CN103512871B - 一种细菌耐药性荧光检测方法及其诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法及其诊断试剂盒/诊断试剂，其中，它采用仅能被广谱β内酰胺酶降解的荧光底物通过双荧光信号所测得不同波长下的吸光度差异检测所述个体或其生物样品的细菌耐药性。本发明提供的检测方法及其所得到检测试剂盒可以检测出市售产品所不能检测的头孢3、4代耐药菌，且可达到10⁵～10⁸个耐药菌的检测值，填补了市场空白，为临床中抗生素的使用提供了更有效的监测方法和使用向导，具有极大的实用价值。

Description

一种细菌耐药性荧光检测方法及其诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种荧光检测细菌耐药性及其诊断试剂盒，更具体地说是涉及一种荧光检测β内酰胺类抗生素治疗的细菌耐药性及其诊断试剂盒，属于医药技术领域。

背景技术

自从人类在上世纪20年代首次发现以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素以来，它们已经成为治疗细菌感染的一线药物，挽救了无数人的生命。同其它类别的抗生素相比，β-内酰胺类抗生素具有疗效高，毒性低的特性。但是，细菌也在不断的进化各种抗药机制。目前，抗药性细菌感染已经成为全球性的问题。特别是在中国，印度，已经其他一些国家，由于存在着滥用抗生素的现象，出现超级抗药性细菌，从而导致无药可治的可能性是不容忽视的。

细菌对抗β-内酰胺类抗生素的最主要机制是通过β-内酰胺酶实现的。它们可以有效的分解β-内酰胺类抗生素。为抵消这些酶的作用，在临床上可以采取了两种方法。第一，共同使用β-内酰胺类药物和β-内酰胺酶抑制剂。一些处方药利用这一策略，包括(氨苄青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉维酸钾)。第二是开发不被普通β-内酰胺酶降解的药物，比如许多第三和第四代的广谱头孢菌素。然而，抗生素的发展和抗药性细菌的出现是一个矛和盾的关系。目前，许多在临床上检测到的细菌已经具有了分解第三和第四代的头孢菌素的能力。这主要是由广谱β-内酰胺酶所造成的。

由于细菌耐药性的发展与误用/滥用抗生素是紧密相关的，为延长广谱抗生素的有效使用期，在临床上治疗细菌感染应该尽可能的做到对症下药，避免使用无必要的广谱抗生素。为了实现这一目标，快速，灵敏，和准确诊断细菌菌株对各种β-内酰胺类药物的药敏程度是必须的步骤。

在西方发达国家，抗生素的使用受到严格控制。但在中国，印度，以及发展中国家，抗生素被大大滥用和误用，其后果是抗药性细菌的不断出现。2009年在印度出现的新德里金属β-内酰胺酶，NDM-1，是一个典型的例子。这个蛋白质酶可以水解目前所有的β-内酰胺类抗生素。换句话说，含有NDM-1的细菌可以抵御任何β-内酰胺类抗生素。同时，由于全球的交通便利，在一地得到的抗药性细菌可以很容易的传播到世界各地，从而造成大规模的微生物感染。

为尽可能的延缓抗药性细菌的出现和延长现有抗生素的使用寿命，防止抗生素的滥用和误用是一个有力的手段。这要求在临床治疗细菌感染过程中，能够尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度，以防止过分使用，或者无效使用抗生素。另外，在治疗败血症病人时，由于及早使用正确的抗生素和病人的生存率直接挂钩，这也需要尽快确定细菌对不同抗生素的抗药和敏感程度。

β-内酰胺类抗生素被广泛应用在临床和畜牧业中用来治疗细菌感染。特别是第三四代头孢菌素是一线抗生素药物。但是，广谱β-内酰胺酶的出现使得三四代头孢菌素不再是治疗细菌感染的万能妙药。在临床上迫切需要一种快速的能够确定细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性的分析方法。利用β-内酰胺酶的荧光底物来检测β-内酰胺酶的存在是一个普遍的分析方法。事实上，目前许多现有的荧光β-内酰胺酶的底物可以做到高灵敏度和实时的对β-内酰胺酶进行检测。然而，所以这些分子都不具有选择性，即不可能区分普通和广谱β-内酰胺酶。

由于含有普通β-内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素敏感，而含有广谱β-内酰胺酶的细菌对第三四代广谱头孢菌素具有抗药性。我们希望能够有一种快捷的方法来区分这两类细菌，从而可以尽快确定临床细菌感染是否可以用第三四代广谱头孢菌素来治疗。

