WO2018181997A1 - カルバペネマーゼ産生菌の検出方法 - Google Patents

カルバペネマーゼ産生菌の検出方法 Download PDF

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壇 竹内
茂幸 浜田
和典 朝野
幸宏 明田
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国立大学法人大阪大学
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    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a carbapenemase-producing bacterium, an apparatus used for the method, a method for determining the hydrolysis performance of a carbapenemase-producing bacterium, and a method for screening an inhibitor of a carbapenemase-producing bacterium.
  • Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae decomposes carbapenem antibiotics, which are trump therapies for severe infections, and exhibits resistance, and its worldwide spread is a major problem. Therefore, establishing a CPE detection system has great clinical significance, and several reports have been reported so far.
  • Patent Document 1 relates to a disk diffusion method, and specifically, a disk test containing at least three kinds of antibacterial drugs consisting of a carbapenem antibacterial agent, a fluoroquinolone antibacterial agent and an aminoglycoside antibacterial agent.
  • a disk test containing at least three kinds of antibacterial drugs consisting of a carbapenem antibacterial agent, a fluoroquinolone antibacterial agent and an aminoglycoside antibacterial agent.
  • Patent Document 2 discloses that by using a composition in which faropenem and cloxacillin are combined in a micro liquid dilution method, only carbapenemase-producing resistant bacteria can be selectively grown, and carbapenemase-producing resistant bacteria can be detected easily and accurately. ing.
  • the conventional technique requires a complicated operation and time for the preparation of the measurement sample, and the evaluator's skill level is necessary for the judgment, so it can be carried out easily and quickly with high sensitivity and specificity. Establishment of a new system was required.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a carbapenemase-producing bacterium, a device for detecting a carbapenemase-producing bacterium, a method for determining the hydrolysis performance of the carbapenemase-producing bacterium, and a carbapenemase-producing bacterium that can be carried out simply and quickly with high sensitivity and specificity. It is related with providing the method of screening the inhibitor.
  • the present invention relates to the following [1] to [9].
  • a method for detecting a carbapenemase-producing bacterium comprising the following steps. Step 1: Step of culturing by adding an antibacterial agent to a sample Step 2: Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the antibacterial agent with respect to the culture solution obtained in Step 1, and the wavelength Step 3 for measuring absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) of at least 40 nm higher wavelength from step 3: Applying the absorbance (B-Abs) obtained in step 2 to a calibration curve, and calculating the blank absorbance (C-Abs) Calculation step Step 4: When the difference between the absorbance (A-Abs) obtained in Step 2 and the absorbance (C-Abs) obtained in Step 3 is below a preset threshold, the sample contains a carbapenemase-producing bacterium [2] The detection method according to [1], wherein the wavelength (Bnm) is 45 to 400 n
  • [3] The detection method according to [1] or [2], wherein imipenem, panipenem, meropenem, biapenem, doripenem, tevipenem, ertapenem, or faropenem is used as the antibacterial agent.
  • [4] The detection method according to any one of the above [1] to [3], wherein the sample is a biological specimen derived from a human or other animal, an environmental specimen or a food specimen.
  • [5] The detection method according to any one of [1] to [4] above, wherein the culture time in step 1 is at least 15 minutes.
  • a spectrophotometric measurement apparatus, and a computer including a processor and a memory under the control of the processor, the memory including the following steps: Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the maximum absorption of the antibacterial agent and a wavelength at least 40 nm higher than the wavelength of the culture solution cultured with the sample and the antibacterial agent added thereto.
  • A-Abs Absorbance
  • Step 1 Step of culturing by adding an antibacterial agent to a sample
  • Step 2 Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the antibacterial agent with respect to the culture solution obtained in Step 1, and the wavelength Step 3 for measuring absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) of at least 40 nm higher wavelength from step 3: Applying the absorbance (B-Abs) obtained in step 2 to a calibration curve, and calculating the blank absorbance (C-Abs) Calculation step 4: When the difference between the absorbance (A-Abs) obtained in step 2 and the absorbance (C-Abs) obtained in step 3 is below a preset threshold, the carbapenemase-producing bacterium contained in the sample [9] The absorbance (A-Abs) at the wavelength (Anm) of the sample obtained by allowing the test substance to act on the carbapenemase-producing bacterium, and the wavelength (Bnm) at least 40 nm higher than the wavelength
  • the test substance is selected as a substance that suppresses the activity of the carbapenemase-producing bacteria.
  • a carbapenemase-producing bacterium can be detected simply and quickly with high sensitivity and specificity.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the absorbance spectrum of each antibacterial drug
  • FIG. 1a shows the measurement results at wavelengths of 220 to 400 nm
  • FIG. 1b shows the correlation between the concentration of imipenem and the absorbance at 297 nm
  • FIG. 2 shows the result of measuring the spectrum of each antibacterial agent when bacteria are present
  • FIG. The measurement results at 400 nm are shown in Fig. 2b, in which the spectrum in the case where the antibacterial agent and the bacterium coexist is compared with the spectrum in the case where the bacterium is present in the PBS for each antibacterial agent.
  • FIG. 3 is a diagram showing the absolute absorbance of imipenem in the bacterial mixture.
  • FIG. 3A schematically shows the absolute absorbance from the absorbance spectra of the bacterial mixture containing imipenem and the bacterial mixture not containing imipenem.
  • FIG. 3b is a diagram showing the absolute absorbance spectrum by subtracting the absorbance of the bacterial mixture not containing imipenem.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a solution prepared for absorbance measurement.
  • FIG. 4a is a case where a solution containing bacteria and imipenem (experimental solution) and a solution containing only bacteria at the same concentration (background) are prepared.
  • FIG. 4 b shows a case where the preparation of the background solution is omitted.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between the background absorbance at 297 nm (C-Abs) and the absorbance at a wavelength different from 297 nm (B-Abs), and FIG. 5a shows the absorbance at the wavelength of 350 nm (B-Abs).
  • 5b is a graph showing the correlation when the absorbance (B-Abs) at a wavelength of 450 nm is used
  • FIG. 5c is a graph showing the correlation when the absorbance (B-Abs) at a wavelength of 600 nm is used.
  • FIG. 6 is a graph showing the hydrolysis rate of imipenem.
  • FIG. 6a shows the result of comparing the hydrolysis rate between CPE and non-CPE strains (55 strains), and FIG.
  • FIG. 6b shows the hydrolysis rate in the CPE strain. It is a figure which shows the level of performance.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of comparing hydrolysis rates between CPE strains and non-CPE strains using antibacterial agents.
  • FIG. 8 is a diagram showing the hydrolysis rate of imipenem.
  • FIG. 8a shows the result of comparing the hydrolysis rate between CPE and non-CPE strains (149 strains), and
  • FIG. 8b shows the hydrolysis in the CPE strain. It is a figure which shows the level of performance.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of comparing the hydrolysis rate between the CPE strain and the non-CPE strain for each incubation time.
  • the present invention utilizes the hydrolysis reaction of an antibacterial agent by a carbapenemase-producing bacterium, and is based on the fact that the specific ultraviolet region absorption of the antibacterial agent changes due to hydrolysis.
  • the present invention has been found by focusing on the fact that the anti-bacterial drug hydrolyzed by carbapenemase changes the ultraviolet absorption spectrum of the anti-bacterial drug with hydrolysis. That is, when measuring the absorbance of the antibacterial drug, a wavelength at which the absorbance varies due to hydrolysis and a specific wavelength different from the wavelength as the background are set, and the absorbance at these wavelengths is measured from the same sample.
  • detecting a carbapenemase-producing bacterium refers to detecting whether or not a carbapenemase-producing bacterium is contained in a sample and determining whether or not a carbapenemase-producing bacterium is present.
  • Step 1 Step of culturing by adding an antibacterial agent to a sample
  • Step 2 Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the antibacterial agent with respect to the culture solution obtained in Step 1, and the wavelength Step 3 for measuring absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) of at least 40 nm higher wavelength from step 3: Applying the absorbance (B-Abs) obtained in step 2 to a calibration curve, and calculating the blank absorbance (C-Abs) Calculation step
  • Step 4 When the difference between the absorbance (A-Abs) obtained in Step 2 and the absorbance (C-Abs) obtained in Step 3 is below a preset threshold, the sample contains a carbapenemase-producing bacterium Process to determine
  • a sample for absorbance measurement is prepared. Specifically, it can be prepared by adding an antibacterial agent to the sample and culturing.
  • a sample that can be used since the presence or absence of a carbapenemase-producing bacterium is detected, a sample that may contain the bacterium can be used.
  • biological samples derived from humans and other animals, environmental samples, and food-derived samples are exemplified.
  • biological specimens include clinical materials such as urine, blood, sputum, and stool.
