CN102119226B

CN102119226B - 校对引物延伸

Info

Publication number: CN102119226B
Application number: CN200980131224.3A
Authority: CN
Inventors: E·菲斯; T·W·迈尔斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2008-08-12
Filing date: 2009-08-08
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2029-08-08
Also published as: EP2324124A1; CA2733903A1; EP2324124B1; HK1159192A1; WO2010017932A4; WO2010017932A1; US20100041053A1; ATE555219T1; JP5596684B2; JP2011530301A; ES2384681T3; US7989168B2; CN102119226A; CA2733903C

Abstract

本发明提供引物延伸反应，其包括聚合酶链式反应，其中具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶编辑不完全互补的引物，从而允许扩增和检测在序列中可具有变异性的靶核酸。

Description

校对引物延伸

技术领域

核酸扩增技术的发展使遗传分析和工程科学发生了重大变化。例如，通常使用选定的引物核酸，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增特定的靶核酸，例如来促使靶核酸的检测成为诊断、法医或其他应用的一部分。引物通常成对发挥作用，它们被设计为针对彼此进行延伸以覆盖选定的靶区域。典型的PCR循环包括高温(例如，85℃或更高)变性步骤(在此期间双链核酸的链彼此分离)，低温(例如，45-65℃)退火步骤(在此期间引物杂交到分离的单链)，和中间温度(例如，大约72℃)延伸步骤(在此期间核酸聚合酶延伸引物)。还使用双温度热循环步骤。这些通常包括高温变性步骤和低温退火-延伸步骤。

PCRs还描述于许多不同的美国专利中，包括：例如，在1987年7月28日授予Mullis等人的标题为“扩增、检测和/或克隆核酸序列的方法”的美国专利号4,683,195，在1987年7月28日授予Mullis的标题为“扩增核酸序列的方法”的美国专利号4,683,202，以及在1990年10月23日授予Mullis等人的标题为“使用热稳定酶扩增、检测和/或克隆核酸序列的方法”的美国专利号4,965,188。此外，与PCR相关的技术还描述于其他各种出版物中，诸如Innis等人(Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)；Innis等人(Eds.), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press (1999)；Edwards等人, Real-Time PCR, Taylor & Francis, Inc. (2004)；以及Rapley等人, Molecular Analysis and Genome Discovery, John Wiley & Sons, Inc. (2004)。

发明内容

本发明提供进行引物延伸反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括∶

a. 将寡核苷酸与(i)模板核酸和(ii)具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶接触，其中：

i. 所述寡核苷酸包括不被所述3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸；

ii. 所述修饰的核苷酸不位于所述寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于所述寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸；

iii. 所述寡核苷酸具有3'部分和5'部分，其中所述3'部分包括在所述寡核苷酸中的核苷酸，其是所述修饰的核苷酸的3'；所述5'部分包括在所述寡核苷酸中的核苷酸，其是所述修饰的核苷酸的5'；和

iv. 如果所述寡核苷酸的3'部分不与所述模板核酸100%互补，则接触步骤是在适于允许聚合酶以模板特异性方式编辑寡核苷酸3'部分的条件下进行；和

b. 以模板依赖性方式通过延伸所述寡核苷酸来进行引物延伸反应。

在一些实施方案中，在编辑前，寡核苷酸的3'部分与模板核酸70-100%互补。

在一些实施方案中，模板核酸来自于生物样品。在一些实施方案中，模板核酸来自于病毒或细菌基因组。

在一些实施方案中，模板核酸是RNA。在一些实施方案中，模板核酸是DNA。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸在2'位置包括除了-H以外的部分。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、-OH、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'末端的2-10个核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'末端的5-7个核苷酸。

在一些实施方案，所述寡核苷酸是∶

长度为15-40个核苷酸；

与贯穿所述寡核苷酸完整长度的模板核酸至少70%互补；和/或

所述修饰的核苷酸是来自所述寡核苷酸3'末端的2-10个核苷酸。

在一些实施方案中，聚合酶包括热可逆的共价修饰，其中在碱性pH的缓冲水溶液中在高于50℃的温度下温育使共价修饰逆转，在少于20分钟内引起酶活性至少增至两倍。

在一些实施方案中，步骤b包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，步骤b包括进行实时聚合酶链式反应。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸不包括荧光部分。

本发明还提供包括本文所述的一种或更多种试剂的反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括不被核酸聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸不位于寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且所述修饰的核苷酸不包括荧光部分。

在一些实施方案中，反应混合物还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物还包括模板核酸。在一些实施方案中，反应混合物还包括脱氧核苷三磷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸长度为15-40个核苷酸。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'末端的3-10个核苷酸。

本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的一种或更多种试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含不被核酸聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸不位于寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且所述修饰的核苷酸不包括荧光部分。

在一些实施方案中，试剂盒还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶。

在一些实施方案中，试剂盒还包括脱氧核苷三磷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸长度为15-40个核苷酸。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'末端的3-10个核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸在2'位置包括除了-H或-OH以外的部分。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括选自氨基，O-甲基，-OH，O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分。

本发明还提供寡核苷酸，所述寡核苷酸包括不被核酸聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸不位于寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且所述修饰的核苷酸不包括荧光部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸长度为15-40个核苷酸。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸在2'位置包括除了-H或-OH以外的部分。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、-OH、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分。

本发明还提供检测生物样品中生物实体的存在、缺失或量的方法。在一些实施方案，所述方法包括：

a. 将寡核苷酸与(i)疑似具有来自生物实体的核酸的生物样品和(ii)具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶接触，其中所述寡核苷酸与来自生物实体的核酸基本上互补；

b. 进行聚合酶链式反应，从而以模板依赖性方式延伸寡核苷酸，以产生与来自生物实体的核酸互补的多核苷酸产物；

c. 定量多核苷酸产物或其互补物；和

d. 将多核苷酸产物或其互补物的量与生物样品中生物实体的量或存在或缺失关联。

在一些实施方案中，定量步骤包括定量实时PCR。

在一些实施方案中，生物实体是病毒，细菌或癌细胞。在一些实施方案中，生物实体是HIV，HBV或HCV。

在一些实施方案中，PCR包括在以下条件下的步骤，所述条件允许寡核苷酸在寡核苷酸和病毒核酸之间无论是否存在零、一个、两个或三个错配的情况下的延伸。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与来自生物实体的核酸的一个或更多个错配，其中聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性编辑所述寡核苷酸以产生与所述多核苷酸产物完全互补的多核苷酸产物。

在一些实施方案中，进行的步骤还包括一种或更多种聚合酶，其中一些基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性。

在一些实施方案中，进行的步骤不包括缺乏或基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶。

定义

术语“一”和“其”（“a”、“an” 和“the”）包括复数指代，除非上下文明确另外指出。

术语“核酸”是指单体的多聚体，对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)多聚体，或其类似物。这包括核苷酸的多聚体，诸如RNA和DNA，以及其修饰的形式，肽核酸(PNAs)，锁核酸(LNA?)等等。在某些应用中，核酸可以是包括多个单体类型(例如，RNA和DNA亚单位)的多聚体。核酸可以是或包括例如染色体或染色体区段，载体（例如，表达载体），表达盒，裸DNA或RNA多聚体，扩增子，寡核苷酸，引物，探针等等。核酸可以是例如单链或双链。除非另外指出，除了明确指示的任意序列外，具体的核酸序列任选地包括或编码互补序列。