目前，国内外用来检测细菌抗药性的方法可以分成3大类。

第一类是基于传统的微生物培养技术，又可以分为液体培养基和固态培养基的方法。液体培养基方法可以准确测定一种抗生素的最低抑菌浓度。但是，当待测抗生素品种较多时，此方法工作量大，所以已经逐渐被固态培养基方法所取代。固态培养基方法又可以分为若干类，主要有纸片扩散法，E-test，等等。比如，在纸片扩散中，不同的抗生素药片被放置在固态培养基表面。当细菌在培养基表面生长时，如果对某种抗生素敏感，这在此药片周围形成一个清晰的环状无菌带。其大小受细菌对抗生素的敏感程度所决定。如果细菌对此抗生素有抗药性，这不会形成此无菌带。这类基于微生物培养技术的方法目前是细菌抗药性检测的主流方法。但是，由于细菌生长需要时间，此类方法至少需要48-72小时。对于生长缓慢的细菌，比如结核分支杆菌，需要的时间更长，因此对于需要尽快知道细菌抗药性的情况，例如败血症病人的治疗，这类方法无法及时提供选择抗生素的必要信息。

第二类方法是基于聚合酶链反应的基因方法。病人样品可以用针对β-内酰胺酶基因的特定探针进行基因扩增，然后来检测得到抗药性的基因变异。此类方法快速，灵敏。但是，由于此类方法不是功能性测定，所以只能用来检测已知的耐药机制，而不能确定以往未知的全新抗药机理。

第三类方法是直接测定β-内酰胺酶的降解β-内酰胺类抗生素的功能。目前有多种β-内酰胺酶的荧光底物可以选择。这类底物本身没有荧光，但是，当它们被β-内酰胺酶分解后，会有荧光产品出现。通过观测荧光强度变化，可以确定β-内酰胺酶的存在。但是，现有β-内酰胺酶底物无法区分普通和广谱β-内酰胺酶。所以并不能够起到指导抗生素选择的作用。

概括而言，虽然目前的相关技术在它们的适用领域中有无可取代的位置，但在特定的应用中，特别是在处理治疗败血症病人的过程中，它们也有着种种局限。所以，一种可以快速区分普通和广谱β-内酰胺酶的检验方法是迫切需要的。在国内外尚无同类产品。类似产品有日本Kanto Chemical公司生产的Cica-β-test试剂。Cica-β-test试剂也可以用来检测细菌是否对三四代头孢菌素具有抗药性。但是，由于Cica-β-test试剂检测依赖于颜色变化(阳性样品的颜色从黄色变到红色)，灵敏度至少要比本产品的荧光检测法低一个数量级，同时也不能直接用于血液检测。另外一个类似产品是美国Life Technologies公司生产的GeneBLAze试剂。GeneBLAze试剂也是基于荧光检测，但是，此试剂只能用来无差别的检测所有的β-内酰胺酶的存在，而不能特异性的检测能够降解三四代头孢菌的广谱β-内酰胺酶。此外，GeneBLAze试剂只是一个研究用产品，用来进行一些真核细胞的光学显像实验，而不是在临床上用于检测细菌抗药性。

发明内容

发明所需要解决的技术问题是提供了新的广谱β-内酰胺酶检测试剂盒及其制备方法，即一种新的细菌耐药性检测试剂盒及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明针对现有技术的不足，通过大量生物技术实验等实践研究以及文献检索和理论研究，目的之一意在提供一类细菌耐药性检测试剂盒，即提供一类用于检测细菌耐药性的检测试剂盒，特别是可以进行定性与定量的检测细菌耐药性检测试剂盒。

本发明的目的之二是提供一种细菌耐药性荧光检测试剂盒，其包含特异性识别广谱β-内酰胺酶的荧光底物，

本发明的目的之三是一种含有所述的荧光底物的检测试剂盒或试剂的制备方法。

本发明的目的之四是提供一种定量和定性检测细菌耐药性的方法，其中包括使用本发明所述的试剂盒或试剂。

本发明的目的之五是提供所述的试剂盒或试剂在定量或定性检测细菌耐药性中的用途。

(一)技术构思

早期的青霉素以及一二代的头孢菌素能够被普通β-内酰胺酶所分解，所以含有普通β-内酰胺酶的细菌对它们具有抗药性。但是，在只有普通β-内酰胺酶存在的情况下，第三和第四代头孢菌素是稳定的。这主要是因为第三和第四代头孢菌素的β-内酰胺环上有一个特殊的取代基，对普通β-内酰胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β-内酰胺酶不能有效的分解三四代头孢菌素。换句话说，只含有普通β-内酰胺酶的细菌对三四代头孢菌素敏感。然而，广谱β-内酰胺酶，包括金属β-内酰胺酶以及由普通β-内酰胺酶突变而来的超广谱β内酰胺酶，不受此取代基的影响，因而可以有效的降解三四代头孢菌素。

