CN108048522A - 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 - Google Patents
具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108048522A CN108048522A CN201810029340.5A CN201810029340A CN108048522A CN 108048522 A CN108048522 A CN 108048522A CN 201810029340 A CN201810029340 A CN 201810029340A CN 108048522 A CN108048522 A CN 108048522A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- chloro
- concentration
- resistance
- bromo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种在生物学样品中检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:a)使所述样品与包含至少一种显色剂以及法罗培南和/或多利培南的反应培养基接触;b)进行整体温育以允许细菌生长;c)检测表现出对碳青霉烯类的抗性的菌株。步骤a)中采用的培养基还包含氯唑西林和/或氯唑西林与PAbetaN的组合。
Description
本申请是申请日为2012年3月6日,申请号为201280014555.0,标题为“具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种适合筛选抗碳青霉烯类的细菌的检测和鉴定方法。
背景技术
对β-内酰胺抗生素如青霉素和头孢菌素抗性的增加使治疗革兰氏阴性菌菌株引起的感染变得复杂。因此这些抗生素被其他广谱抗微生物剂代替。在这些广谱抗微生物剂中,碳青霉烯类已起到重要作用,特别是对于治疗住院患者。碳青霉烯类针对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧细菌以及某些厌氧细菌而发挥作用。
但是,越来越多抗碳青霉烯类的菌株出现在住院患者中。
相关的细菌非限制性地包括大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、气单胞菌(Aeromonas sp.)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、肠球菌(Enterococcus sp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。
对碳青霉烯类的敏感性的减少可以归因于:
●抗β-内酰胺基因的表达:
(i)ampCβ-内酰胺酶的高产,和/或
(ii)ESBL(超广谱β-内酰胺酶),
联合细胞壁通透性的改变(不透性抗性)和/或抗生素的主动外排(Pages et al.,2009;PloS ONE,4(3));和/或
●分解碳青霉烯类的称为碳青霉烯酶的酶的存在。
碳青霉烯酶基因可以存在于染色体和/或质粒中。由于这种质粒形式的存在,这类酶促抗性能够很大程度地蔓延,结果在流行病学角度上构成重大风险。
本领域技术人员难以容易地检测和/或鉴定抗碳青霉烯类的细菌菌株。
在申请WO 2010/010083中提出特征在于使用包含美罗培南和/或厄他培南的显色培养基的方法,并且其在培养基 KPC(Samra et al.,2008;J.Clin.Microbiol.,46(9):3110-3111;CHROMagarTM,Paris,France)和COLOREXTMKPC(BioMed Diagnostics Inc.)中实施。这种培养基不允许检测所有产生碳青霉烯酶的菌株,特别是最近出现的NDM-1菌株(Nordmann et al.,2011;J Clin Microbiol.,49(2):718-721)。在目前的流行病学背景下,特别是随着这些新NDM-1抗性的出现,仍需要提高筛选所有对碳青霉烯类的抗性机制的灵敏度和/或特异性。
法罗培南和多利培南是最近开发和测试的碳青霉烯类(Mushtaq et al.,2007;Journal of Antimicrobial Chemotherapy,59:1025-1030-Lee et al.,2011,MicrobialDrug Resistance)。就申请人所知,它们从未用于直接在生物学样品中检测和/或鉴定抗碳青霉烯类的细菌菌株。
申请人已证实可以改进抗碳青霉烯类菌株的检测,更特别是所有产生碳青霉烯酶(包括KPC碳青霉烯酶和NDM碳青霉烯酶)的菌株。这满足与目前的流行病学背景,特别是新抗性如NDM-1的出现相关的需要,并且允许筛选由于所有已知类型碳青霉烯酶产生导致的所有抗性机制。
发明内容
在这方面,本发明涉及一种在生物学样品中检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使所述样品与包含至少一种显色剂以及法罗培南和/或多利培南的反应培养基接触;
b)进行整体温育以允许细菌生长;
c)检测表现出对碳青霉烯类的抗性的菌株。
申请人已证实将法罗培南和/或多利培南加入显色培养基使得大多数产生碳青霉烯酶的细菌可以生长,同时抑制大多数不产生碳青霉烯酶的菌株如野生菌株,以及例如产生超广谱β-内酰胺酶或高水平头孢菌素酶的菌株。该测试使得可以证实比使用美罗培南的显色培养基更大的灵敏度和特异性。