核酸一般是单链或双链的，通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，如本文所列，也包括核酸类似物，其可具有替代的主链，包括例如并且不限于：磷酰胺(Beaucage等人(1993) Tetrahedron 49(10):1925; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl等人(1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger等人(1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai等人(1984) Chem. Lett. 805; Letsinger等人(1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470和Pauwels等人(1986) Chemica Scripta 26:1419)，硫代磷酸酯(Mag等人(1991) Nucleic Acids Res. 19:1437和美国专利号5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等人(1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321)，O-甲基亚磷酰胺键(O-methylphophoroamiditelinkages) (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992))，以及肽核酸主链和键(Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier等人(1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566和Carlsson等人(1996) Nature 380:207)。其他核酸类似物包括带有正电荷主链(Denpcy等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097)；非离子主链(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141 和4,469,863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger等人(1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger等人(1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook; Mesmaeker等人(1994) Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs等人(1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))和非核糖主链（包括那些描述于美国专利号5,235,033和5,034,506，以及Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook）的核酸类似物。包含一个或更多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(Jenkins等人(1995) Chem. Soc. Rev. pp169-176)。几种核酸类似物还描述于例如Rawls, C & E News Jun. 2, 1997, 第35页中。进行核糖-磷酸主链的这些修饰有利于添加其他部分诸如标记部分，或改变这类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

除了经常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基(例如腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)外，核酸类似物还包括具有非天然存在的杂环或其他修饰核苷酸的那些，其中许多在本文中描述或另外涉及。具体地，许多非天然存在的碱基进一步描述在例如Seela等人(1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein等人(1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976和Seela等人(1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中。为了进一步说明，任选地包括用于作为解链温度(Tm)调节剂的核苷酸中的一些碱基。例如，其中一些包括7-脱氮嘌呤(例如7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤等等)，吡唑并[3,4-d]嘧啶，丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC等等)等等。参见例如于1999年11月23日授权给Seela的标题为“7-脱氮-2'-脱氧鸟苷核苷酸的合成”的美国专利号5,990,303。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤；2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤，鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，2-氨基6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等等。

修饰的核苷酸和核苷酸的其他实例还描述在例如1996年1月16日授权给Froehler等人的标题为“包含5-丙炔基嘧啶的寡核苷酸”的美国专利号5,484,908，1997年7月8日授权给Froehler等人的标题为“利用包含修饰嘧啶的寡聚体进行增强的三螺旋和双螺旋形成”的美国专利号5,645,985，1998年11月3日授权给Froehler等人的标题为“使用包含修饰嘧啶的寡聚体的方法”的美国专利号5,830,653，2003年10月28日授权给Kochkine等人的标题为“[2.2.1]二环核苷的合成”的美国专利号6,639,059，2001年10月16日授权给Skouv的标题为“复杂生物样品中核酸的一步样品制备和检测”的美国专利号6,303,315以及于2003年5月15日公开的Kochkine等人标题为“[2.2.1]二环核苷的合成”的美国专利申请公开号2003/0092905。

“寡核苷酸”是指包括至少6个核酸单体单位(例如核苷酸)例如至少8、10、12或15个单体单位的核酸。寡核苷酸的准确大小通常取决于各种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。通常，核苷酸单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、苯氨基磷酸酯、氨基磷酸酯等等，包括相关的平衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、Na⁺等等，如果存在这类平衡离子。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备，包括但不限于：现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适合序列的克隆和限制性消化，或通过以下方法的直接化学合成，诸如：Narang等人(1979) Meth. Enzymol. 68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979) Meth. Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的二乙基氨基磷酸酯方法；Matteucci等人(1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191的三酯方法；自动合成法；或1984年7月3日授权给Caruthers等人的标题为“制备多聚核苷酸的方法”的美国专利号4,458,066中的固相支持物方法，或本领域技术人员已知的其他方法。

术语“热稳定的聚合酶”是指以下酶：对热稳定(例如90-95℃)，是耐热的，保留足够的活性以影响后续的引物延伸反应，并且当置于高温达影响双链核酸变性必需时间时，不会变为不可逆变性(灭活的)。核酸变性必需的加热条件是本领域公知的，并举例说明于例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中。如本文使用的，热稳定聚合酶适用于温度循环反应，诸如聚合酶链式反应(“PCR”)。用于本文目的的不可逆变性是指酶活性的永久和完全损失。对于热稳定聚合酶来说，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的引物延伸产物。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括例如来自以下细菌的DNA聚合酶：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，栖热水生菌(Thermus aquaticus)，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，黄栖热菌(Thermus flavus)，丝状栖热菌(Thermus filiformis)，栖热菌属sps17种(Thermus species sps17)，栖热菌属Z05种(Thermus species Z05)，Thermus caldophilus，热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)，新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)。

本文使用的“3'-5'核酸外切酶活性”是指一些聚合酶去除核酸3'大部分碱基的活性。这种活性在本领域有时被称为聚合酶的“校对”活性。具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶能够去除寡核苷酸的一个或更多个3'核苷酸，即，以连续方式。所述核苷酸随后以模板依赖性方式被核苷酸取代，从而“编辑”寡核苷酸的核苷酸，即，用与模板互补的核苷酸取代不与模板核酸互补的核苷酸。

“基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性”是指3'-5'核酸外切酶活性小于或等于天然海栖热袍菌DNA聚合酶中该活性的3% (例如，小于1%或0.1%)。基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性的示例性聚合酶包括描述于例如美国专利号7,148,049中的聚合酶。

本文使用的“修饰的核苷酸”是指不是天然存在于基因组DNA中的核苷酸(例如合成的核苷酸或核糖核苷酸)。如本文更详细的描述，在核苷酸戊糖部分2'位具有取代的碱基产生不被DNA聚合酶3'-5'活性去除的修饰的核苷酸。“不被核酸聚合酶3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸”是指这样的修饰的核苷酸，当其位于寡核苷酸的3'末端或3'倒数第二位时，在存在具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶条件下不被去除。

修饰的核苷酸的“2'部分”是指与核苷酸的糖部分2'碳连接的部分，如核酸领域常用的。参见例如美国专利公开号2006/00888555和2007/0219361。

当至少一个核酸段(即，至少两个连续碱基)可以与其他核酸的至少一个子序列以反平行结合方式组合或杂交形成双链时，核酸与另一核酸是“互补的”。反平行结合可以分子内的，例如以核酸内发夹环的形式，或分子间的，诸如当两个或更多个单链核酸彼此杂交时。在本发明的上下文中，对于与特定序列（例如，模板核酸）“100%互补”的寡核苷酸来说，寡核苷酸的每个碱基都与特定序列的相应碱基以反平行方式互补。本发明的核酸包括通常常未在天然核酸中发现的一些碱基，其可以包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤和上文讨论的那些。在一些实施方案中，互补性不是完全的，即，核酸可以是“基本上互补的”，其中它们具有“互补百分比”，表明寡核苷酸中只有一定百分比的核苷酸与模板互补，而剩余的核苷酸不是互补的。例如，在一些实施方案中，本发明的基本上互补的寡核苷酸(或它们的3'部分)与模板核酸小于100%互补，例如，与模板60%、70%、80%、85%、90%或95%互补。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸（或寡核苷酸的至少3'部分）与模板核酸具有1、2、3、4、5、6或更多个错配。在模板核酸长于寡核苷酸(或其中指示的情况下，为它的部分)的典型情况下，通过参考与寡核苷酸(或其中指示的情况下，为它的部分)相同长度并且具有与寡核苷酸(或其中指示的情况下，为它的部分)最高比例的核苷酸互补的模板核酸的子序列来确定错配(或互补核苷酸)的百分比或数目。

