JP5409631B2 - 酵素反応においてサンプル中でcDNAを合成するための方法 - Google Patents
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Description
(a)ポリアデニル化活性を有する第1酵素、逆転写酵素活性を有する第2酵素、バッファー、少なくとも1つのリボヌクレオチド、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチドを同時に調製する工程、(b)リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、および(c)第1酵素および第2酵素が活性を示すように選ばれる、1以上の温度工程において、工程(a)および(b)からの作用物質(agents)をインキュベートする工程を含む方法によって解決される。
(a)ポリアデニル化活性を有する第1酵素、逆転写酵素活性を有する第2酵素、バッファー、少なくとも1つのリボヌクレオチド、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、核酸合成活性を有する少なくとも1つの第3酵素、少なくとも一つのプライマー、任意にプローブ、を同時に調製する工程、(b)リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、および(c)第1酵素および第2酵素が活性を示し、任意に第3酵素が活性または不活性となるように選ばれる、1以上の温度工程において、工程(a)および(b)からの作用物質をインキュベートすることを含む方法によって解決される。任意に、この後に、第1および第2酵素がほとんど活性を持たなくなるか、不活性になり、かつ第3酵素が活性になる、1以上の温度工程が行われる。
例1(配列番号10): 5' TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG
CC (T)xVVN 3'
例2(配列番号11): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xVN 3'
例3(配列番号12): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xV 3'
例4(配列番号13): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xN 3'
例5(配列番号14): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xNN 3'
例6(配列番号15): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xVNN 3'
例7(配列番号16): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xVNNN 3'
例8(配列番号17): 5' AACGAGACGACGACAGAC(T)xNNN 3'
例9(配列番号18): 5' TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG
CC(T)xVN 3'
例10(配列番号19): 5' TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG
CC(T)xVNN 3'
Xは、好ましくは10から30塩基である。
VおよびNは、縮重塩基を表す一文字コードであり、V=A,C,G;N=A,
C,G,Tである。
当業者であれば、他の適切な5’−テール配列を特定することが可能であろう。
同じ反応容器における、ポリ(A)反応および逆転写の、結合された一段階プロセスの実行可能性の証明;22−merのRNAオリゴヌクレオチドの検出効率に及ぼす、種々のバッファーの作用。
この実験は、同じ反応容器におけるポリ(A)ポリメラーゼ反応および逆転写の、結合された一段階プロセスの実行可能性を立証するために行われた。この目的のために、この結合一段階プロセスを種々の条件下で実施した。これらは、一方では、ポリ(A)ポリメラーゼを補給したバッファーであり、他方では、逆転写酵素を補給したバッファーであった。さらに、ポリ(A)ポリメラーゼバッファーと逆転写酵素バッファーの混合物を調べた。コントロールとして、図1Aに基づき、2段階法で反応を実施した。
同じ反応容器における、ポリ(A)ポリメラーゼ反応および逆転写の結合一段階プロセスの再現性および特異性の証明
この実験では、目標は、同じ反応容器における、ポリ(A)ポリメラーゼ反応および逆転写の結合一段階プロセスの実行性を再現することであった。このために、同じ反応容器における、ポリ(A)ポリメラーゼ反応および逆転写の結合一段階プロセスの効率を、22−merRNAオリゴヌクレオチドの検出を例として分析した。標準条件にしたがって用いられる鋳型における逆転写反応を、検出特異性のコントロールとして用いた。
本発明の方法による、各種miRNAの検出
この実験の目標は、一般的な逆転写のポリ(A)反応を伴う、本発明の方法によって合成された鋳型cDNAから、miRNA特異的PCRプライマーによって、いくつかの標的を検出することが可能であることを立証することであった。このために、鋳型として293RNAを用いる方法を実施した。標準条件にしたがって使用される鋳型における逆転写反応を、検出特異性のコントロールとして用いた。
ポリ(A)反応および逆転写の結合一段階プロセスによるmiRNAの検出、それに続く、テール特異的プローブ使用のリアルタイムPCRによる、生成cDNAの検出
この実験では、テールプライマーに特異的結合部位を有するTaqmanプローブ(Uni GAP dT)を用いてリアルタイムPCRを実施した。プローブによる検出は、SYBR GreenリアルタイムPCRによる検出に代わる考えられる別法を示す。プローブの使用は、多重PCRの、さらに別の可能性をもたらす、すなわち、一つ以上の、さらに別の標的核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子であり得る、内部コントロールの共増幅の可能性をもたらす。
