０分後に得た。供給業者によって提案される結果の解釈に基づくと、β−Ｌａｃｔａ（商標）Ｔｅｓｔは、Ｃ３Ｇ耐性株の同定を６８％の一致レベルで可能にするが、９５％の一致レベルが本発明の電気化学的方法によって得られた。比色分析と対照的に、アンペロメトリーは電流の数値を測定する利点を提供し、それは、一方で主観的な結果の解釈（中間色）を避け、他方で結果のトレーサビリティを可能にする。
表７：液体培養について本発明の電気化学的方法によって得られる結果と、供給業者の推奨に従って単離されたコロニーで実施されたβ−Ｌａｃｔａ（商標）Ｔｅｓｔによって得られる結果との比較。両方の例では、読取値は、基質ＨＭＲＺ−８６との３０分間のインキュベーションの後に取られた。
比較検定２
本発明の電気化学的方法を、ＥＳＢＬ、過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼを産生する２８の株のパネルの分析に適用し、その原理がカルバペネム耐性株の定性的な比色検出に基づくβ−Ｃａｒｂａ（商標）Ｔｅｓｔ（Ｂｉｏｒａｄ）と比較した。表８に示される結果は、両方の方法についてＣａｒｂａ−Ｓ基質での単離されたコロニーの１μＬループのインキュベーションの３０分後に得た。供給業者により提案される結果の解釈によれば、β−Ｃａｒｂａ（商標）Ｔｅｓｔは、カルバペネム耐性株の同定を４３％の一致レベルで可能にするが、１００％の一致レベルが本発明の電気化学的方法によって得られた。この場合もやはり、電流の数値測定のために、本発明の電気化学的方法は、結果の主観的な解釈（中間色）を避け、比色分析によるよりもはるかに迅速に信頼できる結果を得ることを可能にする。
表８：単離されたコロニーの分析について、本発明の電気化学的方法によって得られる結果と、供給業者の推奨に従って適用したβ−Ｃａｒｂａ（商標）Ｔｅｓｔによって得られる結果の比較。両方の例では、読取値は、基質Ｃａｒｂａ−Ｓとの３０分間のインキュベーションの後に取られた。

Claims (14)