以往的β-内酰胺酶的荧光底物不具有在三四代头孢菌素上的特殊取代基，所以它们可以同时被普通和广谱β-内酰胺酶所分解。因此它们可以检测所有的β-内酰胺酶，但是无法区分这两类的β-内酰胺酶。

成功设计并合成一种全新的β-内酰胺酶的荧光底物。此底物的化学结构包含了在三四代头孢菌素上的特殊取代基。所以，它对普通β-内酰胺酶稳定，但是可以被广谱β-内酰胺酶所降解，从而产生可以观察到的荧光信号变化。因此，在临床上使用时，可以特定检测到含有广谱β-内酰胺酶的抗药性细菌。

根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品细菌耐药性荧光检测试剂盒。

(二)细菌耐药性荧光检测试剂盒

本发明提供了一种检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法及其诊断试剂盒/诊断试剂，其中，它采用仅能被广谱β内酰胺酶降解的荧光底物通过双荧光信号所测得不同波长下的吸光度差异检测所述个体或其生物样品的细菌耐药性。

优选地，所述的荧光底物包含以下化合物(I)或其对映体、消旋体或非对映异构体

优选地，所述的细菌耐药性检测方法所使用的对照品为等体积的非变性细胞缓冲溶液。

优选地，所述的细菌耐药性检测方法的入射光波长为440nm，双荧光信号分别为520nm和590nm。

优选地，所述的细菌耐药性检测方法是通过检测所述个体或其生物样品的在双荧光信号下的荧光强度比与对照品的荧光强度比的差值。

一种细菌耐药性荧光检测试剂盒内设有：双蒸馏水、非变性细胞裂解缓冲液和荧光底物，其中所述荧光底物为如下具体结构的化合物I或其对映体、消旋体或非对映异构体：

优选地，所述的非变性细胞缓冲液包括：pH值7.5的磷酸钠缓冲液、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。

优选地，所述的非变性细胞缓冲液包括：20毫摩尔/升pH值7.5的磷酸钠缓冲液、150毫摩尔/升的氯化钠、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，其中三者体积比为1：1：1。

与现有技术相比，本发明具有如下技术特长：

本发明为医药等行业提供了一种新的细菌耐药性荧光检测试剂盒及其制备方法，从而拓展了临床抗生素用药新指导的应用。

本发明细菌耐药性荧光检测试剂盒是安全的，能够用于医疗、诊断等工业和行业的大规模生产和应用。

与现有的细菌耐药性诊断产品相比，本发明细菌耐药性荧光检测试剂盒在实际应用等方面，具有以下显著特点：

1)检测具有广谱β-内酰胺酶的感染细菌，区别与以往仅检测普通β-内酰胺酶的感染细菌，临床上用于三、四代头孢菌素耐药性检验，提高治疗成功率；不受细菌类别的限制。革氏阳性和阴性细菌均可以被检测，如：阴沟肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌等。

2)可以直接检验血液中的抗药性细菌的存在，所以可以直接用于检测败血症病人的血样。

3)重感染细菌症的早期诊断，如败血症感染细菌的早期检测，便于临床及早治疗；

4)重感染细菌症的快速诊断，最大可能争取治疗时间，挽救病人生命；

5)判断重感染细菌广谱β-内酰胺酶的亚属，帮助医生制订有效的治疗方案；

6)能检测各种广谱β-内酰胺酶(即ESBLs)，而常规PCR仅仅能够检测一个基因是否存在，而不能确定基因的序列，所以常规PCR不能用于临床诊断ESBLs；

7)目前的DNA芯片仅可以用于诊断已知的ESBLs，但是不能诊断新出现的广谱β-内酰胺酶变异，本发明提供的诊断试剂盒不仅能检测目前已知的“超级细菌”如：鲍氏不动杆菌(ABA)、铜绿假单胞菌(PA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(CRPK)、大肠埃希菌(CRE)，还可以检测目前未知的和未来可能出现的新型“超级细菌”。