  • environment-derived specimens include water and soil in water and sewage systems, hospital facilities, and medical equipment surfaces (for example, bedside fences, floors, sinks, artificial respirators, etc.).
  • the concentration of the carbapenemase-producing bacterium in the sample is not particularly limited.
  • the sample is added to a medium and cultured under conditions suitable for culturing carbapenemase-producing bacteria, for example, pH 6.0 to 8.0, 10 to 42 ° C.
  • the culture time may be 15 minutes, and from the viewpoint of improving accuracy, the lower limit is exemplified by 30 minutes, 1 hour, 1 hour 30 minutes, and 2 hours.
  • the upper limit 6 hours, 4 hours, and 3 hours are mentioned from a rapid viewpoint.
  • a known medium can be appropriately selected and used.
  • the antibacterial agent to be added is not particularly limited as long as it is an antibacterial agent that can be hydrolyzed by carbapenemase-producing bacteria.
  • carbapenem antibiotics penem antibiotics, specifically, imipenem (IPM), panipenem (PAPM), meropenem (MEPM), biapenem (BIPM), doripenem (DRPM), tevipenem (TBPM), Examples include ertapenem (ETPM) and faropenem (FRPM).
  • the added concentration is a concentration at which hydrolysis can be detected by a method described later when contacted with a carbapenemase-producing bacterium. Specifically, 0.1-100 ⁇ g / mL is exemplified in the culture solution.
  • step 2 the absorption in the ultraviolet region is measured for the culture solution thus obtained, that is, the sample for absorbance measurement.
  • the wavelength to be measured is a wavelength (Anm) that is the maximum absorption maximum wavelength of the antibacterial agent used in Step 1, and at least 40 nm, preferably 42 nm or more, more preferably 45 nm or more, further preferably 50 nm or more from the wavelength.
  • the upper limit is not particularly set, but from the viewpoint of specificity, it is preferably 400 nm or less, more preferably 300 nm or less, still more preferably 200 nm or less, still more preferably 150 nm or less, and even more preferably 100 nm or less. ).
  • Table 1 shows an example of combinations of wavelengths (Anm) and wavelengths (Bnm) that can be set in the present invention for antibacterial drugs.
  • the wavelength (Anm) can be set to 297 nm and the wavelength (Bnm) can be set to 350 nm, but is not limited thereto.
  • the wavelength (Anm) may be set as a maximum wavelength by measuring an antibacterial drug alone dissolved in a culture solution in advance, or may be set from known technical information.
  • the wavelength (Anm) may be set to be slightly different from the maximum wavelength, for example, within the range of the maximum wavelength ⁇ 10 nm, preferably the maximum wavelength ⁇ 5 nm, and the wavelength (Anm) and the wavelength (Bnm) are as described above. It is sufficient that the wavelengths are separated.
  • the absorbance measurement is not particularly limited as long as the absorbance at the above-described wavelength can be measured.
  • the absorbance can be measured using a known spectrophotometer.
  • the absorbance (A-Abs) at the wavelength (Anm) and the absorbance (B-Abs) at the wavelength (Bnm) may be measured separately or simultaneously if they are measured for the same sample.
  • the absorbance since a control solution containing only bacteria as a background is not separately prepared, there is a possibility that the bacteria will grow and the absorbance may fluctuate over time, so there is no time difference when measuring separately. It is preferable to measure at the same time. Specifically, for example, it is preferably within 5 minutes, more preferably within 1 minute.
  • the simultaneous measurement includes a mode in which two wavelengths are measured simultaneously without a time difference, and a mode in which measurement is continuously performed as long as the time difference is such that bacteria do not grow.
  • the sample for absorbance measurement may be appropriately concentrated or diluted depending on the absorbance at the wavelength (Anm).
  • the concentration method and the dilution method are not particularly limited, and examples thereof include a method of concentrating by decompressing at a temperature of room temperature or lower, a method of diluting by adding a culture solution, and the like.
  • step 3 the absorbance (B-Abs) obtained in step 2 is applied to a calibration curve to calculate a blank absorbance (C-Abs).
  • Blank absorbance (C-Abs) is characterized in that it is calculated as a blank absorbance at the wavelength (Anm) described above using a separately prepared calibration curve. That is, in the present invention, since the type and amount of bacteria, the composition of the culture solution, and the like differ depending on the sample for absorbance measurement, the absorbance (A-Abs) is measured where the blank value varies depending on the sample and cannot be set unconditionally.
  • One characteristic is that the blank absorbance (C-Abs) can be set without being affected by the blank value by measuring the absorbance (B-Abs) in the same sample as above and applying it to the calibration curve.
  • a calibration curve is created as follows. First, the amount of antibacterial agent added, the type / amount of bacteria, the type / amount of the culture solution, etc. are prepared in advance, and various culture solutions cultured at different wavelengths (Bnm) are prepared. Measure absorbance. Next, except that no antibacterial drug is added, the sample is prepared under the same conditions as described above, and the absorbance at the wavelength (Anm) is measured for the culture medium cultured under the same conditions, and the correlation can be plotted. .
  • a calibration curve shows a good linear relationship (approximate expression) when it is prepared as absorbance at a wavelength (Bnm) on the X axis and blank absorbance at a wavelength (Anm) on the Y axis. Note that the calibration curve can be recalculated from time to time as the data is additionally updated.
  • step 4 if the difference between the absorbance (A-Abs) obtained in step 2 and the absorbance (C-Abs) obtained in step 3 is below a preset threshold value, If the sample used in step 1 contains a carbapenemase-producing bacterium, and if it is equal to or exceeds, it is determined that the sample used in step 1 does not contain a carbapenemase-producing bacterium.
  • the difference between absorbance (A-Abs) and absorbance (C-Abs) is compared with a preset threshold value.
  • the threshold is an appropriate cut-off value for identifying whether or not hydrolysis has occurred.
  • Threshold value can be set as follows. For multiple known carbapenemase-producing bacteria and carbapenemase non-producing bacteria, the difference between absorbance (A-Abs) and absorbance (C-Abs) can be determined as described above, and the trend can be determined from these values. it can. For example, the difference in absorbance can be set as 0.2, preferably 0.15, more preferably 0.1. Therefore, if the difference between absorbance (A-Abs) and absorbance (C-Abs) is less than the threshold value of 0.2, preferably 0.15, more preferably less than 0.1, it is determined that the sample contains carbapenemase-producing bacteria. , It can be determined that it is not included when it is equal or above.
  • the presence or absence of bacteria can be confirmed by comparing the difference between absorbance (A-Abs) and absorbance (C-Abs) as it is and the threshold, but from the viewpoint of ease of judgment.
  • the numerical value calculated by applying the relational expression may be used for the determination.
  • the determination can be made by calculating the hydrolysis rate of the antibacterial agent from the absorbance (A-Abs) and the absorbance (C-Abs) using the following formula.
  • Hydrolysis rate (%) 100 ⁇ [(A-Abs) ⁇ (C-Abs)] / [(D-Abs) ⁇ (E-Abs)] ⁇ 100
  • A-Abs Absorbance at the wavelength (Anm) of the culture solution measured in step 2
  • C-Abs Blank absorbance of the culture solution obtained in step 3
  • D-Abs Wavelength of PBS containing antibacterial drug at the same concentration as in step 1
  • E-Abs Absorbance at the wavelength (Anm) of PBS Note that the absorbance (D-Abs) and absorbance (E-Abs) are measured each time the absorbance (A-Abs) is measured.
  • PBS phosphate buffer
  • D-Abs absorbance
  • E-Abs absorbance
  • a buffer solution or the like can be used without particular limitation.
  • the obtained hydrolysis rate is compared with a preset threshold value.
  • the threshold value used here can be set by calculating the hydrolysis rate for a plurality of known carbapenemase-producing bacteria and non-carbapenemase-producing bacteria using the above-described method, and grasping the tendency from these values. For example, a hydrolysis rate of 10%, preferably 15%, more preferably 20% can be set as the threshold value. Therefore, when calculating the hydrolysis rate from the difference between absorbance (A-Abs) and absorbance (C-Abs), the hydrolysis rate is equal to or exceeding 10% of the threshold, preferably 15%, more preferably 20%. Can be determined that the sample contains carbapenemase-producing bacteria, and when the sample is lower, it can be determined that it is not included.
  • the threshold value may be acquired separately when measuring the absorbance of the sample, or may be acquired in advance. Moreover, when comparing with the hydrolysis rate of a sample, the analysis result obtained so far may be additionally updated as needed.
  • the preset threshold value with the absorbance or the hydrolysis rate calculated from the absorbance, it can be determined whether or not the sample contains a carbapenemase-producing bacterium.
  • the bacteria thus detected are not particularly limited as long as they are carbapenemase-producing bacteria, and examples thereof include NDM-type carbapenemase-producing bacteria, KPC-type carbapenemase-producing bacteria, OXA-type carbapenemase-producing bacteria, and IMP-type carbapenemase-producing bacteria.
