CN103396968B - 一种细菌培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌培养基，在普通的细菌培养基中预先加入β-内酰胺类抗生素和/或其盐类中的一种或几种，所述的预加入细菌培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中微溶，溶解度小于10mg/ml。加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素的浓度大于该β-内酰胺类抗生素在25℃条件下的水中的溶解度，且小于100mg/ml。这种细菌培养基可用于选择性培养具有抗生素抗性的细菌，而且这种培养基可以长时间保存。

Description

一种细菌培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种细菌培养基，特别是涉及一种选择性培养具有抗生素抗性的细菌的培养基。
背景技术
培养基是微生物发酵过程或动植物细胞培养过程中供微生物或动、植物细胞生长、繁殖或累积代谢产物所必需的营养基质。培养基的成分包括:碳源、氮源、矿物质，以及其他必需物质，如某些生物自身不能合成的物质，如某些氨基酸、维生素或核苷酸等。此外，培养基中还常加入pH缓冲剂以维持稳定的pH。培养基按其化学成分可分为天然培养基、复合培养基和合成培养基。天然培养基的成分全由天然产物组成，如动、植物或微生物体包括其提取物等。复合培养基是由部分天然产物和部分已知成分的化合物组成。合成培养基由已知成分的化合物所组成，如各种纯的化合物的组合。培养基按其物理形态又可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基等。培养基按其用途还可以分为基础培养基、丰富培养基、鉴别培养基和选择培养基。基础培养基提供最基础的营养成分。丰富培养基是在基础培养基中添加了更多量的营养物质，以实现培养的微生物或动植物细胞快速生长。鉴别培养基是在培养基中加入某些试剂，从而在培养过程中表现出一些特殊反应，可用作鉴别不同类型的微生物或动植物细胞。选择培养基是根据某些生物体的特殊营养要求或对某些化学物质具有抗性而设计的培养基。
选择培养基是生物学和生物医药科研和生物工程生产实践中很常用的一类培养基。抗生素常被加入到培养基中，以杀死或限制对抗生素敏感菌生长繁殖，从而选择性培养菌群中对抗生素具有抗性的细菌。抗生素是能抑制细菌生长或能杀死细菌的化学物质。有些细菌天然的对某些抗生素具有抗性，可在含该抗生素的选择性培养基中生长。也可使某些原本不具有抗生素抗性的细菌携带能表达抗生素抗性的遗传元件或产生基因突变而获得对这种抗生素的抗性，这种抗性称为获得性抗性。培养基中常用的抗生素抗性基因有以下几种：氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin resistance gene,ampr)、四环素抗性基因(Tetracycline resistancegene,tetr)、氯霉素抗性基因(chloramphenicol resistance gene,Cmr,cat)、卡那霉素和新霉素抗性基因(kanamycin/neomycin resistance gene,kanr,neor)。氨苄青霉素抗性基因是基因工程中使用最广泛的选择标记基因，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因，用以使表达该基因的细菌对氨苄青霉素产生抗性，从而能在氨苄青霉素存在的情况下正常生长。
氨苄青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，可干扰细菌细胞壁的合成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭或抑制作用。氨苄青霉素抗性基因实际上是一种β-内酰胺酶基因，其产物为β-内酰胺酶，可水解氨苄青霉素，从而解除了氨苄青霉素的毒性。早在首次大规模使用盘尼西林(penicillin)前，就已发现细菌中有一种酶可以破坏盘尼西林，这是第一个鉴定的β-内酰胺酶[1]。分子生物学、生物工程、生物医药和工业微生物领域中所用的氨苄青霉素抗性基因是bla基因，它编码TEM-1β-内酰胺酶(TEM-1β-lactamase)。TEM-1是细菌中最常见的β-内酰胺酶，于上世纪60年代被分离于大肠杆菌和肠道沙门氏菌中[2]。上世纪70年代，blaTEM-1基因在肠杆菌属中快速扩散，到了上世纪80年代初，blaTEM-1基因已成为临床中最普遍的抗生素抗性基因[3]。按其基因序列和蛋白序列来分类，TEM-1属于A类β-内酰胺酶(Class A)，这是最大的也是研究最多的一类β-内酰胺酶，历史上也曾称其为“盘尼西林酶”(penicillinases)[4]。按其功能来分类，TEM-1属于2b类β-内酰胺酶(Group 2b)，TEM-1很容易水解青霉素(penicillins)，对早期的头孢菌素(cephalosporins)(另一大类的β-内酰胺类抗生素，即所谓的第一代头孢菌素)也有一定的水解能力[5, 6]。
