JP2003070490A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

核酸配列の増幅方法

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一恵 三宅
Takashi Uemori
隆司 上森
Yoshimi Sato
好美 佐藤
Mariko Moriyama
麻里子 森山
Haruhisa Sawaragi
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Kiyozou Asada
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 オリゴヌクレオチドプライマーの存在下にＤ
ＮＡ合成反応を行なうことを特徴とする簡便で、効率の
良い核酸配列の増幅方法及びＤＮＡ増幅断片の大量供給
のためのＤＮＡ増幅断片の大量製造方法を提供するこ
と。 【解決手段】 キメラオリゴヌクレオチドプライマーの
存在下にＤＮＡ合成反応を行うことを特徴とする簡便
で、効率の良い核酸配列の増幅方法、大量のＤＮＡ増幅
断片を供給する方法、本発明の核酸配列の増幅方法と他
の核酸増幅方法と組み合わせた効率的な核酸配列の増幅
方法、ウイルス、細菌、カビ、酵母などの微生物等の検
出、定量のための核酸配列の検出方法、本発明の方法で
得られたＤＮＡ増幅断片をリアルタイムで検出する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に
おいて有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸
配列の増幅方法および該方法で増幅された核酸の検出方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの
合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレ
オチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほと
んどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により
実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐ
ＣＲ法）があるが、それは米国特許第４，６８３，１９
５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１
５９号に詳細に記述されている。もう一つの例として
は、トレンズ イン バイオテクノロジー（Trendsin B
iotechnology）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９
２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆
転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げられる。上記の
方法の開発により、ＤＮＡから、若しくはＲＮＡから目
的とする領域を増幅することが可能になった。
【０００３】これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤ
ＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡ
の一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプラ
イマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成
（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしく
は、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白
質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜
４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ
反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステ
ップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施され
る。
【０００４】さらに、別法としては、１９８９年６月１
４日に公開された欧州特許出願第３２０，３０８号に記
述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ligase chain
reaction）法、あるいはＰＣＲ プロトコールズ（PCR
Protocols, Academic Press. Inc.,1990）２４５〜２
５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；tr
anscription-based amplification system）法が挙げら
れる。上記４法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標
的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も
繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制
約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行
なう必要がある。
【０００５】従って、上記の方法には広い温度範囲で、
かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高
価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。
また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうた
め設定温度にするために要する時間が必要であり、その
ロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
【０００６】そこで、上記問題点を解決すべく等温状態
で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平
７−１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；st
randdisplacement amplification）法、自立複製（３Ｓ
Ｒ；self-sustained sequence replication）法、日本
国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅
（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based amplific
ation）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplific
ation）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載
のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２
４，５１７号、国際公開パンフレット第９９／０９２１
１号、国際公開パンフレット第９５／２５１８０号ある
いは、国際公開第９９／４９０８１号等に記載の種々の
改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号第５，９１
６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵
素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅
法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、
プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標
的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続く
プライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物
中で同時に起こる。
【０００７】これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤ
ＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリ
メラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置
換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）
の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライ
マーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要が
ある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質とし
て、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例
えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換
された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を
大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行な
う遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深
刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅された
ＤＮＡ断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば（α
−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例え
ば、増幅後のＤＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；
restriction enzyme fragment length polymorphism）
解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断
できないことがある。
【０００８】また、米国特許番号第５，８２４，５１７
号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成さ
れ、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必
須要件とするキメラプライマーを使用するＤＮＡ増幅方
法である。また、国際公開パンフレット第９９／０９２
１１号に記載の改良ＳＤＡ法は、５’突出末端を生じさ
せる制限酵素が必要である。また、国際公開パンフレッ
ト第９５／２５１８０号に記載の改良ＳＤＡ法は、少な
くとも２組のプライマー対を必要とする。さらに、国際
公開パンフレット第９９／４９０８１号に記載の改良Ｓ
ＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１
種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要と
する。一方、米国特許番号第５，９１６，７７７号は、
オリゴヌクレオチドを合成するために、３’末端にリボ
ヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤＮＡを合
成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマ
ー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて
分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを
回収して再利用するというものである。該方法では、プ
ライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単
離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要があ
る。
【０００９】上記のように従来の等温核酸増幅法はまだ
まだ種々の問題をかかえており、低ランニングコスト
で、かつ結果的に得られたＤＮＡ断片をさらに遺伝子工
学的な処理に使用することが可能な核酸配列の増幅方法
が求められていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
オリゴヌクレオチドプライマーの存在下にＤＮＡ合成反
応を行なうことを特徴とする簡便で、効率の良い核酸配
列の増幅方法及びＤＮＡ増幅断片の大量供給のためのＤ
ＮＡ増幅断片の大量製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、リボヌクレオチドが３’末端又は３’末端側に配
置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー、エンド
リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下
に目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法を見出し、優
れた遺伝子増幅反応系を構築し、本発明を完成するに至
った。該方法は、等温条件下、キメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いる核酸配列の増幅（ＩＣＡＮ；Isot
hermally chimeric primer used amplification of nuc
leic acid）法である。
【００１２】本発明の第１の発明は、核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸をこの核
酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプ
ライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して上記鋳型
に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該
プライマーはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌク
レオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ーであって、この リボヌクレオチドは、エ
ンドヌクレアーゼによる切断のためにプライマーの３’
末端又は３’末端側に配置され；（ｂ）（ａ）工程で得
られる二本鎖核酸のプライマー伸長鎖のリボヌクレオチ
ド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；およ
び（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程；を包含す
ることを特徴とする核酸配列の増幅方法に関する。
【００１３】本発明の第２の発明は、少なくとも２種類
のプライマーを使用し、核酸配列を増幅するための方法
であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
ーゼにより処理して上記鋳型に相補的なプライマー伸長
鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボ
ヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラ
オリゴヌクレオチドプライマーであって、このリボヌク
レオチドは、エンドヌクレアーゼによる切断のためにプ
ライマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで（ａ）工程で使用されたプライマーとは異な
るプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的なデ
オキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有
するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、当
該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切断の
ために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置さ
れ； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法に関する。
【００１４】本発明の第１および第２の発明は、等温で
行ってもよく、また鋳型となる核酸配列がＤＮＡ配列で
あってもよい。さらに、第１および第２の発明の（ａ）
工程の前にＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素による逆転
写反応により一本鎖のｃＤＮＡを調製する工程を含んで
もよく、該一本鎖のｃＤＮＡを鋳型となる核酸配列とす
ることもできる。また、本発明の第１および第２の発明
において、鋳型となるＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれ
もが好適に使用できる。二本鎖ＤＮＡが鋳型となる場合
は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性する前処理工程の後に
本発明の方法を行えばよい。
【００１５】上記発明において、プライマーからの伸長
は鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより行われ
ることを特徴とする。即ち、本発明には大腸菌由来のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステア
ロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ
欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カル
ドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損
ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤ
ＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。また、エンドヌ
クレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼが好適に使用で
き、特に限定するものではないが、例えばＲＮａｓｅＨ
が使用できる。
【００１６】本発明の第３の発明は、核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸、デオキ
シリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およ
びこのプライマーより生成する伸長鎖を切断するエンド
ヌクレアーゼを混合して反応混合物を調製する工程；こ
こで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質
的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチドを含有し、リボヌクレオチドがエンドヌ
クレアーゼによる切断のためにプライマーの３’末端又
は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドで
あり；および（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時
間、反応混合物をインキュベートする工程、を包含する
ことを特徴とする核酸配列の増幅方法に関する。
【００１７】上記第３の発明において、鋳型となる核酸
配列としては、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡに変性され
た二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡから逆転写反応によって
得られたｃＤＮＡからなる群より選択される核酸配列が
例示される。また、上記反応混合物中に２種以上のキメ
ラオリゴヌクレオチドプライマーを含有させてもよい。
本発明に使用される鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラ
ーゼ、エンドヌクレアーゼには、上記の第１、第２の発
明に使用されるものが好適に使用できる。
【００１８】本発明の第１〜第３の発明に使用されるプ
ライマーは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーであ
り、例えば、プライマーの３’末端又は３’末端側に少
なくとも１残基、好ましくは連続した２残基以上のリボ
ヌクレオチドが結合した構造を有するキメラオリゴヌク
レオチドプライマーを用いることができる。
【００１９】また、本発明の第１〜第３の発明に使用さ
れる鋳型は、核酸増幅方法によってあらかじめ増幅され
た核酸であってもよい。該核酸増幅方法は、例えば、Ｔ
ＡＳ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑβレプ
リカーゼ法、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法が利用でき
るが、核酸を増幅するための方法であれば、特に限定は
ない。さらに、本発明の方法は、これらの核酸増幅方法
と組み合わせて使用することができる。
【００２０】また、上記核酸増幅反応においては、ラン
ダムプライマーまたは縮重プライマーを使用することが
でき、特に限定はされないが例えば、少なくともその
３’末端又は３’末端側にランダムな配列または縮重し
た配列を有するプライマーが好適に使用できる。
【００２１】本発明の第４の発明は、上記の第１〜第３
の発明に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ーに関する。このプライマーは、デオキシリボヌクレオ
チドとリボヌクレオチドを含有し、プライマーの３’末
端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されている
ことを特徴とする。例えば、少なくとも１残基、好まし
くは連続した２残基以上のリボヌクレオチドを含有し、
その３’末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーであって、リボヌクレアーゼ、
例えばＲＮａｓｅＨの作用により上記リボヌクレオチド
残基の３’末端側が切断されるよう設計されたキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
【００２２】本発明の第５の発明は、上記第１〜第３の
発明に使用される鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼ、エンドヌクレアーゼおよびそれらを含むキットに関
する。
【００２３】本発明の第６の発明は、標的核酸を検出す
るための方法であって、本発明の第１〜３の発明の核酸
配列の増幅方法により標的核酸を増幅した後、この核酸
を検出する工程を包含することを特徴とする。検出方法
には、消光状態になるような距離で配置された２種類以
上の蛍光色素で標識されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）
プローブによって標的核酸を検出する方法が包含され
る。
【００２４】本発明の第７の発明は、本発明の第６の発
明の標的核酸の検出方法に使用される鎖置換活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびそれ
らを含むキットに関する。
【００２５】本発明の第８の発明は、核酸を所定の領域
に整列させた核酸固定化物を作製するための方法に関
し、本発明の第１〜３の発明の核酸配列の増幅方法によ
り増幅された核酸を担体上の所定の領域に整列させて固
定化する工程を包含することを特徴とする。特に好適に
は、実質的にその相補鎖を含まない一本鎖の核酸を増幅
し、所定の領域に整列させて固定化する方法が挙げられ
る。
【００２６】本発明の第９の発明は、核酸を所定の領域
に整列させた核酸固定化物に関し、本発明の第８の発明
の方法によって作製されたものであることを特徴とす
る。特に好適な核酸固定化物としては、実質的にその相
補鎖を含まない一本鎖の核酸を所定の領域に整列させて
固定化させた核酸固定化物が挙げられる。
【００２７】本発明の第１０の発明は、試料中の標的核
酸を検出するための方法に関し、本発明の第９の発明の
核酸を所定の領域に整列させた核酸固定化物を使用し、
この核酸固定化物上の所定の領域に整列させて固定化さ
れた核酸にハイブリダイズした核酸を検出することを特
徴とする。
【００２８】本発明の第１１の発明は核酸を大量に製造
する方法であって、（ａ）鋳型となる核酸をこの核酸の
塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライ
マーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して上記鋳型に相
補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プラ
イマーはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーで
あって、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼに
よる切断のためにプライマーの３’末端又は３’末端側
に配置され；（ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸の
プライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンド
ヌクレアーゼで切断する工程；および（ｃ）（ｂ）工程
で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸の
プライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸
長して鎖置換を行う工程；を包含することを特徴とする
核酸の製造方法に関する。
【００２９】本発明の第１２の発明は、少なくとも２種
類のプライマーを使用し、核酸を大量に製造する方法で
あって、 （ａ）鋳型となる核酸をこの核酸の塩基配列に実質的に
相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメ
ラーゼにより処理して上記鋳型に相補的なプライマー伸
長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリ
ボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメ
ラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌク
レオチドは、エンドヌクレアーゼによる切断のためにプ
ライマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで（ａ）工程で使用されたプライマーとは異な
るプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的なデ
オキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有
するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該
リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切断のた
めにプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸の製造方法に関する。
【００３０】本発明の第１３の発明は核酸を大量に製造
する方法であって、（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリ
ボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびこ
のプライマーより生成する伸長鎖を切断するエンドヌク
レアーゼを混合して反応混合物を調製する工程；ここで
該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に
相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌ
クレオチドを含有し、該リボヌクレオチドがエンドヌク
レアーゼによる切断のためにプライマーの３’末端又は
３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドであ
り；および（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、
反応混合物をインキュベートする工程、を包含すること
を特徴とする核酸の製造方法に関する。
【００３１】本発明の第１４の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、 （ａ）増幅しようとする配列を含む核酸を核酸増幅反応
によって増幅し、鋳型となる核酸を調製する工程； （ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸を該核酸の塩基
配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマー
とＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的な
プライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマー
はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを
含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによる
切断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に
配置され； （ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｄ）（ｃ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程；を包含する
ことを特徴とする核酸配列の増幅方法に関する。
【００３２】本発明の第１５の発明は少なくとも２種類
のプライマーを使用し、核酸配列を増幅するための方法
であって、 （ａ）増幅しようとする配列を含む核酸を核酸増幅反応
によって増幅し、鋳型となる核酸を調製する工程； （ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸を該核酸の塩基
配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマー
とＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的な
プライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマー
はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを
含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによる
切断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に
配置され； （ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｃ）工
程に再度利用される工程； （ｅ）（ｄ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ｂ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで該（ｂ）工程で使用されたプライマーとは異
なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切
断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
置され； （ｆ）（ｅ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｇ）（ｆ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｆ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法に関する。
【００３３】本発明の第１６の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）増幅しようとする配列を
含む核酸を核酸増幅反応によって増幅し、鋳型となる核
酸を調製する工程；（ｂ）(ａ)で得られた鋳型となる核
酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を
有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライ
マー、および該プライマーより生成する伸長鎖を切断す
るエンドヌクレアーゼを混合して反応混合物を調製する
工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配
列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチド
およびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチド
がエンドヌクレアーゼによる切断のために該プライマー
の３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーであり；および（ｃ）反応産物を
生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベート
する工程、を包含することを特徴とする核酸配列の増幅
方法に関する。
【００３４】本発明の第１４〜第１６の発明において
は、増幅しようとする配列を含む核酸を先に核酸増幅反
応によって増幅し、該増幅産物を本発明の第１〜３の発
明の方法の鋳型となる核酸として用いる。第１４〜１６
の発明に使用する該核酸増幅方法は、核酸を増幅するた
めの方法であれば特に限定はなく、例えば、ＴＡＳ法、
３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、Ｑβレプリカーゼ
法、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法が利用できる。
【００３５】また、上記核酸増幅反応においては、ラン
ダムプライマーまたは縮重プライマーを使用することが
でき、特に限定はされないが例えば、少なくともその
３’末端又は３’末端側にランダムな配列または縮重し
た配列を有するプライマーが好適に使用できる。
【００３６】本発明の第１７の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸
の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプラ
イマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相
補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プラ
イマーはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーで
あって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端
又は３’末端側に配置され；（ｂ）（ａ）工程で得られ
る二本鎖核酸のプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含
有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および
（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程；を包含する
ことを特徴とする核酸配列の増幅方法に関する。
【００３７】本発明の第１８の発明は少なくとも２種類
のプライマーを使用し、核酸配列を増幅するための方法
であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオ
チドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置さ
れ； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は
３’末端側に配置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法に関する。
【００３８】本発明の第１９の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸、デオキ
シリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およ
び該プライマーより生成する伸長鎖を切断するエンドヌ
クレアーゼを混合して反応混合物を調製する工程；ここ
で該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的
に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドが該プライ
マーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリ
ゴヌクレオチドプライマーであり；および（ｂ）反応産
物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベ
ートする工程、を包含することを特徴とする核酸配列の
増幅方法に関する。
【００３９】本発明の第２０の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸
の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプラ
イマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相
補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プラ
イマーはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドを含有し、該リボヌクレオチドが該プライマーの
３'末端又は３’末端側に配置され、該リボヌクレオチ
ド含有部位がエンドヌクレアーゼによって切断されるキ
メラオリゴヌクレオチドプライマーであり；（ｂ）
（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸長鎖の
リボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断
する工程；および（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマ
ー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライマー部分の
３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
によって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行
う工程；を包含することを特徴とする核酸配列の増幅方
法に関する。
【００４０】本発明の第２１の発明は少なくとも２種類
のプライマーを使用し、核酸配列を増幅するための方法
であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌ
クレオチドが該プライマーの３'末端又は３’末端側に
配置され、該リボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレ
アーゼによって切断されるキメラオリゴヌクレオチドプ
ライマーであり； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
を含有し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３'末
端又は３’末端側に配置され、該リボヌクレオチド含有
部位がエンドヌクレアーゼによって切断されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーであり； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法に関する。
【００４１】本発明の第２２の発明は核酸配列を増幅す
るための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸、デオキ
シリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およ
び該プライマーより生成する伸長鎖を切断するエンドヌ
クレアーゼを混合して反応混合物を調製する工程；ここ
で該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的
に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドが該プライ
マーの３'末端又は３’末端側に配置され、該リボヌク
レオチド含有部位がエンドヌクレアーゼによって切断さ
れるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；およ
び（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合
物をインキュベートする工程、を包含することを特徴と
する核酸配列の増幅方法に関する。
【００４２】本発明の第２３の発明は、核酸の塩基配列
を決定するための方法であって、上記第１〜第３の発明
及び第１４〜第２２の発明のいずれか１つの発明の方法
の、核酸配列を増幅する工程を包含することを特徴とす
る核酸の塩基配列の決定方法に関する。
【００４３】
【発明の実施の形態】本明細書においてデオキシリボヌ
クレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、
糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレ
オチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シ
トシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。
【００４４】本明細書においてリボヌクレオチド（本明
細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボー
スで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分に
アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するもの
が挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾
リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の
酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド
［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載
する］やこの他の誘導体等も含まれる。
【００４５】本明細書においてキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。該
プライマーは未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／
または修飾デオキシリボヌクレオチドあるいは未修飾リ
ボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを
含有していてもよい。
【００４６】本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端
側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において
核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖
置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが
本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含さ
れる。
【００４７】本明細書において３’末端側とは、核酸、
例えば、プライマーにおいて、その中央より３’末端に
かけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸にお
いてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
【００４８】本明細書においてエンドヌクレアーゼと
は、鋳型核酸にアニーリングした、上記キメラオリゴヌ
クレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成し
た二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレ
オチド部分を特異的に切断するものであればよい。
【００４９】本明細書においてＤＮＡポリメラーゼと
は、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵
素のことを言う。特に限定はされないが、ポルＩ型ＤＮ
Ａポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノ
ウ断片、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α型ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡ
ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、ＶＥＮＴ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社
製）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、Ｄ
ＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイング
ランドバイオラブス社製）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポ
リメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレッ
ト記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。また、
鎖置換(Strand displacement)活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼとしては、バチルス・カルドテナックス（Baci
llus caldotenax、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス
・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophi
lus、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌
由来ＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼの
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体等
が挙げられる。さらに、上記クレノウ断片のような鎖置
換活性を有し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有
していないＤＮＡポリメラーゼも鎖置換型ＤＮＡポリメ
ラーゼに含まれる。さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼ
は、複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物、特に限定はさ
れないが上記鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及
び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを組み合わ
せた混合物でもよい。
【００５０】本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳
型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ
鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングして
いる相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displac
ement）することができる活性のことをいう。また、本
明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列か
ら遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。
【００５１】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマー 本発明の方法において使用されるプライマーは、デオキ
シリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有する
キメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライ
マーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リ
ボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプラ
イマーも含まれる。
【００５２】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の
一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端
よりＤＮＡ鎖の伸長が可能であり、さらに、ＤＮＡ合成
反応中にエンドヌクレアーゼにより切断される部位をそ
の３’末端又は３’末端側に有するものであれば良い。
例えば、その３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチ
ドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーを
使用することができる。当該プライマーは通常、増幅し
ようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しよ
うとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補的
に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配
列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮ
Ａにアニーリング可能な塩基配列を意味する。このよう
なキメラオリゴヌクレオチドプライマーあるいはオリゴ
ヌクレオチドプライマーの設計は当業者に公知であり、
例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝酒造社発行、第１３
頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計することがで
きる。また、市販のプライマー設計ソフト、例えば、Ｏ
ＬＩＧＯＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用することができる。
【００５３】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは１以上の修飾リボヌクレ
オチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書
においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、エ
ンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるもので
あれば、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リ
ボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未
修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含さ
れる。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプ
ライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で
未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用
することができ、さらにこれらを組合せて使用すること
ができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、
特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結
合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボ
ヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基
に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このよう
な修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーは、例えば、米国特許第５，００３，
０９７号記載の硫化反応試薬（グレンリサーチ社製）を
用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチド３リ
ン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥ ホスホアミ
ダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製するこ
とができる。
【００５４】また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐
性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有
し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマ
ーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断
位置を制御し得る点において有用である。
【００５５】本発明の方法で使用するキメラオリゴヌク
レオチドプライマーは、増幅後のＤＮＡ断片を一本鎖も
しくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって１種類
もしくは２種類を使い分けることができる。すなわち、
一本鎖ＤＮＡが望まれる場合には１種類のキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場
合には２種類のプライマーが使用される。
【００５６】本発明の方法において使用されるキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーは特に限定はないが約１２
ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが
好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌクレオチドから
約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩
基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニー
リングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列で
あることが好ましい。該プライマーには、後に示す段階
で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列
を３’末端又は３’末端側に含む。
【００５７】本発明を何ら限定するものではないが、例
えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチド
を本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用する
ことができる。
【００５８】一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−dＮｃ３’ （ａ：１１以上の整数、ｂ：０または１以上の整数、
ｃ：０または１以上の整数、ただし、ｂ＝ｃ＝０の場合
を除く、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド、Ｎ：未修飾
リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド）
【００５９】例えば、上記一般式においてａ＝１１以上
の任意の整数で、ｂ＝１、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレ
オチドプライマー、ｂ＝２、ｃ＝０のキメラオリゴヌク
レオチドプライマー、ｂ＝３〜５、ｃ＝０のキメラオリ
ゴヌクレオチドプライマー、さらにｂ＝２、ｃ＝０〜５
のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等がいずれも本
発明に好適に使用できる。即ち、本発明の方法に用いる
キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３'末端又は３'
末端側のリボヌクレオチドの長さは、好ましくは１ｍｅ
ｒ〜１５ｍｅｒ、さらに好ましくは、１ｍｅｒ〜１０ｍ
ｅｒ、特に好ましくは１ｍｅｒ〜５ｍｅｒである。ま
た、上記一般式中のｃの数は、特に限定はなく、本発明
の方法に使用できる数を選択すればよいが、通常５以下
が好適であり、４、３、２、１、の順に反応結果が良
く、特にｃ＝０の場合が最も反応効率がよい。
【００６０】本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオ
チドプライマーは、該プライマーよりＤＮＡポリメラー
ゼで伸長されたＤＮＡ鎖（プライマー伸長鎖）に含まれ
るリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで切
断されるような構造を有している。すなわち、上記のキ
メラオリゴヌクレオチドプライマーは、エンドヌクレア
ーゼにより切断を受けるようにリボヌクレオチドがその
３’末端又は３’末端側に配置されている。例えば、鋳
型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキ
メラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を
行って生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮａｓｅＨを作用させ
た場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマー
のリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレ
オチドプライマーと伸長により合成されたＤＮＡ鎖の間
にニックの入った二本鎖ＤＮＡが生じる。さらに、該ニ
ックの入った部位からＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換
反応がおこる。従って、プライマーの３’末端から核酸
鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより
切断されることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼによ
り鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライ
マーは全て本発明の方法に使用することができる。
【００６１】これらのキメラオリゴヌクレオチドプライ
マーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライ
ド・バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Applied Biosyste
m Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホ
スホアミダイト法により合成できる。また、別法として
リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホス
ホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたもの
であっても良い。
【００６２】（２）本発明に使用されるエンドヌクレア
ーゼ 本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸
にアニーリングした、上記（１）に記載のキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成
した二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるよう
に伸長鎖を切断するものであればよい。即ち、上記の二
本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー部分にニックを生成する酵素である。特に限定される
ものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼ
が使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二本
鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアーゼ
Ｈ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リボ
ヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常
温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に
本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すよう
に、約５０℃〜約７０℃での反応では大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨが本発明の方法に使用するこ
とができる。また、耐熱性リボヌクレアーゼである市販
のＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ
ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）等も
好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天
然体および変異体のいずれでも良い。なお、本願明細書
に記載されているＲＮａｓｅＨの酵素単位は、実施例中
の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示され
た数値である。
【００６３】また、本発明の方法に使用するエンドヌク
レアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率は上
記プライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所
望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるの
で、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザイ
ンすることは当然のことである。
【００６４】本明細書において使用されている「ニック
を入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖
核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たと
えば、ＲＮａｓｅＨはＤＮＡとリボヌクレオチドを含む
ＤＮＡとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖の
うちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部
分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二
本鎖核酸にニックを入れる。
【００６５】（３）本発明に使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼ 本発明には、ＤＮＡの鎖置換（strand displacement）
活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができ
る。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を有しないものが特に好適に使用することができる。
【００６６】本発明において、「鎖置換活性」とは、鋳
型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ
鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングして
いる相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displac
ement）することができる活性のことをいう。また、本
明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列か
ら遊離したＤＮＡ鎖のこと「置換鎖」と称する。
【００６７】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定は
なく、例えば、バチルス・カルドテナックス（Bacillus
caldotenax、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス・ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu
s、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由
来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ
と称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ フラグ
メント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明
に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性
のいずれのものも好適に使用できる。
【００６８】Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である
好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ ＤＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレ
アーゼ活性を持つことが知られている。
【００６９】上記の酵素はその本来の起源より精製して
取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組
み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、
遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠
失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、
このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレア
ーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼであ
るＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
等が挙げられる。
【００７０】（４）本発明に使用される反応バッファー
の組成 本発明に使用される反応バッファーには、緩衝成分、マ
グネシウム塩、ｄＮＴＰを含有するものが使用される。
緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、トリシン、ト
リス−塩酸、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリ
ウム等）が好適に使用できる。特にトリシン、あるいは
リン酸塩を緩衝成分として含有するバッファーが本発明
に好適である。該緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００
ｍＭの範囲、特に好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲
であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ
７．０〜９．２の範囲のものが使用される。例えば、２
２ｍＭ〜４６ｍＭのトリシンを含有するｐＨ７．５〜
９．２のバッファー、あるいは２５ｍＭ〜５０ｍＭのリ
ン酸カリウムを含有するｐＨ７．０〜８．０のバッファ
ーが好適に使用される。また、マグネシウム塩として
は、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、酢
酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムが好適に使用
でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に
好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。また、ＤＮ
Ａ伸長反応の基質となるｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）は、最終濃度で、それぞ
れ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、特に好ましくは０．２ｍＭ
〜１．２ｍＭの範囲である。使用するプライマーの量
は、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍ
ｏｌの範囲であり、特に１０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ
の範囲が好ましい。さらに、反応液中には増幅反応の安
定化等を目的とした添加物を共存させることができ、最
終濃度０．１％以下のＢＳＡ、最終濃度１０％以下のジ
メチルスルホキシド、あるいは最終濃度４ｍＭ以下のプ
トレスシン２塩酸塩あるいは０．０１％以下のプロピレ
ンジアミンを添加してもよい。この他、ＮＭＰ（１−メ
チル２ピロロリジノン）、グリセロール、ポリ（エチレ
ングリコール）、ジメチルスルフォキシドおよび／また
はホルムアミドを含んでもよく、これらの有機溶媒の添
加により、オリゴヌクレオチドプライマーの非特異的な
アニーリングが軽減されることが期待される。
【００７１】エンドヌクレアーゼは、例えば、大腸菌由
来のＲＮａｓｅＨならば、反応液量５０μｌ当たり３〜
２００Ｕの範囲が好ましく、特に１５Ｕ〜６０Ｕの範囲
が好適である。また、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、
ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼならば、反応液量
５０μｌ当たり０．５Ｕ〜１００Ｕの範囲、特に１Ｕ〜
２２Ｕの範囲が好ましい。特に、前者についてはその種
類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が
予想されるが、その際には増幅産物量が最大になるよう
に該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すれば
よい。いずれの場合においても、使用する酵素の種類に
あわせて反応バッファーの組成等を至適化するのは当然
のことである。
【００７２】（５）本発明の核酸配列の増幅方法 本発明の方法は、上記（１）に示されたオリゴヌクレオ
チドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらに上記
（２）に示されたエンドヌクレアーゼおよび上記（３）
に示されたＤＮＡポリメラーゼを組合わせて実施するこ
とができる。当該方法では、伸長反応の基質となるヌク
レオチド３リン酸には、ＰＣＲ法等に使われるｄＮＴ
Ｐ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
の混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴＰは、使用さ
れるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、
ｄＮＴＰのアナログ、たとえば７−デアザ−ｄＧＴＰ等
を含んでいてもよい。また、当該方法では、キメラオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマ
ーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法
と同様に調製することができる。さらに、本発明の方法
においては、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマー
と通常のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて
使用することもできる。
【００７３】本発明の方法において鋳型となる核酸、す
なわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性の
あるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでも
よい。このような核酸を含む試料には特に限定はない
が、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、
脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ
節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び
細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウ
イルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸
含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もし
くは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製
剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可
能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知
の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物
であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物
やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、ある
いは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試
料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれ
る核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等
の核酸等も好適に使用できる。
【００７４】これら材料からの核酸含有調製物の調製に
は特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処
理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレ
ンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの
例においては、さらに操作を加えて核酸を精製すること
が有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在する
とき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール
抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動
または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施され
る。
【００７５】ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅した
い場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によっ
て合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施
すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮ
Ａには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能
なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの
他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、
あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
【００７６】上記の逆転写反応に使用されるプライマー
は、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニール
するものであれば特に限定されるものではない。該プラ
イマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有す
るプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ
（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有す
るプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。
逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを
行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、
更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌク
レオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオ
チド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下
である。
【００７７】さらに、逆転写用プライマーとして、逆転
写後のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸配列増幅法を
行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能
なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること
ができる。このようなプライマーは、上記（１）に記載
された性質を有し、かつＲＮＡからの逆転写反応に使用
できるものであれば特に限定はない。
【００７８】上記の逆転写反応に使用される酵素として
は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイル
ス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネ
ズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａ
ｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２
ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられ
る。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラー
ゼを使用することもできる。また、本発明の目的のため
には、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例
えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮ
Ａポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例
えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが
好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリ
メラーゼ（以下、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼと記載す
る）が好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ
は、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、
高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながら
ｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活
性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において
天然体、変異体のいずれもが使用できる。
【００７９】本発明の方法による核酸の増幅において
は、あらかじめ鋳型となる核酸を増幅しておくことによ
り、さらに効率よく目的の核酸を増幅できる場合があ
る。例えば、極めて少量のゲノムＤＮＡ等に存在する核
酸配列を増幅する場合には、まず目的の核酸配列を含む
ＤＮＡ断片を適当な核酸増幅方法によって増幅し、次に
こうして得られた増幅ＤＮＡ断片を鋳型とした本発明の
核酸の増幅方法を実施することができる。１段階目の増
幅工程は本発明の方法で実施されてもよく、また公知の
核酸増幅方法、例えばＰＣＲ法で実施されてもよい。ま
た、この工程に使用されるプライマーの５’側にある特
定の塩基配列を付加しておくことができる。このような
プライマーで増幅された断片を鋳型として使用する場合
には、当該プライマーに付加された特定の塩基配列を有
するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して本
発明の核酸増幅方法を実施することができる。すなわち
上記のような特定の塩基配列を５’側に付加されたプラ
イマーを使用したＰＣＲを本発明の方法に組み合わせれ
ば、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とした本発明
の方法による核酸増幅工程は、増幅しようとする領域の
塩基配列とは無関係に共通のキメラオリゴヌクレオチド
プライマーで実施することが可能である。
【００８０】通常、上記の１段階目の核酸増幅工程に
は、目的の核酸配列に応じて、当該配列を特異的に増幅
するための特異的プライマー対を作製する必要がある
が、非特異的に核酸断片を増幅するようなランダムプラ
イマーや、あらかじめ作成された縮重プライマーのセッ
トから選択されるプライマー対を利用することにより、
目的の核酸配列に特異的プライマーを使用することなく
鋳型となる核酸を増幅することができる。例えば、ヌク
レイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Resear
ch）第２４巻、１９号、３７７８〜３７８３頁（１９９
６）に記載のタグ配列を有するランダムプライマーを使
用するＰＣＲ法、あるいはジェノミックス（Genomics）
第１３巻、７１８〜７２５頁（１９９２）に記載のタグ
配列を有する縮重プライマー（Degenerate primer）を
用いたＤＯＰ−ＰＣＲ（Degenerate Oligonucleotide-P
rimed PCR）法を利用することにより多種類の鋳型核酸
を増幅するために必要なプライマー対の数を少なくする
ことができる。これらのプライマーはいずれもその３’
末端にランダムな配列、縮重した配列を有している。さ
らに、タグ配列を有するプライマーで増幅された核酸を
鋳型として本発明の核酸配列増幅方法を実施する場合に
は、上記のようにタグ配列と同じ塩基配列を有する１種
のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること
により、同一のタグ配列を有するプライマーで増幅され
たすべての核酸を鋳型として本発明の方法を実施するこ
とができる。すなわち、ランダムプライマーや縮重プラ
イマーを用いた核酸増幅法と本発明の方法を組み合わせ
れば、数多くの種類の核酸配列を非常に安価に、かつ大
量に供給することができる。
【００８１】上記核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメ
ラーゼとしては、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖
を合成する酵素であれば特に限定はされないが、ポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、
クレノウ断片、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α
型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来
ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラ
ーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載
のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。また、少なく
とも２種類のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせた混合
物、例えばタカラ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）あるいはＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリ
メラーゼ（東洋紡社製）等も好適に使用できる。また、
Ｂ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ．ｓｔ由来由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮ
Ａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を
欠失した変異体、９ＯＮ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ
(exo-) ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、Ｔｆｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）等のＤＮＡポリメ
ラーゼも好適に使用できる。
【００８２】また、ＰＣＲ増幅断片のような直鎖ＤＮＡ
断片を本発明の核酸配列増幅方法の鋳型とする場合、鋳
型となる当該直鎖ＤＮＡ断片の３'末端から本発明の核
酸増幅方法に用いるプライマーの５'末端のアニーリン
グ位置との間にスペーサーと呼ばれる配列部分を設ける
と増幅効率が向上する場合がある。特に限定はないが、
例えば、上記スペーサー部分の長さが１塩基〜約７０塩
基、さらに好ましくは、約５塩基〜約６０塩基になるよ
うに本発明の核酸増幅方法用プライマーを設定するのが
好ましい。なお、本発明の核酸配列増幅用プライマーの
配列によっては、上記の好適なスペーサー部分の塩基数
が異なる場合があるが、その場合最適なスペーサー部分
を本明細書の実施例を参考に検討する事ができる。さら
に、本発明の核酸増幅用プライマーのアニーリングする
領域の３’側に上記のスペーサー部分が付加されるよう
に、例えばＰＣＲによって本発明の核酸増幅方法の鋳型
となる核酸を予め増幅したのち、この増幅断片を本発明
の核酸増幅方法の鋳型として使用することができる。１
つの態様としては、５’→３’方向に上記スペーサー領
域、本発明の核酸増幅方法用プライマー領域及び他の核
酸増幅用プライマー領域を有するプライマーを用いて、
予め鋳型となる核酸を増幅したのち、この増幅断片を本
発明の核酸増幅方法の鋳型として使用することができ
る。なお、前述の他の核酸増幅用プライマー領域は、例
えば、ＰＣＲ法のような核酸増幅方法のためのプライマ
ー領域であればよく特に限定はされない。あるいは、前
述の他の核酸増幅用プライマー領域は、本発明の核酸増
幅方法のための別のプライマー領域であってもよい。
【００８３】上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰ
ＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮ
Ａのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳
型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの
場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）
を施したものが好適に使用できる。
【００８４】また、鋳型がＰＣＲ増幅産物のような直鎖
状２本鎖ＤＮＡにおいては、本発明の方法に用いるプラ
イマーがアニーリングする位置を、該ＤＮＡの末端から
約５０塩基程度内側に設定することにより、前述のデネ
ーチャーの工程を行わなくても本発明の核酸配列の増幅
方法を行うことができる場合がある。さらに、ＲＮＡ由
来の配列を有する核酸の増幅を目的とする場合には、本
発明のＤＮＡの合成方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性
とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、
ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生
成したｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類
のＤＮＡポリメラーゼで行なうことができる。
【００８５】上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中
に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少
なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列
の十分な結合を提供するようなものがよい。
【００８６】本発明の方法は、鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮ
Ａの場合、それらを変性して一本鎖にすることにより鋳
型ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を可能にさせる。二本
鎖ＤＮＡが変性する温度、例えば約９５℃で保持するこ
とは好ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含
むが、オリゴヌクレオチドプライマーを標的物に結合さ
せるためには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要があ
る。上記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工
程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応により
ｃＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、等温条
件下において、連続的に核酸配列が増幅される。
【００８７】ここで、「連続的に」とは、反応温度、反
応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意
味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素お
よび核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一
定の温度条件のことを意味する。
【００８８】本発明の核酸増幅方法は、理論によって限
定されないが、例えば、等温条件下、下記の工程が並行
して連続し、繰返し起こると考えられる： ［１］鋳型となるＤＮＡを少なくとも１種のオリゴヌク
レオチドプライマーとアニーリングさせる工程； ［２］プライマーの３’末端から鋳型ＤＮＡに相補的な
ＤＮＡの伸長反応を行なう工程； ［３］エンドヌクレアーゼで、[２]で伸長させたＤＮＡ
鎖を切断する工程； ［４］［３］で切断された部位の３’末端からＤＮＡ伸
長反応を行なうと同時に、［２］で伸長させたＤＮＡ鎖
を分解することなく鋳型ＤＮＡから遊離させる工程； ［５］［４］の工程で得られた二本鎖ポリヌクレオチド
を用いて［３］〜［４］の工程を繰り返す工程。
【００８９】上記の反応は、例えば、クレノウ断片のよ
うな常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより常
温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱性を有する
酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を使
用して高温、例えば５０℃以上で、さらに例えば６０℃
以上で実施することができる。この場合、プライマーの
非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異
性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されるこ
とによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。さら
に該方法においては、逆転写反応および核酸配列の増幅
を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写
酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を有する
ＤＮＡを増幅することができる。
【００９０】本発明の第１の態様は、一本鎖のＤＮＡを
鋳型として、少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて行なう核酸配列の増幅方法であ
る。
【００９１】すなわち、核酸配列を増幅するための方法
であって、（ａ）鋳型となる核酸配列を該核酸の塩基配
列の一部に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライ
マーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して上記鋳型に相
補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プラ
イマーはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーで
あって、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによ
る切断のためにプライマーの３’末端又は３’末端側に
配置され；（ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプ
ライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌ
クレアーゼで切断する工程；および（ｃ）（ｂ）工程で
得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプ
ライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長
して鎖置換を行う工程；を包含することを特徴とする核
酸配列の増幅方法である。
【００９２】本発明の第２の態様は、一本鎖のＤＮＡを
鋳型として、少なくとも２種類の本発明のキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて行なう核酸配列の増幅
方法である。
【００９３】すなわち、少なくとも２種類のプライマー
を使用し、核酸配列を増幅するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列の一部に実質
的に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポ
リメラーゼにより処理して上記鋳型に相補的なプライマ
ー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキ
シリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有する
キメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、リボヌ
クレオチドは、エンドヌクレアーゼによる切断のために
プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
程；ここで（ａ）工程で使用されたプライマーとは異な
るプライマーは置換鎖の塩基配列の一部に実質的に相補
的なデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切
断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法である。
【００９４】本発明の第３、第４の態様は、二本鎖のＤ
ＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡとする前処理の後に、当該
一本鎖ＤＮＡを鋳型としてそれぞれ第１、もしくは第２
の態様の核酸配列の増幅を行う方法である。
【００９５】さらに、本発明の第５、第６の態様は、Ｒ
ＮＡを鋳型とした逆転写反応により一本鎖のｃＤＮＡを
調製した後、当該ｃＤＮＡを鋳型としてそれぞれ第１、
もしくは第２の態様の核酸配列の増幅を行う方法であ
る。
【００９６】本発明において、「再生されたプライマー
伸長鎖」とは、鎖置換により新たに複製に用いられたオ
リゴヌクレオチドプライマーから伸長した、鋳型となる
核酸配列に相補的なＤＮＡ鎖のことを言う。
【００９７】本発明において、「再度利用され」とは、
鋳型となる核酸配列と再生されたプライマー伸長鎖で構
成された二本鎖ＤＮＡを再度鎖置換の工程に利用するこ
とを言う。
【００９８】上記の本発明の態様のいずれにおいても、
まず一本鎖の鋳型ＤＮＡに該ＤＮＡに相補的なキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせる。次
にＤＮＡポリメラーゼの作用により、当該プライマーの
３’末端より鋳型ＤＮＡの残りの配列に沿って鋳型ＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡ（プライマー伸長鎖）を伸長させて
二本鎖ＤＮＡを合成する。エンドヌクレアーゼは当該二
本鎖ＤＮＡに作用してキメラオリゴヌクレオチドプライ
マー中のリボヌクレオチド部分の３’末端側を切断する
が、これ以外の部分は切断しない。即ち、エンドヌクレ
アーゼは上記の二本鎖ＤＮＡにニックを入れるニッキン
グ酵素として作用する。また、該エンドヌクレアーゼ
は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型ＤＮＡ
の二本鎖ＤＮＡ構造を変化させるとも考えられるが、本
願発明は理論によって限定はされない。さらに、鎖置換
活性を有するＤＮＡポリメラーゼがニックの入った二本
鎖ＤＮＡのニックの３’末端からＤＮＡ鎖を再伸長して
新たなプライマー伸長鎖を生成し、同時にニックの３’
末端から下流のＤＮＡを遊離させる。こうして先に合成
されたプライマー伸長鎖が新たなプライマー伸長鎖に置
換される。
【００９９】本発明の核酸配列増幅方法は、鋳型核酸に
相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、置換
鎖に相補的なもう１種のキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマーの２種のプライマーを使用して実施することがで
きる。この場合、一方のプライマーは鋳型となるＤＮＡ
鎖に結合して鎖置換反応を起し、そして他方のプライマ
ーは上記の鎖置換反応によって遊離した置換鎖に結合
し、新たな鎖置換反応を開始する。この態様を使用する
と、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機
能できることは明らかである。このように鋳型量が増加
することにより、非直線的に増幅産物が増加していく。
【０１００】二本鎖ＤＮＡを鋳型に用いて本発明の核酸
配列増幅方法を実施する場合には、二本鎖ＤＮＡを変性
する前または後に、キメラオリゴヌクレオチドプライマ
ー、４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを
反応液に添加する。熱処理により二本鎖ＤＮＡを変性
し、かつ耐熱性の酵素を使用しない場合には、変性後に
酵素を添加することが好ましい。
【０１０１】上記（２）に記述されたように、この方法
において使用されるエンドヌクレアーゼは、プライマー
のリボヌクレオチド部分において鎖を切断するように選
択するべきである。特に好ましくはリボヌクレオチドの
３’側である。さらにＤＮＡポリメラーゼは、ニックの
入ったＤＮＡ鎖を合理的な速度で解離させるように選択
されるべきである。
【０１０２】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、ニックの入った部位から下流への伸長鎖合成に伴
い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要がある。
そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある５’
→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。
このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異体で
あるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由来の同
様の断片（ニューイングランドバイオラブス社製）、
Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０お
よびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、
ジーン（Gene）第９７巻、１３〜１９頁（１９９１）記
載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼも使用することができる。通常はエキソヌクレア
ーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が
適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合
は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用できる。
【０１０３】本発明の核酸配列の増幅方法は、変温で行
ってもよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温と
は、各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を
変化させることを意味する。すなわち、例えば、プライ
マーのアニーリング、相補鎖の合成反応、相補鎖のニッ
キング、そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化
させる場合のことをいう。
【０１０４】次に等温とは、各工程の反応温度を変化さ
せず、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意
味する。いずれの場合においても、最適の反応条件とな
るように温度を設定するのは当然である。
【０１０５】本発明の核酸配列の増幅方法の１つの特徴
としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする
必要がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸配
列の合成方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、
温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する
必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な
反応装置を必要とするが、本発明の方法においては一定
温度を保持できる装置のみでも実施することができる。
【０１０６】このように、本発明の方法は、単一の温度
で実施することができる。好ましくは、プライマーの非
特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸
配列にプライマーが特異的にアニーリングするように反
応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施さ
れる。特に限定するものではないが、上記のように耐熱
性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事が
できる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発
明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当
な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素に
もよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃で
あり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特
に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。特に高温条
件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合より
も鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。各
反応温度に適したプライマーの配列及び長さの設定につ
いては、例えば、そのＴｍ値を参考にしてもよく、ある
いは市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯ
ＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ（宝酒造社製）を使用してもよい。例えば、本発明
の方法において反応温度を５５℃から６０℃あるいは６
５℃に設定した場合、該方法に使用するプライマーの長
さとしては、特に限定するものではないが、例えば１２
ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは
１４ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さ、さらに好
ましくは１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さの
プライマーが使用できる。このように反応温度を上げる
ことの効果としては、鋳型ＤＮＡの二次構造を解消でき
ることが挙げられ、ＧＣ含量の高い鋳型核酸を使用した
場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域
を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果
は、約１００ｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲で、さらに約２
００ｂｐ〜約４．３ｋｂｐの範囲で、特に約２５０ｂｐ
〜約１５００ｂｐの範囲で認められる。
【０１０７】また、本発明の方法において、逆転写酵素
活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃ
ＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来
の核酸配列の増幅を簡便に実施することができる。ま
た、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行
い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型ＤＮ
Ａとして使用することもできる。
【０１０８】いずれの場合においても、本発明の方法に
おいては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応
温度を低下させて反応を停止させるか、または試薬のう
ちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返され
る。
【０１０９】図１は、一本鎖ＤＮＡを鋳型にし、２種の
プライマーを使用する場合の一態様を図示したものであ
る。各工程を下記に示すが、各工程は並行、連続して行
われる： （１）鋳型となる一本鎖ＤＮＡとキメラオリゴヌクレオ
チドプライマーをアニーリングさせる工程； （２）プライマーの３’末端からＤＮＡ伸長反応を行な
い、プライマー伸長鎖ができる工程； （３）プライマー中のリボヌクレオチドを含有する部位
をエンドヌクレアーゼを用いて切断する工程； （４）（３）の切断した部位よりＤＮＡポリメラーゼに
より鎖置換する工程； （５）（４）の工程で得られた鋳型および再生されたプ
ライマー伸長鎖からなる二本鎖ＤＮＡが（３）の工程に
再度利用され、また遊離した置換鎖が（６）の工程以降
の反応に利用される工程； （６）（５）の工程の遊離した置換鎖を鋳型として
（１）と異なるオリゴヌクレオチドプライマーをアニー
リングさせる工程； （７）プライマーの３’末端からＤＮＡ伸長反応を行な
い、プライマー伸長鎖ができる工程； （８）プライマー中のリボヌクレオチドを含有する部位
をエンドヌクレアーゼを用いて切断する工程； （９）（８）の切断した部位よりＤＮＡポリメラーゼに
より鎖置換する工程； （１０）（９）の工程で得られた鋳型および再生された
プライマー伸長鎖が（８）の工程に再度利用される工
程。
【０１１０】二本鎖ＤＮＡが鋳型の場合は、一本鎖ＤＮ
Ａへの変性処理の後、それぞれのＤＮＡ鎖が上記工程
（１）の鋳型になる。従って、得られる増幅産物の量
は、一本鎖のＤＮＡを鋳型にする場合よりも多く、また
増幅産物の検出においては、一本鎖ＤＮＡを鋳型にする
場合よりも短時間で行なうことができる。
【０１１１】本発明の核酸配列の増幅方法は、核酸配列
の増幅を利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、
標識、塩基配列の決定に使用することができる。
【０１１２】また、本発明の核酸配列の増幅方法は、ｉ
ｎ ｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮＡチップのような固相
担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に
増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用する
ことができる。
【０１１３】本発明の核酸配列の増幅方法の特徴の一つ
として、一本鎖のＤＮＡを調製することが可能なことが
挙げられる。この目的のためには、１種のキメラオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用する方法のみならず、２
種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方
法を使用することもできる。例えば、２つのオリゴヌク
レオチドプライマーを用いる場合は、一方のオリゴヌク
レオチドプライマー量を他方の量に対して過剰にして増
幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック（非対称）
−ＰＣＲ法において採用される方法と同様のプライマー
比率によって行なうことができる。この結果、一方の鎖
を置換した産物の量が、他方の鎖を置換した産物の量に
比べて過剰になる。
【０１１４】本発明の核酸配列の増幅方法によれば実質
的にその相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡを調製する
ことができ、例えば、ＤＮＡチップのような核酸固定化
物を作製するための一本鎖ＤＮＡ、標的核酸検出のため
の一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のための
メガプライマーを容易にしかも短時間に作製することが
できる。また、本発明の方法を使用することにより、セ
ンス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択し
て増幅させることが可能である。従って、本発明はセン
ス配列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方
法としても有用である。
【０１１５】さらに、本発明の核酸配列の増幅方法には
経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がな
いため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施する
ことができる。したがって、例えば医薬用途等に使用さ
れる核酸の工業的大量製造が可能である。
【０１１６】本発明の核酸配列の増幅方法において使用
するプライマーの利用効率は、ほぼ１００％であり、従
来の方法、例えばＰＣＲ法の利用効率に比べて５倍〜１
０倍高くすることができる。
【０１１７】（６）本発明の核酸配列の増幅方法のため
のキット 本発明は、前述の第１〜第６の態様に記載の核酸配列の
増幅方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態
様において、該キットは、パッケージされた形態におい
て、鎖置換反応におけるＤＮＡポリメラーゼおよびエン
ドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴
とする。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を
含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるい
は、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよ
び／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択
し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合
の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラー
ゼは、上記（３）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリ
メラーゼから選択することができる。また、エンドヌク
レアーゼは、上記（２）記載のエンドヌクレアーゼから
選択することができる。さらに、該鎖置換反応用緩衝液
は、上記（４）記載の反応バッファー組成を有するもの
が好適に使用できる。
【０１１８】上記「指示書」とは、当該キットの使用方
法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される
反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまた
はリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに
添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に
記載されたものを含む。さらに、インターネットのよう
な電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
【０１１９】（７）本発明の核酸配列の検出方法および
該方法のためのキット 本発明の核酸配列の増幅方法を使用することにより、試
料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方
法は、（ａ）上記の本発明の核酸配列の増幅方法によ
り、標的核酸を増幅する工程；および（ｂ）上記工程に
より増幅された標的核酸を検出する工程；を包含する。
【０１２０】上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子
の検出・定量に利用することができる。すなわちＤＮＡ
またはＲＮＡ等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料
から特定の遺伝子を検出・定量することができる。前述
の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血
清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾
液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物
（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のよ
うな生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カ
ビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイル
ス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している
可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは
土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料か
ら特定の遺伝子を検出・定量することができる。さらに
例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはそ
の他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとする
ことにより、該遺伝子の存在の有無によって、試料中の
ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはその他の微
生物の存在を検出・定量する方法等に利用することがで
きる。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状
態を調べるために本発明の方法を使用することもでき
る。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、
ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれもが好適に使用できる。
【０１２１】上記（ｂ）工程には公知の核酸検出方法、
例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出す
る方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる
検出等を使用することができる。電気泳動による検出で
はエチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、
プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせても
よい。また、プローブは放射性同位元素による標識の
他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施し
たものが使用できる。この他、上記（ａ）工程において
標識ヌクレオチドを使用することにより増幅産物の検出
を容易とすることや、蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移
等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適
切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に
検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが
可能である。
【０１２２】消光状態になるような距離で配置された２
種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（Ｒ
ＮＡ）プローブを本発明の検出方法に使用することがで
きる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これ
に相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニーリングし
た場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解する。この結
果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発
せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができ
る。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸配列の増幅方
法が実施された場合には、その反応液中にプローブを添
加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プ
ローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、
６−ＦＡＭ（6-carboxyfluorescein）とＴＡＭＲＡ
（N，N，N’，N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine）
との組み合わせが好適に使用できる。
【０１２３】本発明の核酸配列の増幅方法の等温下にお
ける増幅方法においては、サーマルサイクラーのような
装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用
するプライマーを１種類もしくは２種類と従来法よりも
少なくすることができる。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣ
Ｒ等で用いられるものを流用できるため、ランニングコ
ストを従来法よりも低くすることができる。そのため、
ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好
適に使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法より
も短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡
便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用すること
ができる。
【０１２４】さらに、本発明においては、上記の標的核
酸の検出方法に使用されるキットが提供される。該キッ
トは、上記の本発明の核酸配列の増幅方法のためのキッ
トを使用することができる。さらに、標的核酸の増幅に
使用するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマー、
増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプロ
ーブ等を含むものであってもよい。
【０１２５】（８）本発明の核酸を所定の領域に整列さ
せた核酸固定化物とその製造方法 ＤＮＡチップは、多数の異なる遺伝子あるいはＤＮＡの
断片をスライドグラス等の固相担体上の所定の領域ある
いは所定の位置に整列させて固定化した核酸固定化物で
あり、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡアレイ）とも呼ば
れる。ＤＮＡチップは、試料より調製した核酸試料、好
ましくは標識された核酸試料と接触させてハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、核酸試料中に存在する、
ＤＮＡチップ上の所定の領域に整列させて固定化された
ＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の存在を調べる目的
で使用される。試料中の多数の核酸を一度の操作で検
出、定量できることから、ＤＮＡチップは遺伝子の発現
解析や変異あるいは多型解析を飛躍的に加速させる手段
として非常に有用である。二本鎖核酸が所定の領域に整
列させて固定化されたＤＮＡチップは適切な変性処理の
後にハイブリダイゼーション工程に使用されるが、検出
しようとする標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡが所定の
領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは、標的核
酸の検出に特に好適である。
【０１２６】上記のように、本発明の方法により所望の
ＤＮＡを一本鎖の状態で増幅することができる。増幅物
の精製方法に限定はないが、イソプロパノール沈殿によ
る精製が好ましい。こうして得られたＤＮＡ、特に好ま
しくは実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡ
は、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として好適に
使用できる。即ち、本発明の方法は、ＤＮＡチップ作製
において所定の領域に整列させて固定化するＤＮＡを調
製する方法として好適に使用できる。こうして得られた
ＤＮＡを所定の領域に整列させて固定する担体は不溶性
のものであれば特に限定はなく、ガラス、プラスチック
等で作製された板状の担体の他、ニトロセルロースやナ
イロン製の膜状の担体が好適に使用される。また、その
固定化にあたっては公知の核酸固定化方法が使用でき
る。上記のＤＮＡはそのまま担体に固定化を行う他、適
当なリンカーを介して、または複数分子のＤＮＡをライ
ゲーションさせたうえで固定化してもよい。
【０１２７】本発明の方法により増幅されたＤＮＡを所
定の領域に整列させて固定化した核酸固定化物、例えば
ＤＮＡチップを試料より調製された標的核酸を含む可能
性のある核酸試料と接触させ、ハイブリダイゼーション
を実施することにより、当該核酸固定化物上の核酸とハ
イブリダイズした標的核酸を検出、定量することができ
る。特に、本発明の方法により増幅された一本鎖のＤＮ
Ａを所定の領域に整列させて固定化したＤＮＡチップ
は、従来よりも簡便な操作で、かつ、高感度、高再現性
での標的核酸の検出を可能とする。
【０１２８】（９）本発明の核酸の大量製造方法 上記のように、本発明の一態様により等温で実施可能な
核酸配列の増幅方法が提供される。該方法は、増幅しよ
うとする核酸の鋳型となる核酸の他、反応に必要な各種
成分を混合して等温条件下で反応させることにより、所
望の核酸を製造することができる。ＰＣＲ法では反応混
合物の温度を経時的に変化させる必要があるため、反応
のスケールは温度制御が可能な容量（通常、２００μｌ
以下）に限られ、スケールアップは困難である。一方、
当該方法にはこのような制約はなく、反応混合物の容量
を増加させることにより大量の核酸を製造することが可
能である。当該方法は１分子の鋳型から多数の相補鎖分
子が合成され、さらにこれらの相補鎖分子を鋳型とした
核酸の合成も可能であることから、鋳型ならびにプライ
マーを適切に設定することにより、所望の核酸を効率よ
く、大量に製造することができる。さらにまた、当該方
法がＰＣＲ法のような特殊な装置、頻繁な温度変化を必
要としないことは設備、エネルギーのコスト面からも有
利であり、工業的な核酸の大量製造方法としても優れて
いる。
【０１２９】また、本発明の方法は、上記のＤＮＡチッ
プに固定化するためのＤＮＡ断片のような多種類、かつ
大量のＤＮＡ断片を供給する方法として有用である。す
なわち、１つの態様としては、単純な反応工程でＤＮＡ
断片を大量に得ることができ、別の態様としては限られ
た種類のプライマーを使用して非常に多種類のＤＮＡ断
片を得ることができる。後者は、本発明の方法の鋳型と
なる核酸を公知の核酸増幅方法、例えばＰＣＲ法等であ
らかじめ増幅する工程を組み合わせて実施することがで
きる。例えば、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nu
cleic Acids Research）第２４巻、１９号、３７７８〜
３７８３頁（１９９６）に記載のタグ配列を有するラン
ダムプライマーを使用して核酸を増幅する方法あるい
は、ジェノミックス（Genomics）第１３巻、７１８〜７
２５頁（１９９２）に記載の縮重プライマー（Degenera
te primer）を用いたＤＯＰ−ＰＣＲ（Degenerate Olig
onucleotide-Primed PCR）法に基づき、限られた種類の
プライマーを使用してあらゆる種類の鋳型核酸を増幅す
ることができる。さらに、前述のランダムプライマーや
縮重プライマーに付加されたタグ配列にあわせて本発明
の核酸増幅法に使用されるプライマーを設計すれば、上
記の工程で作成されたあらゆる鋳型核酸について１もし
くは数種類のプライマーで本発明の核酸増幅反応を実施
することができる。このように、適切な鋳型核酸の調製
工程と本発明の方法を組み合わせれば、多種類のＤＮＡ
断片を従来よりも安価で、大量に供給することができ
る。
【０１３０】核酸を含有する医薬としては、細胞内にお
いて有用なポリペプチドを発現させるための二本鎖ＤＮ
Ａ、目的の遺伝子の発現を抑制するための一本鎖アンチ
センスＤＮＡ等があり、これらは適切な手段、例えばリ
ポソーム等の遺伝子導入用担体を使用して生体に投与さ
れる。本発明の核酸の製造方法は、上記のような医薬用
途等の一本鎖、もしくは二本鎖の核酸を大量に製造する
ための方法として好適である。さらに、本発明の方法で
は、例えば生体内での分解を抑制するようなｄＮＴＰの
アナログを含有する核酸を製造することも容易である。
【０１３１】本発明において増幅されたＤＮＡ断片は通
常のヌクレオチドにより構成されるため、増幅されたＤ
ＮＡはその内部の制限酵素部位を用いて適当なベクター
にサブクローニングすることができる。さらにＲＦＬＰ
のような制限酵素を用いた処理をすることも問題なくで
き、遺伝子検査の分野においても広く利用できる。ま
た、本発明において増幅されたＤＮＡ断片は、通常のヌ
クレオチドにより構成されるため、増幅断片中にＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーター配列を組込んでおけば、増
幅断片を鋳型としてＲＮＡを合成し、例えば、合成され
たＲＮＡをプローブとして使用可能である。当然なが
ら、通常のｄＮＴＰの代わりに蛍光標識されたｄＮＴＰ
を使用して本発明の核酸配列増幅方法を実施することに
より、蛍光標識されたＤＮＡプローブを作製することが
できる。
【０１３２】本発明の方法において、最終的に増幅され
る断片は、その両端に増幅に使用するプライマーに相補
的な塩基配列を有さないため、増幅産物の持ち込みによ
るコンタミネーションを軽減させることができる。従っ
て、ルーチンワークで同じ領域を増幅する遺伝子検査等
において有用である。
【０１３３】本発明の核酸配列の増幅方法の特徴を以下
に列挙する。 １．少ない鋳型量より、大量の核酸を増幅することがで
きる。２種のプライマーを使用した場合には増幅産物は
２次関数的に増加する。 ２．等温でも実施でき、その場合サーマルサイクラーの
ような装置を必要としない。このため、容易に反応容量
をスケールアップすることができる。 ３．通常、増幅反応は１または２種のキメラオリゴヌク
レオチドプライマーと２種の酵素（ＤＮＡポリメラーゼ
およびエンドヌクレアーゼ）で実施される。 ４．１分子のプライマーより多数のＤＮＡ鎖が合成され
るため、プライマー量が増幅産物量を制限することがな
い。さらに、プライマー使用効率が約１００％とＰＣＲ
法に比べて極めて高い。 ５．一本鎖、二本鎖のＤＮＡを目的に応じ選択的に増幅
することができる。 ６．増幅反応に（α−Ｓ）ｄＮＴＰのようなｄＮＴＰア
ナログを必要としないため、試薬コストが安価である。
また、ｄＮＴＰアナログを含有しない、天然型の核酸を
取得することが可能である。 ７．他の核酸増幅方法と組み合わせることにより、安価
で大量のＤＮＡ増幅断片を供給することができる。
【０１３４】以上のように、本発明の方法は工業的スケ
ールでの核酸製造に適した方法である。
【０１３５】
【実施例】本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例によって限定されるもので
はない。
【０１３６】参考例 本発明の方法に使用されるＲＮａｓｅＨのユニット数
は、以下の方法で測定した。 （１）使用する試薬液の調製 力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ４０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７．７、３７℃）、４ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセ
ロール、２４μＭポリ（ｄＴ）になるように滅菌水で調
製した。
【０１３７】ポリ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液：３７０
ｋＢｑのポリ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液を２００μｌ
の滅菌水に溶解した。
【０１３８】ポリアデニル酸溶液：ポリアデニル酸を３
ｍＭになるように滅菌超純水で希釈した。
【０１３９】酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ２５ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５、３７℃）、５ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．
５、３７℃）、３０ｍＭ塩化ナトリウム、５０％グリセ
ロールになるように滅菌水で調製した。
【０１４０】熱変性子牛胸腺ＤＮＡの調製：子牛胸腺Ｄ
ＮＡ２００ｍｇをＴＥバッファー１００ｍｌに懸濁し、
膨潤させた。該溶液のＵＶ２６０ｎｍの吸光度を測定
し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌超純水で希釈した。次
に、該溶液を１００℃で１０分間加熱後、氷浴中で急冷
した。
【０１４１】（２）活性測定方法 上記（１）で調製した力価測定用反応液９８５μｌにポ
リ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液７μｌを加え３７℃で１
０分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が２４
μＭになるように８μｌ加え、さらに３７℃で５分間保
持した。このようにしてポリ［８−３Ｈ］ｒＡ−ポリｄ
Ｔ反応液１０００μｌを調製した。次に、該反応液２０
０μｌを分取し、３０℃で５分間保持した後、任意の希
釈系列で希釈した酵素液１μｌを加え、これらの反応液
を経時的に５０μｌずつサンプリングして、後の測定に
用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をＹ
分とした。また、全ＣＰＭ用反応液５０μｌおよびブラ
ンク用反応液５０μｌは、酵素液の代わりに酵素希釈液
を１μｌ加えて調製した。該サンプリング溶液に１００
ｍＭピロリン酸ナトリウム１００μｌ、熱変性子牛胸腺
ＤＮＡ溶液５０μｌおよび１０％トリクロロ酢酸３００
μｌ（全ＣＰＭ測定の場合は、超純水３００μｌ）を加
え、０℃で５分間保持後、１００００ｒｐｍで１０分間
遠心した。遠心後、得られた上清２５０μｌをバイアル
に入れ、アクアゾルー２（ＮＥＮライフサイエンスプロ
ダクツ社製） １０ｍｌを加え、液体シンチレーション
カウンターでＣＰＭを測定した。
【０１４２】（３）ユニット計算 各酵素のユニット（Unit）数は、以下の計算式で算出し
た。 Unit/ ml ={（測定したＣＰＭ−ブランクＣＰＭ）×
１．２＊×２０×１０００×希釈率}×２００（μｌ）
／（全ＣＰＭ×Ｙ分×５０（μｌ）×９＊＊） １．２＊：全ＣＰＭ中に含まれるポリ［８−３Ｈ］ｒＡ
−ポリｄＴの５０μｌ当たりのｎｍｏｌ数 ９＊＊：補正係数
【０１４３】実施例１ （１）鋳型ＤＮＡとプライマーの合成 本実施例に鋳型として使用した９９塩基の一本鎖ＤＮＡ
およびプライマーは、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステム社製）を用いて合成した。配列表の配列番号
１に上記の９９塩基の一本鎖ＤＮＡの塩基配列を示す。
また、配列表の配列番号２および３に、それぞれ上流プ
ライマーおよび下流プライマーの基本的な塩基配列を示
す。本実施例に使用されたプライマーの詳細な構造を以
下に示す： プライマー対１：配列表の配列番号２および３に示され
る塩基配列を有し、その全体がすべてデオキシリボヌク
レオチドで構築されたプライマーの組み合わせ； プライマー対２：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端から２個のデオキシリボヌクレオチドが
リボヌクレオチドに置換され、かつ３’末端から２個め
のリボヌクレオチドの５’側リン酸結合がホスホロチオ
エート結合に置換されたプライマーの組み合わせ； プライマー対３：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端のデオキシリボヌクレオチドのみがリボ
ヌクレオチドに置換され、かつ当該リボヌクレオチドの
５’側リン酸結合がホスホロチオエート結合に置換され
たプライマーの組み合わせ； プライマー対４：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端から２個のデオキシリボヌクレオチドが
リボヌクレオチドに置換されたプライマーの組み合わ
せ； プライマー対５：プライマー対１のプライマーのそれぞ
れの３’末端から３、４個めのデオキシリボヌクレオチ
ドがリボヌクレオチドに置換され、かつ３’末端から４
個めのリボヌクレオチドの５’側リン酸結合がホスホロ
チオエート結合に置換されたプライマーの組み合わせ。
【０１４４】（２）増幅反応 ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチル
ス・カルドテナックス由来のＤＮＡポリメラーゼである
ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
と、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨであるｃｌｏｎｅｄリボ
ヌクレアーゼＨ（宝酒造社製）を用いて、以下のモデル
１〜７の反応系について検討した。
【０１４５】反応液は、下記のように調製した。 ３５ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、０．１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、２．７％グ
リセロール、５％ジメチルスルオキシド 、各１．４ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭ塩化マグネシウム、それ
ぞれ２０ｐｍｏｌの（１）のプライマー対もしくはその
一方のプライマー、ならびに０．６ｎｇの合成一本鎖鋳
型ＤＮＡ、５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラー
ゼ、６０ＵのｃｌｏｎｅｄリボヌクレアーゼＨ、反応液
の最終容量５０μｌ。上記反応液を均一に混合し、５５
℃、６０分間保温した後、９０℃、２分間加熱して酵素
を失活させた。その後、各反応液の８μｌを３％ヌシー
ブ３：１アガロース（宝酒造社製）ゲルにて電気泳動を
行なった。以下に各モデルに使用されたプライマーを示
す： モデル１〜５：それぞれプライマー対１〜プライマー対
５を使用； モデル６：プライマー対２のうちの下流プライマーのみ
を使用； モデル７：プライマー対４を使用し、ＲＮａｓｅＨを添
加しない。
【０１４６】その結果、モデル２〜５の反応液を使用し
た場合、約４０ｂｐ(base pair)〜約９０ｂｐの範囲で
目的のサイズの増幅断片が確認された。これらの反応系
でＤＮＡが増幅されることが明らかとなった。また、一
方のプライマーのみを使用したモデル６においても、予
想される約７０ｂ(base)の増幅断片（一本鎖ＤＮＡ断
片）が確認できた。なお、モデル１および７の反応では
ＤＮＡの増幅はまったく認められなかった。
【０１４７】（３）増幅産物の確認 上記（２）の、モデル４の反応によって得られた反応液
をマイクロコン−１００（宝酒造社製）を用いてろ過し
た後、フィルターにトラップされた増幅ＤＮＡ断片を回
収した。該ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法により
解析した。その結果、上記の反応によって増幅された断
片が鋳型ＤＮＡと同じ塩基配列を持つＤＮＡである事が
確認された。
【０１４８】（４）反応時間の検討 上記（２）のモデル２の反応液を調製し、これを種々の
時間反応させた場合の増幅産物量の変化を調べた。当該
反応液を、０、１５、３０、６０、９０、１２０分間、
それぞれ５５℃で保温した後、９０℃、２分間の処理に
より酵素を失活させた。各反応液８μｌを３％ ヌシー
ブ３：１アガロースゲルを使用した電気泳動にて解析し
た。電気泳動の結果を図２に示す。図中１〜６はそれぞ
れ０、１５、３０、６０、９０、１２０分間反応した反
応液の泳動されたレーンを、また、Ｍは分子量マーカー
として、１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅ
ｒ（宝酒造社製）が泳動されたレーンを示す。
【０１４９】図２に示されるように、反応時間が０分で
は増幅産物は確認できなかったが、反応時間が１５分、
３０分、６０分と長くなるに従い、増幅産物量が増大し
ていることが確認できた。しかし、６０分以上の反応で
は、電気泳動によって確認される増幅産物量はほぼ横ば
いであり、使用された反応系での増幅は６０分程度でプ
ラトーに達することが示された。
【０１５０】実施例２ （１）ＲＮＡの調製 本実施例に鋳型として使用するＲＮＡは、ヒト培養細胞
ＨＴ２９（ＡＴＣＣＨＴＢ−３８）（大日本製薬社製）
からトライゾール試薬（ライフテック社製）を用いて調
製した。得られたトータルＲＮＡは、その濃度を１μｇ
／μｌに調製した。またＲＮＡの純度を分光学的に調べ
たところ、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８であった。
【０１５１】（２）増幅反応 逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＢｃ
ａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅＨエンド
ヌクレアーゼを用いて、ＲＮＡからのｃＤＮＡが増幅さ
れるかを検討した。
【０１５２】反応液には１μｇ相当の上記トータルＲＮ
Ａを加え、実施例２と同様の組成に調製した。ジーンバ
ンク(GenBank)登録番号、Ｘ０１０６０のヒトトランス
フェリンレセプターをコードする領域を増幅のターゲッ
トとし、プライマーとして実施例１に記載のプライマー
対２を用いた。
【０１５３】上記の反応液を５５℃、６０分間保温した
後、９０℃、２分間加熱して酵素を失活させた。この反
応液のうちの８μｌを３％ ヌシーブ３：１アガロース
ゲルにて電気泳動したところ、予想される５６ｂｐの増
幅断片が確認できた。さらに、ターゲットとした塩基配
列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。その５’末端にビオチン標識を付し
た、配列表の配列番号４に示される塩基配列のＤＮＡプ
ローブを使用してサザンハイブリダイゼーションを行っ
たところ、このプローブは上記の増幅断片にハイブリダ
イズした。即ち、本発明の方法によりターゲットとした
領域が正しく増幅されていることが確認された。
【０１５４】実施例３ （１）プライマーの合成 二本鎖ＤＮＡを鋳型とした場合の本発明の増幅方法につ
いて検討した。使用するプライマーは、ＤＮＡ合成機
（アプライド・バイオシステム社製）を用いて合成し
た。配列表の配列番号５〜１３にプライマーの基本的な
塩基配列を示す。さらに、本実施例に使用されたプライ
マーの詳細な構造を以下に示す。プライマー対Ａ〜Ｆま
では、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造社製）を鋳型とした。
ｐＵＣ１９のヌクレオチド配列はデータベース、ジーン
バンク(GenBank)登録番号、Ｌ０９１３７から入手可能
である。プライマー対Ｇの場合は、実施例２で得られた
ヒト全ＲＮＡより配列表の配列番号１４および１５記載
のプライマーおよびＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉ
ｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）用いて、添
付の標準プロトコールに従って調製した２本鎖ＤＮＡ増
幅断片を鋳型とした。
【０１５５】プライマー対Ａ（増幅断片長約４５０ｂ
ｐ）：配列表の配列番号５および６に示される塩基配列
を有し、その３’末端２塩基がリボヌクレオチドに置き
換わったプライマーの組み合わせ； プライマー対Ｂ（増幅断片長約２５０ｂｐ）：配列表の
配列番号５および７に示される塩基配列を有し、その
３’末端２塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプラ
イマーの組み合わせ； プライマー対Ｃ（増幅断片長約５２０ｂｐ）：配列表の
配列番号５および８に示される塩基配列を有し、その
３’末端２塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプラ
イマーの組み合わせ； プライマー対Ｄ（増幅断片長約８９０ｂｐ）：配列表の
配列番号５および９に示される塩基配列を有し、その
３’末端２塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプラ
イマーの組み合わせ； プライマー対Ｅ（増幅断片長約１３０ｂｐ）：配列表の
配列番号１０および６に示される塩基配列を有し、その
３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプラ
イマーの組み合わせ； プライマー対Ｆ（増幅断片長約２２０ｂｐ）：配列表の
配列番号１１および６に示される塩基配列を有し、その
３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプラ
イマーの組み合わせ； プライマー対Ｇ（増幅断片長約３２０ｂｐ）：配列表の
配列番号１２および１３に示される塩基配列を有し、そ
の３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置き換わったプ
ライマーの組み合わせ。
【０１５６】（２）増幅反応 反応液は、下記のように調製した。３５ｍＭリン酸カリ
ウムバッファー（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ジメチルスルオキシド
、各１．４ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、それぞれ６０ｐｍｏｌの（１）のプライマー
対、ならびに１００ｎｇのｐＵＣ１９鋳型ＤＮＡ、５．
５ＵのＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、６０ＵのＲ
ＮａｓｅＨ、反応液の最終容量５０μｌ。
【０１５７】反応条件は以下のとおりである。ＤＮＡポ
リメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ無添加の反応液を９８
℃、１分間熱変性処理後、５５℃に冷却し、ＤＮＡポリ
メラーゼおよびＲＮａｓｅＨを混合し、５５℃、６０分
間保温した。反応終了後、９０℃、２分間加熱して酵素
を失活させた。その後、各反応液の８μｌを３％ ヌシ
ーブ３：１アガロースゲルにて電気泳動を行なった。
【０１５８】その結果、いずれのプライマー対において
も目的の増幅断片が得られることが確認できた。即ち、
本発明の増幅方法において、２本鎖ＤＮＡを鋳型として
増幅反応を行うことができることを確認した。
【０１５９】（３）増幅産物の制限酵素消化 本発明の増幅方法を用いて得られた増幅断片の制限酵素
消化について検討した。鋳型ＤＮＡとして、ｐＵＣ１９
プラスミドＤＮＡを用いた。配列表の配列番号５〜６に
記載のｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ （２）ＮＮプライマーお
よびｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマーを使用し
た。なお、該プライマーは、いずれも３’末端の２塩基
がリボヌクレオチドに置き換わったものを用いた。下記
に反応液組成を示す。 反応液Ａ：３５ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．４ｍＭ ｄ
ＮＴＰ混合物、０．０１％ＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ、２．
７％グリセロール 、各１００ｐｍｏｌずつのｐＵＣ１
９ ｕｐｐｅｒ（２）ＮＮプライマーおよびｐＵＣ１９
ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマー、５００ｎｇのｐＵＣ１９
ＤＮＡ、および滅菌蒸留水で反応液容量を４８μｌに調
製した。
【０１６０】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理し
た後、５５℃に冷却した。次に、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮａｓｅＨおよび５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴを添加
し、反応液量を５０μｌにした。該反応液を５５℃で１
時間インキュベーションした。反応終了後、９０℃、２
分間加熱処理して酵素を失活させた。その反応液を３％
アガロースゲル電気泳動して、得られた増幅産物を精製
した。回収された増幅産物は、１００μｌの滅菌蒸留水
に再懸濁した。
【０１６１】上記ＤＮＡ溶液を使用して制限酵素消化を
行った。制限酵素は、ＡｃｃＩＩ（宝酒造社製）および
ＢｃｎＩ（宝酒造社製）を使用した。以下に反応液組成
を示す。ＤＮＡ溶液３μｌ、１０×ＡｃｃＩＩ添付バッ
ファーあるいは１０×ＢｃｎＩ添付バッファーを１μ
ｌ、制限酵素ＡｃｃＩＩあるいはＢｃｎＩを１μｌ、さ
らに滅菌蒸留水で反応液容量を１０μｌに調製した。該
反応液を３７℃、３０分間反応後、１０×ローディング
バッファー（loading buffer）を１．５μｌ加え、その
うちの６μｌを３％ヌシーブアガロースゲルで電気泳動
した。
【０１６２】その結果、ＡｃｃＩＩおよびＢｃｎＩのい
ずれの制限酵素においても目的とする制限酵素消化ＤＮ
Ａ断片が得られた。
【０１６３】（４）突然変異検出 本発明の増幅方法を用いた突然変異検出について検討し
た。鋳型としてｐＵＣ１９を用いた。配列表の配列番号
５〜６にｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ（２） ＮＮプライマー
およびｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマーの基本的
な塩基配列を示した。上記プライマーは、いずれもその
３’末端の２塩基がリボ核酸であるキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーである。さらに、ｐＵＣ１９ ｕｐｐ
ｅｒ（２） ＮＮプライマーは、３’末端を鋳型と相補
的なＵおよびミスマッチのＡ、Ｃ、Ｇに置換した４種類
（それぞれ、ｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ（２） ＮＮ−Ｕ、
ｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ（２） ＮＮ−Ａ、ｐＵＣ１９
ｕｐｐｅｒ（２） ＮＮ−ＣおよびｐＵＣ１９ ｕｐｐｅ
ｒ（２） ＮＮ−Ｇと称する）を作製した。これらのプ
ライマーの組み合わせについて以下に示す。 プライマー対１： pUC19 upper(2) NN-UおよびpUC19 lo
wer NN プライマー対２： pUC19 upper(2) NN-AおよびpUC19 lo
wer NN プライマー対３： pUC19 upper(2) NN-CおよびpUC19 lo
wer NN プライマー対４： pUC19 upper(2) NN-GおよびpUC19 lo
wer NN
【０１６４】反応液は、下記のように調製した。 ３０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．３）、
０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ＤＭＳ
Ｏ、各１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、それぞれ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対および
５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および滅菌蒸留水で反応液容量
を４８μｌにした。
【０１６５】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、５．５ＵのＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼ、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａ
ｓｅＨを添加し、５５℃、６０分間保持した。その後、
９０℃、２分間加熱して酵素を失活させた。各反応液８
μｌを使用し、４％ ヌシーブ３：１アガロース（宝酒
造社製）ゲルにて電気泳動を行なった。その結果、ｐＵ
Ｃ１９ ｕｐｐｅｒ（２） ＮＮの３’末端が相補的なプ
ライマーの組み合わせのみ目的とする約４５０ｂｐの増
幅断片が検出された。一方、 ｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ
（２） ＮＮの３’末端がミスマッチのプライマーの組
み合わせについてはいずれも増幅断片は、確認できなか
った。
【０１６６】実施例４ （１）マイクロチューブでの反応 本発明の増幅方法について反応容量の検討を行った。増
幅領域としては、ヒトトランスフェリンレセプターをコ
ードする領域を選択した。配列表の配列番号１２および
１３記載の配列を有するプライマーを使用した。なお、
該プライマーは、３’末端の２塩基がリボ核酸に置き換
わったものを使用した。鋳型となるＤＮＡは、あらかじ
めＲＴ−ＰＣＲ法により得た増幅断片約７５０ｂｐを使
用した。反応容量は、５０μｌ、１００μｌ、３００μ
ｌ、および５００μｌになるように調製した。下記に反
応液組成を示す。 反応液Ａ：５×専用バッファー（１３５ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、２．５％ＤＭＳＯ）１０μｌ、１００ｍＭ酢酸マグ
ネシウム ４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 ５μ
ｌ、１０μＭ ＡＴＰ１０μｌ、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（２２Ｕ／μｌ）１μｌ、ＲＮａｓｅＨ
（６０Ｕ／μｌ）１μｌ、および滅菌蒸留水で３９μｌ
に調製した。 反応液Ｂ：２０μＭヒトトランスフェリンレセプターＳ
プライマー（配列番号１２）および２０μＭヒトトラン
スフェリンレセプタープライマー（配列番号１３）をそ
れぞれ３μｌ、鋳型ＤＮＡ約１００ｎｇおよび滅菌蒸留
水で１１μｌにした。容量が５０μｌ以上の場合は、上
記組成に基づきスケールアップした。
【０１６７】増幅反応は、上記Ｂ液を９８℃、２分間処
理した後、５５℃、３分間保持した。次に、１５００μ
ｌ容マイクロチューブ中で５５℃でプレインキュベーシ
ョンしたＡ液に前述のＢ液を添加し、混和後、５５℃で
１時間インキュベーションした。反応終了後、氷浴上に
移し、反応液８μｌを３％アガロースゲル電気泳動し
た。
【０１６８】その結果、いずれの反応容量においても効
率よく目的とする約３００ｂｐの増幅断片が検出でき
た。また、鋳型ＤＮＡがＰＣＲ増幅断片であっても問題
なく目的とする増幅断片を得られることを確認した。
【０１６９】（２）シャーレでの反応 反応容量の増大に伴う反応液の温度不均一を防ぐため
に、シャーレを使用して検討を行った。増幅領域として
は、ヒトトランスフェリンレセプターをコードする領域
を選択した。配列表の配列番号１２および１３記載の配
列を有するプライマーを使用した。なお、該プライマー
は、３’末端の２塩基がリボ核酸に置き換わったものを
使用した。鋳型となるＤＮＡは、あらかじめＲＴ−ＰＣ
Ｒ法により得た増幅断片約７５０ｂｐを使用した。反応
容量は、１０ｍｌになるように調製した。下記に反応液
組成を示す。 反応液Ａ：５×専用バッファー（１３５ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、２．５％ ＤＭＳＯ） ２０００μｌ、１００ｍＭ
酢酸マグネシウム ８００μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混
合物 １０００μｌおよび滅菌蒸留水で９．１ｍｌに調
製した。 反応液Ｂ：６０μＭ ヒトトランスフェリンレセプター
Ｓプライマー（配列番号１２）および６０μＭ ヒトト
ランスフェリンレセプタープライマー（配列番号１３）
をそれぞれ２００μｌ、鋳型ＤＮＡ 約１０μｇおよび
滅菌蒸留水で５００μｌにした。 反応液Ｃ：ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（２２
Ｕ／μｌ） ２００μｌ、ＲＮａｓｅＨ（６０Ｕ／μ
ｌ） ２００μｌ。
【０１７０】増幅反応は、上記Ｂ液を９８℃、１分間処
理した後、５５℃、３分間保持した。次に、直径６０ｍ
ｍのプラスティックシャーレ中で５５℃でプレインキュ
ベーションしたＡ液に前述のＢ液を添加し、さらにＣ液
を添加し混和後、５５℃で１時間インキュベーションし
た。反応終了後、氷浴上に移し、反応液８μｌを３％ア
ガロースゲル電気泳動した。
【０１７１】その結果、１０ｍｌの反応容量であっても
目的とする約３００ｂｐの増幅断片が効率よく検出でき
た。また、鋳型ＤＮＡがＰＣＲ増幅断片であっても問題
なく目的とする増幅断片を得られることを確認した。即
ち、多量のＤＮＡ断片を必要とするＤＮＡチップ作製に
おいて、本発明の方法が従来のＰＣＲ法と比較しても好
適に使用できることを確認した。
【０１７２】実施例５ （１）バッファーの種類とＲＮａｓｅＨ使用量の関係 バッファーの種類とＲＮａｓｅＨの使用量の関係につい
て検討した。鋳型としてｐＵＣ１９ベクターに２４９ｂ
ｐおよび９１１ｂｐのフラグメントをクローニングして
得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９−２４９および
ｐＵＣ１９−９１１と称す）を、プライマーとして配列
表の配列番号１６〜１７記載の配列を有するＭＦ２Ｎ３
（２４）プライマーおよびＭＲ１Ｎ３（２４）プライマ
ーの３’末端３塩基をリボヌクレオチドにしたキメラオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用した。該プライマー
の組み合わせによりｐＵＣ１９−２４９では約４５０ｂ
ｐの、ｐＵＣ１９−９１１では約１１００ｂｐの増幅断
片が得られる。
【０１７３】検討するバッファーは、トリス塩酸バッフ
ァー、リン酸カリウムバッファー、トリシンバッファー
系を選択した。また、ＲＮａｓｅＨは、無添加および最
終濃度０．３Ｕ〜１．２Ｕ／μｌで検討した。トリス塩
酸バッファー系は、１０ｎｇのｐＵＣ１９−２４９ある
いは２００ｎｇのｐＵＣ１９−９１１、各６０ｐｍｏｌ
のプライマーおよび１１Ｕ／５０μｌ 反応容量のＢｃ
ａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ以外は、実施例１
（２）と同様に調製した。リン酸カリウムバッファー系
についても同様の組成とした。トリシンバッファー系に
ついては、最終濃度が３４ｍＭ トリシンバッファー
（ｐＨ８．７）、１０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
硫酸アンモニウム、０．０１％ ＢＳＡ、１％ ＤＭＳ
Ｏ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ
混合物となるように調製した。上記バッファー系につい
てｐＵＣ１９−２４９プラスミド１０ｎｇ／５０μｌ
反応容量、ならびにｐＵＣ１９−９１１プラスミド２０
０ｎｇ／５０μｌ 反応容量、各６０ｐｍｏｌ／５０μ
ｌ 反応容量のプライマー、各濃度となるＲＮａｓｅ
Ｈ、１１Ｕ／５０μｌ 反応容量のＢｃａＢＥＳＴ Ｄ
ＮＡポリメラーゼになるように調製した。
【０１７４】増幅反応は鋳型となるｐＵＣ１９−２４９
あるいはｐＵＣ１９−９１１と各プライマーの混液を９
８℃で１分間熱変性処理後、５５℃まで冷却した後に残
りの反応組成混液を添加し、５５℃で６０分間反応させ
た。反応終了後、４℃に冷却し、１／１０量の０．５Ｍ
ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。その後、各反
応液の３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造
社製）ゲルにて電気泳動を行った。
【０１７５】その結果、ｐＵＣ１９−２４９を鋳型とし
た場合はトリス塩酸バッファー系、リン酸カリウムバッ
ファー系、トリシンバッファー系の順に、ｐＵＣ１９−
９１１を鋳型とした場合はトリス塩酸バッファー系、ト
リシンバッファー系、リン酸カリウムバッファー系の順
に増幅効率の向上が認められた。さらに、ＲＮａｓｅＨ
については、無添加では目的の増幅断片は得られなかっ
たが、最終濃度０．３Ｕ〜１．２Ｕ／μｌで用いた場合
はいずれも目的の増幅断片が得られた。
【０１７６】（２）プライマー量の検討 使用するプライマー量が本発明の増幅方法に与える影響
を検討した。反応液は、上記（１）記載の組成のうち、
鋳型としてｐＵＣ１９−２４９を用いた系を使い、リン
酸カリウムバッファー系は６０Ｕ／５０μｌ反応のＲＮ
ａｓｅＨを、トリス塩酸バッファー系、トリシンバッフ
ァー系は３０Ｕ／５０μｌ反応のＲＮａｓｅＨを用いて
行った。プライマーの濃度は１０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍ
ｏｌ／５０μｌの範囲で検討した。反応条件および増幅
確認は、上記（１）記載と同様にした。
【０１７７】その結果、どの反応バッファー系を用いた
場合も、１０ｐｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ／５０μｌの範
囲で目的とする増幅断片が確認できた。
【０１７８】（３）反応バッファーのｐＨの影響 反応液のｐＨが本発明の増幅方法に与える影響について
検討した。反応液は、上記（２）記載の組成と同様にし
た。ｐＨは、リン酸カリウムバッファー系は、ｐＨ７．
０〜８．０の範囲で、トリシンバッファー系は、ｐＨ
７．５〜９．２の範囲で、トリス塩酸バッファー系は、
ｐＨ７．５〜９．０の範囲で検討した。反応条件および
増幅確認は、上記（１）記載と同様にした。
【０１７９】その結果、各々のバッファー系で用いたｐ
Ｈの範囲において、目的とする増幅断片が確認できた。
【０１８０】（４）添加剤の効果 上記（３）記載のリン酸バッファー系（ｐＨ７．５）の
反応液組成で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の添
加効果を検討した。また、ポリアミンの添加効果につい
ても検討した。ＤＭＳＯの添加量は、無添加〜１０％の
範囲で検討した。一方、ポリアミンとしては、スペルミ
ン４塩酸塩（シグマ社製）、スペルミジン３塩酸塩（シ
グマ社製）、アセチルプトレスシン（ナカライ社製）、
プトレスシン２塩酸塩（ナカライ社製）、トリメチレン
ジアミン（ナカライ社製）、プロピレンジアミン（ナカ
ライ社製）、ジアミノメタン２塩酸塩（ナカライ社製）
を使用した。添加量は、プロピレンジアミンおよびトリ
メチレンジアミンは、無添加〜２％の範囲で、それ以外
のポリアミンは、無添加〜５ｍＭの範囲で行った。反応
条件および増幅確認は、上記（１）記載の方法と同様に
した。
【０１８１】その結果、ＤＭＳＯは、無添加〜５％、ス
ペルミン４塩酸塩とスペルミジンは、無添加〜２００μ
Ｍ、アセチルプトレスシンとプトレスシン２塩酸塩は、
４０μＭ〜４０ｍＭ、トリメチレンジアミンは、０．０
０２％〜０．０２％、プロピレンジアミンは、０．００
０１％〜０．０１％、そしてジアミノメタン２塩酸塩
は、０．１μＭ〜１０μＭの範囲で、目的のＤＮＡ断片
が効率よく増幅されることが確認できた。
【０１８２】（５）マグネシウム塩の種類の検討 本発明の増幅方法に対するマグネシウム塩の種類につい
て検討した。鋳型としてｐＵＣ１９ＤＮＡを、プライマ
ーとして配列表の配列番号１１および６記載の配列を有
するｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ ＮＮ２４９プライマーおよ
びｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマーを使用した。
該プライマー対で、約２２５ｂｐの増幅断片が得られ
る。マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネ
シウムおよび硫酸マグネシウムを使用した。以下に反応
液組成を示す。
【０１８３】３５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７．３）、最終濃度８ｍＭの塩化マグネシウム、酢酸マ
グネシウムまたは硫酸マグネシウム、最終濃度１．０ｍ
ＭｄＮＴＰ混合物、５０ｎｇ ｐＵＣ１９ＤＮＡ、各６
０ｐｍｏｌの上記プライマー対、６０Ｕ ＲＮａｓｅ
Ｈ、５．５Ｕ ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、お
よび滅菌蒸留水で反応容量５０μｌ。反応条件および増
幅確認は、上記（３）と同様にして行った。その結果、
いずれのマグネシウム塩においても目的の増幅断片が確
認できた。
【０１８４】（６）マグネシウム濃度、およびｄＮＴＰ
濃度の検討 本発明の増幅方法に対するマグネシウム濃度、およびｄ
ＮＴＰ濃度について検討した。反応液組成は、２５ｎｇ
のｐＵＣ１９ ＤＮＡ、種々の濃度のマグネシウム、ｄ
ＮＴＰ以外は上記（５）記載のものと同様にした。反応
条件および増幅確認は上記（１）と同様にして行った。
【０１８５】最終濃度１ｍＭのｄＮＴＰで固定した反応
系では、マグネシウム濃度が最終濃度６ｍＭ〜１０ｍＭ
の範囲で目的の増幅断片が得られ、また、最終濃度８ｍ
Ｍのマグネシウムで固定した反応系ではｄＮＴＰ濃度が
最終濃度０．６〜１．２ｍＭの範囲で目的の増幅断片が
得られた。さらに、最終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰで固
定した反応系では、マグネシウム濃度が最終濃度２ｍＭ
〜６ｍＭの範囲で目的の増幅断片が得られ、最終濃度４
ｍＭのマグネシウムで固定した反応系ではｄＮＴＰ濃度
が最終濃度０．２〜０．８ｍＭの範囲で目的の増幅断片
が得られた。
【０１８６】（７）リン酸カリウムバッファー濃度、お
よびトリシンバッファー濃度変化と反応性の検討 本発明の増幅方法に対するリン酸カリウムバッファー濃
度、およびトリシンバッファー濃度について検討した。
反応液組成は、最終濃度２０〜５０ｍＭリン酸カリウム
バッファー、最終濃度２２〜４６ｍＭトリシンバッファ
ーとする以外は上記（１）記載のｐＵＣ１９−２４９を
鋳型とした反応と同様にした。反応条件および増幅確認
も上記（１）と同様にして行った。
【０１８７】その結果、リン酸カリウムバッファー、ト
リシンバッファーの濃度が、それぞれ最終濃度２０〜５
０ｍＭ、最終濃度２２〜４６ｍＭの範囲で目的の増幅断
片が得られた。
【０１８８】（８）ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラー
ゼ濃度の検討 本発明の増幅方法に対するＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリ
メラーゼ濃度について検討した。反応液組成はリン酸カ
リウムバッファー、トリシンバッファー系を用い、Ｂｃ
ａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを１〜２２Ｕ／５０μ
ｌ反応容量の範囲で使用する以外は上記（１）記載のｐ
ＵＣ１９−２４９を鋳型とした反応と同様にした。反応
条件および増幅確認も上記（１）と同様にして行った。
【０１８９】その結果、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメ
ラーゼ量が１〜２２Ｕ／５０μｌの範囲において目的の
増幅断片が得られた。
【０１９０】実施例６ ＰＣＲ法との比較 本発明の増幅方法についてＰＣＲ法との比較を行った。
鋳型は、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡのマルチクローニ
ングサイトに約１５０ｂｐおよび約２５０ｂｐのＤＮＡ
断片を挿入したものを用いた。該鋳型は、以下のように
して調製した。
【０１９１】配列表の配列番号１０、１１および６記載
の配列を有するｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ １５０プライマ
ー、 ｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ ２４９プライマー、ｐＵ
Ｃ１９ ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマー、を使用し、ｐＵＣ
１９プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを鋳型としてＰＣＲ反
応を行った。 ｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ １５０プライマ
ーおよびｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ ＮＮプライマーの組み
合わせでは約１５０ｂｐの増幅断片、 ｐＵＣ１９ ｕｐ
ｐｅｒ ２４９プライマーおよびｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ
ＮＮプライマーの組み合わせでは、約２５０ｂｐの増
幅断片が得られた。該増幅断片は、マイクロコン−１０
０で精製後、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ（宝酒造
社製）を用いて平滑末端化し、ｐＵＣ１９プラスミドの
ＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングした。上記増幅
断片の挿入されたプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換した。該形質転換体を培養し、その菌体よ
りＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キ
アゲン社製）を用いてＤＮＡ挿入プラスミドを精製し
た。このＤＮＡ挿入プラスミドを鋳型として使用した。
【０１９２】本実施例において使用するプライマーを配
列表の配列番号１８〜１９に示した。なお、本発明の増
幅方法に用いるプライマーは、３’末端３塩基がリボヌ
クレオチドに置換したものを使用した。以下に反応液組
成を示す。 ２７ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．３）、０．０１％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ＤＭＳＯ 、各１ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ酢酸マグネシウム、それぞ
れ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対および１ｎｇの鋳
型ＤＮＡ、および滅菌蒸留水で反応液容量を４８μｌに
した。
【０１９３】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、５．５ＵのＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼ、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａ
ｓｅＨを添加し、５５℃、６０分間保持した。その後、
９０℃、２分間加熱して酵素を失活させた。各反応液３
μｌを４％ ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造社製）
ゲルにて電気泳動を行なった。
【０１９４】一方、対照としてＰＣＲ法での増幅を行っ
た。反応は、ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉ
ｔ（宝酒造社製）を使用し、配列表の配列番号１８〜１
９に示したリボヌクレオチドを含まないプライマーを各
１０ｐｍｏｌずつ、１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および滅菌蒸
留水で反応液容量を５０μｌにした。反応条件は、９４
℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を１サイ
クルとして２５サイクル行った。反応終了後、各反応液
３μｌを４％ ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造社
製）ゲルにて電気泳動を行なった。
【０１９５】その結果、挿入断片が、１５０ｂｐおよび
２４９ｂｐのいずれのプラスミドを鋳型とした場合にお
いてもＰＣＲ法より本発明の増幅方法の方が目的の増幅
断片が多く確認できた。さらに増幅産物量を数値化する
ために、上記各反応液２０μｌをマイクロコン−１００
にて精製し、その量をベックマンＤＵ−６４０分光光度
計（ベックマン社製）にて定量した。すると本発明の増
幅方法の方が挿入断片が１５０ｂｐのプラスミドを鋳型
とした場合は約６０倍、挿入断片が２５０ｂｐの場合は
約４０倍多く得られることが確認できた。このことか
ら、多量のＤＮＡ断片を必要とするＤＮＡチップにおい
て、本発明の方法が従来のＰＣＲ法と比較しても好適に
使用できることを確認した。
【０１９６】実施例７ （１）ＲＮＡプローブの調製 本発明の増幅方法により得られた増幅断片の検出法につ
いて検討した。検出用プローブとして、リボヌクレオチ
ドで構成され、該プローブの両端のリボヌクレオチドに
異なる２つの蛍光物質の結合したものを調製した。検出
用ＲＮＡプローブは、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステム社製）を用いて合成した。その塩基配列を配
列表の配列番号２０に示す。また、蛍光標識は、５’末
端が、６−ＦＡＭ（グレーンリサーチ社製）、３’末端
が、ＴＡＭＲＡ（グレーンリサーチ社製）を使用した。
【０１９７】（２）増幅反応および検出 鋳型として、０．１および１ｎｇのｐＵＣ１９ＤＮＡを
使用した。プライマーは、配列表の配列番号１０および
８に記載の配列を有するｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ １５０
プライマーおよびｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ ５４２プライ
マーで、該プライマーの３’末端２塩基が、リボヌクレ
オチドに置き換わったものを使用した。
【０１９８】反応液組成を以下に示す。 ２７ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．３）、０．０１％
ＢＳＡ、５％ ＤＭＳＯ、各１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、
８ｍＭ 酢酸マグネシウム、それぞれ６０ｐｍｏｌの上
記のプライマー対および０．１または１ｎｇの鋳型ＤＮ
Ａ、上記ＲＮＡプローブ０．１μｇおよび滅菌蒸留水で
反応液容量を４８μｌにした。また対照として、鋳型Ｄ
ＮＡなしのものも調製した。
【０１９９】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、２２ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼまたは滅菌水、および６０Ｕの
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを添加し、５５℃、６０分
間保持した。その後、１０％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム、ナカライ社製）を５μｌ添加し、酵素を失活
させた。各反応液５０μｌを滅菌水で等量希釈し、マイ
クロプレートに移した。検出は、イメージアナライザー
ＦＭ ＢＩＯ II Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ（宝酒造社製）
を用いて励起波長５０５ｎｍで行った。
【０２００】その結果、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメ
ラーゼ無添加では、どの鋳型量でも蛍光シグナルは検出
されなかった。また、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラ
ーゼ添加時においても鋳型ＤＮＡ量がなしの場合も蛍光
シグナルは検出されなかった。一方、鋳型ＤＮＡが０．
１ｎｇあるいは１ｎｇの場合、いずれも蛍光シグナルを
検出することができた。また、同時に０．００００３％
のエチジウムブロマイドを含む３％アガロース電気泳動
においてもＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ存在
下、鋳型ＤＮＡ量が０．１ｎｇおよび１ｎｇの場合のみ
目的とする約１９０ｂｐの増幅断片が確認できた。即
ち、ＲＮＡプローブによる検出法と従来の電気泳動によ
る検出法において同じ結果が得られた。このように、本
発明の増幅方法で得られた増幅断片をＲＮＡプローブを
用いて検出する方法を確立した。
【０２０１】実施例８ 本発明の方法で一方のプライマーをデオキシヌクレオチ
ドにした場合について検討した。プライマーは、配列表
の配列番号１９記載の配列を有するＭＲ１Ｎ３（３０）
と配列表の配列番号５８記載の配列を有するＭ４プライ
マー（宝酒造社製）を使用した。なお、ＭＲ１Ｎ３プラ
イマーは、３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置換し
たものを使用した。以下に反応液組成を示す。 ２７ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．３）、０．０１
％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ ＤＭＳＯ、各１
ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ 酢酸マグネシウム、それ
ぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対および１ｎｇの
鋳型ＤＮＡ、および滅菌蒸留水で反応液容量を２４μｌ
にした。
【０２０２】上記反応液を９８℃、２分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓ
ｅＨを添加し、反応容量を２５μｌにした。該反応液を
５５℃、６０分間保持した。その後、９０℃、２分間加
熱して酵素を失活させた。各反応液５μｌを４％ ヌシ
ーブ３：１アガロースゲルにて電気泳動を行なった。そ
の結果、目的の増幅断片が確認できた。
【０２０３】実施例９ 本発明の方法を用いて出血性大腸菌Ｏ−１５７検出を行
った。本実施例において使用するプライマーを配列表の
配列番号２１〜２４に示した。配列番号２１と２２の組
み合わせは、Ｏ−１５７のベロ毒素１をコードする配列
を、配列番号２３と２４の組み合わせは、ベロ毒素２を
コードする配列を検出するように、臨床と微生物、第１
８巻、第４号、５０７〜５１３頁（１９９１）記載のプ
ライマーを構築した。なお、本発明の増幅方法に用いる
プライマーは、３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置
換したものを使用した。鋳型は、ＡＴＣＣ登録番号４３
８９５の出血性大腸菌Ｏ−１５７を培養したものを集菌
し、適当な細胞数に滅菌水で懸濁した後、９８℃で１０
分間処理した熱抽出物を使用した。以下に反応液組成を
示す。 ２７ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．３）、０．０１
％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ ＤＭＳＯ 、各
１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ 酢酸マグネシウム、そ
れぞれ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対、１０４〜１
０６細胞数に相当する鋳型ＤＮＡ（熱抽出物）、および
滅菌蒸留水で反応液容量を４８μｌにした。
【０２０４】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、５．５ＵのＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼ、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａ
ｓｅＨを添加し、５５℃、６０分間保持した。その後、
９０℃、２分間加熱して酵素を失活させた。各反応液３
μｌを４％ ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造社製）
ゲルにて電気泳動を行なった。
【０２０５】その結果、いずれのプライマー対でも１０
４細胞数相当のＤＮＡを鋳型として、Ｏ−１５７ベロ毒
素１および２を検出することができ、本発明の方法が、
病毒性細菌の検出方法として利用できることを確認し
た。
【０２０６】実施例１０ 本発明の方法による長鎖ＤＮＡ断片の増幅について検討
した。鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、以下のようにして調
製した。まず、胃正常部組織由来ｍＲＮＡから常法によ
りＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクター（ストラタジーン社
製）を用いてライブラリーを構築した。次にそのライブ
ラリーをスクリーニングして、インサート部が約２．１
ｋｂｐおよび約４．３ｋｂｐのクローンを用いてインビ
トロエキシジョンして得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（−）ファージベクターを選択した。さらに、該プ
ラスミドを鋳型として、配列表の配列番号２５〜２６記
載の配列を有するＭＣＲ−ＦプライマーおよびＭＣＲ−
Ｒプライマー、ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ（宝酒造社製）を用いて約２．２ｋｂｐおよび約
４．４ｋｂｐの増幅断片を得た。このＰＣＲ断片を本発
明の増幅方法の鋳型とした。使用するプライマーは、配
列表の配列番号２７〜２８に記載の配列を有するＭＦ２
Ｎ３（２４）プライマーおよびＭＲ１Ｎ３（２４）プラ
イマーを使用し、該プライマーは３’末端の３塩基がリ
ボヌクレオチドである。反応液組成を以下に示す。
【０２０７】２８ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．
５）、０．０１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、１％
ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４ｍＭ 酢酸
マグネシウム、各３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対、
０．２ｍＭプトレスシンおよび滅菌水を加え、２４．２
５μｌにした。該反応液を９２℃で２分間処理して、５
５℃に冷却した後、３０ＵのＲＮａｓｅＨおよび５．５
ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを加え、反応
容量を２５μｌにし、１時間保持した。反応終了後、４
℃に冷却し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を２．５μｌ加え
て反応を停止させた。その後、該溶液５μｌを１％アガ
ロース電気泳動に供した。その結果、本発明の方法で約
２．２ｋｂｐあるいは約４．４ｋｂｐの増幅断片を得る
ことができ、本方法で長鎖ＤＮＡ断片を増幅できること
を確認した。
【０２０８】実施例１１ 本発明の増幅方法で増幅した約４００ｂｐのλＤＮＡ断
片とＰＣＲで増幅した３００ｂｐと１０００ｂｐのλＤ
ＮＡ断片をスポットしたＤＮＡマイクロアレイを作製し
た。λＤＮＡのヌクレオチド配列はジーンバンク(GenBa
nk)登録番号、Ｖ００６３６、Ｊ０２４５９、Ｍ１７２
３３及びＸ００９０６のより入手可能である。本実施例
において使用するプライマーを配列表の配列番号２５〜
２６および２９〜３５に示した。なお、本発明の増幅方
法の反応液は、下記のように調製した。
【０２０９】３４ｍＭ トリシン塩酸バッファー（ｐＨ
８．７）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモ
ニュウム、０．０１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、
１％ジメチルスルオキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、
各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、それぞれ５００ｐｍｏ
ｌのプライマー対、ならびに鋳型として１００ｎｇのＰ
ＣＲ増幅産物、１１０ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリ
メラーゼ、３００ＵのｃｌｏｎｅｄＲＮａｓｅＨ、反応
液の最終容量は５００μｌ。上記反応液を均一に混合
し、５５℃で６０分間保温した後、９０℃で２分間加熱
して酵素を失活させた。この溶液を以下の工程に使用し
た。また、スポットしたＤＮＡ断片は次の通りである。 １．サンプル：λＤＮＡを鋳型にした、配列表の配列番
号２９と３０に記載の配列を有するプライマーの組み合
わせによるＰＣＲ増幅産物（３００ｂｐ）をｐＵＣ１９
ベクターにサブクローニング後、配列表の配列番号２５
と２６に記載の配列を有するプライマーでＰＣＲ増幅し
たものを鋳型にして、配列表の配列番号３１と３２に記
載の配列を有するプライマーで、該フライマーの３’末
端２塩基がリボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーで本発明の増幅方法により増幅したも
の（増幅サイズは約４００ｂｐ）。スポットする際のＤ
ＮＡ溶液としては、反応液原液、炭酸バッファーでそれ
ぞれ２倍、４倍、８倍、１６倍希釈したもの（希釈溶液
の炭酸バッファー濃度はすべて５０ｍＭ）で計５種類。 ２．サンプル：上記１で増幅したＤＮＡ断片をマイクロ
コン−１００（宝酒造社製）で処理して５０ｍＭ 炭酸
バッファーで次の０．１２５μｇ／μｌ，０．２５μｇ
／μｌ，０．５μｇ／μｌ，１．０μｇ／μｌ，２．０
μｇ／μｌの各濃度に調整したもの、計５種類。 ３．陽性コントロール：λＤＮＡを鋳型にした、配列表
の配列番号２９と３０に記載の配列を有するプライマー
の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物（３００ｂｐ）をマ
イクロコン−１００で処理して５０ｍＭ 炭酸バッファ
ーで次の０．１２５μｇ／μｌ，０．２５μｇ／μｌ，
０．５μｇ／μｌ，１．０μｇ／μｌ，２．０μｇ／μ
ｌの各濃度に調整したもの、計５種類。 ４．陽性コントロール：λＤＮＡを鋳型にした、配列表
の配列番号３３と３４に記載の配列を有するプライマー
の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物（１０００ｂｐ）を
マイクロコン−１００で処理して５０ｍＭ 炭酸バッフ
ァーで次の０．１２５μｇ／μｌ，０．２５μｇ／μ
ｌ，０．５μｇ／μｌ，１．０μｇ／μｌの各濃度に調
整したもの、計４種類。 ５．陰性コントロール：λＤＮＡを鋳型にした、配列表
の配列番号３３と３５に記載の配列を有するプライマー
の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物（３００ｂｐ）をｐ
ＵＣ１９ベクターにサブクローニング後、配列表の配列
番号２５と２６に記載の配列を有するプライマーでＰＣ
Ｒ増幅したものを鋳型にして、配列表の配列番号３１と
３２に記載の配列を有するプライマーで本発明の増幅方
法により増幅したもの（増幅サイズは約４００ｂｐ）。
スポットする際のＤＮＡ溶液としては、反応液原液、炭
酸バッファーでそれぞれ２倍、４倍、８倍、１６倍希釈
したもの（希釈溶液の炭酸バッファー濃度はすべて５０
ｍＭ）で計５種類。 ６．陰性コントロール：上記５で得られたＤＮＡ断片を
マイクロコン−１００で処理して５０ｍＭ 炭酸バッフ
ァーで次の０．１２５μｇ／μｌ，０．２５μｇ／μ
ｌ，０．５μｇ／μｌ，１．０μｇ／μｌ，２．０μｇ
／μｌの各濃度に調整したもの、計５種類。
【０２１０】調製した各ＤＮＡ溶液をＤＮＡチップ作製
装置（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｇ
ＭＳ社製）を用いてアミノ基導入スライドガラス（松浪
硝子工業社製）にスポットし、ＵＶ照射により固定し
た。スライドを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で洗浄、
乾燥してＤＮＡアレイとした。
【０２１１】また、配列表の配列番号２９と３０に記載
の配列を有するプライマーの組み合わせによるＰＣＲ増
幅産物（３００ｂｐ）をＬａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ５Ｒ Ｌ
ａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）によりＣｙ５標
識してプローブとした。次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ
（宝酒造社製）の取扱説明書に記載のプレハイブリダイ
ゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液を用
いてハイブリダイゼーションを行った。まず上記ＤＮＡ
アレイを室温にて２時間プレハイブリダイゼーション処
理を行った後、変性したＣｙ５標識プローブを含むハイ
ブリダイゼーション溶液をＤＮＡアレイに滴下し、カバ
ーガラスをかけて周囲をフィルムで密封した。これを６
５℃で１３時間保持した後、カバーガラスを除いて、６
５℃で２×ＳＳＣ溶液で５分間、次に６５℃で０．２×
ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液で５分間、最後
に室温で０．２×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄し、風乾し
た。これをマイクロアレイスキャナー（ＧＭＳ社）にか
けて各スポットの蛍光シグナルを解析した。
【０２１２】この結果、ＰＣＲ法で増幅した断片（上記
３、４の陽性コントロール）および、本発明の方法で増
幅した断片（上記１、２のサンプル）をスポットした位
置のいずれにおいても蛍光シグナルが確認できた。ま
た、シグナルの強さはサンプル２＞陽性コントロール４
＞サンプル１＞陽性コントロール３であった。一方、陰
性コントロールの５、６ではシグナルは全く認められな
かった。このことから、本発明の方法で増幅したＤＮＡ
断片は、未精製でもあるいは精製後でもＤＮＡチップを
作製するための固定化用ＤＮＡ断片として好適に使用で
きることを確認した。
【０２１３】実施例１２ （ｉ）ＰＣＲ増幅断片を鋳型とする場合の本発明の方法
に使用するプライマーデザインについて検討した。ま
ず、配列表の配列番号３６〜４１記載の配列を有するプ
ライマーを常法により合成した。各プライマーの構造に
ついて以下に示す。 （ｉ）Ｒ１−Ｓ１プライマー：５'末端から７塩基のス
ペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列（またはＲＶ
配列）は、Ｍ１３ＲＶプライマー（宝酒造社製）のヌク
レオチド配列をいう）及び２０塩基のλＤＮＡ特異的Ｐ
ＣＲ用センスプライマー配列； （ｉｉ）Ｒ１−Ａ３プライマー：５'末端から７塩基の
スペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列及び２０塩
基のλＤＮＡ特異的ＰＣＲ用アンチセンスプライマー配
列； （ｉｉｉ）Ｒ２−Ｓ１プライマー：５'末端から２５塩
基のスペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列及び２
０塩基のλＤＮＡ特異的ＰＣＲ用センスプライマー配
列； （ｉｖ）Ｒ２−Ａ３プライマー：５'末端から２５塩基
のスペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列及び２０
塩基のλＤＮＡ特異的ＰＣＲ用アンチセンスプライマー
配列； （ｖ）Ｒ３−Ｓ１プライマー：５'末端から５８塩基の
スペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列及び２０塩
基のλＤＮＡ特異的ＰＣＲ用センスプライマー配列； （ｖｉ）Ｒ３−Ａ３プライマー：５'末端から５８塩基
のスペーサー配列、１７塩基のＭ１３ＲＶ配列及び２０
塩基のλＤＮＡ特異的ＰＣＲ用アンチセンスプライマー
配列。
【０２１４】なお、Ｍ１３ＲＶ ２０ｍｅｒは、１７塩
基のＭ１３ＲＶ配列及び５'側に３塩基の計２０塩基の
配列を有する。従って、Ｍ１３ＲＶ ２０ｍｅｒを用い
て本発明の方法を実施した場合、上記プライマーのスぺ
ーサー配列の長さは、それぞれ４塩基、２２塩基、５５
塩基となる。さらに、対照として、上記プライマーのス
ペーサー配列のないプライマーも作成した。
【０２１５】上記プライマー対、例えば、Ｒ１−Ｓ１プ
ライマー／Ｒ１−Ａ３プライマーを用いると３４８ｂｐ
の増幅断片が得られる。この増幅断片の両端７塩基がス
ペーサー部分であり、その内側にＲＶ配列、さらに内側
にλＤＮＡの配列を含む。
【０２１６】同様に、Ｒ２−Ｓ１プライマー／Ｒ２−Ａ
３プライマーを用いると増幅断片の両端２５塩基がスペ
ーサー部分である３８４ｂｐの増幅断片が得られ、Ｒ３
−Ｓ１プライマー／Ｒ３−Ａ３プライマーを用いると増
幅断片の両端５８塩基がスペーサー部分である４５０ｂ
ｐの増幅断片が得られる。一方、対照用プライマーを用
いた増幅断片は、スペーサー部分を有さない。これらの
ＰＣＲ増幅断片を鋳型として以下の検討を行った。
【０２１７】本実施例においては、配列表の配列番号４
２及び４３記載の配列を有するＭ１３ＲＶ−２Ｎ １７
ｍｅｒプライマー、Ｍ１３ＲＶ−２Ｎ ２０ｍｅｒプラ
イマーの２種類を用いた。なお、該プライマーは、３'
末端の２塩基がリボヌクレオチドに置き換わったものを
用いた。反応は以下のように行った。即ち、前述のプラ
イマー ２０μＭ、約２０ｎｇの上記鋳型及び０．０１
％プロピレンジアミンの混合液５μｌを９８℃ ２分間
変性後、５５℃まで冷却した。その後、３４ｍＭ トリ
シンバッファー（ｐＨ８．７）、１０ｍＭ 塩化カリウ
ム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．０１％ ＢＳＡ、
１％ ＤＭＳＯ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．５ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、１５ＵのＲＮａｓｅＨを添加し、最終反応容量を
２５μｌにした。該反応液は、５５℃で１時間保持し
た。反応終了後、４℃に冷却し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶
液２．５μｌを添加して反応を停止し、該反応液３μｌ
を３％ ヌシーブ ３：１アガロース（宝酒造社製）ゲ
ル電気泳動に供した。その結果、Ｍ１３ＲＶ−２Ｎ１７
ｍｅｒを用いた場合は、スペーサー配列が２５ｍｅｒ、
７ｍｅｒ、５８ｍｅｒ、スペーサー配列なしの順に、Ｍ
１３ＲＶ−２Ｎ ２０ｍｅｒを用いた場合は、スペーサ
ー配列が２２ｍｅｒ、４ｍｅｒ、５５ｍｅｒ、スペーサ
ー配列なしの順に増幅効率がよいことが確認できた。ま
た、上記（ｉ）から（ｖｉ）のプライマーのＭ１３ＲＶ
配列をＭ１３Ｍ４配列に変更した場合でも、スペーサー
配列と増幅効率の関係は同じ傾向を示した。即ち、ＰＣ
Ｒ増幅断片のような直鎖ＤＮＡ断片を鋳型とする場合、
スペーサー配列（部分）ができるように本発明の方法に
用いるプライマーをデザインすることが増幅効率向上に
つながることを確認した。
【０２１８】（２）反応温度を上げた場合の核酸配列増
幅方法について、ＧＣ含量の高い鋳型の増幅について検
討した。まず、ジーンバンク(GenBank)登録番号、ＡＡ
７８９３２８のＣＤＣ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＩＳＳＬＲＥ遺伝子領域 ３０
７ｂｐ（ＧＣ含量：６２．５％）について配列表の配列
番号４４と４５に記載のＰＣＲ増幅用プライマーを、ま
たジーンバンク(GenBank)登録番号、ＡＡ７０６０２２
のＴｙｐｅ ＩＩ ｃｙｔｏｓｋｅｌｔａｌ １ｋｅｒ
ａｔｉｎ遺伝子領域 ２８４ｂｐ（ＧＣ含量：６１．３
％）について配列表の配列番号４６と４７に記載のＰＣ
Ｒ増幅用プライマーをそれぞれ作製した。これらのプラ
イマーを用いて、市販のＤＮＡ断片（リサーチジェネテ
ィック社製）を鋳型としてＰＣＲ増幅した。上記プライ
マー対を用いることにより、得られたＰＣＲ増幅断片
は、両端にスぺーサー配列及びＭ１３ＲＶ配列を有す
る。これを本発明の鋳型とした。
【０２１９】次に本実施例において使用するプライマー
は、配列表の配列番号４２記載の配列を有するＭ１３Ｒ
Ｖ−２Ｎ １７ｍｅｒプライマーまたは配列表の配列番
号４３記載の配列を有するＭ１３ＲＶ−２Ｎ ２０ｍｅ
ｒプライマーを用いた。なお、該プライマーは、いずれ
も３'末端の２塩基がリボヌクレオチドに置き換わった
ものを用いた。反応は以下のように行った。即ち前述の
プライマー １００ｐｍｏｌ、２０ｎｇの鋳型及び０．
０１％プロピレンジアミンの混合液１０μｌを９８℃
２分間変性後、５５℃または、６０℃まで冷却した。そ
の後、３４ｍＭトリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１
０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０
１％ ＢＳＡ、１％ ＤＭＳＯ、４ｍＭ 酢酸マグネシ
ウム、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ、３０ＵのＲＮａｓｅＨ を添加
して、最終反応容量を５０μｌにした。該反応液を５５
℃または６０℃で１時間保持した。反応終了後、４℃に
冷却し、該反応液３μｌを３％アガロース電気泳動に供
した。その結果を以下の表１に示す。
【０２２０】
【表１】
【０２２１】表１に示したように、反応温度を高くする
こと（５５℃から６０℃）、さらに６０℃で反応する場
合、５５℃反応時の至適プライマーよりＴｍ値の高いプ
ライマーを使用することにより、ＧＣ含量の高い鋳型の
場合でも効率よく目的とする領域を増幅することができ
た。
【０２２２】（３）反応温度が高い場合の核酸配列の増
幅方法について増幅断片長と増幅産物の関係を検討し
た。まず、ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ（宝酒造社製）の８０
０ｂｐ領域を増幅できる配列表の配列番号４８及び４９
記載の配列を有するプライマーと４００ｂｐ領域を増幅
できる配列表の配列番号５０及び５１記載の配列を有す
るプライマーを常法により合成した。このプライマー対
を用いて、λＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い増幅断片
を得た。さらに、実施例５（１）に記載のｐＵＣ１９−
９１１プラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号１６〜
１７記載の配列を有するＭＦ２（２４）プライマー及び
ＭＲ１（２４）プライマー用いて増幅した約１．１ｋｂ
ｐの増幅断片も調製した。上記プライマー対を用いるこ
とにより、得られたＰＣＲ増幅断片は、両端にスぺーサ
ー配列及びＭ１３ＲＶあるいはＭ４配列を有する。これ
を本発明の鋳型とした。
【０２２３】次に本実施例において使用するプライマー
は、配列表の配列番号４２記載の配列を有するＭ１３Ｒ
Ｖ−２Ｎ １７ｍｅｒプライマーまたは配列表の配列番
号４３記載の配列を有するＭ１３ＲＶ−２Ｎ ２０ｍｅ
ｒプライマーを用いた。なお、該プライマーは、いずれ
も３'末端の２塩基がリボヌクレオチドに置き換わった
ものを用いた。さらに、約１ｋｂｐ領域の増幅に関して
は、配列表の配列番号５５記載の配列を有するＭ１３Ｍ
４−３Ｎ ２０ｍｅｒプライマーと配列表の配列番号４
３記載のＭ１３ＲＶ−３Ｎ ２０ｍｅｒプライマーの組
み合わせ及び配列表の配列番号５６〜５７記載の配列を
有するＭ１３Ｍ４−３Ｎ ２４ｍｅｒプライマー及びＭ
１３ＲＶ−３Ｎ ２４ｍｅｒプライマーの組み合わせで
行った。なお、該プライマーは、いずれも３'末端の３
塩基がリボヌクレオチドに置き換わったものを用いた。
反応は以下のように行った。即ち、前述のプライマー
１００ｐｍｏｌ、約２０ｎｇの鋳型及び０．０１％プロ
ピレンジアミンの混合液１０μｌを９８℃ ２分間変性
後、５５℃または６０℃まで冷却した。その後、３４ｍ
Ｍ トリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１０ｍＭ 塩
化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０１％
ＢＳＡ、１％ ＤＭＳＯ、４ｍＭ 酢酸マグネシウ
ム、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ、３０ＵのＲＮａｓｅＨを添加し、
最終反応容量を５０μｌにした。該反応液を５５℃また
は６０℃で１時間保持した。反応終了後、４℃に冷却
し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液５μｌを添加して反応を停
止し、該反応液３μｌを３％ ヌシーブ３：１アガロー
ス（宝酒造社製）ゲル電気泳動に供した。その結果を表
２及び表３に示す。
【０２２４】
【表２】
【０２２５】表２に示したように、増幅に使用するプラ
イマーの長さを１７ｍｅｒから２０ｍｅｒにし、さらに
反応温度を５５℃から６０℃に高くすることにより、４
００ｂｐ及び８００ｂｐの増幅領域において増幅断片を
効率よく得ることができた。
【０２２６】
【表３】
【０２２７】さらに、表３に示したように増幅に使用す
るプライマーの長さを２０ｍｅｒから２４ｍｅｒにし、
さらに反応温度を５５℃から６５℃に高くすることによ
り、約１ｋｂｐの増幅領域において増幅断片を効率よく
得ることができた。また、実施例１０に示したような長
鎖ＤＮＡ断片の増幅においても、使用するプライマーを
長くし、反応温度を上げることにより上記と同様の結果
が得られ、約２ｋｂｐ以上の増幅領域の場合でも増幅効
率が向上することが確認できた。
【０２２８】実施例１３ （１）本発明の方法についてＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポ
リメラーゼ以外の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用した
場合について検討した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとし
てＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバ
イオラボ社製）を使用した。まず、配列表の配列番号５
２及び５３記載の配列を有する５'ＩＤプライマー及び
３'ＩＤプライマーを常法により合成した。このプライ
マー対を用いて、市販のｃｙｃｌｉｎ Ａ遺伝子のＤＮ
Ａ断片（リサーチジェネティック社製）を鋳型としてＰ
ＣＲを行い、約３００ｂｐの増幅断片を得た。上記プラ
イマー対を用いることにより、得られたＰＣＲ増幅断片
は、両端にＭ１３ＲＶ配列を有する。これを本発明の鋳
型とした。
【０２２９】次に本実施例において使用するプライマー
は、配列表の配列番号４２記載の配列を有するＭ１３Ｒ
Ｖ−２Ｎ １７ｍｅｒプライマーを用いた。なお、該プ
ライマーは、３'末端の２塩基がリボヌクレオチドに置
き換わったものを用いた。反応は以下のように行った。
即ち、前述のプライマー ２０μＭ、約２０ｎｇの上記
鋳型及び０．０１％プロピレンジアミンの混合液１０μ
ｌを９８℃ ２分間変性後、５５℃まで冷却した。その
後、３４ｍＭ トリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１
０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
０．０１％ ＢＳＡ、１％ ＤＭＳＯ、４ｍＭ 酢酸マ
グネシウム、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、４Ｕ、８Ｕ、１２
Ｕ及び１６ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、３０Ｕの
ＲＮａｓｅＨを添加し、最終反応容量を５０μｌにし
た。また、対照として、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮ
Ａポリメラーゼを使用する以外は上記反応液組成と同じ
ものを調製した。該反応液は、５５℃で１時間保持し
た。反応終了後、４℃に冷却し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶
液５μｌを添加して反応を停止し、該反応液３μｌを３
％ ヌシーブ ３：１アガロース（宝酒造社製）ゲル電
気泳動に供した。その結果、いずれのユニット数のＢｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合でも目的の増幅
断片を得ることができた。従って、本発明の方法におい
て、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できること
を確認した。
【０２３０】（２）本発明の方法について常温性ＤＮＡ
ポリメラーゼを使用した場合について検討した。常温性
ＤＮＡポリメラーゼとして５'→３'エキソ活性（−）ク
レノウ断片（宝酒造社製）を使用した。本発明の方法に
用いる鋳型ＤＮＡは、上記（１）で調製したものを使用
した。
【０２３１】次に本実施例において使用するプライマー
は、配列表の配列番号５４記載の配列を有するＭ１３Ｒ
Ｖ−２Ｎ １６ｍｅｒプライマーを用いた。なお、該プ
ライマーは、３'末端の２塩基がリボヌクレオチドに置
き換わったものを用いた。反応は以下のように行った。
即ち、前述のプライマー ２０μＭ、約２０ｎｇの上記
鋳型及び０．０１％プロピレンジアミンの混合液１０μ
ｌを９８℃ ２分間変性後、４０℃まで冷却した。その
後、３４ｍＭ トリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１
０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
０．０１％ ＢＳＡ、１％ ＤＭＳＯ、４ｍＭ 酢酸マ
グネシウム、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０Ｕ、２Ｕ、４
Ｕ、６Ｕ及び８Ｕのクレノウ断片、３０ＵのＲＮａｓｅ
Ｈを添加し、最終反応容量を５０μｌにした。該反応液
は、４０℃で１時間保持した。反応終了後、４℃に冷却
し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液５μｌを添加して反応を停
止し、該反応液３μｌを３％ ヌシーブ ３：１アガロ
ース（宝酒造社製）ゲル電気泳動に供した。その結果、
クレノウ断片が存在しない場合を除いて、いずれのユニ
ット数の場合でも目的の増幅断片を得ることができた。
従って、本発明の方法において、常温性ＤＮＡポリメラ
ーゼが好適に使用できることを確認した。
【０２３２】実施例１４ 本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライ
マーについて検討した。鋳型ＤＮＡ及びプライマー合成
は、実施例１（１）記載の方法に従った。本実施例に使
用されたプライマーの詳細な構造を以下に示す： プライマー対１：配列表の配列番号２および３に示され
る塩基配列を有し、その全体がすべてデオキシリボヌク
レオチドで構築されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対２：配列表の配列番号５９および６０に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から６、７
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対３：配列表の配列番号６１および６２に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から５、６
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対４：配列表の配列番号６３および６４に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から４、５
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対５：配列表の配列番号６５および６６に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から３、４
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対６：配列表の配列番号６７および６８に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から２、３
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対７：配列表の配列番号２および３に示され
る塩基配列を有し、それぞれの３’末端から１、２個め
のデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに置換
されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対８：配列表の配列番号６７および６８に示
される塩基配列を有し、それぞれの３’末端から２、３
個めのデオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドに
置換され、かつ３’末端から３個めのリボヌクレオチド
の５’側リン酸結合がホスホロチオエート結合に置換さ
れたプライマーの組み合わせ。
【０２３３】増幅条件及び検出方法については、実施例
１（２）及び（３）記載の方法に準じて行った。その結
果、プライマー対２〜８のいずれにおいても目的の長さ
の増幅断片を確認することができた。また、プライマー
対２〜７については、３'末端のデオキシリボヌクレオ
チドの数が減少するに従って増幅産物量が多くなり、特
に３'末端にデオキシリボヌクレオチドがないプライマ
ー対７において最も増幅産物量が多くなることを確認し
た。一方、プライマー対１については、増幅断片は確認
できなかった。さらに、プライマー対６と８のいずれに
おいても目的とする増幅断片が確認できたことから、プ
ライマー中に存在するリボヌクレオチドが修飾リボヌク
レオチドあるいは未修飾リボヌクレオチドのいずれであ
っても本発明の方法に好適に使用できることを確認し
た。
【０２３４】
【発明の効果】本発明により、キメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーの存在下にＤＮＡ合成反応を行うことを特
徴とする簡便で、効率の良い核酸配列の増幅方法が提供
される。また、本発明により、大量のＤＮＡ増幅断片を
供給する方法が提供される。また、本発明の核酸配列の
増幅方法は、他の核酸増幅方法と組み合わせて使用する
ことにより、効率的な核酸配列の増幅方法が提供され
る。また、本発明によりウイルス、細菌、カビ、酵母な
どの微生物等の検出、定量のための核酸配列の検出方法
が提供され、本発明の方法で得られたＤＮＡ増幅断片を
リアルタイムで検出する方法が提供される。さらに本発
明により遺伝子の大規模シークエンシング方法が提供さ
れる。
【０２３５】配列表フリーテキスト SEQ ID NO:1: Synthetic DNA corresponding to a port
ion of human transferrin receptor-encoding sequenc
e used as a template. SEQ ID NO:2: Designed oligonucleotide primer to am
plify a portion of human transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:3: Designed oligonucleotide primer to am
plify a portion of human transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:4: Designed oligonucleotide used as a pr
obe for detecting anamplified portion of human tra
nsferrin receptor-encoding sequence. SEQ ID NO:5: Designed oligonucleotide primer desig
nated as pUC19 upper(2)NN to amplify a portion of
plasmid pUC19. SEQ ID NO:6: Designed oligonucleotide primer desig
nated as pUC19 lowerNN to amplify a portion of pla
smid pUC19. SEQ ID NO:7: Designed oligonucleotide primer to am
plify a portion of plasmid pUC19. SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide primer desig
nated as pUC19 lower542 to amplify a portion of pl
asmid pUC19. SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide primer to am
plify a portion of plasmid pUC19. SEQ ID NO:10: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as pUC19 upper 150 to amplify a portion of
plasmid pUC19. SEQ ID NO:11: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as pUC19 upper 249 to amplify a portion of
plasmid pUC19. SEQ ID NO:12: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:13: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:14: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:15: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:16: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MF2N3(24)to amplify a portion of plasmid
pUC19-249 or plasmid pUC19-911. SEQ ID NO:17: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MR1N3(24)to amplify a portion of plasmid
pUC19-249 or plasmid pUC19-911. SEQ ID NO:18: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofplasmid pUC19. SEQ ID NO:19: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MR1N3 to amplify a portion of plasmid pU
C19. SEQ ID NO:20: Synthetic RNA used as a probe for de
tecting an amplifiedportion of plasmid pUC19. SEQ ID NO:21: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofvero toxin 1-encoding sequence
from hemorrhagic Escherichia coli O-157. SEQ ID NO:22: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofvero toxin 1-encoding sequence
from hemorrhagic Escherichia coli O-157. SEQ ID NO:23: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofvero toxin 2-encoding sequence
from hemorrhagic Escherichia coli O-157. SEQ ID NO:24: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofvero toxin 2-encoding sequence
from hemorrhagic Escherichia coli O-157. SEQ ID NO:25: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MCR-F to amplify a long DNA fragment. SEQ ID NO:26: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MCR-R to amplify a long DNA fragment. SEQ ID NO:27: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MF2N3(24)to amplify a long DNA fragment. SEQ ID NO:28: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as MR1N3(24)to amplify a long DNA fragment. SEQ ID NO:29: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:30: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:31: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:32: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:33: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:34: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:35: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:36: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R1-S1 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:37: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R1-A3 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:38: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R2-S1 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:39: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R2-A3 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:40: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R3-S1 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:41: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as R3-A3 to amplify a portion of bacterioph
age lambda DNA. SEQ ID NO:42: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13RV-2N 17mer. SEQ ID NO:43: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13RV-2N 20mer. SEQ ID NO:44: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofCDC2-related protein kinase PIS
SLRE gene. SEQ ID NO:45: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofCDC2-related protein kinase PIS
SLRE gene. SEQ ID NO:46: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofType II cytoskeltal 11 keratin
gene. SEQ ID NO:47: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofType II cytoskeltal 11 keratin
gene. SEQ ID NO:48: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:49: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:50: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:51: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofbacteriophage lambda DNA. SEQ ID NO:52: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as 5'ID to amplify a portion of cyclin A DN
A. SEQ ID NO:53: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as 3'ID to amplify a portion of cyclin A DN
A. SEQ ID NO:54: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13RV-2N 16mer. SEQ ID NO:55: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13M4-3N 16mer. SEQ ID NO:56: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13M4-3N 24mer. SEQ ID NO:57: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13RV-3N 24mer. SEQ ID NO:58: Designed oligonucleotide primer desi
gnated as M13M4 17mer. SEQ ID NO:59: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:60: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:61: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:62: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:63: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:64: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:65: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:66: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:67: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence. SEQ ID NO:68: Designed oligonucleotide primer to a
mplify a portion ofhuman transferrin receptor-enco
ding sequence.
【０２３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleotide sequence <130> 184751 <150> JP 11-076966 <151> 1999-03-19 <150> JP 11-370035 <151> 1999-12-27 <160> 68 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA corresponding to a portion of human transferrin rece ptor-encoding sequence used as a template <400> 1 ggacagcaac tgggccagca aagttgagaa actcacttta gagaattctg ctttcccttt 60 ccttgcatat tctgagcagt ttctttctgt ttttgcgag 99 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 2 cagcaactgg gccagcaaag tt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 3 gcaaaaacag aaagaaactg ct 22 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide used as a probe for detecting an amplifie d portion of human transferrin receptor-encoding sequence <400> 4 tgctttccct ttccttgcat attctg 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper(2)NN to amplify a portion of plasmid pUC19 <400> 5 attgcttaat cagtgaggca cctat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 lower NN to am plify a portion of plasmid pUC19 <400> 6 gataacactg cggccaactt acttc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pU C19 <400> 7 actggcgaac tacttactct agctt 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 lower 542 to a mplify a portion of plasmid pUC19 <400> 8 agtcaccagaa aagcatctta cggat 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pU C19 <400> 9 gctcatgaga caataaccct gataa 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 to a mplify a portion of plasmid pUC19 <400> 10 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 249 to a mplify a portion of plasmid pUC19 <400> 11 cgcctccatc cagtctatta attgt 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 12 ctgattgaga ggattcctga gt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 13 tagggagaga ggaagtgata ct 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 14 caacttcaag gtttctgcca gc 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 15 aatagtccaa gtagctagag c 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MF2N3(24) to amplify a portion of plasmid pUC19-249 or plasmid pUC19-911 <400> 16 gctgcaaggc gattaagttg ggta 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MR1N3(24) to amplify a portion of plasmid pUC19-249 or plasmid pUC19-911 <400> 17 ctttatgctt ccggctcgta tgtt 24 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pU C19 <400> 18 ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MR1N3 to amplify a p ortion of plasmid pUC19 <400> 19 tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30 <210> 20 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA used as a probe for detecting an amplified portion o f plasmid pUC19 <400> 20 ugauccccca uguugugcaa aaaagcgguu 30 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157 <400> 21 agttaatgtg gtggcgaa 18 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157 <400> 22 gactcttcca tctgcca 17 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157 <400> 23 ttcggtatcc tattcccg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2-encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli O-157 <400> 24 tctctggtca ttgtatta 18 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCR-F to amplify a l ong DNA fragment <400> 25 ccattcaggc tgcgcaactg tt 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MCR-R to amplify a l ong DNA fragment <400> 26 tggcacgaca ggtttcccga ct 22 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MF2N3(24) to amplify a long DNA fragment <400> 27 gctgcaaggc gattaagttg ggta 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as MR1N3(24) to amplify a long DNA fragment <400> 28 ctttatgctt ccggctcgta tgtt 24 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 29 aacaacaaga aactggtttc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 30 gcaatgcatg acgactgggg 20 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 31 gttttcccag tcacgac 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 32 caggaaacag ctatgac 17 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 33 gtacggtcat catctgacac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 34 gcaatcggca tgttaaacgc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 35 cgccatcctg ggaagactcc 20 <210> 36 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R1-S1 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 36 tttcacacag gaaacagcta tgacaacaac aagaaactgg tttc 44 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R1-A3 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 37 tttcacacag gaaacagcta tgacgcaatg catgacgact gggg 44 <210> 38 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R2-S1 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 38 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acaacaacaa gaaactggtt 60 tc 62 <210> 39 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R2-A3 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 39 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatgca tgacgactgg 60 gg 62 <210> 40 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R3-S1 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 40 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60 ggaaacagct atgacaacaa caagaaactg gtttc 95 <210> 41 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as R3-A3 to amplify a p ortion of bacteriophage lambda DNA <400> 41 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60 ggaaacagct atgacgcaat gcatgacgac tgggg 95 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13RV-2N 17mer <400> 42 caggaaacag ctatgac 17 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13RV-2N 20mer <400> 43 acacaggaaa cagctatgac 20 <210> 44 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of CDC2-relat ed protein kinase PISSLRE gene <400> 44 gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacccaac aagagcctat 60 agcttcgctc 70 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of CDC2-relat ed protein kinase PISSLRE gene <400> 45 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacccgct gtctttgagt 60 tgtggtg 67 <210> 46 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of Type II cy toskeltal 11 keratin gene <400> 46 gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacgctat tctgacatca 60 ctttccagac 70 <210> 47 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of Type II cy toskeltal 11 keratin gene <400> 47 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacgaatt ccactggtgg 60 cagtag 66 <210> 48 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 48 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgtacggtc atcatctgac 60 ac 62 <210> 49 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 49 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acatgcgccg cctgaaccac 60 ca 62 <210> 50 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 50 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acctgctctg ccgcttcacg 60 ca 62 <210> 51 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of bacterioph age lambda DNA <400> 51 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatcgg catgttaaac 60 gg 62 <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 5'ID to amplify a po rtion of cyclin A DNA <400> 52 tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacatgtt ttgggagaa 60 ttaagtctga 70 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 3'ID to amplify a po rtion of cyclin A DNA <400> 53 gagttcgtgc cgtacaacta tttcacacag gaaacagcta tgacttacag atttagtgtc 60 tctggtggg 69 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13RV-2N 16mer <400> 54 aggaaacagc tatgac 16 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13M4-3N 16mer <400> 55 agggttttcc cagtcacgac 20 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13M4-3N 24mer <400> 56 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13RV-3N 24mer <400> 57 tttcacacag gaaacagcta tgac 24 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13M4 <400> 58 gttttcccag tcacgac 17 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 59 cagcaactgg gccagcaaag ttgagaa 27 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 60 gcaaaaacag aaagaaactg ctcagaa 27 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 61 cagcaactgg gccagcaaag ttgaga 26 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 62 gcaaaaacag aaagaaactg ctcaga 26 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 63 cagcaactgg gccagcaaag ttgag 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 64 gcaaaaacag aaagaaactg ctcag 25 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 65 cagcaactgg gccagcaaag ttga 24 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 66 gcaaaaacag aaagaaactg ctca 24 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 67 cagcaactgg gccagcaaag ttg 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human tran sferrin receptor-encoding sequence <400> 68 gcaaaaacag aaagaaactg ctc 23
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１：本発明における１本鎖ＤＮＡに対する
方法の一例を示すフローチャートである。図中、黒丸は
遊離したＤＮＡ鎖が（６）の鋳型ＤＮＡであることを示
す。
【図２】 図２：本発明の方法により種々の反応時間で
増幅された増幅ＤＮＡ断片の、アガロースゲル電気泳動
の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:01 37/00 １０２ 1:19 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三宅 一恵 京都府宇治市五ケ庄三番割34−７ (72)発明者 上森 隆司 滋賀県大津市大江３丁目１−16 シャルマ ンコーポ第２瀬田709号 (72)発明者 佐藤 好美 滋賀県栗太郡栗東町綣３丁目８番23−1010 号 (72)発明者 森山 麻里子 滋賀県大津市野郷原１−４−３ シャロム 瀬田西311号 (72)発明者 椹木 治久 滋賀県大津市野郷原１−14−３ 瀬田寮 301 (72)発明者 萩屋 道雄 滋賀県大津市陽明町３−４ (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県甲賀郡甲南町希望ケ丘３−20−９ (72)発明者 加藤 郁之進 京都府宇治市南陵町１−１−150 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 4B029 AA07 BB20 CC03 FA15 4B050 CC04 DD02 LL03 4B063 QA01 QA13 QQ06 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR56 QR62 QR66 QR75 QS24 QS25 QS34 QX02

Claims (83)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的
    に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリ
    メラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸
    長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリ
    ボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメ
    ラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌク
    レオチドは、エンドヌクレアーゼによる切断のために該
    プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
    （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および（ｃ）（ｂ）工程で得られるプ
    ライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライマー部
    分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラ
    ーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換
    を行う工程；を包含することを特徴とする核酸配列の増
    幅方法。
  2. 【請求項２】 （ｂ）工程と（ｃ）工程が連続的に反復
    される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも２種類のプライマーを使用
    し、核酸配列を増幅するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
    補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
    ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
    を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
    クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラオ
    リゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオ
    チドは、エンドヌクレアーゼによる切断のために該プラ
    イマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
    生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
    程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
    て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
    とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
    して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
    程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
    なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
    で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切
    断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
    置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
    された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
    置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
    補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
    再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
    工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
    る核酸配列の増幅方法。
  4. 【請求項４】 各工程が等温で行われることを特徴とす
    る請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸配列の増幅方
    法。
  5. 【請求項５】 鎖置換活性を有する１種のＤＮＡポリメ
    ラーゼを使用して実施されることを特徴とする請求項１
    〜４のいずれか１項記載の核酸配列の増幅方法。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡポリメラーゼとして、大腸菌由来
    のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ス
    テアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレア
    ーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス
    カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ
    欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され
    るＤＮＡポリメラーゼが使用される請求項１〜５のいず
    れか１項記載の核酸配列の増幅方法。
  7. 【請求項７】 エンドヌクレアーゼがエンドリボヌクレ
    アーゼである請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸配
    列の増幅方法。
  8. 【請求項８】 エンドリボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＨ
    である請求項７記載の核酸配列の増幅方法。
  9. 【請求項９】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、連続した２残基以上のリボヌクレオチドを含有する
    ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の核
    酸配列の増幅方法。
  10. 【請求項１０】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、１以上の修飾リボヌクレオチドを含有していること
    を特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸配
    列の増幅方法。
  11. 【請求項１１】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、リボヌクレオチドのα位のリン原子に結合している
    酸素原子を硫黄原子に置き換えた（α−Ｓ）リボヌクレ
    オチドを含有していることを特徴とする請求項１０記載
    の核酸配列の増幅方法。
  12. 【請求項１２】 トリシン、リン酸塩およびトリスから
    選択される緩衝成分を含有する緩衝液中で実施されるこ
    とを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載の核
    酸配列の増幅方法。
  13. 【請求項１３】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド
    ３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少
    なくとも１種類のプライマー、および該プライマーより
    生成する伸長鎖を切断するエンドヌクレアーゼを混合し
    て反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、
    鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デ
    オキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有
    し、該リボヌクレオチドがエンドヌクレアーゼによる切
    断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
    置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；
    および（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応
    混合物をインキュベートする工程、を包含することを特
    徴とする核酸配列の増幅方法。
  14. 【請求項１４】 反応混合物を等温でインキュベートす
    ることを特徴とする請求項１３記載の核酸配列の増幅方
    法。
  15. 【請求項１５】 さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実
    質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプ
    ライマーを含有する反応混合物を使用することを特徴と
    する請求項１３または１４に記載の核酸配列の増幅方
    法。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来の
    ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステ
    アロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアー
    ゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カ
    ルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠
    損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される
    ＤＮＡポリメラーゼである請求項１３〜１５のいずれか
    １項記載の核酸配列の増幅方法。
  17. 【請求項１７】 エンドヌクレアーゼがエンドリボヌク
    レアーゼである請求項１３〜１６のいずれか１項記載の
    核酸配列の増幅方法。
  18. 【請求項１８】 エンドリボヌクレアーゼがＲＮａｓｅ
    Ｈである請求項１７記載の核酸配列の増幅方法。
  19. 【請求項１９】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、連続した２残基以上のリボヌクレオチドを含有する
    ことを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項記載
    の核酸配列の増幅方法。
  20. 【請求項２０】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、１以上の修飾リボヌクレオチドを含有していること
    を特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項記載の核
    酸配列の増幅方法。
  21. 【請求項２１】 キメラオリゴヌクレオチドプライマー
    が、リボヌクレオチドのα位のリン原子に結合している
    酸素原子を硫黄原子に置き換えた（α−Ｓ）リボヌクレ
    オチドを含有していることを特徴とする請求項２０記載
    の核酸配列の増幅方法。
  22. 【請求項２２】 トリシン、リン酸塩およびトリスから
    選択される緩衝成分を含有する緩衝液中で実施されるこ
    とを特徴とする請求項１３〜２１のいずれか１項記載の
    核酸配列の増幅方法。
  23. 【請求項２３】 鋳型となる核酸が一本鎖または二本鎖
    のＤＮＡである請求項１〜２２のいずれか１項記載の核
    酸配列の増幅方法。
  24. 【請求項２４】 鋳型となる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮ
    Ａにする工程の後に実施されることを特徴とする請求項
    ２３記載の核酸配列の増幅方法。
  25. 【請求項２５】 鋳型となる核酸がＲＮＡから逆転写反
    応によって得られたｃＤＮＡである請求項２３または２
    ４記載の核酸配列の増幅方法。
  26. 【請求項２６】 ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によっ
    てｃＤＮＡを合成する工程の後に実施されることを特徴
    とする請求項２５記載の核酸配列の増幅方法。
  27. 【請求項２７】 逆転写反応用プライマーがオリゴｄＴ
    プライマー、ランダムプライマーもしくは、特異的プラ
    イマーからなる群より選択されるプライマーである請求
    項２６記載の核酸の増幅方法。
  28. 【請求項２８】 逆転写反応用プライマーがキメラオリ
    ゴヌクレオチドプライマーである請求項２６または２７
    記載の核酸配列の増幅方法。
  29. 【請求項２９】 逆転写酵素として逆転写酵素活性を有
    するＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする請
    求項２６〜２８いずれか１項記載の核酸配列の増幅方
    法。
  30. 【請求項３０】 逆転写反応と鋳型に相補的な伸長鎖の
    合成とが、逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する１種
    のＤＮＡポリメラーゼにより実施されることを特徴とす
    る請求項２６〜２９のいずれか１項記載の核酸配列の増
    幅方法。
  31. 【請求項３１】 ＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ス
    テアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレア
    ーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バチル
    ス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレア
    ーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴
    とする請求項２８記載の核酸配列の増幅方法。
  32. 【請求項３２】 逆転写反応の鋳型となるＲＮＡが核酸
    増幅反応で増幅されたＲＮＡである請求項２５〜３１記
    載の核酸配列の増幅方法。
  33. 【請求項３３】 ＲＮＡを鋳型とした核酸増幅反応によ
    る増幅ＲＮＡ断片を合成する工程の後に実施されること
    を特徴とする請求項３２記載の核酸配列の増幅方法。
  34. 【請求項３４】 核酸増幅反応が、転写増幅システム
    （ＴＡＳ；transcription-based amplification syste
    m）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustained sequence r
    eplication）法、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence-
    based amplification）法、ＴＭＡ（transcription-med
    iated amplification）法あるいはＱβレプリカーゼ法
    のいずれかより選択されることを特徴とする請求項３２
    〜３３記載の核酸配列の増幅方法。
  35. 【請求項３５】 鋳型となる核酸が核酸増幅反応によっ
    て得られたＤＮＡである請求項２３または２４記載の核
    酸配列の増幅方法。
  36. 【請求項３６】 ＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応によ
    る増幅ＤＮＡ断片を合成する工程の後に実施されること
    を特徴とする請求項３５記載の核酸配列の増幅方法。
  37. 【請求項３７】 核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応
    （ＰＣＲ；polymerase chain reaction）法、リガーゼ
    連鎖反応（ＬＣＲ；ligase chain reaction）法、ＳＤ
    Ａ（strand displacement amplification）法のいずれ
    かより選択されることを特徴とする請求項３６記載の核
    酸配列の増幅方法。
  38. 【請求項３８】 核酸増幅反応がランダムプライマーま
    たは縮重プライマーを使用して行われることを特徴とす
    る請求項３２〜３７いずれか１項記載の核酸配列の増幅
    方法。
  39. 【請求項３９】 ランダムプライマーまたは縮重プライ
    マーが、少なくともその３’末端又は３’末端側にラン
    ダムな配列または縮重した配列を有するプライマーであ
    ることを特徴とする請求項３８記載の核酸配列の増幅方
    法。
  40. 【請求項４０】 請求項１〜３９いずれか１項記載の核
    酸配列の増幅方法に用いられるキメラオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであって、デオキシリボヌクレオチドとリ
    ボヌクレオチドを含有し、当該リボヌクレオチドが該プ
    ライマーの３’末端又は３’末端側に配置された構造を
    有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
  41. 【請求項４１】 連続した２残基以上のリボヌクレオチ
    ドを含有する請求項４０記載のキメラオリゴヌクレオチ
    ドプライマー。
  42. 【請求項４２】 １以上の修飾リボヌクレオチドを含有
    する請求項３８または４１記載のキメラオリゴヌクレオ
    チドプライマー。
  43. 【請求項４３】 修飾リボヌクレオチドとして、リボヌ
    クレオチド３リン酸のα位のリン原子に結合している酸
    素原子を硫黄原子に置き換えた（α−Ｓ）リボヌクレオ
    チドを含有することを特徴とする請求項４２記載のキメ
    ラオリゴヌクレオチドプライマー。
  44. 【請求項４４】 請求項１〜３９のいずれか１項記載の
    核酸配列の増幅方法に使用される鎖置換活性を有するＤ
    ＮＡポリメラーゼ。
  45. 【請求項４５】 請求項１〜３９のいずれか１項記載の
    核酸配列の増幅方法に使用されるエンドヌクレアーゼ。
  46. 【請求項４６】 請求項１〜３９のいずれか１項記載の
    核酸配列の増幅方法に使用されるキットであって、パッ
    ケージされた形態において、鎖置換反応におけるＤＮＡ
    ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼの使用を指示した
    指示書を含むことを特徴とするキット。
  47. 【請求項４７】 ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエ
    ンドヌクレアーゼを含有することを特徴とする請求項４
    ６記載のキット。
  48. 【請求項４８】 パッケージされた形態において： （ａ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；（ｂ）
    エンドヌクレアーゼ；及び（ｃ）鎖置換反応用緩衝液を
    含むことを特徴とする請求項４７記載のキット。
  49. 【請求項４９】 請求項４４記載の鎖置換活性を有する
    ＤＮＡポリメラーゼおよび／または請求項４５記載のエ
    ンドヌクレアーゼを含む、請求項１〜３９いずれか１項
    記載の核酸配列の増幅方法に使用されるキット。
  50. 【請求項５０】 ＤＮＡポリメラーゼとして大腸菌由来
    のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ス
    テアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレア
    ーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス
    カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ
    欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され
    るＤＮＡポリメラーゼを含有する請求項４７〜４９いず
    れか１項記載のキット。
  51. 【請求項５１】 エンドヌクレアーゼとしてＲＮａｓｅ
    Ｈを含有する請求項４７〜４９いずれか１項記載のキッ
    ト。
  52. 【請求項５２】 試料中の標的核酸を検出するための方
    法であって、（ａ）請求項１〜３９記載の核酸配列の増
    幅方法により標的核酸を増幅する工程；および（ｂ）
    （ａ）工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
    を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法。
  53. 【請求項５３】 消光状態になるような距離で配置され
    た２種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド
    （ＲＮＡ）プローブによって増幅された標的核酸を検出
    することを特徴とする請求項５２記載の核酸配列の検出
    方法。
  54. 【請求項５４】 請求項５２または５３記載の核酸配列
    の検出方法に使用される鎖置換活性を有するＤＮＡポリ
    メラーゼ。
  55. 【請求項５５】 請求項５２または５３記載の核酸配列
    の検出方法に使用されるエンドヌクレアーゼ。
  56. 【請求項５６】 請求項５２または５３記載の核酸配列
    の検出方法に使用されるキットであって、パッケージさ
    れた形態において、鎖置換反応におけるＤＮＡポリメラ
    ーゼ及びエンドヌクレアーゼの使用を指示した指示書を
    含むことを特徴とするキット。
  57. 【請求項５７】 ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエ
    ンドヌクレアーゼを含有することを特徴とする請求項５
    ６記載のキット。
  58. 【請求項５８】 パッケージされた形態において： （ａ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ； （ｂ）エンドヌクレアーゼ；及び （ｃ）鎖置換反応用緩衝液を含むことを特徴とする請求
    項５７記載のキット。
  59. 【請求項５９】 請求項５４記載の鎖置換活性を有する
    ＤＮＡポリメラーゼおよび／または請求項５５記載のエ
    ンドヌクレアーゼを含む、請求項５６〜５８いずれか１
    項に記載のキット。
  60. 【請求項６０】 ＤＮＡポリメラーゼとして大腸菌由来
    のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ス
    テアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレア
    ーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス
    カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ
    欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択され
    るＤＮＡポリメラーゼを含有する請求項５７〜５９いず
    れか１項記載のキット。
  61. 【請求項６１】 エンドヌクレアーゼとしてＲＮａｓｅ
    Ｈを含有する請求項５７〜５９いずれか１項記載のキッ
    ト。
  62. 【請求項６２】 核酸を所定の領域に整列させた核酸固
    定化物を作製するための方法であって、（ａ）請求項１
    〜３９記載の核酸配列の増幅方法により固定化すべき核
    酸を増幅する工程；および、（ｂ）（ａ）工程で増幅さ
    れた核酸を担体上の所定の領域に整列させて固定化する
    工程；を包含することを特徴とする核酸を所定の領域に
    整列させた核酸固定化物の作製方法。
  63. 【請求項６３】 実質的にその相補鎖を含まない一本鎖
    の核酸を増幅し、担体上の所定の領域に整列させて固定
    化することを特徴とする請求項６２記載の核酸を所定の
    領域に整列させた核酸固定化物の作製方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６２または６３記載の核酸を所
    定の領域に整列させた核酸固定化物の作製方法により作
    製された核酸を所定の領域に整列させた核酸固定化物。
  65. 【請求項６５】 一本鎖の核酸が所定の領域に整列させ
    て固定化されていること特徴とする請求項６４記載の核
    酸を所定の領域に整列させた核酸固定化物。
  66. 【請求項６６】 実質的にその相補鎖を含まない一本鎖
    の核酸が所定の領域に整列させて固定化されていること
    特徴とする請求項６５記載の核酸を所定の領域に整列さ
    せた核酸固定化物。
  67. 【請求項６７】 試料中の標的核酸を検出するための方
    法であって、（ａ）試料より標的核酸を含む可能性のあ
    る核酸試料を調製する工程；（ｂ）該核酸試料を請求項
    ６４〜６６いずれか１項記載の核酸固定化物に接触させ
    る工程；および、（ｃ）核酸固定化物中の核酸とハイブ
    リダイズした該核酸試料中の標的核酸を検出する工程；
    を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法。
  68. 【請求項６８】 核酸配列を大量に製造する方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的
    に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリ
    メラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸
    長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリ
    ボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメ
    ラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌク
    レオチドは、エンドヌクレアーゼによる切断のために該
    プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
    （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および（ｃ）（ｂ）工程で得られるプ
    ライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライマー部
    分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラ
    ーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換
    を行う工程；を包含することを特徴とする核酸の製造方
    法。
  69. 【請求項６９】 少なくとも２種類のプライマーを使用
    し、核酸を大量に製造するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
    補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
    ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
    を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
    クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラオ
    リゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオ
    チドは、エンドヌクレアーゼによる切断のために該プラ
    イマーの３’末端又は３’末端側に配置され； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
    生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
    程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
    て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
    とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
    して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
    程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
    なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
    で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切
    断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
    置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
    された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
    置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
    補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
    再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
    工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
    る核酸の製造方法。
  70. 【請求項７０】 核酸を大量に製造するための方法であ
    って、（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチ
    ド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
    少なくとも１種類のプライマー、および該プライマーよ
    り生成する伸長鎖を切断するエンドヌクレアーゼを混合
    して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマー
    は、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であ
    り、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有し、該リボヌクレオチドがエンドヌクレアーゼに
    よる切断のために該プライマーの３’末端又は３’末端
    側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーで
    あり；および（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時
    間、反応混合物をインキュベートする工程、を包含する
    ことを特徴とする核酸の製造方法。
  71. 【請求項７１】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、 （ａ）増幅しようとする配列を含む核酸を核酸増幅反応
    によって増幅し、鋳型となる核酸を調製する工程； （ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸を該核酸の塩基
    配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマー
    とＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的な
    プライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマー
    はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを
    含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによる
    切断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に
    配置され； （ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｄ）（ｃ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程；を包含する
    ことを特徴とする核酸配列の増幅方法。
  72. 【請求項７２】 少なくとも２種類のプライマーを使用
    し、核酸配列を増幅するための方法であって、 （ａ）増幅しようとする配列を含む核酸を核酸増幅反応
    によって増幅し、鋳型となる核酸を調製する工程； （ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸を該核酸の塩基
    配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマー
    とＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的な
    プライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマー
    はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを
    含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによる
    切断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に
    配置され； （ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
    生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｃ）工
    程に再度利用される工程； （ｅ）（ｄ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
    て（ｂ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
    とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
    して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
    程；ここで該（ｂ）工程で使用されたプライマーとは異
    なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
    で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドはエンドヌクレアーゼによる切
    断のために該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
    置され； （ｆ）（ｅ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｇ）（ｆ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
    された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
    置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
    補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
    再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｆ）
    工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
    る核酸配列の増幅方法。
  73. 【請求項７３】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）増幅しようとする配列を含む核酸を核酸増幅
    反応によって増幅し、鋳型となる核酸を調製する工程；
    （ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸、デオキシリボ
    ヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリ
    メラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、および該プ
    ライマーより生成する伸長鎖を切断するエンドヌクレア
    ーゼを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プ
    ライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補
    的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレ
    オチドを含有し、該リボヌクレオチドがエンドヌクレア
    ーゼによる切断のために該プライマーの３’末端又は
    ３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプラ
    イマーであり；および（ｃ）反応産物を生成するのに充
    分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、を包
    含することを特徴とする核酸配列の増幅方法。
  74. 【請求項７４】 鋳型となる核酸を調製するための核酸
    増幅反応が、ＴＡＳ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭ
    Ａ法、Ｑβレプリカーゼ法、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤ
    Ａ法からなる群より選択されることを特徴とする請求項
    ７１〜７３記載の核酸配列の増幅方法。
  75. 【請求項７５】 核酸増幅反応がランダムプライマーま
    たは縮重プライマーを使用して行われることを特徴とす
    る請求項７４に記載の核酸配列の増幅方法。
  76. 【請求項７６】 ランダムプライマーまたは縮重プライ
    マーが、少なくともその３’末端又は３’末端側にラン
    ダムな配列または縮重した配列を有するプライマーであ
    ることを特徴とする請求項７５記載の核酸配列の増幅方
    法。
  77. 【請求項７７】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的
    に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリ
    メラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸
    長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリ
    ボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメ
    ラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌク
    レオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配
    置され；（ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプラ
    イマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌク
    レアーゼで切断する工程；および（ｃ）（ｂ）工程で得
    られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプラ
    イマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡ
    ポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長し
    て鎖置換を行う工程；を包含することを特徴とする核酸
    配列の増幅方法。
  78. 【請求項７８】 少なくとも２種類のプライマーを使用
    し、核酸配列を増幅するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
    補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
    ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
    を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
    クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラオ
    リゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオ
    チドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置さ
    れ； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
    生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
    程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
    て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
    とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
    して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
    程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
    なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
    で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであっ
    て、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は
    ３’末端側に配置され； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
    された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
    置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
    補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
    再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
    工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
    る核酸配列の増幅方法。
  79. 【請求項７９】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド
    ３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少
    なくとも１種類のプライマー、および該プライマーより
    生成する伸長鎖を切断するエンドヌクレアーゼを混合し
    て反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、
    鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デ
    オキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有
    し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３’末端又は
    ３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプラ
    イマーであり；および（ｂ）反応産物を生成するのに充
    分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、を包
    含することを特徴とする核酸配列の増幅方法。
  80. 【請求項８０】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的
    に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリ
    メラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸
    長鎖を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリ
    ボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リ
    ボヌクレオチドが該プライマーの３'末端又は３’末端
    側に配置され、該リボヌクレオチド含有部位がエンドヌ
    クレアーゼによって切断されるキメラオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであり；（ｂ）（ａ）工程で得られる二本
    鎖核酸のプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位
    をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および（ｃ）
    （ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二
    本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性
    を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核
    酸配列を伸長して鎖置換を行う工程；を包含することを
    特徴とする核酸配列の増幅方法。
  81. 【請求項８１】 少なくとも２種類のプライマーを使用
    し、核酸配列を増幅するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相
    補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラ
    ーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖
    を合成する工程；ここで該プライマーはデオキシリボヌ
    クレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌ
    クレオチドが該プライマーの３'末端又は３’末端側に
    配置され、該リボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレ
    アーゼによって切断されるキメラオリゴヌクレオチドプ
    ライマーであり； （ｂ）（ａ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程； （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ
    れた二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置
    換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補
    的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、再
    生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｂ）工
    程に再度利用される工程； （ｄ）（ｃ）工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型とし
    て（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なく
    とも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理
    して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工
    程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異
    なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的
    で、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド
    を含有し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３'末
    端又は３’末端側に配置され、該リボヌクレオチド含有
    部位がエンドヌクレアーゼによって切断されるキメラオ
    リゴヌクレオチドプライマーであり； （ｅ）（ｄ）工程で得られる二本鎖核酸のプライマー伸
    長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼ
    で切断する工程；および （ｆ）（ｅ）工程で得られる、プライマー伸長鎖が切断
    された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖
    置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相
    補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程であって、
    再生されたプライマー伸長鎖を含む二本鎖核酸が（ｅ）
    工程に再度利用される工程；を包含することを特徴とす
    る核酸配列の増幅方法。
  82. 【請求項８２】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド
    ３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少
    なくとも１種類のプライマー、および該プライマーより
    生成する伸長鎖を切断するエンドヌクレアーゼを混合し
    て反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、
    鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デ
    オキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有
    し、該リボヌクレオチドが該プライマーの３'末端又は
    ３’末端側に配置され、該リボヌクレオチド含有部位が
    エンドヌクレアーゼによって切断されるキメラオリゴヌ
    クレオチドプライマーであり；および（ｂ）反応産物を
    生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベート
    する工程、を包含することを特徴とする核酸配列の増幅
    方法。
  83. 【請求項８３】 核酸の塩基配列を決定するための方法
    であって、請求項１〜３９および請求項７１〜８２のい
    ずれか１項記載の方法の、核酸配列を増幅する工程を包
    含することを特徴とする核酸の塩基配列の決定方法。
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