根据第一实施方案,本发明对应于一种在生物学样品中检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使所述样品与包含至少一种显色底物以及至少法罗培南和/或多利培南的培养基接触;
b)进行整体温育以允许细菌生长;
c)检测表现出对碳青霉烯类的抗性的菌株。
根据本发明的一优选实施方案,所述细菌为NDM-1细菌。
优选地,碳青霉烯浓度为0.05-32mg/L。
更优选地,对于法罗培南,碳青霉烯浓度为2-32mg/L,并且对于多利培南,碳青霉烯浓度为0.05-2mg/L。
有利地,步骤a)中采用的培养基还包含氯唑西林和/或氯唑西林与PAbetaN的组合。这些化合物提供额外水平的选择,并且使得可以区分不透性抗性和其他非酶促抗性与通过产生碳青霉烯酶的抗性。
具体实施方式
生物学样品应理解为用于分析的实体的一小部分或分离的少量。其可以是临床样品,人或动物的,来自生物液体的样本;或者是食物样品,来自任何类型的食物;或者是来自食物生产或加工环境的样品。因此该样品可以是液体或固体。可以以非限制性的方式举例:全血、血清、血浆、尿、粪便的临床样品,鼻、喉、皮肤、伤口、脑脊液的样本;水、饮料(如奶、果汁)、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品;来自动物饲料的食物样品,特别是例如动物食品样品,或者表面或水体对照的样品。这种样本可以直接使用,或者在分析之前按照本领域技术人员已知的方法通过富集、稀释、提取、浓缩或纯化来进行制备。
反应培养基应理解为包含代谢的表达和/或微生物的生长所必需的所有元素的培养基。反应培养基可以是固体、半固体或液体。例如,固体培养基应理解为胶凝培养基。琼脂是微生物学中用于微生物培养的常规胶凝剂,但是可以使用明胶、琼脂糖或者其他天然或人工的凝胶形成物质。许多制品可商购,例如Columbia琼脂、Trypcase-大豆琼脂、MacConkey琼脂,或者更一般地,微生物学培养基手册(CRC Press)所述的那些制品。
反应培养基可以包含组合的一种或多种元素,例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。该培养基还可以包含染料。作为指示,可能的染料可以是伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿、一种或多种代谢指示剂、一种或多种代谢调节剂等。
反应培养基可以是显示培养基或者培养和显示培养基。在第一种情况下,微生物的培养在接种之前进行,而在第二种情况下,检测和/或鉴定培养基还构成用于培养的培养基。
本领域技术人员还可以使用双板,这使得可以容易地比较包含不同底物或不同选择混合物的两种培养基,在这两种培养基上沉积相同的生物学样品。
反应培养基可以包含一种或多种选择剂。选择剂应理解为能够防止或减缓除靶微生物以外的微生物的生长的任何化合物。不受限制地,0.01mg/l-5g/l的浓度特别适合本发明。
作为选择剂,可以提到抗生素、抗真菌剂、胆盐、结晶紫、碱性品红、亮绿等。抗生素应理解为能够防止或减缓细菌生长的任何化合物。具体地,它们属于β-内酰胺、糖肽、氨基糖苷(aminoside)、多肽、磺酰胺和喹诺酮类组。作为提示,具体可以提到抗生素氯唑西林、头孢噻肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南、万古霉素、庆大霉素、甲氧苄啶、妥布霉素、拉氧头孢、磷霉素、D-环丝氨酸、多链丝霉素、多粘菌素E以及喹诺酮类如萘啶酸。
抗真菌剂应理解为能够防止或减缓酵母或霉菌的生长的任何化合物。作为提示,具体可以提到两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和环己米特。
氯唑西林对应于青霉素类的抗生素。其体外使用以抑制某些β-内酰胺酶(Giskeet al.,2010;Clin.Microbiol.Infect.;17(4):552-6)。有利地认为双氯西林和氟氯西林等同于氯唑西林。优选以25-300mg/l的浓度使用氯唑西林。
PABN或PAbetaN对应于苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺。这种化合物已知为外排泵抑制剂,例如,使得可以减少氯霉素对产气肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)(Mallea etal.,2002;Biochemical and Biophysical Research Communications 293:1370-3)。优选地,以1-50mg/l的浓度使用PAbetaN。
显色底物应理解为使得可以通过直接或间接的可检测信号检测靶微生物的酶促或代谢活性的底物。对于直接检测,这种底物可以连接至作为荧光或有色标记发挥作用的部分(Orenga et al.,2009;J.Microbiol.Methods;79(2):139-55)。对于间接检测,本发明的反应培养基还可以包含pH指示剂,其对底物消耗所诱导的pH变化敏感并且显示靶微生物的代谢。所述pH指示剂可以是发色团或荧光团。作为发色团的实例,可以提到溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、苯胺蓝和溴甲酚蓝。荧光团包括例如4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物或试卤灵衍生物。