“引物延伸反应”是指这样的分子反应，其中核酸聚合酶以模板特异性方式向引物的3'末端添加一个或更多个核苷酸。延伸不但是指第一个核苷酸添加到引物3'末端，而且还包括由延伸引物形成的多核苷酸的任何进一步延伸。

本文使用的酶的“热可逆共价修饰”是指酶的可逆化学修饰，以使酶最初在室温下基本上无活性，但在更高的温度时(例如，大于50℃)其化学(例如，共价的)修饰被解除。热可逆共价失活的实例包括赖氨酸残基的化学修饰，例如通过与酸酐的反应实现(参见EP 0 962 526)。

本文使用的“生物样品”是指包含或推测包含核酸的任意物质（例如来自细菌、病毒、组织活检等等）。可以通过本领域技术人员公知的任何方法获得样品。这类样品可以是从个体或多个个体中分离的一定量的组织或液体，或其纯化组分，包括但不限于例如：皮肤、血浆、血清、全血、脊髓液、唾液、腹膜液、淋巴液、水性或玻璃性体液、滑液、尿液、泪液、血细胞、血液制品、精子、精液、阴道液、肺流出液、浆膜液、器官、支气管-肺泡灌洗液、肿瘤、石蜡包埋组织等等。样品还可以包括体外细胞培养的成分和组分，包括但不限于来自在细胞培养基中细胞生长的条件培养基、重组细胞、细胞组分等等。可以通过本领域公知的方法可从生物样品获得核酸。

附图说明

图1提供错配编辑的示意图。引物序列中的两个T（下划线表示）与靶错配。DNA聚合酶在延伸引物之前去除引物上的错配。通过引物序列的2'-氨基修饰保护引物免于进一步酶促降解。这种方法产生与其靶完全匹配的引物。

图2A 提供实施例使用的引物(SEQ ID NOS:1-4)和模板(SEQ ID NOS:5-8)。

图2B显示在包括基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性(左栏)或具有3'-5'核酸外切酶活性(右栏)的聚合酶的PCR反应中，对于匹配和错配引物，产物的积聚作为循环次数的函数。

图2C显示对于包括基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性或具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶的反应，Ct的平均差异。

图3显示涉及不同的酶以及有或没有苄化引物的条件下匹配和错配引物的平均Ct值。

图4A-B 显示只使用基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶(“无”)或还包括一定量具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶，针对HIV靶序列的匹配(A)和错配(B)引物的平均Ct值。

具体实施方式

I. 介绍

本发明允许在引物延伸反应中检测靶(即模板)核酸，其中反应中的一个或更多个引物与待扩增和检测的靶核酸不是完全互补或可以不是完全互补。本发明可用于例如设计用于扩增和检测各种靶的引物，其中多种相关序列可能位于一个靶序列中。举例来说，本发明可用于检测病毒病原体，其中所述病毒病原体在其基因组中具有大量的变异，足以使其很难或不可能设计出能扩增大部分或所有可能病毒基因组的单个或小组引物。靶或模板核酸还可以来自其他来源，例如细菌基因组。

本发明提供定量扩增反应，其中具有3'-5'核酸外切酶活性(有时称为校对活性)的热稳定聚合酶用于扩增靶序列，例如可能具有一些变异的模板，以使用于扩增的一种或更多种寡核苷酸引物不是与靶完全互补的。可以设定PCR的条件，以使引物保留对靶的特异性，但还容许引物和模板之间互补性的某些变化（例如1、2、3个错配）。这些条件下的聚合酶将编辑寡核苷酸，以使所得到的扩增产物与靶序列完全互补。当然，应理解引物也可以在引物的5'端包括一个或更多个不互补的核苷酸(例如用于克隆、序列标签、标记等等)，“完全互补”表示所得到的反应产物不会包括引物和模板之间存在的任何内部或3'错配，但还可以包括5'不互补的核苷酸，其功能不是与靶杂交。

在一些实施方案中，PCR产物是不止一个简单的引物延伸反应(即，其中引物只延伸1或2个核苷酸的反应)。例如，在一些实施方案中，PCR产物的长度是至少10个核苷酸，不计算也掺入产物的寡核苷酸序列自身。

在一些实施方案中，反应包括不止一种聚合酶。一些情况下，至少一种聚合酶基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性。在这些情况下，具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶相对于基本上缺乏这类活性的聚合酶的量的比例可以改变。例如，在一些实施方案中，具有核酸外切酶活性的聚合酶的量小于基本上缺乏所述活性的聚合酶的量，即，在一些实施方案中，比例小于1:2、1:3、1:4或1:10 (具有活性/基本上缺乏活性)。任选地，在一些实施方案中，反应中聚合酶的量基本上相等；在一些实施方案中，具有核酸外切酶活性的聚合酶比基本上缺乏活性的聚合酶多。

在本发明的一些实施方案中，例如使用定量扩增可定量样品中靶核酸的量。任选地，不考虑寡核苷酸引物与模板之间错配的存在或缺失来进行定量，因为所需信息是可能变化的模板的存在和量，其显示病原体、微生物、癌细胞等等的存在或缺失，而不是存在哪种序列。一旦确定，可以将模板的存在或量与作为模板来源的生物实体(即病毒、微生物、癌细胞等等)的存在或量相关联。

本发明还提供在引物延伸反应中作为引物的寡核苷酸。而常规引物延伸反应不涉及使用具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶，因为可引起由于3'-5'活性的引物降解而发生的特异性缺乏。本发明提供包括至少一种酶，例如，具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶。但是，为了阻止引物的降解，在一些实施方案中，本发明提供在引物寡核苷酸中间包括修饰的核苷酸。因为修饰的核苷酸不被3'-5'核酸外切酶活性去除，只有引物的3'部分被3'-5'核酸外切酶活性编辑。这允许维持引物5'未降解部分的一些特异性，从而允许引物的杂交和延伸，尽管可能有发生在引物3'部分与潜在可变模板之间的初始错配。

II. 修饰的核苷酸

本发明提供任意类型的修饰的核苷酸的用途，只要在存在模板条件下(其中寡核苷酸与模板的杂交导致修饰的核苷酸与模板的错配)，当修饰的核苷酸位于寡核苷酸的3'末端时，在存在3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶条件下，碱基阻止寡核苷酸的实质降解。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有修饰的2'位(即，2'位不是-H (DNA))。修饰的核苷酸可以包括但不限于：2'氨基、2' O-甲基、2' OH(核糖)、2' O-磷酸酯和2'硫代磷酸酯。