传统上，被用来选择性培养携带bla基因的细菌的β-内酰胺类抗生素是氨苄青霉素。因此，bla基因常被称作为氨苄青霉素抗性基因。然而，bla基因所编码的TEM-1β-内酰胺酶能水解多种β-内酰胺类抗生素，而不仅仅是氨苄青霉素。Novagen的科学家就曾建议，也可以用羧苄青霉素代替氨苄青霉素作为选择性抗生素使用[7]。氨苄青霉素(ampicillin)及羧苄青霉素(carbenicillin)均为广谱青霉素，可有效杀灭革兰氏阳性菌，也对包括大肠杆菌在内革兰氏阴性菌有较好的杀灭效果。现代生物学、生物工程、生物医药以及工业微生物中大量应用的大肠杆菌属革兰氏阴性菌。培养基中常使用浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素，可有效杀灭不具有抗生素抗性的大肠杆菌等革兰氏阴性菌，而使具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌正常生长。
β-内酰胺类抗生素为分子结构中含具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素类抗生素、头孢菌素抗生素以及一些非典型的β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺类抗生素本身为有机酸，纯品溶液为酸性，pH约为2-4左右。在实际使用于生物体时，一般将这类抗生素制成其盐类，如钠盐、钾盐等，以适应生物体所需的酸碱度，并可提高其溶解度。因此一般所说的β-内酰胺类抗生素均是指其各种各样的盐类化合物，其有效成分则仍为抗生素本身。
β-内酰胺类抗生素的核心结构β-内酰胺环是一个四元环，其环内张力大，容易开环。此外，其酰胺键易受亲核和亲电攻击而水解开环。因此，尽管这类抗生素的干燥纯品较稳定，但其水溶液稳定性很差。这也是β-内酰胺类抗生素的注射剂均为粉剂，临使用前才溶解成注射液的原因。
氨苄青霉素(ampicillin)及羧苄青霉素也属于β-内酰胺类抗生素。氨苄青霉素的药品说明书表明，溶于水或生理盐水(0.9％氯化钠)并保存在4℃的氨苄青霉素，其活性在2-3天内就会下降10％，而如果溶于葡萄糖注射液的话，即便存放在4℃，氨苄青霉素的活性在1小时左右就会下降10％。这说明在溶液中的氨苄青霉素稳定性相当差。以此佐证，在实践中，含有氨苄青霉素的液体培养基和固体平板培养基一般只能在4℃存放一个月左右，只有少数时候，存放了2个月的含氨苄青霉素的培养基还可以使用。羧苄青霉素比氨苄青霉素更耐酸，但在培养基适用的中性pH条件下，其稳定性相比于氨苄青霉素并无显著增加。含有羧苄青霉素的培养基的有效保质期仍只有1-2个月。在-20℃到0℃的范围内，氨苄青霉素反而更不稳定，其它β-内酰胺类抗生素也有相似的特性[8,9]。尽管更低的保存温度能延长溶液中β-内酰胺类抗生素的保质期，但以琼脂为代表的半固体培养基只能储存于冰点温度以上，因为结冰会使半固体培养基开裂或变形，影响使用效果。β-内酰胺类抗生素在溶液中不稳定这一因素也局限了预添加这一类抗生素的培养基产品的大规模商业化。如著名的化学试剂公司Sigma-Aldrich曾经供应过预添加氨苄青霉素的琼脂平板培养基，该产品的保质期极短，一般只有1-2个月。Sigma-Aldrich现已不再供应这些产品了。也有一些小规模的国外公司生产和供应预添加抗生素的半固体琼脂平板培养基，但都明确说明这些产品的保质期最长不超过2个月，因而其产量也极为有限。如果能使预加了β-内酰胺类抗生素的培养基可以长期稳定保存，就可以是这一产品实现大规模商业化，大大节约操作人员的时间和效率。但目前，尚无这方面的研究和报道。
为克服β-内酰胺类抗生素在溶液中稳定性差的不足，人们研究开发了具有相对长效的β-内酰胺类抗生素品种，这些长效抗生素大多通过降低药物溶解度，从而实现较长时间的缓释作用，常见的有普鲁卡因青霉素(Procaine penicillin)、苯明青霉素(Benethamine Penicillin)、苄星青霉素、苄星邻氯青霉素(Cloxacillinbenzathine)和苄星头孢匹林(Cephapirin benzathine)等。普鲁卡因青霉素(CAS：54-35-3)为青霉素的普鲁卡因盐，在水中微溶，溶解度约为4mg/ml。苯明青霉素(CAS:751-84-8)又称苄胺青霉素，是青霉素的苯乙苄胺盐，在水中的溶解度约为1mg/ml。苄星青霉素(CAS：1538-09-6)、苄星邻氯青霉素(CAS:23736-58-5)和苄星头孢匹林(CAS：97468-37-6)分别为青霉素、邻氯青霉素和头孢匹林的二苄基乙二胺盐，它们溶解度更低，约为50-200μg/ml。由于这些药物的溶解度极低，因而以悬浊液的形式注射到体内后，未溶解的药物就好像药物的储蓄池，随着抗生素药物的缓慢溶解而释放，实现长时间保持一定血药浓度的目的。