根据本发明,显色底物优选自基于吲哚氧基的底物(3-吲哚氧基、5-溴-3-吲哚氧基、5-碘-3-吲哚氧基、4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基、6-溴-3-吲哚氧基、6-氯-3-吲哚氧基、6-氟-3-吲哚氧基、5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚氧基、N-甲基-3-吲哚氧基、AldolTM等);基于伞形酮的底物(4-甲基伞形酮、环己酮七叶苷(Cyclohexenoesculetin)等);基于茜素的底物;基于对萘酚苯甲醇的底物;基于硝基苯酚的底物(邻硝基苯酚、对硝基苯酚等);基于羟基喹啉的底物;基于儿茶酚(Cathecol)的底物(儿茶酚、二羟黄酮、羟基黄酮等);基于试卤灵的底物;基于氯酚红的底物;基于荧光素的底物;基于氨基苯酚的底物(对氨基苯酚、二氯-氨基苯酚等);基于萘酚的底物(α-萘酚、2-萘酚、萘酚-ASBI等);基于氨基香豆素的底物(7-氨基-4-甲基-香豆素等);基于萘基酰胺的底物;基于吖啶的底物(氨基-苯基-吖啶等);基于氨基-吩噁嗪的底物(氨基-苯并吩噁嗪酮、氨基-戊基-试卤灵等)。
作为指示,显色底物靶向的酶促活性可以属于水解酶组,并且优选氧化酶(osidase)、酯酶或肽酶组。
作为指示,用于检测β-葡糖醛酸酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、茜素-β-葡糖苷酸、环己酮七叶苷-β-葡糖苷酸或它们的盐。
用于检测β-半乳糖苷酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、茜素-β-半乳糖苷、环己酮七叶苷-β-半乳糖苷或它们的盐。
用于检测β-葡糖苷酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、茜素-β-葡糖苷、环己酮七叶苷-β-葡糖苷、硝基苯基-β-葡糖苷、二氯氨基苯基葡糖苷或它们的盐。
作为指示,用于检测酯酶活性的底物具体可以是具有6-14个碳、优选7-9个碳的饱和或不饱和直链脂肪酸的酯,以及4-甲基伞形酮、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基、6-氯-3-吲哚氧基、5-溴-3-吲哚基或茜素的酯或它们的盐。优选地,它们选自4-甲基伞形酮基-辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯、5-溴-3-吲哚基-辛酸酯或茜素-辛酸酯。
用于检测脱氨酶活性的底物具体可以是L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸。
用于检测硫酸酯酶活性的底物具体可以是4-甲基伞形酮基-硫酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-硫酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-硫酸酯、3-吲哚氧基-硫酸酯、酚酞-二硫酸酯或它们的盐。
优选地,显色底物选自:5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-葡糖苷)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷(品红β-Gal)、6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸(玫瑰βGur)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(绿AβGlu)、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(甲基βD葡糖苷)和L-色氨酸。
温育应理解为表示在1-48小时之间,优选4-24小时之间,更优选16-24小时之间升至并维持在适当的温度,一般为20-50℃,优选30-40℃。
检测应理解为表示用裸眼或使用光学装置识别靶细菌生长的存在。有利地,当采用的培养基包含显色底物时,检测还可以使得能够鉴定靶细菌。对于荧光底物,使用光学装置进行检测,或者对于有色底物,用裸眼或使用光学装置进行检测。
如上文所示,对碳青霉烯类的酶促抗性应理解为表示由于靶细菌表达碳青霉烯酶而导致的对碳青霉烯抗生素的抗性。
如上文所示,最常见的抗碳青霉烯类的细菌有:大肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、雷氏普罗威登斯菌、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、丛毛单胞菌、气单胞菌、摩氏摩根菌、肠球菌、奇异变形杆菌、森夫顿堡沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等。
本发明还涉及一种用于检测和/或鉴定表现出对碳青霉烯类的抗性的细菌的培养基,所述培养基对应于基本培养基,其还包含至少一种显色底物以及至少法罗培南和/或多利培南。
下文展开的实施例的目的是促进对本发明的理解。它们以解释的方式给出而不是为了限制本发明的范围。