III. 本发明的寡核苷酸

本发明的寡核苷酸可以具有便于用于引物延伸反应的任意长度。本发明的寡核苷酸长度为至少8个核苷酸，任选地包括不位于寡核苷酸3'或5'端的修饰的核苷酸。包括修饰的核苷酸的本发明寡核苷酸可以参照3'和5'部分进行描述，其中3'部分是指寡核苷酸中修饰的核苷酸的核苷酸3'，5'部分是指寡核苷酸中修饰的核苷酸的核苷酸5'。除了修饰的核苷酸以外，如本文所述，寡核苷酸中的其余核苷酸可以包括天然存在或合成的核苷酸（例如核苷酸类似物）或其组合。但是，通常，核苷酸的3'部分不包括不会被聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的核苷酸。

寡核苷酸的5'部分可以是任意序列。例如，寡核苷酸5'部分可以被设计为在引物延伸反应中与靶(模板)核酸杂交(单独的或与3'部分的一些或全部组合)。在一些实施方案中，当靶核酸可具有一些变异（例如病毒或细菌基因组）的情况下，5'部分可以被设计为与至少部分保守的靶序列区域杂交。这可以通过以下方式实现，例如将5'部分设计为与靶具有大量互补性的核苷酸，例如与靶核酸至少80%、85%、90%、95%或100%互补。

寡核苷酸5'部分的长度(即，核苷酸数目)可以是便于引物延伸的任意长度。在一些实施方案中，5'部分是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40个或更多个核苷酸。例如、在一些实施方案中、5'部分长度是6-50个核苷酸，例如10-20、8-20、15-50、20-50、25-50、15-40、20-40个核苷酸。

寡核苷酸的3'部分也可以具有可用于引物延伸反应的任意长度。因为3'部分可以被聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性编辑，所以在一些实施方案中，3'部分在控制引物延伸反应的特异性方面的作用低于5'部分。因此，在一些实施方案中，3'部分的长度短于5'部分。因此，例如，在一些实施方案中，3'部分长度是1-15个核苷酸，例如，1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-8、2-5、3-10、3-8个核苷酸。在一些实施方案中、3'部分长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。

任选地，本发明寡核苷酸可以被标记或具有共价或其他连接的其他部分。在一些实施方案，本发明的寡核苷酸不包括标记。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸不包括荧光标记。在本发明的寡核苷酸被标记的实施方案中，可以使用任意标记。如果需要，通过掺入可通过例如光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其他技术检测的标记，可以标记寡核苷酸。为了举例说明，有用的标记包括放射性同位素、荧光染料、高电子密度剂、酶（通常用于ELISA）、生物素、或获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。这些和其他标记中的许多在本文进一步描述和/或是本领域已知的。

在本发明的一些实施方案中，标记是荧光染料或荧光团。通常，特定荧光团在吸收更短波长的光后可以发射特定波长的光。特定荧光团发射的光的波长是该荧光团的特征。因此，可以通过用更短波长的光激发荧光团后检测相应波长的光来检测特定荧光团。荧光标记可以包括带负电荷的染料，诸如荧光素家族的染料，或电中性的染料，诸如羧基罗丹明(carboxyrhodamine)家族，或带正电荷的染料，诸如花菁家族或罗丹明家族的染料。可用于本发明的其他家族的染料包括例如：聚卤素荧光素（polyhalofluorescein）-家族染料、六氯荧光素（hexachlorofluorescein）-家族染料、香豆素-家族染料、

嗪-家族染料、噻嗪-家族染料、squaraine-家族染料、螯合的镧系元素-家族染料、ALEXA FLUOR?染料和BODIPY?-家族染料。荧光素家族的染料包括例如：FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。羧基罗丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA由Perkin-Elmer (Foster City, Calif.)出售，而Texas Red由Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.)出售。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7，由Amersham GE Healthcare (Piscataway, N.J.)出售。

IV. 具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶

如本文所述，可以使用具有3'-5'核酸外切酶活性的任意聚合酶。具有3'-5'核酸外切酶活性的代表性聚合酶(包括热稳定聚合酶)包括例如：来自海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶 (Tma [包括但不限于Tma D323A E325A]、UlTma、Tma25等等 [参见例如美国专利号6,228,628])，Tma/Z05嵌合体(参见例如Schonbrunner等人, Biochemistry 45:12786-12795 (2006))，热网菌属的种(Pyrodictium species)，包括但不限于：隐蔽热网菌(Pyrodictiumoccultum) (Poc) [1和2型]和Pyrodictiumabyssi (Pab) [1和2型]，和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus) (Taf)。其他包含3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶包括例如：埃希氏大肠杆菌(Eschericia coli) (E. coli-DNA pol I，Klenow片段）；phi29 DNA聚合酶；T4 DNA聚合酶；T7 DNA聚合酶； Thermococcuslitoralis (Tli, a.k.a. Vent & Deep Vent)；强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)；焦球菌属的物种的KOD1株(Pyrococcus sp. strain KOD1)；热球菌属TY种(Thermococcus sp. TY)；热球菌属9oN-7 种(Thermococcus sp. 9oN-7)；詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)；热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax (Bca))；酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius (Sac))；嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum (Tac))；嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum (Mth))；Thermococcusgorgonarius (RAS Tgo)。其他可购得的具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶包括但不限于：Invitrogen出售的那些 (例如，AccuPrime?包含Taq DNA聚合酶和包含3’-5’核酸外切酶的DNA聚合酶，源自焦球菌属的某些种的GB-D聚合酶；Pfx50? DNA聚合酶，源自古细菌Thermococcuszilligii;；AccuPrime? Pfx DNA聚合酶，源自热球菌属的物种的KOD株的DNA聚合酶)，Qiagen (例如HotStar?和ProofStart?)和Stratagene (EXL? DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶和ArchaeMaxx?聚合酶增强因子)。还可参见美国专利号5,747,298。

在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括天然聚合酶的修饰，以使聚合酶具有改进的活性。例如，在一些实施方案中，将聚合酶修饰，以使与最密切相关的天然聚合酶相比，荧光标记的核苷酸相对于未标记的核苷酸以减少的区别掺入。例如，可以使用如美国专利公开号2003/0152988所述的在“第4位”的氨基酸修饰来减少区别。其他有用的突变描述于例如美国专利号7,148,049。

V. 可逆的化学修饰

在一些实施方案中，本发明使用的聚合酶包括可逆修饰，以使聚合酶具有实质上降低的活性，直至聚合酶被加热到足以变性DNA的温度，例如至少60℃和通常约80-95℃。这些修饰可用于例如防止核酸底物在环境温度下非特异性延伸或降解。