在这类低溶解度药物的悬浊液中，溶解部分的药物已达饱和浓度，浓度等于药物的溶解度。在人体内，普鲁卡因青霉素的药效可达48小时；苄星青霉素的药效可达3-4周；而苄星邻氯青霉素和苄星头孢匹林常用在兽医领域，药效也可达3-4周。而一般的β-内酰胺类抗生素在生物体内的药效只能维持几个小时。此外，通过降低了药物溶解度，也可使药物在液体环境中的稳定性大为增加。商品名为Bicillin的即用型注射用悬液剂型成分即是苄星青霉素和普鲁卡因青霉素。数据显示，苄星头孢匹林(benzathine cephapirin)的悬液制剂在低于25℃的条件下，可稳定保存长达36个月[10]，这说明这类低溶解度药物的悬液制剂是可以稳定保存的。而一般的β-内酰胺类抗生素注射剂只能做成粉针剂的形式。长久以来，在培养细菌用的培养基中，仅使用溶解度高的可溶性抗生素用作培养基的选择性试剂，至今没有研究将这类低溶解度的长效β-内酰胺类抗生素作为培养基的选择性抗生素使用，也未有数据显示预加了这类长效青霉素类抗生素的培养基是否具有较长的储存时间。
参考文献：
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发明内容
针对现有技术β-内酰胺类抗生素或其盐添加到培养基中后稳定性差，选择性培养具有β-内酰胺类抗生素抗性细菌的培养基保质期短的问题，设计了本发明的技术方案，具体实施方式为：
一种细菌培养基，在普通的细菌培养基中预先加入β-内酰胺类抗生素和/或其盐类中的一种或几种，所述的预加入细菌培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类为在25℃条件下水中溶解度大于0mg/ml，小于10mg/ml的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类。
进一步，所述的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类为普鲁卡因青霉素、苯明青霉素、苄星青霉素、苄星邻氯青霉素或苄星头孢匹林。
进一步，加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的浓度大于该β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中的溶解度，且小于100mg/ml。
所述的细菌培养基用于选择性培养具有β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。
本发明公开了能长期保存的预加β-内酰胺类抗生素的培养基。能长期保存的预加β-内酰胺类抗生素的培养基在现代生物学、生物工程、生物医药以及工业微生物等领域中可用于选择性地培养具有的β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。所述的能长期保存或具有较长的保质期是指经过较长时间保存后，培养基中的β-内酰胺类抗生素的浓度仍处于有效工作浓度范围内。所述的β-内酰胺类抗生素的有效工作浓度是指，在此浓度范围内，培养基中的β-内酰胺类抗生素可有效抑制无β-内酰胺类抗生素抗性的细菌生长，或有效杀灭无β-内酰胺类抗生素抗性的细菌，或两种效应兼之，从而可实现筛选培养具有β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。
本发明中的培养基的保质期是指在这种培养基的冰点温度以上，40℃以下的保存条件下的保质期。培养基中，由于加入了各种盐类及矿物质，其冰点一般低于0℃。实际应用中，便于操作的保存温度为0-30℃，进一步为0-16℃，最常用的保存温度为2-8℃。在上述存放温度下，本发明中的培养基的保质期远大于目前传统使用的含氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在相同温度下的保质期，一般地这种培养基的保质期大于6个月，更优地大于12个月，更优地大于24个月。
本发明中的培养基经长期储存后，不影响正常使用。即预加β-内酰胺类抗生素的培养基存放6个月、12个月和24个月后，对细菌的生长速度，形态，性状，遗传稳定性等没有显著改变，不影响实验或生产的进行和效率。具体地，是在相同培养条件下的培养过程的任一时间点上，具有β-内酰胺类抗生素抗性的细菌在经上述时间储存后的本发明中的培养基中的生长速度及活菌体数目不小于在新鲜配制培养基中的70％，更优地不小于90％，更优地为在新鲜配制培养基中的100％。
本发明中的培养基即为在现有各种类型的细菌培养基中预添加β-内酰胺类抗生素。抗生素是能抑制细菌生长或能杀死细菌的化学物质。β-内酰胺类抗生素是含有β-内酰胺环，并以β-内酰胺环为杀菌抑菌活性中心的抗生素及其盐类，包括青霉素类抗生素及其盐类、头孢菌类抗生素及其盐类以及任何其它非典型β-内酰胺类抗生素及其盐类。