实施例
实施例1在纯菌株上测试法罗培南
1.培养基和微生物
在包含不同浓度的法罗培南的培养基上测试79株革兰氏阴性菌菌株,其中69株为肠细菌且10株为非肠细菌(非发酵细菌),它们的抗性特征列于表I,以建立每种制品的灵敏度/特异性。在37℃下培养24小时后读皿。
表I:表征测试菌株的抗性机制
所用的培养基是包含至少一种显色底物并补充了以下浓度的法罗培南的常规琼脂培养基:
2.测试
将培养基分入120X120方形皿中。
在trypcase大豆琼脂上于37℃下从24-h预培养物进行接种。
对于每种菌株,制备生理水中的0.5McF悬浮液,然后稀释1/100。
根据琼脂稀释(AD)法,借助多点接种器,将每种悬浮液点状接种(1-2μL)于各培养基上。
在37℃下培养24小时后进行读数。
为了解释,认为以下情况对应于生长抑制:
o不存在细菌生长
o菌落数≤3
认为存在4个菌落或更多个是阳性生长。
3.结果和解释
检测灵敏度和特异性在表II中示出。
表II:产生碳青霉烯酶的菌株在包含16mg/L法罗培南的培养基上的检测灵敏度/特异性
例如以16mg/L使用的法罗培南使得可以清楚地区分产生碳青霉烯酶的细菌和其他类型的抗性。
全部KPC菌株的MIC通常>32,无论任何测试的接种物。所有KPC菌株均在包含16mg/L法罗培南的培养基上显色。
实施例2纯菌株上的多利培南测试
1.培养基和微生物
在包含不同浓度的法罗培南的培养基上测试100株革兰氏阴性菌菌株,其中98株为肠细菌且2株为非肠细菌(非发酵细菌),它们的抗性特征列于表III,以建立每种制品的灵敏度和特异性。还测试包含0.125mg/L美罗培南的培养基。显色培养基(Biorad)用作生长对照。在37℃下培养24h和48h后读皿。
表III:表征测试菌株的抗性机制
所用的培养基是包含至少一种显色底物并补充了以下浓度的碳青霉烯的常规琼脂培养基:
2.测试
将培养基分入90mm皿中。
使用1μL(包含约104个微生物)稀释的0.5McF悬浮液将每种菌株点状接种于各培养基上。
在37℃下培养24和48小时后进行读数。
3.结果和解释
结果集中在表IV中。
表IV:在不同培养基上显色的每种抗性类别的菌株的百分比。
实施例3用可商购的培养基比较包含多利培南的培养基
1.培养基和微生物
在上文所述的培养基B(0.065mg/L多利培南)和COLOREXTMKPC培养基上测试100株肠细菌菌株,其中25株产生碳青霉烯酶,并且其抗性特征列于表V。后一种培养基由BioMedDiagnostics Inc.提供并对应于CHROMagarTMKPC即用培养基。
表V:表征测试菌株的抗性机制
2.测试
使用1μL(包含约104个微生物)稀释的0.5McF悬浮液将每种菌株点状接种于各培养基上。
在37℃下培养24和48小时后进行读数。
3.结果和解释
表VI:在培养基上显色的菌株的百分比
包含0.065mg/L多利培南的培养基允许92%测试的产生碳青霉烯酶的肠细菌生长,而在商业培养基上仅80%,无论培养时间。因此包含多利培南的培养基优于商业培养基。
实施例4临床样本上的测试
1.培养基和样本
将载有分离自粪便的细菌群体的200个拭子(具有转运培养基)接种在上文所示的培养基B(0.065mg/L多利培南)、与上文所示的培养基7相似的培养基(16mg/L法罗培南)和COLOREXTMKPC培养基上。
2.测试
将0.5mL无菌水加入包含拭子和转运培养基的管中。将管涡旋。
将10μl所得的悬浮液接种于每种培养基上的4个区中。
在37℃下培养24小时后进行培养基的读数。
3.结果和解释
表VII:从分离自粪便的细菌群体筛选产生碳青霉烯酶的菌株的结果
1产生碳青霉烯酶的肠细菌
从37个粪便样本分离了64株NDM-1型产生碳青霉烯酶的肠细菌(CPE)菌株。包含16mg/L法罗培南的培养基7在灵敏度(86%)和特异性(15个革兰氏假阳性)方面表现出最佳性能。包含0.065mg/L多利培南的培养基B表现出同样高的灵敏度,但是略低的特异性(28革兰氏假阳性)。对于相当于包含法罗培南的培养基的特异性/选择性,COLOREXTMKPC培养基仅使得可以检测62.5%的CPE。
综上所述,通过实施例1、2、3和4,本发明的检测抗碳青霉烯的细菌的方法证实其对现有技术在实验室菌株和临床样本方面的改进。
实施例5不同碳青霉烯在琼脂培养基中的稳定性的测试
制备以上文所示的那些培养基为模型的琼脂培养基并维持在2-8℃的温度下长达9周(63天)。
在D0、D14、D42和D63将ESBL和AmpC菌株以及来自B类、IR或KPC的碳青霉烯酶接种在这些不同培养基上。
这些测试使得可以证实多利培南和法罗培南在琼脂培养基中表现出与厄他培南相近的稳定性,并且大于亚胺培南和美罗培南在琼脂培养基中的稳定性。
实施例6
在法罗培南的存在下,氯唑西林和/或PAbetaN对不透性-抗性(IR)或表现出其他非酶促抗性机制或产生碳青霉烯酶的菌株的最小抑制浓度(MIC)的影响
1.培养基和微生物
在有或无PAbetaN、包含不同浓度的法罗培南和氯唑西林的培养基上测试77株革兰氏阴性菌菌株,其中71株为肠细菌且6株为非肠细菌(非发酵细菌),它们的抗性特征列于表VIII,以建立每种制品的灵敏度和特异性。测试培养基如表IX所述。
表VIII:表征测试菌株的对抗生素抗性的机制
表IX:测试培养基的组成
2.测试
将显色培养基分入120x120方形皿中。
在trypcase大豆琼脂上于37℃下从24-h预培养物进行接种。对于每种菌株,制备生理水中的0.5McF悬浮液。根据琼脂稀释(AD)法,借助多点接种器,将每种悬浮液点状接种(1-2μL)于各培养基上。在37℃下培养24小时后进行读数。