  • Specific examples include Gram-negative bacteria that produce carbapenemases, including Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Acinetobacter spp., Aeromonas spp. .
  • the level of hydrolysis performance of carbapenemase-producing bacteria can also be evaluated in comparison with the threshold value in step 4 in the detection method. Specifically, the smaller the calculated difference in absorbance or the higher the hydrolysis rate, the higher the hydrolysis performance of the carbapenemase-producing bacterium contained in the sample, in other words, it is measured in step 2. It can be evaluated that the lower the absorbance at the wavelength (Anm) of the culture solution, the higher the hydrolysis activity of the carbapenemase-producing bacterium.
  • the present invention can also determine the level of hydrolysis performance of a carbapenemase-producing bacterium from the absorbance at a wavelength serving as an index, and therefore provides a method for determining the hydrolysis performance of a carbapenemase-producing bacterium, including the following steps.
  • Step 1 Step of culturing by adding an antibacterial agent to a sample
  • Step 2 Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the antibacterial agent with respect to the culture solution obtained in Step 1, and the wavelength Step 3 for measuring absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) of at least 40 nm higher wavelength from step 3: Applying the absorbance (B-Abs) obtained in step 2 to a calibration curve, and calculating the blank absorbance (C-Abs) Calculation step 4: When the difference between the absorbance (A-Abs) obtained in step 2 and the absorbance (C-Abs) obtained in step 3 is below a preset threshold, the carbapenemase-producing bacterium contained in the sample To determine that the hydrolysis performance of
  • the section in the detection method of the present invention can be referred to.
  • the bacteria whose hydrolysis performance is determined include those detected by the detection method of the present invention.
  • the detecting device of the present invention includes a spectrophotometric measuring device, a processor, and a computer having a memory under the control of the processor.
  • the memory includes the following steps: Absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) of the maximum absorption of the antibacterial agent and a wavelength at least 40 nm higher than the wavelength of the culture solution cultured with the sample and the antibacterial agent added thereto.
  • the present embodiment includes a spectrophotometric measurement device and a computer system connected to the measurement device.
  • the measurement device is a UV measurement device that measures the absorbance of a culture solution obtained by adding a sample and an antibacterial drug, for example, based on two set wavelengths. Measurements at two wavelengths may be performed simultaneously or separately. The interval in separate cases is not particularly limited, but it is preferable to carry out the steps sequentially.
  • the wavelength is automatically set to the maximum absorption maximum wavelength (Anm) and the wavelength (Bnm) away from the wavelength by a certain wavelength to the higher wavelength side by inputting information on the antibacterial agent used in the computer system described later. It can also be set.
  • the measuring device mix the sample and the antibacterial solution with a pH of 6.0 to 8.0 and 10 to 42 ° C for a period of about 15 minutes (the lower limit is 30 minutes, 1 hour, 1 hour 30 Minutes, 2 hours are exemplified, and the upper limit is exemplified by 6 hours, 4 hours, 3 hours), and then the absorbance can be automatically measured as it is.
  • the type of antibacterial agent, amount used, wavelength setting method, and the like can be referred to the detection method section of the present invention.
  • the sample container may be any container capable of UV measurement, and may be used with reference to the section of the detection kit of the present invention, for example.
  • the obtained absorbance is transmitted to the computer system.
  • the computer system executes a program for determining the presence or absence of carbapenemase-producing bacteria in the sample based on the obtained absorbance.
  • the program for determining the presence or absence of carbapenemase-producing bacteria calculates blank absorbance from the obtained absorbance based on an approximate expression stored in a hard disk or the like, and then calculates the hydrolysis rate.
  • the presence or absence of carbapenemase-producing bacteria in the sample is determined using a preset threshold value described on a hard disk or the like.
  • the determination result can be separately printed on a printer or displayed on a display unit (display).
  • the detection device of the present invention may be configured separately so that it can be connected even if the spectrophotometer and the computer system are integrated. Moreover, the apparatus from the absorbance measurement to the determination may be automated. For example, the apparatus may display the determination result with the addition of the sample.
  • the size of the detection device of the present invention is not particularly limited.
  • the spectrophotometric measurement device and the computer system are integrated, and preferably a small size in which the simultaneous measurement and determination of absorbance at two wavelengths are automated and the result display is automated. It may be a device or a device that can be attached to an existing spectrophotometric apparatus.
  • A-Abs Absorbance at the maximum wavelength (Anm) of the maximum absorption of the antibacterial agent and a wavelength at least 40 nm higher than the wavelength of the culture solution cultured with the sample and the antibacterial agent added thereto.
  • a program for causing a computer to execute a step of determining that a sample contains a carbapenemase-producing bacterium when it falls below a set threshold can also be used by being mounted on a known computer as determination software. It is included as one aspect.
  • the present invention is based on the principle of determining the bacteria contained in the sample based on the fluctuation of the ultraviolet absorption of the antibacterial agent to be used. Therefore, if a compound having a known structure is used. For example, those skilled in the art can fully understand that the present invention can also be applied to detection of ⁇ -lactamase producing bacteria.
  • the screening method of the present invention uses a substance that suppresses the activity of a carbapenemase-producing bacterium as a candidate compound, using a change in absorbance at a specific wavelength as an index, and a sample obtained by allowing a test substance to act on a known carbapenemase-producing bacterium. Compare the absorbance with the absorbance of the sample that does not act, and if the absorbance of the sample that acted the test substance exceeds the absorbance of the sample that did not act, the test substance can be selected as a substance that suppresses the activity of the carbapenemase-producing bacteria it can.
  • the absorbance of a sample that does not act on the test substance is not prepared separately.
  • the absorbance at a wavelength set separately is measured. It is characterized by measuring. Specifically, the absorbance (A-Abs) at the wavelength (Anm) of the sample in which the test substance was allowed to act on the carbapenemase-producing bacterium, and the absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) at least 40 nm higher than the wavelength.
  • the difference between the absorbance (A-Abs) and the absorbance (C-Abs) is a preset threshold, for example, , 0.1, preferably 0.15, more preferably more than 0.2, the test substance is selected as a substance that suppresses the activity of the carbapenemase-producing bacterium.
  • the maximum wavelength (Anm) is not measured in advance, but is estimated and set from the structure based on the common general knowledge of those skilled in the art, and the wavelength (Bnm) is set with reference to the detection method of the present invention. Good.
  • the blank absorbance (C-Abs) is calculated with reference to the detection method section of the present invention. be able to.
  • the carbapenemase-producing bacterium that can be used in the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it can be detected by the detection method of the present invention. Culture conditions and the like can be set as appropriate based on the bacteria used.
  • the hydrolysis rate can be calculated and compared by applying the formula of the hydrolysis rate used in the detection method of the present invention.
  • the test substance can be selected as a substance that suppresses the activity of the carbapenemase-producing bacteria, and the hydrolysis rate is 20
  • a test substance exceeding% cannot be selected as a substance that suppresses the activity of a carbapenemase-producing bacterium.
  • the kit for detecting carbapenemase-producing bacteria Since the present invention determines the presence or absence of bacteria based on the change in ultraviolet absorption of the added antibacterial agent, it can be determined by adding an antibacterial agent. It can also be said. Therefore, the present invention also provides a kit for detecting a carbapenemase-producing bacterium containing an antibacterial drug.
  • the kit of the present invention is preferably a kit that can be provided for absorbance measurement by adding a sample to a container.
  • a container plate type, card type, test tube type, etc.
  • the container may be provided with a well, or an antibacterial drug may be dried and fixed on the side surface and / or the bottom surface of the container or each well.
  • a solvent for dissolving the antibacterial drug for example, PBS
  • Such a kit includes, for example, containers for positive control, negative control, and sample preparation. These containers come into direct contact with bacteria, and are preferably disposable in consideration of safety. Moreover, it is preferable that it is applicable to the detection apparatus of this invention.
  • an antibacterial agent added in the detection method of the present invention can be used.
  • the concentration of the antibacterial agent in the kit is not particularly limited as long as the concentration of the antibacterial agent in the culture solution is, for example, 0.1 to 100 ⁇ g / mL at the time of measuring ultraviolet absorption, and can be set as appropriate.
  • materials used for sample preparation for absorbance measurement can also be included.
  • a known medium or the like can be applied as long as the bacteria to be measured can be cultured.
  • imipenem was used from Wako Pure Chemical Industries, Ltd .
  • Meropenem was Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .
  • Doripenem, Biapenem, Eltapenem, Faropenem and PBS (phosphate buffer) were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Test example 1 Prepare UV solution 96-well plate (Zell-tive, Germany) in PBS solution with various concentrations of each antibacterial agent, using corona plate reader SH-9000 (HITACHI, Japan), room temperature (25 ° C) Below, analysis was performed at wavelengths between 220 nm and 400 nm (FIG. 1 a).