本发明所述的预加入培养基中的β-内酰胺类抗生素及其盐类具有较低的溶解度这一物理特性。本发明所述的较低的溶解度，是指在25℃条件下的水中的溶解度小于10mg/ml,更优地小于1mg/ml，最优地小于0.25mg/ml。应用者可通过饱和浓度法测定抗生素在水中的溶解度，具体地，在25℃条件下，取一定质量(W1)的抗生素加入到100ml的水中，恒温充分搅拌溶解1小时以上，用滤纸滤出未溶解的抗生素，干燥后称重(W2)，该抗生素的溶解度即为W1-W2。应用者也可以通过测定抗生素过滤液中的抗生素浓度来确定该抗生素的饱和溶液浓度即溶解度。测定溶液中β-内酰胺类抗生素可运用HPLC法和比色法等，此类方法被广泛应用于检测牛奶等食物中残留的β-内酰胺类抗生素含量，这些方法所使用的试剂、仪器和操作流程等均有公开的资料可查，应用者可以轻易获得。本发明中的培养基含有上述较低溶解度的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的一种或几种组合。加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的浓度大于该β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中的溶解度，且小于100mg/ml，更优地且小于10mg/ml，最优地且小于1mg/ml，由于β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的溶解度不同，选择的最大的添加量也不同，添加量要保证β-内酰胺类抗生素和/或其盐类要有一部分不溶的存在于培养基中，随着物质消耗逐渐溶解，使得培养基具有较长的保质期，但添加量过大也会使得培养基过于粘稠，且增加成本。在本发明的培养基中，具有较低溶解度这一物理特性的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在培养基中大部分以未溶的固体形式存在，并缓慢溶解释放，使培养基能保持含有有效工作浓度的β-内酰胺类抗生素达24个月以上。β-内酰胺类抗生素在培养基中能发挥长时间缓释作用，保持其长时间处于有效工作浓度的基础为这些β-内酰胺类抗生素及其盐类在培养基中具有较低的溶解度这一物理特性。因此，在培养基中具有所述较低溶解度的β-内酰胺类抗生素或其盐类均可作为适用的β-内酰胺类抗生素加入到培养基中，而使预加这些β-内酰胺类抗生素的培养基具有较长的保质期，可以长期发挥作用。
具体实施方式
实施例1 培养基中氨苄青霉素或羧苄青霉素的保质期测试
LB液体培养基(含1％的胰蛋白胨、0.5％的酵母抽提物和0.5％的氯化钠，pH＝7.0)及LB琼脂平板培养基(LB液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入100μg/ml、1mg/ml、10mg/ml和100mg/ml的氨苄青霉素或羧苄青霉素。于4℃储存2个月，3个月和4个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含100μg/ml和1mg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在2个月时已不能完全抑制大肠杆菌的生长，含10mg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在3个月时已不能完全抑制大肠杆菌的生长，而含100mg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在4个月时也已不能完全抑制大肠杆菌的生长，说明传统使用的含100μg/ml氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基的保质期不超过2个月，而增加这两种抗生素的浓度也并不能显著延长培养基中抗生素的有效期。
实施例2 LB培养基中普鲁卡因青霉素的保质期测试
在LB液体培养基(含1％的胰蛋白胨0.5％的酵母抽提物和0.5％的氯化钠，pH＝7.0)和LB琼脂平板培养基(LB液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入10mg/ml、40mg/ml和80mg/ml的普鲁卡因青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度普鲁卡因青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例3 SOC培养基中普鲁卡因青霉素的保质期测试
在SOC液体培养基(含2％的胰蛋白胨，0.5％的酵母抽提物和0.05％的氯化钠，2.5mM的氯化钾和10mM的氯化镁，pH＝7.0)和SOC琼脂平板培养基(SOC液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入10mg/ml、40mg/ml和80mg/ml的普鲁卡因青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度普鲁卡因青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例4 TB培养基中苯明青霉素的保质期测试