  1. βラクタマーゼを産生する細菌の、前記細菌を含んでいる可能性のある試料中での存在のインビトロ判定のための方法であって、前記方法が、以下の工程：
    （ａ）電気化学的性質を有する前記βラクタマーゼの基質を含有する培地中で前記試料をインキュベートする工程であって、前記基質が、ニトロセフィン、又は化合物ＨＭＲＺ−８６（（６Ｒ，７Ｒ）−トリフルオロアセテート７−［［２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−［（１−カルボキシ−１−メチルエトキシ）イミノ］アセチル］アミノ］−１−アザ−３−［２−（２，４−ジニトロフェニル）エテニル］−８−オキソ−５−チアビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸のＥ異性体）である、前記工程と、
    （ｂ）βラクタマーゼを産生する前記細菌の存在を判定するための電気化学的分析手段を適用する工程と、
    （ｃ）加水分解された前記基質の酸化に対応するアノード電流を検出することによって、前記βラクタマーゼを産生する細菌の存在を判定する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記電気化学的分析手段が、電位差測定、インピーダンス測定、電量測定またはアンペロメトリック測定であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、以下の工程：
    （ａ）前記細菌を含んでいる可能性のある試料を、電気化学的性質を有する前記βラクタマーゼの基質を含有する培地中でインキュベートする工程
    であって、前記基質がニトロセフィン又は前記化合物ＨＭＲＺ−８６である、前記工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程と
    （ｃ）前記βラクタマーゼ産生細菌の存在を、工程（ａ）の終わりに得た前述の培地について測定された、前記加水分解された基質の酸化に対応するアノード電流の強度の値と、前記陰性対照について測定された、アノード電流の強度の値とを比較することによって判定する工程と
    を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記細菌を含んでいる可能性のある試料において前記βラクタマーゼ産生細菌を判定および定量化するために、前記方法が、工程（ｃ）の後に、工程（ａ）の終わりに得た前記培地について測定されたアノード電流の強度の値と、同じ条件下で確立された検量線とを比較することからなる工程（ｄ）をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前述の細菌を含んでいる可能性のある試料においてその細菌によって産生される、ペニシリナーゼ、基質特異性拡張型βラクタマーゼ、誘導型セファロスポリナーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼから選択されるβラクタマーゼの種類を区別することをさらに可能にする請求項１又は２に記載の方法であって、前記方法が以下の工程：
    （ａ）前述の試料の一部を、培地Ａ、培地Ｂおよび培地Ｃ：
    −培地Ａは、基本培地であり、
    −培地Ｂは、第三世代セファロスポリンを添加した基本培地であり、かつ
    −培地Ｃは、セファロスポリンおよびペニシリナーゼ阻害剤を添加した基本培地である：中で、かつ
    随意に、培地Ｂ’、培地Ｃ’、培地Ｄ、培地Ｅ：
    −培地Ｂ’は、培地Ｂ中に存在するものとは異なる第三世代セファロスポリンを添加した基本培地であり；
    −培地Ｃ’は、ペニシリナーゼ阻害剤を添加した培地Ｂ’であり；
    −培地Ｄは、セファロスポリンおよびセファロスポリナーゼ阻害剤を添加した基本培地であり、かつ
    −培地Ｅは、カルバペネムを添加した基本培地である：中で、
    並行してインキュベートする工程と
    （ｂ）工程（ａ）のインキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程と；
    （ｃ）βラクタマーゼ産生細菌の存在を判定し、βラクタマーゼの種類を区別するための、電気化学的手段を、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地に適用する工程と
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する前記細菌の存在を判定するために、前記方法が、以下の工程：
    （ａ）請求項５に記載されるように、前述の試料の一部を培地Ａ、培地Ｂおよび培地Ｃ中で、随意に培地Ｂ’および培地Ｃ’中で並行してインキュベートする工程、
    （ｂ）工程（ａ）での前記インキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程
    （ｃ）基質特異性拡張型βラクタマーゼを産生する前記細菌の存在を判定するための、電気化学的手段を、工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地に適用する工程、
    を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記βラクタマーゼ産生細菌を、それを含んでいる可能性のある試料において判定および区別するために、以下の工程：
    （ａ）請求項５に記載されるように、前述の試料の一部を培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｃ、培地Ｄ、培地Ｅ、随意に培地Ｂ’および培地Ｃ’中で並行してインキュベートする工程、
    （ｂ）工程（ａ）での前記インキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程と、
    （ｄ）培地Ａで培養された前記一部について得た加水分解されたニトロセフィンの前記酸化に対応するアノード電流の強度の値と、前記陰性対照について得た電流の強度の値とを比較することによって、前記試料中のβラクタマーゼ産生細菌の前記存在を判定する工程と、
    （ｅ）培地Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、随意にＢ’およびＣ’で並行して培養した前記一部について得た前述のアノード電流の強度のそれぞれの値と、基準細菌株について得たそれぞれの値とを比較することによって、前記試料中で前述の細菌によって産生されたβラクタマーゼの種類を区別する工程と、
    を含む、請求項５に記載の方法。
  8. 工程（ｅ）の後に、前記βラクタマーゼによって加水分解されたニトロセフィンに対応するアノード電流の強度の値と、同じ条件下で確立された検量線とを比較することによって、工程（ｅ）で区別したβラクタマーゼ産生細菌を定量化することを可能にする、工程（ｆ）をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. βラクタマーゼの種類を区別し、随意に前述の細菌を含んでいる可能性のある試料においてその細菌によって産生されるカルバペネマーゼの前記サブファミリーを規定するための、請求項５、７〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法が、以下の工程：
    （ａ）前述の試料の一部を培地Ａ、培地Ｂ、培地Ｃ、培地Ｄ、培地Ｅ、および培地Ｆ、随意に培地Ｂ’および培地Ｃ’中で並行してインキュベートする工程であって、
    前記培地Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、Ｅが請求項５に記載される通りであり、
    培地Ｆが、カルバペネムおよびカルバペネマーゼのサブファミリーに特異的な阻害剤を添加した基本培地である、工程と；
    （ｂ）工程（ａ）での前記インキュベーションの終わりに得た前述の培地を、ニトロセフィンを含有する培地中で並行してインキュベートする工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）の終わりに得た前述の培地と陰性対照にそれぞれアンペロメトリック測定を適用する工程と、
    （ｄ）培地Ａで培養された前記一部について得た加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度の値と、前記陰性対照について得た電流の強度の値とを比較することによって、前記試料中のβラクタマーゼ産生細菌の前記存在を判定する工程と、
    （ｅ）培地Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ、随意に前記培地Ｂ’およびＣ’で並行して培養した前記一部について得た前述のアノード電流の強度のそれぞれの値と、基準細菌株について得たそれぞれの値とを比較することによって、前記試料中で前述の細菌によって産生されたβラクタマーゼの前記種類を区別する工程と、
    を含む、方法。
  10. 中性ｐＨの緩衝液中の加水分解されたニトロセフィンの酸化に対応するアノード電流の強度が、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．１Ｖ〜＋０．５Ｖの間からなる電位範囲で測定されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 第三世代セファロスポリンが、セフォタキシム、セフタジジムおよびセフトリアキソンを含む群から選択されること；ペニシリナーゼ阻害剤が、クラブラン酸、タゾバクタムまたはスルバクタムであること；前記セファロスポリナーゼ阻害剤が、クロキサシリンであること；カルバペネムが、エルタペネム、イミペネムまたはメロペネムであること；カルバペネマーゼ阻害剤が、ＥＤＴＡ、メルカプト酢酸、ボロン酸、またはクラブラン酸から選択されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記方法が、第三世代セファロスポリンに耐性である細菌の存在をインビトロで判定および定量化するために使用されること、ならびに工程（ａ）で使用される前記培地が、基質特異性拡張型βラクタマーゼ、過剰産生セファロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼによってのみ加水分解されるβラクタム系抗生物質を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記方法がカルバペネマーゼ産生細菌の存在をインビトロで判定および定量化するために使用されること、ならびに工程（ａ）で使用される前記培地が、前記カルバペネマーゼによってのみ加水分解される基質を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記試料が、生体試料、環境起源試料、または食物試料から選択されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

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