  • Each antibacterial solution showed a characteristic absorbance between 250 nm and 350 nm, and peak absorbance around 297 nm. Further, even if the spectrum was analyzed up to 1000 nm, no other peak was identified.
  • the absorbance at 297 nm (A-Abs) showed a linear relationship with the concentration in the solution (FIG. 1b), and the abundance in the solution could be estimated from the absorbance of imipenem.
  • Test example 2 The spectrum of imipenem in the bacterial mixture was measured to see if a difference in hydrolysis activity could be found between carbapenemase-producing bacteria (CPE strain) and carbapenemase non-producing bacteria (non-CPE strain) .
  • CPE strains Klebsiella pneumoniae, ATCC BAA-2470 strain
  • non-CPE strains Klebsiella pneumoniae, ATCC 4352 strain
  • CPE imipenem and CPE strain
  • PBS PBS
  • a mixture of the antibacterial agent and the CPE strain and a suspension of the CPE strain in PBS were prepared, and the spectrum from 200 nm to 1000 nm was also measured.
  • both antibacterial agents are a mixture of antibacterial agent and CPE strain (antibacterial agent + Bac) and a suspension of CPE strain in PBS (PBS + Bac) shows that the spectra are almost identical.
  • Test example 3 Since the background seemed to change due to different types of bacteria, "absolute absorbance of imipenem” in the bacterial mixture was examined. As shown in FIG. 3a, for example, at a wavelength of 297 nm, the absolute absorbance of imipenem is obtained by subtracting the absorbance (point C) of the bacterial mixture containing no imipenem from the absorbance (point A) of the bacterial mixture containing imipenem. Therefore, the absolute absorbance of the sample of Test Example 2 was calculated as described above.
  • FIG. 3b clearly shows that the hydrolysis of imipenem is clearly shown as the disappearance of the characteristic spectrum of imipenem in the solution containing CPE, and the presence or absence of CPE can be detected by the difference in absorbance.
  • the non-CPE solution for example, had a relatively stable peak absorbance at 297 nm and was similar to the imipenem solution without bacteria.
  • Test example 4 In the method of Test Example 3, it was necessary to prepare two types of solutions for measuring the absorbance. Specifically, a solution containing bacteria and imipenem (experimental solution) and a solution containing only bacteria at the same concentration (background) were required (FIG. 4a). However, considering application to the detection system, it was ideal to skip the procedure of preparing the background solution in order to save time and simplify the system. Also, the extent of bacterial growth in the two solutions was different, suggesting that the background solution could no longer be used as “background”. Therefore, as shown in FIG. 4b, a method for estimating background absorbance using an experimental solution was examined.
  • Test Example 5 Based on Test Example 4, the hydrolysis activity of 55 known strains shown in Table 3 was measured. The control strains purchased from ATCC were used, and the others were human clinical isolates owned by the laboratory.
  • the bacteria are cultured overnight on an agar plate, and the colony is added to 100 ⁇ L of imipenem solution (25 ⁇ g / mL) to achieve a turbidity equivalent to 1.0 McFarland standard, then at 37 ° C. for 60 minutes. After the incubation, spectrophotometric measurements were taken. From the obtained absorbance, the hydrolysis rate was calculated using the following formula.
  • Hydrolysis rate (%) 100 ⁇ [(A-Abs) ⁇ (C-Abs)] / [(D-Abs) ⁇ (E-Abs)] ⁇ 100
  • E-Abs PBS Absorbance at wavelength (297nm)
  • Fig. 6a shows that the hydrolysis rate is clearly separated between CPE and non-CPE strains.
  • the MIC value of imipenem is shown using color scale, some CPEs have low MIC values, but the difference in carbapenemase activity from non-CPE strains can be achieved by using the detection method of the present invention. Is clear.
  • OXA type which is known to have a weak hydrolysis action in a short time, has been confirmed to exhibit relatively lower activity than other CPE strains, and the detection method of the present invention is also suitable for such detection. It was found to be excellent (Figure 6b).
  • Test Example 6 About the carbapenemase producing bacteria (CPE strain: Klebsiella pneumoniae, ATCC BAA-2470 strain) and the carbapenemase non-producing bacteria (non-CPE strain: Klebsiella pneumoniae, ATCC 4352 strain) used in Test Example 5 using each antibacterial agent, Test Example 5 The hydrolysis rate was calculated in the same manner as above. In this test, the approximate expression for calculating the blank absorbance was that of imipenem prepared in Test Example 4, and for each antibacterial agent, the wavelength (Anm) was set to 297 nm and the wavelength (Bnm) was set to 350 nm for convenience.
  • CPE strain Klebsiella pneumoniae, ATCC BAA-2470 strain
  • non-CPE strain Klebsiella pneumoniae, ATCC 4352 strain
  • Test Example 7 It was confirmed whether the detection method of the present invention can cope with various strains. Specifically, hydrolytic activity was evaluated for the strains shown in Table 4 (149 strains) in the same manner as in Test Example 4 except that the incubation time was changed to 120 minutes. The strain was purchased from ATCC or a human clinical isolate owned by the laboratory.
  • the detection method of the present invention is an excellent detection method applicable to various strains.
  • Test Example 8 Regarding the detection method of the present invention, the discrimination between CPE strains and non-CPE strains at different incubation times (30, 60, 120, 180 minutes) was examined using 149 strains used in Test Example 7. Specifically, the hydrolysis activity was evaluated in the same manner as in Test Example 4 except that the incubation time was changed to the above time. Further, at each incubation time, an ROC curve was created regarding the hydrolysis rate, and a cut-off value was calculated (Table 5).
  • the cut-off value 9.43 after incubation for 30 minutes has a sensitivity of 98.25% and a specificity of 100%, indicating that the judgment performance is sufficient.
  • the incubation time is 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes, 100% sensitivity and specificity are exhibited, and it can be seen that the detection method of the present invention can perform determination with good specificity and accuracy (FIG. 9). ).
  • Test Example 9 An antibacterial agent is added to a colony grown by culturing a specimen (blood, etc.) derived from a biological sample and further cultured. For the obtained culture solution, the absorbance (A-Abs) at the maximum wavelength (Anm) and the absorbance (B-Abs) at a wavelength (Bnm) at least 40 nm higher than the wavelength are measured according to the added antibacterial agent. The blank absorbance (C-Abs) is calculated from the absorbance (B-Abs). Next, it is determined from the difference between the absorbance (A-Abs) and the blank absorbance (C-Abs) whether the specimen contains a carbapenemase-producing bacterium.
  • the detection method of the present invention can detect carbapenemase-producing bacteria easily and rapidly with high sensitivity and specificity, and is useful for clinical and hospital infection countermeasures.