在一些实施方案中，酶的活性被酶与抑制剂之间的反应可逆阻断，其导致酶活性的全部或几乎全部（例如至少80%，例如至少90%）的损失。选择抑制剂以使抑制在升高的温度下可逆。在一些实施方案中，抑制剂是能够抑制所述热稳定酶中一种的抗体。任选地，通过另一种抑制剂(其引起聚合酶的可逆化学修饰)，而不使用抗体，也可以抑制酶。如本发明所述，可以通过赖氨酸残基的化学修饰进行热稳定酶的可逆失活。例如，可以通过酸酐进行赖氨酸的化学修饰（参见例如EP 962 526，美国专利号5,773,258）。但是，其他氨基酸残基的化学修饰可以产生具有合适特征的修饰蛋白。文献中已经描述了大量化合物，它们以可逆方式与氨基反应。例如氨基可以通过以下进行可逆修饰：三氟乙酰化(参见Goldberger 和Anfinsen, 1962, Biochemistry 1:410)，脒基化(amidination) (参见Hunter和Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc. 84:3491)，malaylation (参见Butler等人, 1967, Biochem. J. 103:78)，乙酰乙酰基化(参见Marzotto等人, 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26:517以及Marzotto等人, 1968, Biochim. Biophys. Acta 154:450)，四氟琥珀酰化 (参见Brannitzer等人, 1968, Hoppe-Seylers's Z. Physiol. Chem. 349:265)和柠康酰化 (参见Dixon和Perham, 1968, Biochem. J. 109:312-314以及Habeeb和Atassi, 1970, Biochemistry 9 (25):4939-4944。

用于赖氨酸残基ε氨基的化学修饰的示例性试剂是二羧酸酐。参见美国专利号5,773,258；美国专利公开号2004/0115639。因此，在一些实施方案中，可逆修饰的聚合酶通过酶和修饰剂的混合物的反应产生，其中所述反应在碱性pH在低于约25°的温度下进行，其中所述试剂是具有以下通式的二羧基酐：

其中R₁和R₂是氢或有机基，其可以被连接，或具有以下通式：

其中R₁和R₂是有机基，其可以被连接，氢是顺式的，其中所述反应导致酶活性的基本上完全失活。

有机基通过碳-碳键或通过碳-杂原子键诸如碳-氧、碳-氮或碳-硫键可以直接连接到环。有机基还可以彼此连接形成环状结构，例如3,4,5,6-四氢酞酐。

示例性试剂的实例包括马来酸酐；取代的马来酸酐诸如柠康酸酐、顺式乌头酸酐和2,3-二甲基马来酸酐；外-顺式-3,6-环内桥氧-.Δ.⁴ -四氢酞酐；和3,4,5,6-四氢酞酐。试剂购自例如Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.)，Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)或Spectrum Chemical Mfg. Corp (Gardena, Calif.)。

V. 模板核酸

靶核酸可以来自生物或合成来源。靶可以是例如DNA或RNA。通常，当产生扩增子时，扩增子由DNA组成，尽管核糖核苷酸或合成的核苷酸也可以掺入扩增子。当希望检测RNA时，扩增方法通常包括使用逆转录，包括例如逆转录PCR (RT-PCR)。

特定的靶序列可以包括例如病毒核酸（例如人类免疫缺陷性病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、巨细胞病毒（CMV）、细小B19病毒、EB病毒、丙肝病毒（HCV）、人乳头瘤病毒（HPV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、墨累山谷脑炎病毒和Kunjin病毒），细菌核酸（例如金黄色葡萄球菌(S. aureus)、脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))，分枝杆菌，真菌核酸，或来自动物或植物的核酸。在一些实施方案中，靶核酸是动物（例如人）核酸或源来于动物（例如人）样品（即，病毒或其他病原生物核酸可以存在于来自动物活检的样品、血液样品、尿液样品、粪便样品、唾液等等）。在一些实施方案中，靶核酸是例如可包括与疾病（例如癌症，糖尿病等等）有关的变体的人遗传区。

VI. 引物延伸反应

通常将引物延伸反应条件设计为使得寡核苷酸作为整体将与靶序列杂交，即使寡核苷酸和靶之间存在一些错配。本领域技术人员应理解，可以确定引物和探针的解链温度，并且可以控制扩增温度以允许足以用于寡核苷酸退火的低温和足以实现所需引物特异性程度的高温。

适于引物延伸的条件是本领域已知的。参见例如Sambrook等人, 如上文。还可参见Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons 1999)。通常，引物与靶核酸退火(即，杂交)形成引物-模板复合物。在允许向引物3'端添加一个或更多个核苷酸的合适环境下，将引物-模板复合物与DNA聚合酶和游离核苷酸接触，从而产生与靶核酸互补的延伸引物。如本文所述，在引物延伸前，寡核苷酸3'部分的一个或更多个核苷酸可以被聚合酶的校对活性切除。引物可以包括例如一个或更多个核苷酸类似物。此外，游离核苷酸可以是常见核苷酸，非常见核苷酸（例如核糖核苷酸或标记的核苷酸）或其混合物。在一些变化中，引物延伸反应包括靶核酸的扩增。适于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的（例如PCR扩增方法）。参见例如Sambrook等人, 如上文；Ausubel等人, 如上文；PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis等人编, Academic Press 1999。在其他非互斥的实施方案中，引物延伸反应包括RNA模板的逆转录（例如RT-PCR）。目前突变聚合酶(其例如提供改进的延伸速率或另外改进反应)的使用，例如允许以相对短的温育时间、降低的酶浓度和/或增加的产物产率来进行这类引物延伸反应的能力。

在一些实施方案中，位于靶SNP位置侧面但不与其直接杂交的引物用于引物延伸反应，其中引物与接近靶SNP位置的区域（即，距离靶SNP位点1、2、3或更多个核苷酸内）杂交。在引物延伸反应期间，如果特定核苷酸（等位基因）存在于该靶SNP位点，引物通常不能延伸通过靶SNP位点，可以检测引物延伸产物以确定哪种SNP等位基因存在于靶SNP位点。例如，一旦ddNTP掺入延伸产物（例如在引物延伸产物的3'最末端包括ddNTP的引物延伸产物，并且其中ddNTP是待检测SNP的核苷酸），就可以在引物延伸反应中使用特定ddNTPs以终止引物延伸。

在一些实施方案中，PCR反应按照自动化步骤进行，其使用热稳定酶。在该步骤中，反应混合物进行以下循环：变性步骤，引物（和任选地，探针）退火步骤和合成步骤(其中切割和置换与引物依赖性模板延伸同时发生)。在一些实施方案中，利用一种系统进行本文描述的方法。任选地，例如可以使用热循环仪，诸如从例如Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)购得的热循环仪，其被设计为与热稳定酶一起使用。

可以通过选择合适的杂交条件实现引物或探针与靶核酸的杂交。通常选择寡核苷酸：靶核酸杂交的稳定性以适合测定法和清洗条件，以使只在引物/探针和靶核酸之间形成稳定的可检测的杂交物。一种或更多种不同测定参数的操作决定了特定杂交测定法的准确的敏感性和特异性。