3.结果
结果集中在表X中。
认为不存在细菌生长或者少于或等于3个的菌落数对应于生长抑制。认为存在4个菌落或更多个是阳性生长。
表X:在法罗培南的存在下,氯唑西林和/或PAbetaN对产生碳青霉烯酶或由于其他抗性机制抗β-内酰胺的菌株的生长(显色菌株的数量)的影响
4.解释
表XI:对于产生碳青霉烯酶或由于其他抗性机制抗β-内酰胺的菌株,在氯唑西林的存在下,联合或没有PAbetaN,包含法罗培南的培养基的灵敏度和特异性
4a.氯唑西林和PAbetaN对IR菌株的影响
表XII:与PAbetaN相关或无关的氯唑西林对测试的19株IR菌株的生长的影响
在高达16mg/L的浓度下,单独的法罗培南对这些菌株有很少影响。
从加入50mg/L氯唑西林的时刻观察到IR菌株的抑制,并且对于测试的最高浓度的法罗培南(16和32mg/L)甚至更显著。这种抑制效应随着氯唑西林的浓度增加(例如,对于浓度为16mg/L的法罗培南,加入50mg/L或200mg/L氯唑西林分别允许抑制6株和9株额外的IR菌株)。观察到法罗培南浓度和氯唑西林浓度对IR菌株的联合效应。
这些结果还证实在氯唑西林+PAbetaN的存在下IR菌株的更好抑制。这种效应对于测试的大多数氯唑西林和法罗培南浓度是可见的,但是在200mg/L氯唑西林的存在下非常显著(无论法罗培南浓度)。
4b.氯唑西林和PAbetaN对产生碳青霉烯酶的菌株的影响
在法罗培南的存在下获得的结果证实单独的氯唑西林对产生碳青霉烯酶的菌株的生长有很少影响或没有影响(在测试的3个法罗培南浓度下)。它们还证实将PAbetaN与氯唑西林关联使得可以增加某些菌株对碳青霉烯类的MIC,只要法罗培南浓度保持低于32mg/L。因此,在与50或100mg/L氯唑西林相关的8或16mg/L法罗培南的存在下的检测灵敏度大于在PAbetaN的存在下的检测灵敏度。对于200mg/L氯唑西林以及8或16mg/L法罗培南,加入PAbetaN不改变检测灵敏度。
5.结论
这些结果证实在碳青霉烯的存在下,氯唑西林对不透性抗性菌株的抑制作用。这些结果还证实当氯唑西林与PAbetaN相关时IR菌株的最佳抑制。因此加入氯唑西林和PAbetaN使得可以极大地增加培养基的灵敏度。
将氯唑西林(在测试的3个浓度下)和PAbetaN(25mg/L)加入培养基不改变在8或16mg/L法罗培南的存在下检测产生碳青霉烯酶的菌株。这证实加入PAbetaN倾向于改进它们在与50或100mg/L氯唑西林相关的等于8或16mg/L的法罗培南浓度下的检测。
因此,在法罗培南的存在下,证实通过厄他培南观察到的结果(E-测试),即通过加入氯唑西林的更好的IR菌株抑制,以及在PAbetaN的存在下检测产生碳青霉烯酶的菌株的改进。
Claims (9)
1.一种用于检测和/或鉴定具有对碳青霉烯的抗性的细菌的培养基,包含基础培养基,至少一种显色底物,以及浓度为2至32mg/L的法罗培南。
2.权利要求1的培养基,其中所述培养基进一步包含氯唑西林、双氯西林或氟氯西林。
3.权利要求1或2的培养基,其中所述培养基进一步包含浓度为25至300mg/L的氯唑西林。
4.权利要求1-3任一项的培养基,其中所述培养基进一步包含氯唑西林和苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
5.权利要求2-4任一项的培养基,其中所述培养基进一步包含浓度为25至300mg/L的氯唑西林和浓度为1至50mg/L的苯丙氨酸-精氨酸-β-萘基酰胺(PAbetaN)。
6.权利要求1-5任一项的培养基,其中所述显色底物检测选自葡糖醛酸酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶和脱氨酶的活性。
7.权利要求1-6任一项的培养基,其中所述显色底物选自:5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-葡糖苷)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷(品红β-Gal)、6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸(玫瑰βGur)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(绿A βGlu)和L-色氨酸。
8.权利要求1-7任一项的培养基,其中所述培养基进一步包含浓度为0.05至2mg/L的多利培南。
9.权利要求1-8任一项的培养基,其中所述培养基是液体或固体培养基。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1152477 | 2011-03-25 | ||
FR1152477A FR2973042B1 (fr) | 2011-03-25 | 2011-03-25 | Detection de bacteries presentant une resistance aux carbapenemes |