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Abstract

工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程、工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程、工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程、を含むカルバペネマーゼ産生菌の検出方法。本発明の検出方法により、高い感度・特異度で簡便かつ迅速にカルバペネマーゼ産生菌を検出することができるため、臨床及び院内感染対策上有用である。

Description

カルバペネマーゼ産生菌の検出方法
　本発明は、カルバペネマーゼ産生菌の検出方法及び該方法に用いる装置、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法、ならびにカルバペネマーゼ産生菌の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
　カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌(CPE)は、重症感染症に対する切り札的治療薬であるカルバペネム系抗生物質を分解して耐性を示すことから、その世界的拡散は大きな問題である。そのため、CPEの検出系を確立することは、臨床医学的に大きな意義があり、これまでにも幾つか報告されている。
　例えば、特許文献１は、ディスク拡散法に関するものであり、具体的には、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬及びアミノグリコシド系抗菌薬からなる少なくとも３種の抗菌薬を含有しているディスク試験片と緑膿菌、アシネトバクター属菌などが増殖可能な固体培地を組み合わせて用い、培地上の薬剤拡散領域内のコロニーの有無を目視で観察するのみで、短時間で容易かつ正確に多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターなどの多剤耐性菌を検出できることが開示されている。
　特許文献２は、微量液体希釈法においてファロペネムとクロキサシリンとを組み合わせた組成物を用いることにより、カルバペネマーゼ産生耐性菌のみが選択的に発育し、カルバペネマーゼ産生耐性菌を簡便かつ正確に検出できることを開示している。
　また、カルバペネマーゼの遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを行って、耐性菌の存在有無を検出する方法もある(例えば、特許文献３参照)。カルバペネマーゼに選択的に切断されうるプローブを接触させて該プローブに結合させた標識を検出する方法(例えば、特許文献４参照)や、特異性のある基質と反応させることで生じた反応混合物のpH変化を指示薬によって評価する方法もある(例えば、特許文献５参照)。
特開２０１６－１６８０５８号公報 特開２０１６－０１０３９９号公報 特開２０１６－１４６８１８号公報 特表２０１７－５０５６１２号公報 特表２０１４－５３３９５１号公報
　しかしながら、従来技術は、測定サンプルの調製に煩雑な操作や時間が必要であったり、判定に評価者の熟練度が必要であったりするために、高い感度・特異度で簡便かつ迅速に実施できる新たな系の確立が求められていた。
　本発明の課題は、高い感度・特異度で簡便かつ迅速に実施できるカルバペネマーゼ産生菌の検出方法及びカルバペネマーゼ産生菌を検出するための装置、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法、ならびにカルバペネマーゼ産生菌の阻害剤をスクリーニングする方法を提供することに関する。
　本発明は、下記〔１〕～〔９〕に関する。
〔１〕　下記工程を含む、カルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
〔２〕　波長(Ｂnm)が波長(Ａnm)より45～400nm高波長である、前記〔１〕記載の検出方法。
〔３〕　抗菌薬として、イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム、エルタペネム、又はファロペネムを用いる、前記〔１〕又は〔２〕記載の検出方法。
〔４〕　試料が、ヒト、他の動物の生体由来検体、環境由来検体又は食品由来検体である、前記〔１〕～〔３〕いずれか記載の検出方法。
〔５〕　工程１における培養時間が少なくとも15分である、前記〔１〕～〔４〕いずれか記載の検出方法。
〔６〕　カルバペネマーゼ産生菌が、カルバペネマーゼを産生するグラム陰性菌である、前記〔１〕～〔５〕いずれか記載の検出方法。
〔７〕　分光光度測定装置と、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを備えたコンピュータを含み、前記メモリには、下記の工程：
試料と抗菌薬を添加して培養した培養液について、分光光度測定装置により前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程、
前記で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び
前記で得られた吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、カルバペネマーゼ産生菌の検出装置。
〔８〕　下記工程を含む、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法。
工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料に含まれるカルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能が高いと判定する工程
〔９〕　カルバペネマーゼ産生菌に被験物質を作用させたサンプルの波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定し、該吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出し、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を上回る場合に被験物質をカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質として選択する、カルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
　本発明によれば、高い感度・特異度で簡便かつ迅速にカルバペネマーゼ産生菌を検出することができる。
図１は、各抗菌薬の吸光度スペクトルを測定した結果を示し、図１aは波長220～400nmにおける測定結果を、図１bはイミペネムの濃度と297nmにおける吸光度の相関関係を示す図である。 図２は、菌が存在する場合の各抗菌薬のスペクトルを測定した結果を示し、図２aはカルバペネマーゼ産生菌(CPE株)又はカルバペネマーゼ非産生菌(非CPE株)が存在する場合の波長220～400nmにおける測定結果を、図２bは抗菌薬と菌が共存する場合のスペクトルとPBSに菌が存在する場合のスペクトルを各抗菌薬で対比した図である。 図３は、細菌混合液中のイミペネムの絶対吸光度を示した図であり、図３aがイミペネムを含む細菌混合液とイミペネムを含まない細菌混合液の吸光度スペクトルから絶対吸光度を模式的に示した図、図３bがイミペネムを含まない細菌混合液の吸光度を差し引いて絶対吸光度のスペクトルを示した図である。 図４は、吸光度の測定に調製する溶液を模式的に示す図であり、図４aが細菌とイミペネムを含む溶液(実験溶液)及び細菌のみを同濃度で含む溶液(バックグラウンド)を準備する場合、図４bがバックグラウンド溶液の調製を省略する場合を示す図である。 図５は、297nmでのバックグラウンド吸光度(C-Abs)と297nmとは異なる波長での吸光度(B-Abs)の相関関係を示す図であり、図５aは波長350nmでの吸光度(B-Abs)を用いた場合、図５bは波長450nmでの吸光度(B-Abs)を用いた場合、図５cは波長600nmでの吸光度(B-Abs)を用いた場合の相関関係を示す図である。 図６は、イミペネムの加水分解率を示す図であり、図６aがCPE株と非CPE株との間で加水分解率を対比した結果(55株)を示し、図６bがCPE株における加水分解性能の高低を示す図である。 図７は、CPE株と非CPE株との間で各抗菌薬を用いて加水分解率を対比した結果を示す図である。 図８は、イミペネムの加水分解率を示す図であり、図８aがCPE株と非CPE株との間で加水分解率を対比した結果(149株)を示し、図８bがCPE株における加水分解性能の高低を示す図である。 図９は、インキュベーションの時間毎にCPE株と非CPE株との間で加水分解率を対比した結果を示す図である。
　本発明は、カルバペネマーゼ産生菌による抗菌薬の加水分解反応を利用したものであり、該抗菌薬が有する特異的な紫外線領域吸収が加水分解により変化することに基づくものである。
　従来のカルバペネマーゼ産生菌による加水分解反応を利用する方法としては、カルバペネマーゼの酵素活性を指標としたものが挙げられる。この場合、酵素活性が低いと検出が困難になるため、偽陰性が認められるなど検出感度に問題があった。一方、本願発明は、カルバペネマーゼによって加水分解される抗菌薬について、加水分解に伴って該抗菌薬の紫外線吸収スペクトルが変化することに着目して見出したものである。即ち、該抗菌薬の吸光度を測定する際に、加水分解によって吸光度が変動する波長と、バックグラウンドとして前記波長とは異なる特定の波長をそれぞれ設定し、これらの波長における吸光度を同一サンプルから測定することで、高い感度・特異度で簡便かつ迅速にカルバペネマーゼ産生菌を検出することができるというものである。なお、本明細書において、カルバペネマーゼ産生菌を検出するとは、試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれるか否かを検出するものであって、カルバペネマーゼ産生菌の有無を判定するものであるとも言える。
１．カルバペネマーゼ産生菌の検出方法
　本発明の検出方法は、下記工程を含む。
工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
　工程１では、吸光度測定用の試料を調製する。具体的には、試料に抗菌薬を添加して培養することにより調製することができる。ここで、用いることができる試料としては、カルバペネマーゼ産生菌の有無を検出することから、当該菌が含まれている可能性がある試料を使用することができる。具体的には、ヒト、他の動物の生体由来検体、環境由来検体、食品由来検体が例示される。生体由来検体としては、例えば、尿、血液、喀痰、便などの臨床材料が挙げられる。環境由来検体としては、上下水道内の水や土壌、病院内の設備や医療機器表面(例えば、ベッドサイド柵、床、シンク、人口呼吸装置など)が挙げられる。試料中のカルバペネマーゼ産生菌の濃度は特に限定されない。
　前記試料を培地に添加し、カルバペネマーゼ産生菌の培養に適する条件、例えば、pH6.0～8.0、10～42℃の条件下で培養する。培養時間は15分でもよく、精度を向上させる観点からは、下限としては、30分、1時間、1時間30分、2時間が例示される。また、上限としては、迅速性の観点から、6時間、4時間、3時間が挙げられる。なお、培地は公知のものを適宜選択して用いることができる。