在TB液体培养基(含1.2％的胰蛋白胨、2.4％的酵母抽提物、0.5％甘油，17mM的磷酸二氢钾和72mM的磷酸氢二钾)和TB琼脂平板培养基(液体TB培养基中加1.5％琼脂)中分别加入5mg/ml和25mg/ml的苯明青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度苯明青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例5 M9基本培养基中苯明青霉素的保质期测试
在M9基本液体培养基(含48mM的磷酸氢二钠、22mM的磷酸二氢钾、0.05％的氯化钠、0.1％氯化铵、2mM的硫酸镁、0.1mM的氯化钙和0.2％的葡萄糖)和M9基本琼脂平板培养基(M9基本液体培养基中1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入5mg/ml和25mg/ml的苯明青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度苯明青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例6 YT培养基中苄星邻氯青霉素的保质期测试
YT液体培养基(含0.8％的胰蛋白胨，0.5％的酵母抽提物和0.25％的氯化钠，pH＝7.0)和YT琼脂平板培养基(YT液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.5mg/ml和2.5mg/ml和的苄星邻氯青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星邻氯青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例7 YPD培养基中苄星邻氯青霉素的保质期测试
YPD液体培养基(含2％的胰蛋白胨，1％的酵母抽提物和2％的葡萄糖，pH＝7.0)和YPD琼脂平板培养基(YPD液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.5mg/ml和2.5mg/ml和的苄星邻氯青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星邻氯青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例8 LB培养基中苄星青霉素的保质期测试
LB液体培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5％的酵母抽提物和0.5％的氯化钠，pH＝7.0)和LB琼脂平板培养基(LB液体培养基中1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.5mg/ml和2.5mg/ml的苄星青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例9 SOC培养基中苄星青霉素的保质期测试
在SOC液体培养基(含2％的胰蛋白胨，0.5％的酵母抽提物和0.05％的氯化钠，2.5mM的氯化钾和10mM的氯化镁，pH＝7.0)和SOC琼脂平板培养基(SOC液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.5mg/ml和2.5mg/ml的苄星青霉素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星青霉素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例10 YT培养基中苄星头孢匹林的保质期
YT液体培养基(含0.8％的胰蛋白胨，0.5％的酵母抽提物和0.25％的氯化钠，pH＝7.0)和YT琼脂平板培养基(YT液体培养基中加1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.25mg/ml和1mg/ml的苄星头孢匹林。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星头孢匹林的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例11 M9基本培养基中苄星头孢匹林的保质期
在M9基本液体培养基(含48mM的磷酸氢二钠、22mM的磷酸二氢钾、0.05％的氯化钠、0.1％氯化铵、2mM的硫酸镁、0.1mM的氯化钙和0.2％的葡萄糖)和M9基本琼脂平板培养基(M9基本液体培养基中1.5％琼脂，pH＝7.0)中分别加入0.25mg/ml和1mg/ml的苄星头孢匹林。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，含上述浓度的苄星头孢匹林的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例12 培养基中普鲁卡因青霉素和苄星邻氯青霉素的保质期测试