CN201280014555.0A CN103597092A (zh) | 2011-03-25 | 2012-03-16 | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280014555.0A Division CN103597092A (zh) | 2011-03-25 | 2012-03-16 | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108048522A true CN108048522A (zh) | 2018-05-18 |
Family
ID=45974421
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280014555.0A Pending CN103597092A (zh) | 2011-03-25 | 2012-03-16 | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 |
CN201810029340.5A Pending CN108048522A (zh) | 2011-03-25 | 2012-03-16 | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280014555.0A Pending CN103597092A (zh) | 2011-03-25 | 2012-03-16 | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9347888B2 (zh) |
EP (1) | EP2689026B1 (zh) |
CN (2) | CN103597092A (zh) |
AU (1) | AU2012236786B2 (zh) |
FR (1) | FR2973042B1 (zh) |
WO (1) | WO2012131216A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR3005736B1 (fr) * | 2013-05-17 | 2016-02-12 | Commissariat Energie Atomique | Procede d'observation d'organismes et systeme associe. |
CN103396968B (zh) * | 2013-08-13 | 2015-03-25 | 上海启动元生物科技有限公司 | 一种细菌培养基及其应用 |
JP2016010399A (ja) * | 2014-06-03 | 2016-01-21 | 日水製薬株式会社 | カルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物 |
CN105733974B (zh) * | 2014-12-11 | 2019-02-22 | 明儒成 | 选择性肠球菌增菌培养基 |
CN111601897A (zh) | 2016-12-30 | 2020-08-28 | 奎多公司 | 用于确定细菌对抗生素或益菌剂的易感性的噬菌体介导的免疫分析和方法 |
CN111788314A (zh) | 2017-10-02 | 2020-10-16 | 奎多公司 | 用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法 |
CN109536568A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-29 | 华南农业大学 | 一种快速检测产碳青霉烯酶菌株的方法、试剂盒及其应用 |
CN109706214A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-03 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及分离方法 |
CN114015740B (zh) * | 2021-11-18 | 2023-07-21 | 常德云港生物科技股份有限公司 | 一种猪胆盐的生产方法 |
CN115161377A (zh) * | 2022-08-26 | 2022-10-11 | 四川大学华西医院 | 一种耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的鉴定培养基及其制备方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010010083A1 (en) * | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Alain Rambach | Selective enrichment medium for carbapenem-resistant bacteria |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7452691B2 (en) * | 2005-07-07 | 2008-11-18 | Creighton University | Device and method for detecting antibiotic inactivating enzymes |
FR2925070B1 (fr) * | 2007-12-14 | 2012-10-26 | Alain Rambach | Milieu d'enrichissement selectif de bacteries productrices de bsle avec un acide boronique |