　また、添加する抗菌薬は、カルバペネマーゼ産生菌によって加水分解され得る抗菌薬であれば特に限定はない。例えば、カルバペネム系抗菌薬、ペネム系抗菌薬が挙げられ、具体的には、イミペネム(IPM)、パニペネム(PAPM)、メロペネム(MEPM)、ビアペネム(BIPM)、ドリペネム(DRPM)、テビペネム(TBPM)、エルタペネム(ETPM)、ファロペネム(FRPM)などが例示される。添加濃度は、カルバペネマーゼ産生菌に接触させた時に加水分解を後述の方法によって検出できる濃度である。具体的には、培養液中に0.1～100μg/mLが例示される。
　工程２では、かくして得られた培養液、即ち、吸光度測定用の試料について紫外領域の吸収を測定する。
　測定する波長は、工程１で用いた抗菌薬の最大吸収の極大波長である波長(Ａnm)と、当該波長から少なくとも40nm、好ましくは42nm以上、より好ましくは45nm以上、更に好ましくは50nm以上であり、上限は特に設定されないが、特異度の観点から、好ましくは400nm以下、より好ましくは300nm以下、更に好ましくは200nm以下、更に好ましくは150nm以下、更に好ましくは100nm以下の高波長側の波長(Ｂnm)である。表１に、抗菌薬について、本発明で設定可能な波長(Ａnm)と波長(Ｂnm)の組み合わせの一例を示す。例えば、カルバペネム系抗菌薬としてイミペネムを用いた場合、波長(Ａnm)は297nmに、波長(Ｂnm)は350nmに設定することができるが、これに限定されるものではない。なお、波長(Ａnm)は、予め抗菌薬のみを培養液に溶解したものを測定して極大波長として設定してもよく、公知技術情報から設定してもよい。また、波長(Ａnm)は、極大波長から多少の乖離、例えば、極大波長±10nm、好ましくは極大波長±5nmの範囲内に設定されてもよく、波長(Ａnm)と波長(Ｂnm)が前記した波長分離れていればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　吸光度の測定は、前記した波長における吸光度を測定できるのであれば特に限定されず、例えば、公知の分光光度測定装置を用いて行うことができる。また、波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)は、同一サンプルについて測定するのであれば、別々に測定しても同時に測定してもよい。本発明では、バックグラウンドとして菌のみが存在する対照液を別途調製しないことから、時間を置くと菌が増殖して吸光度が変動する可能性もあるため、別々に測定する場合は時間差がないことが好ましく、同時に測定することが好ましい。具体的には、例えば、好ましくは5分以内、より好ましくは1分以内である。ここで、同時に測定するとは、時間差なく同時に二波長を測定する態様以外、菌が増殖しない程度の時間差であれば連続して測定する態様も含むものである。
　また、本発明においては、波長(Ａnm)の吸光度に応じて、吸光度測定用の試料を適宜、濃縮あるいは希釈して用いてもよい。濃縮方法、希釈方法は特に制限されず、例えば、室温以下の温度下で減圧して濃縮する方法や培養液を添加して希釈する方法などが例示される。
　工程３では、工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する。
　ブランク吸光度(C-Abs)とは、前記した波長(Ａnm)におけるブランク吸光度として、別途作成した検量線を用いて算出することに特徴がある。即ち、本発明では、菌の種類や量、培養液組成などが吸光度測定用の試料によって異なるため、ブランク値が試料によって変動して一概には設定できないところ、吸光度(A-Abs)を測定するのと同一のサンプルにおいて吸光度(B-Abs)を測定して検量線に当てはめることで、ブランク値の影響を受けずにブランク吸光度(C-Abs)を設定できることに一つの特徴を有する。
　検量線は次のようにして作成する。先ず、抗菌薬の添加量、菌の種類・量、培養液の種類・量などが予め既知のサンプルを調製し、培養条件などを変更して培養した種々の培養液について、波長(Ｂnm)における吸光度を測定する。次いで、抗菌薬を添加しない以外は、前記と同じ条件でサンプルを調製し同じ条件で培養した培養液について波長(Ａnm)における吸光度を測定し、その相関関係をプロットすることで作成することができる。検量線は、例えば、Ｘ軸に波長(Ｂnm)における吸光度、Ｙ軸に波長(Ａnm)におけるブランク吸光度として作成した場合、良好な直線関係(近似式)を示すものである。なお、検量線は、そのデータが追加更新されて随時、近似式が再算出可能なものである。
　かくして得られたブランク吸光度(C-Abs)を用いて、工程４での判定を行う。
　工程４では、工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回るか否かによって、下回る場合には工程１で用いた試料がカルバペネマーゼ産生菌を含んでおり、同等もしくは上回る場合は工程１で用いた試料がカルバペネマーゼ産生菌を含んでいないと判定する。
　吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差を予め設定された閾値と対比する。閾値とは加水分解されたか否かを識別する適切なカットオフ値のことであり、当該閾値と前記で得られた吸光度の差を対比することにより、試料に含まれる菌がカルバペネマーゼ産生菌であるか否かを判定できる。
　閾値は以下のようにして設定することができる。複数の既知のカルバペネマーゼ産生菌とカルバペネマーゼ非産生菌について前記のようにして吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差を求め、それらの値から傾向を把握することで設定することができる。例えば、吸光度の差が0.2、好ましくは0.15、より好ましくは0.1として設定することができる。よって、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が、閾値の0.2、好ましくは0.15、より好ましくは0.1よりも下回る場合は、試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれていると判定し、同等もしくは上回る場合は含まれていないと判定することができる。
　また、本発明においては、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差をそのまま算出した値と閾値との対比から菌の存在有無を確認できるが、判断のしやすさの観点から、関係式に当てはめて算出した数値を判定に用いてもよい。
　例えば、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)から、以下の式を用いて抗菌薬の加水分解率を算出して判定を行うこともできる。
　加水分解率(％)＝100－[(A-Abs)－(C-Abs)]/[(D-Abs)－(E-Abs)]×100
　　A-Abs：工程２で測定された培養液の波長(Ａnm)における吸光度
　　C-Abs：工程３で得られた培養液のブランク吸光度
　　D-Abs：工程１と同濃度の抗菌薬含有PBSの波長(Ａnm)における吸光度
　　E-Abs：PBSの波長(Ａnm)における吸光度
　なお、吸光度(D-Abs)と吸光度(E-Abs)は、吸光度(A-Abs)を測定する際にその都度測定してもよいが、予め測定しておいたデータを用いてもよい。また、ここではPBS(リン酸緩衝液)を用いているが、吸光度(D-Abs)と吸光度(E-Abs)を測定するサンプルが同一の溶液で用いて調製されるのであれば、公知の緩衝液など特に限定されずに用いることができる。
　得られた加水分解率を予め設定された閾値と対比する。ここで用いる閾値は、複数の既知のカルバペネマーゼ産生菌とカルバペネマーゼ非産生菌について加水分解率を前記の方法を用いて算出し、それらの値から傾向を把握することで設定することができる。例えば、加水分解率が10％、好ましくは15％、より好ましくは20％を閾値として設定することができる。よって、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差から加水分解率を求める場合は、加水分解率が閾値の10％、好ましくは15％、より好ましくは20％と同等もしくは上回る場合は、試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれていると判定し、下回る場合は含まれていないと判定することができる。
　なお、閾値は、試料の吸光度を測定する際に別途同時に取得してもよく、事前に取得しておいたものであってもよい。また、試料の加水分解率と比較する際に、それまでに得られた解析結果を随時追加更新して、取得されたものであってもよい。
　こうして予め設定された閾値と吸光度又は吸光度から算出された加水分解率とを対比することで、試料がカルバペネマーゼ産生菌を含むか否かを判定することができる。
　かくして検出される菌は、カルバペネマーゼ産生菌であれば特に限定はなく、NDM型カルバペネマーゼ産生菌、KPC型カルバペネマーゼ産生菌、OXA型カルバペネマーゼ産生菌、IMP型カルバペネマーゼ産生菌などが挙げられる。具体的には、カルバペネマーゼを産生するグラム陰性菌が挙げられ、肺炎桿菌、大腸菌、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、緑膿菌、ビブリオ・コレラ、アシネトバクター属菌、エロモナス属菌などが含まれる。
２．カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法
　また、前記検出方法において工程４での閾値との対比において、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の高低についても評価することができる。具体的には、算出された吸光度の差が小さいほど又は加水分解率が高いほど、試料に含まれるカルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能が高いと判定することができ、換言すると、工程２で測定された培養液の波長(Ａnm)における吸光度が低いほど、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解活性が高いことを示唆すると評価することができる。よって、本発明はまた、指標となる波長の吸光度からカルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の高低も判定することができることから、下記工程を含む、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法を提供する。
工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料に含まれるカルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能が高いと判定する工程
　前記判定方法における工程１～４での具体的な操作や仕様は、本発明の検出方法における項を参照することができる。また、加水分解性能を判定される菌も、本発明の検出方法において検出される菌が挙げられる。
３．カルバペネマーゼ産生菌の検出装置
　本発明の検出装置は、分光光度測定装置とプロセッサおよび前記プロセッサの制御下にあるメモリを備えたコンピュータを含み、前記メモリには、下記の工程：
試料と抗菌薬を添加して培養した培養液について、分光光度測定装置により前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程、
前記で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び
前記で得られた吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
　以下に、本発明の方法を実施するのに好適な装置の一例を説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
　本実施形態は、分光光度測定装置と該測定装置に接続されたコンピュータシステムを含んでいる。
　測定装置は、試料と抗菌薬を添加して培養した培養液について、例えば、設定した二波長に基づいて吸光度を測定するUV測定装置である。二波長での測定は同時であっても別々に行ってもよい。別々の場合の間隔は特に制限されないが、順次に行うことが好ましい。波長は、後述のコンピュータシステムに使用した抗菌薬の情報を入力することで、自動的に最大吸収の極大波長(Ａnm)と当該波長から一定波長分高波長側に離れた波長(Ｂnm)とに設定することもできる。また、測定装置において、試料と抗菌薬を添加した混合液をpH6.0～8.0、10～42℃の条件下で、15分程度の時間(下限としては、30分、1時間、1時間30分、2時間が例示され、上限としては、6時間、4時間、3時間が例示される)培養し、次いで、そのまま吸光度を自動的に測定することもできる。抗菌薬の種類や使用量、波長の設定方法などは本発明の検出方法の項を参照にすることができる。また、試料を入れる容器はUV測定が可能な容器であればよく、例えば、本発明の検出用キットの項を参照にして用いてもよい。得られた吸光度はコンピュータシステムに送信される。
　コンピュータシステムは、得られた吸光度に基づいて、試料におけるカルバペネマーゼ産生菌の有無を判定するプログラムを実行する。
　カルバペネマーゼ産生菌の有無を判定するプログラムは、得られた吸光度からハードディスク等に記憶された近似式に基づいてブランク吸光度を算出し、次いで、加水分解率を算出する。
　その後、ハードディスク等に記載された予め設定された閾値を用いて、試料におけるカルバペネマーゼ産生菌の有無を判定する。判定結果は、別途プリンターに印刷させたり、表示部(ディスプレイ)に表示させることができる。
　本発明の検出装置は、分光光度測定装置とコンピュータシステムとが一体化していても、接続可能なものとして別々に構成されていてもよい。また、吸光度測定から判定までが自動化した装置であってもよく、例えば、試料を添加することで判定結果が付随したディスプレイに表示されるような装置であってもよい。
　本発明の検出装置の大きさは、特に制限されず、例えば、分光光度測定装置とコンピュータシステムとが一体化した、好ましくは、二波長の吸光度同時測定と判定、その結果表示までが自動化した小型デバイスであってもよく、既存の分光光度測定装置に付設させることが可能なデバイスであってもよい。
　また、本発明においては、前記コンピュータに記録されるプログラムとして、
下記の工程：
試料と抗菌薬を添加して培養した培養液について、分光光度測定装置により前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程、
前記で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び
前記で得られた吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
をコンピュータに実行させるためのプログラム、あるいは、
下記の工程：
別途分光光度測定装置に測定した、抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を用いて、当該吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び
前記で得られた吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
をコンピュータに実行させるためのプログラムもまた、判定用ソフトとして公知のコンピュータに搭載して使用可能なことから、本発明の一態様として含まれる。
　本発明は、以上説明したように、使用する抗菌薬の紫外吸収の変動に基づいて試料に含まれる菌を判定するという原理に基づくものであることから、構造が既知の化合物を用いるのであれば、例えば、β-ラクタマーゼ産生菌の検出についても適用可能であることは、当業者には十分理解できるものである。
４．カルバペネマーゼ産生菌の阻害剤のスクリーニング方法
　本発明は添加した抗菌薬の紫外吸収の変化に基づいて菌の存在有無を判定していることから、公知のカルバペネマーゼ産生菌が存在する場合には、添加した化合物が加水分解されるか否かを判定することができ、ひいては、添加した化合物がカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制できるか否かを判定することが可能となる。即ち、本発明はまた、カルバペネマーゼ産生菌を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法は、特定の波長における吸光度の変化を指標とし、カルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質を候補化合物とするものであり、公知のカルバペネマーゼ産生菌に被験物質を作用させたサンプルの吸光度と作用させないサンプルの吸光度とを比較し、被験物質を作用させたサンプルの吸光度が、作用させないサンプルの吸光度より上回る場合に、被験物質をカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質として選択することができる。
　より詳しくは、被験物質を作用させないサンプルの吸光度としては当該サンプルを別途調製するのではなく、本発明では、被験物質を作用させたサンプルの吸光度を測定する際に、別途設定した波長における吸光度を測定することに特徴を有する。具体的には、カルバペネマーゼ産生菌に被験物質を作用させたサンプルの波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定し、該吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出し、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値、例えば、0.1、好ましくは0.15、より好ましくは0.2を上回る場合に被験物質をカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質として選択することを特徴とする。なお、極大波長(Ａnm)は予め測定せずとも、当業者の技術常識に基づいて構造から推定して設定後、本発明の検出方法の項を参照して波長(Ｂnm)を設定してもよい。波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)の測定後は、本発明の検出方法の項を参照して、ブランク吸光度(C-Abs)を算出することができる。
　本発明のスクリーニング方法において使用可能なカルバペネマーゼ産生菌としては、本発明の検出方法において検出され得る菌であれば特に限定されない。使用する菌に基づいて、培養条件などを適宜設定することができる。
　吸光度の対比においては、本発明の検出方法において用いた加水分解率の式にあてはめ、加水分解率を算出して対比することもできる。この場合、加水分解率が20％以下、好ましくは15％以下、より好ましくは10％以下の場合、被験物質をカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質として選択することができ、加水分解率が20％を超える被験物質はカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質としては選択することができない。
　かくして、カルバペネマーゼ産生菌を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
５．カルバペネマーゼ産生菌の検出用キット
　本発明は添加した抗菌薬の紫外吸収の変化に基づいて菌の存在有無を判定していることから、抗菌薬を添加することでその判定を行うことが可能であるとも言える。よって、本発明はまた、抗菌薬を含む、カルバペネマーゼ産生菌の検出用キットを提供する。
　本発明のキットとしては、試料を容器に添加することで吸光度測定に提供することが可能になるキットが好ましく、具体的には、例えば、容器（プレート型、カード型、試験管型など）に基質である抗菌薬が予め添加されているものが挙げられる。また、容器はウェルを備えたものであってもよく、抗菌薬が容器あるいは各ウェルの側面及び／又は底面に乾燥固定されたものであってもよい。この場合、抗菌薬を溶解する溶剤（例えば、PBS）等もキットの構成要素として含まれていてもよい。かかるキットは、例えば、ポジティブコントロール用、ネガティブコントロール用、サンプル調製用の各容器を含み、これらの容器は、菌と直接触れるので安全面を考慮して、ディスポーザブルであることが望ましい。また、本発明の検出装置に、適用可能なものであることが好ましい。
　抗菌薬としては、本発明の検出方法において添加される抗菌薬を用いることができる。なお、紫外吸収の測定時に培養液中の抗菌薬の濃度が、例えば、0.1～100μg/mLとなるのであれば、キットにおける抗菌薬の濃度は特に限定されず、適宜設定することができる。
　また、前記抗菌薬以外には、吸光度測定用の試料調製に使用される材料も含むことができる。具体的には、測定対象となる菌を培養できるのであれば、培地など公知のものを適用することができる。
　以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、イミペネムは和光純薬工業社；メロペネムは東京化成工業社；ドリペネム、ビアペネム、エルタペネム、ファロペネムとPBS(リン酸緩衝液)はSigma Aldrich社から購入したものを用いた。
試験例１
　UV透過性96ウェルプレート(Zell-kontakt、Germany)に、各抗菌薬が種々濃度となるようPBS溶液に調製し、コロナプレートリーダーSH-9000(HITACHI、Japan)を用いて、室温(25℃)下、220nm～400nmの波長で分析した(図１a)。
　いずれの抗菌薬溶液も250nm～350nmの間の特徴的な吸光度を示し、297nm付近でピーク吸光度を示した。また、スペクトルは1000nmまで分析しても他のピークは同定されなかった。例えば、イミペネム溶液については、297nmでの吸光度(A-Abs)は溶液中濃度と線形関係を示し(図１b)、イミペネムの吸光度から溶液中の存在量を推定することができた。
試験例２
　細菌混合液中のイミペネムのスペクトルを測定して、加水分解活性の差がカルバペネマーゼ産生菌(CPE株)とカルバペネマーゼ非産生菌(非CPE株)との間に見出され得るか否かを調べた。具体的には、CPE株(Klebsiella pneumoniae、ATCC BAA-2470株)と非CPE株(Klebsiella pneumoniae、ATCC 4352株)を用い、イミペネムとCPE株を混合させたもの(CPE)、イミペネムと非CPE株を混合させたもの(Non-CPE)、細菌非含有でイミペネムをPBSに溶解させたもの(PBS)について、試験例１と同様にして220nm～400nmのスペクトルを測定した。また、各抗菌薬について、抗菌薬とCPE株を混合させたもの及びPBSにCPE株を懸濁させたものを調製し、200nm～1000nmのスペクトルも測定した。
　図２aに示すように、細菌の種類によって異なるベースライン吸光度を示すために、CPE溶液と非CPE溶液との間の297nmでピーク吸光度を比較することは困難であった。また、図２bから、350nm付近より長波長側においては、いずれの抗菌薬も、抗菌薬とCPE株を混合させたもの(抗菌薬+Bac)とPBSにCPE株を懸濁させたもの(PBS+Bac)はスペクトルがほぼ一致することが分かる。
試験例３