LB液体培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5的酵母抽提物和0.5的氯化钠，pH＝7.0)和LB琼脂平板培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5的酵母抽提物，0.5的氯化钠和1.5％琼脂，pH＝7.0)中同时加入25mg/ml的普鲁卡因青霉素和2.5mg/ml的苄星邻氯青霉素两种抗生素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，上述含混合β-内酰胺类抗生素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例13 培养基中普鲁卡因青霉素、苯明青霉素、苄星青霉素和苄星头孢匹林的保质期
LB液体培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5的酵母抽提物和0.5的氯化钠，pH＝7.0)和LB琼脂平板培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5的酵母抽提物，0.5的氯化钠和1.5％琼脂，pH＝7.0)中同时加入50mg/ml的普鲁卡因青霉素、5mg/ml的苯明青霉素、1mg/ml的苄星青霉素和0.5mg/ml的苄星头孢匹林四种抗生素。于4℃储存6个月，12个月，18个月，24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌DH5α菌株，于37℃培养过夜。测试显示，上述含混合β-内酰胺类抗生素的培养基在储存上述时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。
实施例14 伽马射线辐照灭菌过程对含β-内酰胺类抗生素的培养基保质期影响测试
用高剂量的钴60伽马射线对实施例2-13中预加β-内酰胺类抗生素的液体培养基和琼脂平板培养基进行辐照灭菌处理。使用的剂量为30KGy，该剂量已超过医用级别灭菌所需的25KGy剂量，足以保证灭菌确保水平小于10-6(SAL<10-6)。经伽马射线照射后的培养基于4℃储存6个月，12个月和18个月，24个月后取出测试。测试结果显示，所有经伽马射线照射的培养基和未照射培养基中的抗生素保质期并无差异。经照射过的培养基在上述储存时间后，均能完全抑制大肠杆菌DH5α菌株的生长，说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。

Claims (4)

1.一种细菌培养基，在普通的细菌培养基中预先加入β-内酰胺类抗生素和/或其盐类中的一种或几种，其特征在于，所述的预加入细菌培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类为在25℃条件下水中溶解度大于0mg/ml，小于10mg/ml的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类；
所述的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类为普鲁卡因青霉素、苯明青霉素、苄星青霉素、苄星邻氯青霉素或苄星头孢匹林；
加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的浓度大于该β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中的溶解度，且小于100mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种细菌培养基，其特征在于，加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的浓度大于该β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中的溶解度，且小于10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种细菌培养基，其特征在于，加入到培养基中的β-内酰胺类抗生素和/或其盐类的浓度大于该β-内酰胺类抗生素和/或其盐类在25℃条件下的水中的溶解度，且小于1mg/ml。
4.权利要求1-3任一权利要求所述的细菌培养基用于选择性培养具有β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。
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