此外，加上本发明提供的产品，市场上将出现两个个等级的产品，

1)现有的以(nitrocefin,头孢硝噻吩)为代表的检测普通β-内酰胺抗药性，或者K1025；

2)本发明提供的诊断试剂盒(CEP-R)用于检测广谱β-内酰胺抗药性。

三种产品联合使用，构成了对临床指导意义。三种产品检测结果的临床意义见下表：

因此，本发明所述方法的成功开发对于临床抗生素用药有着重要的意义。在临床上，医生会根据病人的症状，凭经验直接跳过普通β-内酰胺抗药性的检测，因为能被普通青霉素治愈的病症往往很轻。再加上三、四代头孢菌素已经是目前市场的主流，所以这也直接导致现有的K1025药性检验临床意义不大的原因。Cica-b-test是通过颜色变化来检测广谱内酰胺酶(从黄色到红色)，不但灵敏度低，而且不和血液检测兼容。CEP-R，使得合理指导抗生素用药变得切实可行。所以，我们的发明在合理指导抗生素用药上具有里程碑的作用。

总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该细菌耐药性荧光检测试剂盒，对改进和提高现有的该细菌耐药性荧光检测试剂盒具有重要价值。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

本发明研究了现有的荧光检测技术，提供了一种新的细菌耐药性荧光检测试剂盒，便于现代生物、预防保健、临床诊断等领域的安全使用。

本发明最终需要制备成细菌耐药性荧光检测试剂盒进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题，可以与发明人直接联系。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种细菌耐药性荧光检测试剂盒及其使用方法及一些试验研究内容，但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。

也就是说，在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，特别是这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，不能解释为了对本申请的限制或者用来限制本发明的保护范围。

为了更清楚地说明本发明，下面结合如下实施例对本发明作详细描述。

实施例1、荧光底物C-1的制备

合成路线

以头孢噻肟为原料(cefotaxime,455.5毫克，1.00毫摩尔)和甲苯磺酸(172.2毫克，1.00毫摩尔)溶解在5毫升乙腈和8毫升的水溶液中；继续加入Diphenyldiazomethane(199.2毫克，1.00毫摩尔，1当量)；在-20°C下混合搅拌4到5分钟，直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节pH值到9后，用乙酸乙酯(50毫升)提取；有机层先后用水(15毫升)洗涤两次，然后用无水氯化钙干燥；用旋转蒸发仪除去溶剂。富集物用30％正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化；收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到白色固体500毫克化合物1(得率80％)。

核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)δ7.81(s,1H),7.50–7.29(m,10H),6.99(s,1H),6.83(s,1H),6.11(s,1H),5.45(s,2H),5.12(s,1H),5.07(d,J=12.6Hz,1H),4.83(d,J=12.6Hz,1H),4.09(s,3H),3.59(d,J=18.6Hz,1H),3.45(d,J=18.6Hz,1H),2.05(s,3H)ppm;质谱(ESI)计算分子量:C₂₉H₂₇N₅O₇S₂Exact Mass:621.14,测量分子量622.3[M+1]⁺。

在乙腈溶液中(80毫升)添加2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐(HBTU，834毫克，2.2毫摩尔)，1-羟基-苯并三唑(HOBT，298毫克，2.2毫摩尔)和二异丙基乙胺(DIPEA，284.5毫克，383UL，2.2毫摩尔)，化合物1(680毫克，1.1毫摩尔)和三苯甲基甘氨酸(347毫克，1.1毫摩尔)。得到的混合物在-20°C下搅拌4小时，然后自然升温到0°C，并继续反应12小时，氮气保护；反应完成后将反应液倒入250毫升2M HCl中。用100毫升的二氯甲烷提取；有机层用水(50毫升)洗涤两次，加入无水氯化钙干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体；该产品加载到50克的硅胶柱上并用30％乙酸乙酯—正己烷洗脱纯化。收集组分用旋转蒸发除去溶剂后得到658毫克的白色固体化合物2(得率65％)。

核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)9.02(s,1H),7.46(s,1H),7.45–7.15(m,25H),6.99(s,1H),6.90(s,1H),6.25(s,1H),5.40(s,2H),5.20(s,1H),5.08(d,J=12.6Hz,1H),4.85(d,J=12.6Hz,1H),4.12(s,3H),3.55(d,J=18.6Hz,1H),3.48(d,J=18.6Hz,1H),2.04(s,3H)ppm;质谱(ESI)计算分子量:C₅₀H₄₄N₆O₈S₂Exact Mass:920.27,测量分子量921.0[M+1]⁺。

三异丙基硅烷(800μL)和三氟乙酸(400μL)在-20°C分别加入到含有化合物2(150毫克，0.16毫摩尔)的二氯甲烷溶液(8毫升)中；由此得到的混合物在-20°C下搅拌4小时；除去溶剂后得到的白色产品,然后溶解在乙腈(15毫升)和150毫升磷酸钠缓冲液(pH值=6.5)中。继续加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶(1毫克)后，混合物搅拌，并加入丙酮(40毫升)用来沉淀乙酰酯酶。得到的黄色滤液浓缩至40毫升左右，加入Ph₂CN₂(199.2毫克，1.0毫摩尔)。搅拌2小时后，黄色溶液用氢氧化钠溶液(15摩尔/升)调整pH值至8.9；加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂(82.8毫克，0.2毫摩尔)，用乙酸乙酯提取(15毫升)两次，获得大约15毫升的有机层。混合物用浓缩除去溶剂；黄色油状产物被重新溶解于15毫升的乙酸乙酯中；继续加入4-硝基苯基氯(150毫克)和吡啶(220微升)；混合物在-20°C下搅拌4小时；产物加载到20克的硅胶柱上用30％乙酸乙酯正己烷洗脱纯化；收集组分旋转蒸发后得到白色固体化合物3(108毫克，61％)。

核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)8.26(d,J=8.4Hz,2H),7.88(s,1H),7.77–7.15(m,28H),6.96(s,1H),6.61(s,1H),5.82(m,2H),5.35(d,J=3.6Hz,1H),5.27(s,1H),4.84(d,J=12.6Hz,1H),4.74(d,J=12.6Hz,1H),4.26-4.18(m,4H),3.17(s,2H)ppm;质谱(MALDI-TOF)计算分子量:C₅₇H₄₈N₈O₁₂S₂Exact Mass:1100.28,测量分子量1101.3[M+1]⁺,1123.3[M+Na]⁺。

罗丹明B哌嗪(Rhodamine B piperazine，21.9毫克，0.05毫摩尔)溶解在含有二异丙基乙胺(180μL)的20毫升二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3(55.0毫克，0.05毫摩尔)。由此得到的混合物在-20°C下搅拌2小时后用胶柱纯化，并用30％丙酮—正己烷洗脱，得到粉红色的固体产品化合物4(41.2毫克，得率56％)。

核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)7.68–7.10(m,33H),6.97(m,3H),6.62(s,1H),5.90(m,2H),5.38(d,J=3.6Hz,1H),5.25(s,1H),4.80(d,J=12.6Hz,1H),4.72(d,J=12.6Hz,1H),4.26-4.16(m,4H),4.08(s,4H),3.74-3.64(m,12H),3.17(s,2H),3.11(s,4H),1.30-1.25(t,J=7.5Hz,12H)ppm；质谱(MALDI-TOF)计算分子量:C₈₃H₈₂N₁₁O₁₁S₂ 1472.56，测量分子量1473.3[M+1]⁺,1495.3[M+Na]⁺。

三异丙基硅烷(120微升)和三氟乙酸(20微升)加入到含有15毫克化合物4的二氯甲烷中(300微升)；-20°C下搅拌2小时后用旋转蒸发仪除去溶剂，得到暗红色固体；用水(8毫升)洗涤2次后重新溶解在二甲基亚砜(DMSO,200微升)中，然后加入化合物(R-OSu,7毫克)和二异丙基乙胺(10.0微升)；所得到的混合物在-20°C下搅拌6小时；该产品通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测。收集组分冷冻干燥后得到红色的蓬松固体化合物C-1(3.9毫克)。

核磁共振氢谱(氘代氯仿,600MHz)8.20(s,1H),7.56-7.15(m,20H),6.65(s,1H),5.90-5.55(m,4H),5.20(s,1H),4.80-4.70(m,2H),4.26-4.16(m,4H),4.12(s,3H),4.08(s,4H),3.74-3.64(m,12H),3.13(s,4H),1.30-1.25(m,12H)ppm；质谱(MALDI-TOF)计算分子量C₇₄H₇₃N₁₁O₁₇S₂ 1451.4622，测量分子量1451.4641[M+1]⁺。

将上述步骤得到的产物通过C18-HPLC纯化，所用梯度：0.1%TFA的纯水（洗脱剂A），0.1%TFA的乙腈（洗脱剂B），在40分钟内从10%的洗脱剂B到90%的洗脱剂B，在440nm波长检测；20分钟后收集C18柱洗脱液并冷冻干燥得到暗红色固体；可以分装用于制备广谱细菌耐药性荧光检测试剂盒及其产品。

实施例2细菌耐药性荧光检测试剂盒的制备及检测细菌耐药性实验

1）配置检测试剂盒所需的溶液如下：

荧光底物1mL,浓度1微摩尔/升，临用前用双蒸水配置。

非变性细胞缓冲液.1mL包括：20毫摩尔/升pH值7.5的磷酸钠缓冲液、150毫摩尔/升的氯化钠、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)

2）细菌耐药性荧光检测试剂盒的使用及检测方法

细菌耐药性荧光检测试剂盒的使用方法，即细菌耐药性荧光检测试剂盒的检测操作程序或检测方法。

本发明所述的检测方法是通过荧光共振能量转移现象，故而抗药性细菌的检测是通过测量两个波长(520和590纳米)的荧光信号强度变化来实现的。具体来说，在抗药性细菌存在的情况下，520纳米的荧光信号强度会逐渐增加，而590纳米的荧光强度逐渐降低。它们(I520/I590)之间的比例用于测定细菌抗药性的强度。

具体检测方法为：

1.溶液配制：

荧光底物溶液：将一管的双蒸馏水加入到一管的固体荧光底物中，配制成1mL 1微摩尔/升的荧光β-内酰胺酶底物溶液；

非变性细胞缓冲液组成：1mL非变性细胞缓冲液由20毫摩尔/升pH值7.5的磷酸钠缓冲液，150毫摩尔/升的氯化钠，1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)以体积比为1：1：1配制而成。

2.检测方法

将生物样品(细菌培养液、血清等)加入非变性细胞裂解缓冲液充分混合，放置5分钟后取出0.1毫升，然后和0.1毫升的底物溶液混合得到检测样品；空白对照为0.1毫升的底物溶液和0.1毫升的非变性细胞裂解缓冲液混合液。

放置15分钟后用荧光仪检测荧光信号(入射光波长：440nm，双荧光信号：520nm和590nm)。得到数据后计算I520/I590比例(I590是590nm的荧光强度，I520是520nm的荧光强度)。如果测定样品的比例大于空白对照在20%以上(样品的I520/I590>1.2×空白对照的I520/I590)，即可断定测定样品中有抗三四代头孢菌素的细菌存在。

检测仪器可由市售的任何荧光分光光度计和荧光酶标仪均可用于此检测，如Hitachi High-Tech的F-7000荧光分光光度计，Tecan公司的Infinite系列荧光酶标仪等。

3.细菌耐药性检测实验结果

根据上述实验方法，检测如表1所示的各样品，并记录结果：

表1荧光底物C-1的个体抗药性检测

实验结果表明，本发明提供的荧光底物C-1可准确的定性检测出不同样品中的抗头孢菌素的细菌，所检测的细菌数量可达10⁵～10⁸个抗药性细菌，可用于临床或其他检测领域制备相应的诊断试剂或诊断试剂盒，具有广泛的应用空间和实用价值。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法，其特征在于：它采用仅能被广谱β内酰胺酶降解的荧光底物通过双荧光信号所测得不同波长下的吸光度差异检测所述个体或其生物样品的细菌耐药性,

所述荧光底物包含以下化合物(I)或其对映体、消旋体或非对映异构体:

2.如权利要求1所述的检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法，其特征在于：所述的细菌耐药性检测方法所使用的对照品为等体积的非变性细胞缓冲溶液。

3.如权利要求1所述的检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法，其特征在于：所述的细菌耐药性检测方法的入射光波长为440nm，双荧光信号分别为520nm和590nm。

4.如权利要求1所述的检测个体中细菌耐药性的荧光检测方法，其特征在于：所述的细菌耐药性检测方法是通过检测所述个体或其生物样品的在双荧光信号下的荧光强度比与对照品的荧光强度比的差值。

5.一种细菌耐药性荧光检测试剂盒，所述诊断试剂盒内设有：双蒸馏水、非变性细胞裂解缓冲液和荧光底物，其特征在于，所述的荧光底物包含如下具体结构的化合物I或其对映体、消旋体或非对映异构体：

6.如权利要求5所述的细菌耐药性荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的非变性细胞缓冲液包括：pH值为7.5的磷酸钠缓冲液、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。

7.如权利要求6所述的细菌耐药性荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的非变性细胞缓冲液包括：20毫摩尔/升pH值7.5的磷酸钠缓冲液、150毫摩尔/升的氯化钠、1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，其中三者体积比为1：1：1。