-
2011
- 2011-03-25 FR FR1152477A patent/FR2973042B1/fr active Active
-
2012
- 2012-03-16 CN CN201280014555.0A patent/CN103597092A/zh active Pending
- 2012-03-16 AU AU2012236786A patent/AU2012236786B2/en active Active
- 2012-03-16 WO PCT/FR2012/050556 patent/WO2012131216A1/fr active Application Filing
- 2012-03-16 CN CN201810029340.5A patent/CN108048522A/zh active Pending
- 2012-03-16 EP EP12714799.9A patent/EP2689026B1/fr active Active
- 2012-03-16 US US14/001,565 patent/US9347888B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010010083A1 (en) * | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Alain Rambach | Selective enrichment medium for carbapenem-resistant bacteria |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FIONA WALSH: "Doripenem: A new carbapenem antibiotic a review of comparative antimicrobial and bactericidal activities", 《THERAPEUTICS AND CLINICAL RISK MANAGEMENT》 * |
HANNAH M. WEXLER等: "In Vitro Activities of Faropenem against 579 Strains of Anaerobic Bacteria", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 * |
PATRICE NORDMANN等: "How To Detect NDM-1 Producers", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2689026A1 (fr) | 2014-01-29 |
EP2689026B1 (fr) | 2017-03-08 |
AU2012236786B2 (en) | 2016-07-07 |
FR2973042B1 (fr) | 2017-09-29 |
WO2012131216A1 (fr) | 2012-10-04 |
CN103597092A (zh) | 2014-02-19 |
FR2973042A1 (fr) | 2012-09-28 |
US20130344522A1 (en) | 2013-12-26 |
AU2012236786A1 (en) | 2013-09-26 |
US9347888B2 (en) | 2016-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11111518B2 (en) | Medium for the specific detection of resistant microorganisms | |
CN108048522A (zh) | 具有对碳青霉烯类的抗性的细菌的检测 | |
AU2012236787B2 (en) | Detection of bacteria having an enzymatic resistance to carbapenems | |
JP5845179B2 (ja) | β‐ラクタム抗生物質に対して耐性化しているグラム陰性菌の特異的検出のための培地 | |
AU2013294867B2 (en) | Method of detecting OXA-048 carbapenemase producing bacteria | |
EP2981619B1 (fr) | Utilisation d'au moins un substrat de phosphatase chromogène et/ou fluorogène pour la détection et/ou le dénombrement d'entérobactéries dans un échantillon | |
JP5823390B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
JP5730304B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
US8883437B2 (en) | Nitroreductase enzymatic substrates |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |