JP2011530301A - プルーフリーディング・プライマー伸長 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸増幅技術の開発は、遺伝子分析及びエンジニアリングサイエンスに革命を起こした。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、例えば診断、法医学、又は他の適用の一部として標的核酸検出を促進するため、選択されるプライマー核酸を用いて特定の標的核酸を増幅するために頻繁に使用されている。プライマーは、通常、互いに向かって伸長するように設計されている対で機能して、選択される標的領域をカバーする。典型的PCRサイクルには、高温(例えば、85℃以上)の変性ステップで二本鎖核酸の鎖が互いに別々になるステップ、低温(例えば、45〜65℃)アニーリングステップでプライマーが別々になった一本鎖とハイブリダイズするステップ、及び中温(例えば、72℃位)伸長ステップで核酸ポリメラーゼが前記プライマーを伸長させるステップを含む。2種類の温度による熱サイクル手順も用いられる。これらは、一般に、高温変性ステップと低温アニール伸長ステップを含む。
本発明はプライマー伸長反応の実施方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、以下のステップ:
a.オリゴヌクレオチドを、(i)鋳型核酸及び(ii)3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで:
i.前記オリゴヌクレオチドが、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり;
ii.前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端ヌクレオチドではなく、また3’末端から二番目のヌクレオチドでもなく;
iii.前記オリゴヌクレオチドには3’部分及び5’部分があり、ここで、前記3’部分は、前記修飾ヌクレオチドの3’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記5’部分は、前記修飾ヌクレオチドの5’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり;並びに
iv.前記オリゴヌクレオチドの3’部分が鋳型核酸に対して100%の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの3’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され;そして
b.前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、生体サンプルからのものである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、ウイルス又は細菌ゲノムからのものである。
いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、RNAである。いくつかの実施形態において、前記鋳型核酸は、DNAである。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2〜10ヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端から5〜7ヌクレオチドの間に存在する。
15〜40ヌクレオチドの長さであり;
そのオリゴヌクレオチドの全長にわたって鋳型核酸に対して少なくとも70%の相補性を持ち;及び/又は
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2〜10ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、蛍光部分を含まない。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から3〜10ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、2’位に‐H以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、O‐メチル、OH、O‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される2’部分を含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記キットは、デオキシヌクレオシド三リン酸をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドには、15〜40ヌクレオチドの長さがある。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端から3〜10ヌクレオチドの間に存在する。
いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、2’位に‐H又は‐OH以外の部分を含んでなる。いくつかの実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、アミノ、O‐メチル、OH、O‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される2’部分を含んでなる。
a.オリゴヌクレオチドを、(i)生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び(ii)3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち;
b.ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、前記生物学的実体からの核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ;
c.前記ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し;そして
d.ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は存在若しくは不存在に相関させる、
を含んでなる。
いくつかの実施形態において、前記生物学的実体は、ウイルス、細菌、又は癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、HIV、HBV、又はHCVである。
いくつかの実施形態において、前記実施ステップは、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているか、又は実質的に欠いているポリメラーゼを含まない。
「a」、「an」、及び「the」といった語句は、別段のはっきりと指示する文脈がない限り、複数の指示対象物も含む。
「プライマー伸長反応」は、核酸ポリメラーゼがプライマーの3’末端に鋳型特異的様式で1又は複数のヌクレオチドを付加する分子反応を指す。伸長は、プライマーの3’末端への最初のヌクレオチドの付加を指すだけではなく、伸長されたプライマーによって形成されるポリヌクレオチドのさらなるあらゆる伸長もまた含む。
I.序論
本発明は、プライマー伸長反応により標的(すなわち、鋳型)核酸の検出を可能にするが、ここで、前記反応の1又は複数のプライマーは、増幅され、そして検出されるべき標的核酸に対して完全に相補性を持つか、又は完全に相補性を持つというわけではない。本願発明は、例えば、関連配列の多様性が標的配列にあるかもしれない様々な標的の増幅及び検出のためのプライマーの設計において有用である。例として、本発明はウイルス病原体を検出するのに使用でき、ここで、前記ウイルス病原体には、潜在的ウイルスゲノムの大部分若しくはすべてを増幅する単一の又は少数のセットのプライマーを設計するのを困難又は不可能にするのに十分なほどそのゲノムに変動がある。標的又は鋳型核酸はまた、他の起源、例えば、細菌ゲノムに由来することもある。
本発明は、(鋳型へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションがその鋳型と修飾ヌクレオチドのミスマッチをもたらす)鋳型の存在下、修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの3’末端に存在するときに、塩基が3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドの実質的な分解を妨げるのであれば、あらゆるタイプの修飾ヌクレオチドの使用をおこなう。
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応における使用のために便利なあらゆる長さのものであることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも8ヌクレオチドの長さであり、そしてオリゴヌクレオチドの3’又は5’末端に存在することのない修飾ヌクレオチドを任意に含んでなる。修飾ヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、3’及び5’部分に関して説明されることができ、ここで、前記3’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの3’側のヌクレオチドを指し、そして前記5’部分は、オリゴヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの5’側のヌクレオチドを指す。本明細書中に記載したような修飾ヌクレオチドは別として、オリゴヌクレオチド内の残りのヌクレオチドとしては、天然若しくは合成ヌクレオチド(例えば、ヌクレオチド類似体)、又はその組み合わせが挙げられる。しかしながら、一般に、ヌクレオチドの3’部分は、ポリメラーゼの3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除くことができないヌクレオチドを含まないであろう。
3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有するあらゆるポリメラーゼが、本明細書中に記載したように使用できる。(熱安定性ポリメラーゼを含めた)3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する代表的なポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリチマ(Tma[Tma D323A E325Aを含むが、これだけに限定されるものではない]、UlTma、Tma25など[例えば、米国特許番号第6,228,628号を参照のこと])、Tma/Z05キメラ(例えば、Schonbrunnerら、Biochemistry 45:12786‐12795(2006)を参照のこと)、ピロディクティウム・オクルタム(Pyrodictium occultum)(Poc)[形態1と2]及びピロディクティウム・アビッシ(Pyrodictium abyssi)(Pab)[形態1と2]を含めたピロディクティウム属、及びサーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)(Taf)由来のDNAポリメラーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明に使用するポリメラーゼには、ポリメラーゼがDNAを変性するのに十分な温度まで、例えば、少なくとも60℃、そして一般に約80〜95℃まで加熱されるまでそのポリメラーゼが実質的に減弱された活性を有するような可逆的修飾が含まれる。そのような修飾は、例えば、常温における核酸基質の非特異的伸長又は分解を予防するのに有用である。
によって表されるジカルボン酸無水物であり、そしてここで、上述の反応は、酵素活性の事実上完全な不活性化をもたらす。
標的核酸は、生体又は合成起源に由来することができる。標的は、例えば、DNA又はRNAであることができる。一般に、アンプリコンが作り出される場合には、アンプリコンはDNAで構成されるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドもまた増幅産物に組み込まれ得る。当業者がRNAを検出することを望む場合には、増幅工程は、通常、例えば逆転写PCR(RT‐PCR)を含めた逆転写の使用を伴うであろう。
プライマー伸長反応条件は、一般に、オリゴヌクレオチドと標的の間にいくつかのミスマッチがあっても、全体でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするように設計されている。当業者は、プライマーとプローブの融解温度を決定でき、そして増幅温度がオリゴヌクレオチド・アニーリングのために十分低い温度、なおかつ、所望の量のプライマー特異性を達成するのに十分高い温度を許容するように制御できることを理解するであろう。
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬の反応混合物を提供する。反応混合物は、例えば、ポリメラーゼ3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの3’又は5’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなることができる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端から3〜10ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは15〜40ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明の反応混合物に任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。
本発明はまた、本明細書中に記載した試薬のうちの1つ又は複数を含んでなるキットも提供する。いくつかの実施形態において、前記キットは、例えば、ポリメラーゼ3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれないで、またオリゴヌクレオチドの3’又は5’末端には存在しない修飾ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端から3〜10ヌクレオチドの間に存在する。好ましくは15〜40ヌクレオチドの長さがある、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの具体的な実施形態は、本発明のキットに任意に包含されることが明確に企図される。いくつかの実施形態において、前記反応混合物は、さらに、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含んでなる。本発明のキットは、任意に、取扱説明書を含むことができる。そういった取扱説明書は、紙、(例えば、CD‐ROM又はDVDによる)電子的なもの、又は他の形態であることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のプライマー伸長反応を実施する、及び/又はその結果を検出するための統合システムを提供する。前記システムには、特に、プライマー伸長反応の結果を導き出す手段にアルゴリズム、及び/又は電子的に保存された情報(例えば、回収された蛍光データ、伸長産物に関する予定された選択肢など)を含んでなる場合、回収されたデータを解釈し、そして分析する計装と手段を含むことができる。前記統合システムの各部分は、機能的に相互接続されることができ、場合によっては、物理的に接続されることができる。いくつかの実施形態において、前記統合システムは、自動化されていて、そこでは、分析開始後に操作者によるサンプル又は計装に関していずれの操作も必要としない。
図1は、ミスマッチ校正に関する略図を提供する。プライマー配列の中の2つのTは標的に対するミスマッチである。DNAポリメラーゼは、それを伸長する前にプライマー上のミスマッチを取り除く。プライマーは、プライマー配列内の2’アミノ修飾によってさらに酵素的分解から保護される。この過程は、その標的に完全に一致するプライマーを作り出す。
図2Aは、HIVのGAG領域の増幅に使用したプライマーと鋳型を示している。図2Bは、(3’部分の)完全に一致した転写産物又はミスマッチ転写産物(T97599‐1)のいずれかを使用した15分間のRTステップによるHIV RT/PCR(SYBR Green)の結果を示している。RTプライマー上の2’アミノ修飾は、末端から二番目の位置(−1)、又はプライマー3’末端からN−6位に存在した。
3’末端のミスマッチを伸長する難しさは、(より大きいCt遅延を引き起こす)プライマーがベンジル基で修飾されているときに深刻になる。図3を参照のこと。Tma6D DNAポリメラーゼは、ベンジル化プライマーと共にミスマッチ標的を使用することで〜15サイクルの遅延を示すのに対して、プルーフリーディングDNAポリメラーゼTmaLDは<1サイクルの遅延しか示さなかった。TmaL DNAポリメラーゼ(同様にプルーフリーディング酵素)は、ミスマッチ標的に関して〜7サイクルの遅延を示す。これらの結果は、プルーフリーディング活性がミスマッチ標的の増幅の改善に関与し、そしてTmaのD640G突然変異がさらにそれを改善したことを示唆している。これらの結果は、アルキル化プライマーがDNAポリメラーゼの3’‐5’エキソヌクレアーゼ(プルーフリーディング)活性によって分解されることを裏付けている。
プルーフリーディング酵素CS5G又はCS5GLを、COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV‐1試験の製品版Mastermix中に混入した。0.1UのCS5G又は1UのCS5GL DNAポリメラーゼのいずれかを加えたとき、好ましい結果を得た。図4A及び4Bを参照のこと。ミスマッチ標的T97599‐1を使用して、0.1UのCS5G又は1UのCS5GL DNAポリメラーゼのいずれかの添加は、単独のZ05 DNAポリメラーゼに比べて、8.5〜11.6サイクル早いCtを示した。定量標準(QS)は、それぞれ2.1〜3.9サイクル早いCtを示した。よって、プルーフリーディング酵素の添加は、このミスマッチ転写産物に関してより正確なコピー数測定につながる。マッチ標的であるEF021を用いると、結果は、添加が定量におけるわずかな変化しか引き起こさなかったことを示した。
我々は、ミスマッチ鋳型によって検証される増幅系の性能を改善する多様なアプローチを実証した。DNAポリメラーゼ(例えば、TmaLD)のプルーフリーディング活性が、プライマーの3’末端にミスマッチを持つ標的を首尾よく増幅することを示した。プルーフリーディングの程度を制限した、すなわち、プライマー配列の末端から二番目の位置に2’アミノ修飾ヌクレオチドを持つプライマーを使用したとき、増幅は、非プルーフリーディングDNAポリメラーゼを使用したかのように振る舞った(Tma6Dと同程度)。しかしながら、2’アミノ修飾形態をミスマッチの上流に配置したとき、ミスマッチを通過して2’アミノ基の1塩基前までの分解が、その標的と完全に一致したプライマーを可能にし、その結果、増幅が改善された。
Claims (15)
- プライマー伸長反応の実施方法であって、以下のステップ:
a.オリゴヌクレオチドを、(i)鋳型核酸及び(ii)3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで:
i.前記オリゴヌクレオチドが、3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり;
ii.前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端ヌクレオチドではなく、また3’末端から二番目のヌクレオチドでもなく;
iii.前記オリゴヌクレオチドには3’部分と5’部分があり、ここで、当該3’部分が、前記修飾ヌクレオチドの3’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり、且つ、前記5’部分が、前記修飾ヌクレオチドの5’側に存在するオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを含んでなり;並びに
iv.前記オリゴヌクレオチドの3’部分が鋳型核酸に対して100%の相補性を持たない場合に、前記接触ステップは、前記ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドの3’部分を鋳型特異的様式で校正できるようにするのに好適な条件下で実施され;そして
b.前記オリゴヌクレオチドを、鋳型依存的様式で伸長することによって、プライマー伸長反応を実施する、
を含んでなる前記方法。 - 前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、O‐メチル、OH、O‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される2’部分を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から2〜10ヌクレオチドの間に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、蛍光部分を含まない、請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを含んでなる反応混合物であって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、当該修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’又は5’末端ヌクレオチドではなく、また3’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記反応混合物。
- 3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項5に記載の反応混合物。
- 鋳型核酸をさらに含んでなる、請求項5又は6に記載の反応混合物。
- オリゴヌクレオチドを含んでなるキットであって、当該オリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性によって取り除かれない修飾ヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記修飾ヌクレオチドが、3’又は5’末端ヌクレオチドではなく、またオリゴヌクレオチドの3’末端から二番目のヌクレオチドでもなく、且つ、前記修飾ヌクレオチドが蛍光部分を含まない前記キット。
- 3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項8に記載のキット。
- 前記修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの3’末端から3〜10ヌクレオチドの間に存在する、請求項8に記載のキット。
- 前記修飾ヌクレオチドが、アミノ、O‐メチル、‐OH、O‐ホスファート、及びホスホロチオアートから成る群から選択される2’部分を含んでなる、請求項8に記載のキット。
- 生体サンプル中の生物学的実体の有無、又は量の検出方法であって、以下のステップ:
a.オリゴヌクレオチドを、(i)生物学的実体からの核酸を持っていると疑われる生体サンプル及び(ii)3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触させ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは生物学的実体からの核酸に対して実質的に相補性を持ち;
b.ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、それによって、前記オリゴヌクレオチドを鋳型依存的様式で伸長して、生物学的実体由来の核酸に対して相補性を持つポリヌクレオチド産物を生じさせ;
c.ポリヌクレオチド産物又はその相補体を定量し;そして
d.ポリヌクレオチド産物又はその相補体の量を、生体サンプルの生物学的実体の量、又は有無に相関させる、
を含んでなる前記方法。 - 前記定量ステップが、定量的リアルタイムPCRを含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 前記PCRが、オリゴヌクレオチドとウイルス核酸の間に0、1、2、又は3つのミスマッチが存在するか否かに関係なくオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下でのステップを含んでなり、そしてここで、前記オリゴヌクレオチドには、生物学的実体からの核酸との1つ又は複数のミスマッチがあり、且つ、ここで、前記ポリメラーゼの3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性が前記オリゴヌクレオチドを校正して、ポリヌクレオチド産物に対して完全な相補性を持つポリヌクレオチド産物をもたらす、請求項12に記載の方法。
- 前記実施ステップが、そのうちの一部が3’‐5’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている1つ又は複数のポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項12に記載の方法。
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