更具体地，DNA、RNA、PNA、或DNA、RNA和PNA组合的互补碱基之间的杂交在在温度、盐浓度、静电强度、缓冲液组成等等变化的各种条件下发生。应用它们的这些条件和方法实例描述于例如Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Vol. 24, Elsevier Science (1993), 以及Hames和Higgins, 见上文。杂交通常发生在约0℃和约70℃之间，时间从约1分钟到约1小时，取决于待杂交序列的性质及其长度。但是，应意识到杂交可以秒或小时为单位发生，取决于反应的条件。为了举例说明，对于两个20-mers的混合物的典型杂交条件是在2微升中将混合物升温到68℃，然后冷却到室温(22℃) 5分钟或在非常低的温度诸如2℃。可以使用缓冲液诸如Tris-EDTA (TE)、Tris-HCl和HEPES、盐溶液(例如NaCl、KC1、CaC1₂)或其他水溶液、试剂和化学品来促进核酸之间的杂交。这些试剂的实例包括单链结合蛋白诸如Rec A蛋白，T4基因32蛋白，大肠杆菌单链结合蛋白和主要或次要核酸沟结合蛋白。这类试剂和化学品的其他实例包括二价离子，多价离子和嵌入物诸如溴化乙锭、放线菌素D、补骨脂素和异补骨脂内酯。

在一些实施方案中，引物延伸反应（例如包括 PCR）是“实时”监测，任选地是定量的。参见例如Real-Time PCR: An Essential Guide, Horizon Scientific Press (2004), Innis等人(Eds.)。定量扩增的方法公开于例如美国专利号6,180,349；6,033,854和5,972,602，以及例如Gibson等人, Genome Research 6:995-1001 (1996)；DeGraves等人, Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003)；Deiman B等人, Mol Biotechnol. 20(2):163-79 (2002)。

为了定量样品中特定RNA的量，可以从包含感兴趣基因的质粒的失控转录(run-off transcription)产生标准曲线。可以利用在实时PCR中确定的阈值(Ct)产生标准曲线，其与测定法使用的初始cDNA浓度有关。此外，可以针对标准多核苷酸（例如先前定量的序列）产生标准曲线。这允许将生物样品的初始RNA含量标准化为标准品的量以用于比较目的。参见例如The PCR Technique: Quantitative PCR (J. Larrick编, 1997)。

可以使用用于检测引物延伸（包括扩增）产物的任意方法。在一些实施方案中，使用特异性结合（即，杂交）反应产物的标记的核酸探针来检测产物的积聚。一种检测扩增产物的方法是5'核酸酶PCR测定法(使用例如COBAS TaqMan 48 Analyzer? (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA))。参见例如Holland等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991); Lee等人, Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993); 美国专利号6,214,979; 5,804,375; 5,487,972和5,210,015。这种测定法通过扩增反应期间双标记荧光探针的杂交和切割来检测特定PCR产物的积聚。荧光探针可由用荧光报告染料和淬灭染料标记的寡核苷酸（例如与所需靶核酸或其互补物杂交的寡核苷酸）组成。在PCR期间，如果并且只有当这种探针与被扩增的区段杂交时，所述探针才被DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割。探针的切割产生报告染料荧光强度的增加。

另一种依赖使用能量转移来检测扩增产物的方法是由Tyagi和Kramer描述 (NatureBiotech. 14:303-309 (1996))的“分子信标探针”方法，其也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。这种方法使用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'或3'端)存在供体荧光团，在另一端存在受体部分。就Tyagi和Kramer的方法而言，这种受体部分是猝灭剂，即，受体吸收供体释放的能量，但其自身不发荧光。因此，当信标是开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标是发夹（闭合）构象时，供体荧光团的荧光被淬灭。当用于PCR时，分子信标探针(与PCR产物的一条链杂交)是“开放构象”，可检测到荧光，而剩余得未杂交的那些分子信标探针不会发荧光 (Tyagi和Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306 (1996)。因此，荧光的量将随PCR产物的量的增加而增加，从而可以用做PCR过程的量度。

可用于实时PCR方法的其他类型的探针包括Scorpion^TM探针，可以从Proligo, C (Boulder, CO)获得“单-标记”和“双-标记”形式。还可参见Bates等人, Mol. Plant Pathol. 2(5):275-280 (2001)。本领域技术人员将意识到其他定量扩增法也是可用的。

VII. 反应混合物

本发明还提供本文所述试剂的反应混合物。反应混合物包括例如，包括修饰的核苷酸的寡核苷酸，所述修饰的核苷酸不被聚合酶3'-5'核酸外切酶活性去除，并且不位于寡核苷酸的3'或5'端。优选的，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'端的3-10个核苷酸。本文描述的寡核苷酸的具体实施方案（优选为长15-40个核苷酸）被特别预期地任选地包括在本发明的反应混合物中。在一些实施方案中，反应混合物还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶。

任选地，反应混合物还包括生物样品（例如来自生物体的核酸）。在一些实施方案中，反应混合物包括模板核酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的3'部分与模板核酸70-100%互补，或另外与本文描述的模板互补。

VIII. 试剂盒

本发明还提供包含本文所述的一种或更多种试剂的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括例如，包括修饰的核苷酸的寡核苷酸，所述修饰的核苷酸不被聚合酶3'-5'核酸外切酶活性去除，并且不位于寡核苷酸的3'或5'端。优选地，修饰的核苷酸是来自寡核苷酸3'端的3-10个核苷酸。本文描述的寡核苷酸的具体实施方案（优选为长15-40个核苷酸）被特别预期地任选地包括在本发明的试剂盒内。在一些实施方案中，反应混合物还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶。本发明的试剂盒可任选地包括使用说明书。这类说明书可以是纸件、电子(例如在CD-ROM或DVD上)或其他形式。

IX. 系统

在一些实施方案中，本发明提供用于进行和/或检测本发明引物延伸反应结果的集成系统。所述系统可包括用于解释和分析收集的数据的装置和方法，特别是其中推导引物延伸反应结果的方法包括算法和/或电子存储的信息（例如收集的荧光数据、延伸产物的预定选项等等）。集成系统的各个部分可以功能互联，一些情况下，物理相连。在一些实施方案中，集成系统是自动化的，其中在开始分析后不需要操作者对样品或装置进行任何操作。

本发明的系统可以包括装置。例如本发明可以包括检测器诸如荧光检测器（例如荧光分光光度计）。可结合本发明使用检测器或多个检测器，例如来监测/测量引物延伸反应，例如测定为荧光的变化。检测器可以是多孔板读数器的形式，以促进测定的高通量能力。

在一些实施方案中，为了控制反应的温度，集成系统包括热循环装置或热循环仪。在一些实施方案中，热循环装置和检测器是集成装置，其中热循环和发射检测（例如荧光检测）在同一装置中完成。

检测器，例如荧光分光光度计，可以连接到计算机用于控制分光光度计工作参数(例如激发波长和/或检测的发射波长)和/或用于存储从检测器收集的数据(例如扩增循环期间的荧光测量值)。计算机也可以可操作的连接到热循环装置以控制温度、时间和/或系统中温度变化的速率。集成计算机还可以包含“关联模块”，在其中分析（电子地）从检测器收集的数据。在一些实施方案中，关联模块包括用于分析生成的数据的计算机程序，例如确定病毒或其他病原体的存在或缺失，或待检测的SNP或其他潜在靶的存在或缺失，例如通过比较用可能输出的数据库产生的数据来进行。

在一些实施方案中，检测器被构造为检测例如在或邻近给定的测定系统中的另一个部件（例如容器中，固相支持物上等等)产生的可检测信号。任选地使用的或适用的合适信号检测器，用于在本文中检测例如荧光、磷光、放射性、吸光度、折射率、发光、质量（mass）等等。检测器任选地监测一个或多个信号，其来自例如指定的测定步骤的表现的上游和/或下游。例如，检测器任选地监测多个光信号，其在位置上对应于“实时”结果。检测器或传感器的实例包括光倍增管、CCD阵列、光传感器、温度传感器、压力传感器、pH传感器、电导传感器、扫描检测器等等。任选地用于进行本发明方法的更具体的示例性检测器包括例如：共振光散射检测器、发射分光镜、荧光分光镜、磷光分光镜、发光分光镜、分光光度计、光度计等等。检测器还描述于例如Skoog等人, Principles of Instrumental Analysis, 5^th Ed., Harcourt Brace College Publishers (1998)和Currell, Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality, John Wiley & Sons, Inc. (2000)。

本发明的系统还通常包括控制器，其可操作地连接到系统的一个或更多个部件（例如检测器、热调节器、液体转移部件等等)以控制各部件的操作。更具体地，控制器通常被包括作为单独的或集成的系统部件，其被用于例如接收来自检测器的数据，影响和/或调节容器中的温度，影响和/或调节流动到所选容器的流体或流自所选容器的流体等等。控制器和/或其他系统部件（或多个系统部件）任选地连接到合适的编程处理器、计算机、数字装置或其他信息设备（例如，如需要的，包括模数转换器或数模转换器），其作用是按照预编程的或用户输入信息来指导这些装置的运行，接收来自这些装置的数据和信息以及向用户解释、处理和报告所述信息。合适的控制器通常是本领域已知的，可以获自各种商品化来源。

任意控制器或计算机任选地包括监视器，其通常是阴极射线管（“CRT”）显示器、平板显示器（例如活性基质液晶显示器、液晶显示器等等）或其他。计算机电路经常被置于箱中，其包括许多集成电路片，诸如微处理器、存储器、接口电路等等。所述箱任选地包括硬盘驱动器，软盘驱动器，高容量可移动驱动器诸如可写入的CD-ROM，和其他常见的外部元件。输入装置诸如键盘或鼠标任选地供用户输入。这些部件在下文进一步说明。

计算机通常包括用于接受用户指令的合适软件，采用用户输入一组参数域的形式，例如在GUI中，或采用预编程指令的形式，例如预编程用于各种不同的具体操作。然后，软件将这些指令转化为合适的语言以指导一个或更多个控制器的运行来实现所需操作。然后，计算机从例如包括在系统内的传感器/检测器接受数据，并解释所述数据，以用户理解的形式提供，或根据程序设计使用所述数据来起始进一步的控制器指令，例如诸如根据从重量量度接收到的流体重量数据来控制流体流量调节器等等。

实施例

通常用于PCR和RT/PCR的DNA聚合酶倾向于很难扩增在邻近引物的3'末端具有错配的靶。不幸的是，这经常在具有显著序列异质性的靶(诸如HIV和HCV诊断测定中的靶)中观察到。当引物被烷化修饰时，DNA聚合酶错误延伸3'末端错配的能力的降低甚至更加显著。引物的烷化降低引物/二聚体作用(参见例如美国专利号6,001,611；6,794,142)，但是，本发明的方法可以不用烷基化引物进行。一种将这些末端错配的影响最小化的方法是在延伸寡核苷酸引物之前完全去除错配。我们评价了使用具有改变的3'-5'核酸外切酶(校对)活性的DNA聚合酶来减轻错配不耐性（intolerance），并将它们与缺乏校对活性的酶进行比较。可以通过在引物序列中使用2'-氨基修饰的碱基来阻断DNA聚合酶的校对活性。我们设计了具有这些阻断基团的引物来提供所需程度的校对降解。将引物设计为在倒数第二个碱基(阻断全部校对)或3'末端潜在错配的上游(允许3'末端的校对，但不允许酶进一步降解寡核苷酸)具有2'-氨基修饰。这些研究的结果显示校对活性允许DNA聚合酶有效地扩增这些错配的靶。因此，我们证明了一种提高扩增系统(受到寡核苷酸引物的序列异质性的挑战)性能的方法。

通过组合来自栖热菌属的Z05种的5'-3'核酸外切酶结构域和来自Thermatoga maritima的3'-5'核酸外切酶和DNA聚合酶结构域来产生嵌合DNA聚合酶CS5。参见Schonbrunner等人, Biochemistry 45:12786-12795 (2006)。使用这种DNA聚合酶产生具有减弱的校对活性的嵌合突变DNA聚合酶的集合，其中CS5L (具有突变L329A的CS5)保留大约10%的校对活性，CS6缺乏校对活性。参见Schonbrunner等人, Biochemistry 45:12786-12795 (2006)。在第二轮诱变中，选择在存在SYBR Green的条件下对引发的M13 DNA模板具有提高的延伸速率的酶。这些CS5L突变体中的一些显示进行长敏感性RT/PCR的能力。最有希望的突变是D640G。我们将来自CS5 DNA聚合酶主链的这些突变转移到野生型Tma DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶和DNA聚合酶结构域。Tma6D和TmaLD DNA聚合酶包含D640G “更快-更远延伸”（“faster-extender”）突变，但Tma6D缺乏校对活性，TmaLD具有降低的校对活性。类似地，我们将CS5的同源D640G DNA聚合酶结构域突变转移到Z05(D580G)。

通过在引物序列内使用2'-氨基修饰的碱基来限制DNA聚合酶的校对活性。将引物设计为在倒数第二个碱基(完全阻断校对)或在引物的N-6位(其是3'端潜在错配的上游，允许有限的校对)具有2'-氨基修饰。将这些引物与没有2'-氨基修饰的烷基化引物进行比较。评价了使用具有改变的校对活性的酶和使用新的DNA聚合酶来减轻由引物3'末端错配引起的性能下降。

酶活性

图1提供错配编辑的示意图。引物序列中的两个T与靶错配。DNA聚合酶在延伸引物之前去除引物上的错配。通过引物序列的2'-氨基修饰保护引物免于进一步酶促降解。这种方法产生与其靶完全匹配的引物。

匹配和错配靶的RT/PCR

图2A显示用于扩增HIV GAG区的引物和模板。图2B显示使用完全匹配的(在3'部分)转录物或错配的转录物(T97599-1)，利用15分钟RT步骤的HIV RT/PCR (SYBR Green)的结果。RT引物的2'-氨基修饰位于引物3'末端的倒数第二位(-1)或N-6位。

对于利用2'-氨基-修饰引物(-1和-6)的错配靶，Tma6D DNA聚合酶(无校对活性)具有约8 Ct延迟。对于利用-1 2'-氨基修饰的引物的错配靶，校对DNA聚合酶TmaLD具有约6个循环的延迟，但利用-6氨基修饰的引物(错配的2'-氨基上游)具有小于1个的循环延迟。Ct差异还显示于图2C。

烷基修饰的引物的扩增

当用苄基修饰引物时，在3'端延伸错配的难度加大(引起更大的Ct延迟)。参见图3。使用错配靶和苄基化引物，Tma6D DNA聚合酶显示约15个循环的延迟，而校对DNA聚合酶TmaLD显示<1个循环的延迟。TmaL DNA聚合酶（也是校对酶）显示对错配靶约7个循环的延迟。这些结果表明：校对活性负责改进错配靶的扩增，Tma的D640G突变进一步将其改进。这些结果证实烷基化引物被DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶(校对)活性降解。

添加到HIV-1 MMX的校对酶

将校对酶CS5G或CS5GL加入制备好的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1检测的Mastermix。当添加0.1 U的CS5G或1 U的CS5GL DNA聚合酶时，得到有利的结果。参见图4A和4B。使用错配的靶T97599-1，添加0.1 U的CS5G或1 U 的CS5GL DNA聚合酶显示比单独添加Z05 DNA聚合酶早8.5-11.6个循环的Ct。定量标准品(QS)分别显示早2.1-3.9个循环的Ct。因此，添加校对酶引起对于这种错配转录物更准确的拷贝数确定。利用匹配的靶EF021，结果显示添加几乎没有造成定量上的变化。

结论

我们已经显示改进扩增系统(受到错配模板的挑战)性能的多种方法。DNA聚合酶(例如TmaLD)的校对活性显示成功地扩增在引物3'端具有错配的靶。当使用具有2'-氨基修饰核苷酸的引物(限制了校对程度)时，即在引物序列的倒数第二位，扩增行为如同使用非校对DNA聚合酶(可与Tma6D相当)。但是，当2'-氨基修饰位于错配上游时，从错配到缺乏2'氨基的一个碱基的降解允许引物与其靶完全匹配从而改进扩增。

烷基修饰使得延伸3'-错配更加困难(引起更大的Ct延迟)。这些结果表明：校对活性负责改进错配靶的扩增，Tma的D640G (Z05中是D580G)突变进一步将其改进。这些结果证实苄基化引物被DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶(校对)活性降解。

将校对酶添加到现有的基于Z05的病毒TaqMan检测可以是改进现有扩增系统(受到寡核苷酸引物的序列异质性的挑战)性能的解决方案。

当存在错配模板时，表现在Tma和Z05 DNA聚合酶中的特定突变可以为使用烷基化引物的系统提供双重益处。Tma DNA聚合酶的D640G突变和Z05 DNA聚合酶中D580位的突变(诸如Z05D)改进3'修饰引物的延伸并改进错配耐受性。

应理解的是：本文描述的实施例和实施方式只是用于说明目的，根据其的不同改变或者变化是本领域技术人员能够想到的，并包括在本申请的精神和界限以及所附权利要求的范围内。

序列表

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Diagnostics GmbH

<120> 校对引物延伸

<130> 24614 WO-KOE

<140> 还未指定

<141> 还未指定

<150> US 61/188,841

<151> 2008-08-12

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIV GAG区的上游引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (26)..(26)

<223> n = 2'-氨基(核糖) c (E)

<400> 1

agtgggggga catcaagcag ccatgnaaa 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIV GAG区的RT引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (29)..(29)

<223> n = 2'-氨基(核糖) c (E)

<400> 2

ggtactagta gttcctgcta tgtcacttnc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIV GAG区的RT引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (24)..(24)

<223> n = 2'-氨基(核糖) c (E)

<400> 3

ggtactagta gttcctgcta tgtnacttcc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIV GAG区的RT引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (24)..(24)

<223> n = 2'-氨基 (核糖) c (E)

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (29)..(29)

<223> n = 乙基-脱氧c (P)

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (30)..(30)

<223> n = 叔丁基苯甲基脱氧c (Q)

<400> 4

ggtactagta gttcctgcta tgtnacttnn 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与HIV GAG区上游引物匹配的转录模板

<400> 5

tttgcatggc tgcttgatgt ccccccact 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与HIV GAG区RT引物匹配的转录模板

<400> 6

ggaagtgaca tagcaggaac tactagtacc 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与HIV GAG区RT引物错配的转录模板

<400> 7

tttgcattgc tgcttgatgg cccccaact 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与HIV GAG区RT引物错配的转录模板

<400> 8

ggccgtgaca tagcaggaac tactagtacc 30

Claims

1.一种进行引物延伸反应的方法，所述方法包括：

iv. 如果所述寡核苷酸的3'部分不与所述模板核酸100%互补，则接触步骤是在适于允许聚合酶以模板特异性方式编辑所述寡核苷酸3'部分的条件下进行；和

b. 以模板依赖性方式通过延伸所述寡核苷酸来进行引物延伸反应，其中所述修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分。

2.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸是来自所述寡核苷酸3'末端的2-10个核苷酸。

3.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸不包括荧光部分。

4.一种反应混合物，其包括寡核苷酸并且包括具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶，所述寡核苷酸包括不被核酸聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸不位于所述寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于所述寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且所述修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分，但不包括荧光部分。

5.权利要求4的反应混合物，其还包括模板核酸。

6.一种试剂盒，其包括寡核苷酸并且包括具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶，所述寡核苷酸包括不被核酸聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸不位于所述寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于所述寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且所述修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分，但不包括荧光部分。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述修饰的核苷酸是来自所述寡核苷酸3'末端的3-10个核苷酸。

8.寡核苷酸在制备用于检测生物样品中生物实体的存在、缺失或量的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：

a. 将寡核苷酸与(i)疑似具有来自所述生物实体的核酸的生物样品和(ii)具有3'-5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶接触，其中所述寡核苷酸包括不被所述3'-5'核酸外切酶活性去除的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸不位于所述寡核苷酸的3'或5'末端核苷酸，也不位于所述寡核苷酸的3'倒数第二个核苷酸，并且其中所述修饰的核苷酸包括选自氨基、O-甲基、O-磷酸酯和硫代磷酸酯的2'部分，并且其中所述寡核苷酸与来自所述生物实体的核酸基本上互补；

b. 进行聚合酶链式反应，从而以模板依赖性方式延伸所述寡核苷酸，以产生与来自所述生物实体的核酸互补的多核苷酸产物；

c. 定量所述多核苷酸产物或其互补物；和

d. 将所述多核苷酸产物或其互补物的量与所述生物样品中生物实体的量或存在或缺失关联。

9.权利要求8的用途，其中所述定量步骤包括定量实时PCR。

10.权利要求8的用途，其中所述PCR包括在以下条件下的一个步骤，所述条件允许所述寡核苷酸在所述寡核苷酸和来自所述生物实体的核酸之间无论是否存在零、一个、两个或三个错配的情况下的延伸，并且其中所述寡核苷酸具有与来自所述生物实体的核酸的一个或更多个错配，和其中所述聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性编辑所述寡核苷酸以产生与来自所述生物实体的核酸完全互补的多核苷酸产物。

11.权利要求8的用途，其中进行的步骤还包括一种或更多种聚合酶，其中一些基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性。