　細菌の種類が異なることでバックグラウンドが変化すると思われたので、細菌混合液中の「イミペネムの絶対吸光度」について検討した。図３aに示すように、例えば、波長297nmにおいては、イミペネムを含む細菌混合液の吸光度(A点)から、イミペネムを含まない細菌混合液の吸光度(C点)を引くことにより、イミペネムの絶対吸光度が算出できると考えたので、試験例２のサンプルにおいて前記のようにして絶対吸光度を算出した。
　図３bより、イミペネムの加水分解は、CPEを含む溶液においてイミペネムの特徴的なスペクトルの消失として明らかに示され、吸光度の差によりCPEの存在有無が検出できることが分かった。一方、非CPE溶液は、例えば、297nmでのピーク吸光度は比較的安定であり、細菌のないイミペネム溶液と同様であった。
試験例４
　試験例３の方法では、吸光度の測定に2種類の溶液を調製する必要があった。具体的には、細菌とイミペネムを含む溶液(実験溶液)及び細菌のみを同濃度で含む溶液(バックグラウンド)が必要であった(図４a)。しかし、検出システムへの適用を考慮すると、時間を節約し、システムを単純化するためには、バックグラウンド溶液を準備する手順をスキップすることが理想的であった。また、2種類の溶液における細菌の増殖程度は異なり、バックグラウンド溶液がもはや「バックグラウンド」として使用することができないことが示唆された。よって、図４bに示すように、実験溶液を用いてバックグラウンド吸光度を推定する方法を検討した。
　イミペネムの測定においては297nmの吸光度(A-Abs)を指標とすることから、297nmでのバックグラウンド吸光度(C-Abs)と、350nmでの吸光度(B-Abs)との関係に着目して検討した(図３aのB点とC点の関係)。表２に示す株を用いて、これら2種類の吸光度を測定してプロットすると、R2=0.9987と良好な直線関係を示すことが分かった(図５a)。350nmでの吸光度(B-Abs)は、イミペネムの吸光度の影響を受けず、イミペネムを含まない細菌混合液の代わりに用いることが可能であることが示唆された。また、450nmでの吸光度(B-Abs)からバックグラウンド吸光度(C-Abs)を算出した場合と600nmでの吸光度(B-Abs)からバックグラウンド吸光度(C-Abs)を算出した場合についても同様に検討した結果を図５b、図５cに示すが、いずれも、イミペネムを含まない細菌混合液の代わりに用いることが可能であることが示唆された。なお、表２に示すカルバペネマーゼ型は、NDM：New Delhi Metallo-b-lactamase、KPC：Klebsiella pneumonia Carbapenemase、OXA：Oxacillinase、IMP：Imipenemaseを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例５
　試験例４に基づいて、表３に示す公知の55株について加水分解活性を測定した。対照株はATCCから購入したものを用い、その他は研究室で保有するヒトの臨床分離株を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　具体的には、細菌を寒天プレート上で一晩培養し、コロニーをイミペネム溶液(25μg/mL)100μLに添加し、1.0McFarland標準と同等の濁度となるようにした後、37℃で60分のインキュベーション後、分光光度測定を行った。得られた吸光度から、以下の式を用いて加水分解率を算出した。
　加水分解率(％)＝100－[(A-Abs)－(C-Abs)]/[(D-Abs)－(E-Abs)]×100
　　A-Abs：297nmにおける吸光度
　　C-Abs：試験例４で得られた関係式(350nm)から算出されたブランク吸光度
　　D-Abs：抗菌薬含有PBSの波長(297nm)における吸光度
　　E-Abs：PBSの波長(297nm)における吸光度
　図６aより、加水分解率はCPE株と非CPE株との間で明らかに分離されることが分かる。また、イミペネムのMIC値をcolor scaleを用いて示しているが、CPEの中にはMIC値が低いものも含まれるが、本発明の検出方法を用いることで非CPE株とのカルバペネマーゼ活性の違いが明らかとなっている。また、短時間での加水分解作用が弱いことが知られているOXA型は、他のCPE株よりも比較的低い活性を示すことが確認され、本発明の検出方法はそのような検出にも優れていることが分かった(図６b)。
試験例６
　試験例５において用いたカルバペネマーゼ産生菌(CPE株：Klebsiella pneumoniae、ATCC BAA-2470株)とカルバペネマーゼ非産生菌(非CPE株：Klebsiella pneumoniae、ATCC 4352株)について、各抗菌薬を用いて試験例５と同様にして加水分解率を算出した。なお、本試験では、ブランク吸光度を求める近似式は試験例４で作成したイミペネムのものを用い、いずれの抗菌薬も便宜上波長(Ａnm)を297nm、波長(Ｂnm)を350nmに設定した。
　図７より、いずれの抗菌薬を用いてもCPE株と非CPE株との間で明らかに判別することが可能である。また、同じCPE株間でも、抗菌薬によってカルバペネマーゼ活性が相違することも分かる。また、各抗菌薬の波長(Ａnm)がそれぞれの極大波長から多少ずれたとしても、波長(Ａnm)と波長(Ｂnm)の吸光度をそれぞれ測定することで、判定を簡便に良好な精度で行えることも示唆される。
試験例７
　本発明の検出方法が、種々の株に対応しうるか否かを確認した。具体的には、インキュベーション時間を120分に変更する以外は試験例４と同様の方法で、表４に示す株(149株)について加水分解活性を評価した。株は、ATCCから購入、あるいは、研究室で保有するヒトの臨床分離株を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図８a及び８bより、株数を増やしても、加水分解率がCPE株と非CPE株との間で明らかに分離されることが確認され、また、活性が弱いOXA型についても十分判別可能であることが明らかである。よって、本発明の検出方法は種々の株に適用しうる優れた検出方法であることが分かった。
試験例８
　本発明の検出方法について、試験例７で用いた149株を用いて異なるインキュベーション時間（30、60、120、180分）におけるCPE株と非CPE株との判別性を検討した。具体的には、インキュベーション時間を前記時間に変更する以外は試験例４と同様の方法で加水分解活性を評価した。また、各インキュベーション時間において、加水分解率に関してROC曲線を作成し、カットオフ値を算出した(表５)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　30分間インキュベーション後のカットオフ値9.43は、98.25％の感度と100％の特異性であり、十分な判定性能を示すものであることが分かる。また、インキュベーション時間が60分、120分、180分では100％の感度と特異性を示すものであり、本発明の検出方法が、判定を良好な特異度と精度で行えることが分かる(図９)。
試験例９
　生体試料由来の検体（血液など）を培養して発育したコロニーに、抗菌薬を添加して更に培養する。得られた培養液について、添加した抗菌薬に応じて極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定し、吸光度(B-Abs)からブランク吸光度(C-Abs)を算出する。次いで、吸光度(A-Abs)とブランク吸光度(C-Abs)の差から検体にカルバペネマーゼ産生菌が含まれるか否かを判定する。
　本発明の検出方法により、高い感度・特異度で簡便かつ迅速にカルバペネマーゼ産生菌を検出することができるため、臨床及び院内感染対策上有用である。

Claims (9)

  1. 　下記工程を含む、カルバペネマーゼ産生菌の検出方法。
    工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
    工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
    工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
    工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
  2. 　波長(Ｂnm)が波長(Ａnm)より45～400nm高波長である、請求項１記載の検出方法。
  3. 　抗菌薬として、イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム、エルタペネム、又はファロペネムを用いる、請求項１又は２記載の検出方法。
  4. 　試料が、ヒト、他の動物の生体由来検体、環境由来検体又は食品由来検体である、請求項１～３いずれか記載の検出方法。
  5. 　工程１における培養時間が少なくとも15分である、請求項１～４いずれか記載の検出方法。
  6. 　カルバペネマーゼ産生菌が、カルバペネマーゼを産生するグラム陰性菌である、請求項１～５いずれか記載の検出方法。
  7. 　分光光度測定装置と、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを備えたコンピュータを含み、前記メモリには、下記の工程：
    試料と抗菌薬を添加して培養した培養液について、分光光度測定装置により前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程、
    前記で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程、及び
    前記で得られた吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料にカルバペネマーゼ産生菌が含まれると判定する工程
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、カルバペネマーゼ産生菌の検出装置。
  8. 　下記工程を含む、カルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能の判定方法。
    工程１：試料に抗菌薬を添加して培養する工程
    工程２：工程１で得られた培養液について、前記抗菌薬の最大吸収の極大波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定する工程
    工程３：工程２で得られた吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出する工程
    工程４：工程２で得られた吸光度(A-Abs)と工程３で得られた吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を下回る場合は試料に含まれるカルバペネマーゼ産生菌の加水分解性能が高いと判定する工程
  9. 　カルバペネマーゼ産生菌に被験物質を作用させたサンプルの波長(Ａnm)における吸光度(A-Abs)と、該波長から少なくとも40nm高波長側の波長(Ｂnm)における吸光度(B-Abs)を測定し、該吸光度(B-Abs)を検量線に当てはめブランク吸光度(C-Abs)を算出し、吸光度(A-Abs)と吸光度(C-Abs)の差が予め設定された閾値を上回る場合に被験物質をカルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質として選択する、カルバペネマーゼ産生菌の活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
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