ポリ(A)反応および逆転写の、結合一段階プロセスに及ぼす、ポリ(A)ポリメラーゼ濃度およびインキュベーション時間の作用
この実験では、二種類の濃度のポリ(A)ポリメラーゼ(2Uまたは0.5U)を、各場合において、本発明による方法において15分間または1時間用いた。各場合において、RTバッファー(キアゲン)およびポリ(A)ポリメラーゼバッファーについて全ての条件を調べた。
種々の逆転写酵素による、本発明の方法の実施
本発明による方法を、合計5種の異なる逆転写酵素(表35参照)を用い、バッファーRT(キアゲン)中で(反応1−5)、または、更に比較のために、各場合において、該逆転写酵素を補給したバッファー中で(反応6−9)、実施した。
同じ反応容器における、ポリ(A)反応、逆転写、およびPCRの結合三段階プロセスの実行可能性の立証;22−merのRNAオリゴヌクレオチド検出の効率に及ぼす各種添加剤の作用
この実験の目的は、同じ反応容器における、ポリ(A)ポリメラーゼ反応、逆転写、およびPCRの結合三段階プロセスの実行可能性を立証することであった。このために、結合三段階プロセスを、記述の添加と共に下記の条件下に実施した。
結合三段階プロセスの反応を推進する目的で、手動的PCRプライマー”ホットスタート”を用いて本発明による「3−イン−1」法を実施した。コントロールとして、図1Bに基づく二段階法で反応を実施した。反応は、表44に示すように、表43に記載の材料のを用いて設定した。
結合三段階プロセスの反応の特異性を推進する目的で、PCR”ホットスタート”プライマーを用いて本発明による「3−イン−1」法を実施した。コントロールとして、図1Bに基づく二段階法で反応を実施した。反応は、表48に示すように、表47に提示する材料を用いて設定した。
結合三段階プロセスの反応の特異性を推進する目的で、PCR”ホットスタート”プライマーを用いて本発明による「3−イン−1」法を実施した。コントロールとして、図1Bに基づく二段階法で反応を実施した。反応は、表51に示すように、表50に提示する材料を用いて設定した。
Claims (23)
- 酵素反応においてサンプル中でcDNAを合成するための方法であって、
以下の工程:
a)ポリアデニル化活性であるターミナルトランスフェラーゼ活性を有する第1酵素、逆転写酵素活性を有する第2酵素、バッファー、少なくとも1つのリボヌクレオチド、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド、ポリ−(T)ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチド、ならびにDNA合成活性を有する酵素および生成されたcDNAの増幅のための試薬を同時に供給する工程、
b)リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、ならびに、
c)第1酵素および第2酵素が活性を示すように選ばれる1以上の温度工程において、工程a)およびb)からの作用物質をインキュベートする工程、
を含み、その後、こうして当該方法において生成されたcDNAを増幅することを特徴とする、前記方法。 - 反応が、65℃〜95℃の高温での少なくとも1つの温度工程を更に含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 当該方法において生成されるcDNAは、その後ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、かつ反応はランダムプライマーを含み、および/または、特異的プライマーおよび/または1つ以上のプローブを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- サンプルが、原核生物RNA、真核生物RNA、ウイルスRNA、古細菌RNA、miRNA、snoRNA、mRNA、tRNA、非ポリアデニル化RNA、およびrRNA、ならびにそれらの混合物を含む群から選ばれるリボ核酸を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチドが、ポリ(T)オリゴヌクレオチド、および5’−テールを更に含むポリ(T)オリゴヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチドが、6〜150ヌクレオチドの間の長さを有し、かつ3’末端にアンカー配列を有することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸(DNA)、ペプチド−核酸(PNA)、またはロックド核酸、ホスホロチオエート−デオキシリボ核酸、シクロヘキセン−核酸(CeNA)、N3'−P5'−ホスホロアミデート(NP)、またはトリシクロ−デオキシリボ核酸(tcDNA)であることを特徴とする、請求項5または6に記載の方法。
- リボヌクレオチドが、アデノシン−5'−三リン酸、チミン−5'−三リン酸、シトシン−5'−三リン酸、グアニン−5'−三リン酸、ウラシル−5'−三リン酸、塩基アナログを有するリボヌクレオチドを含む群から選択され、かつリボヌクレオチドが修飾または標識されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- デオキシリボヌクレオチドが、デオキシアデノシン−5'−三リン酸(dATP)、デオキシチミン−5'−三リン酸(dTTP)、デオキシシトシン−5'−三リン酸(dCTP)、デオキシグアニン−5'−三リン酸(dGTP)、デオキシウラシル−5'−三リン酸(dUTP)を含む群から選択され、かつデオキシリボヌクレオチドが修飾または標識されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- デオキシリボヌクレオチドの標識が、放射性標識、および蛍光色素を含む群から選択され得ることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 修飾が、ビオチン化、ジゴキシゲニン標識、およびハプテンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- デオキシリボヌクレオチドの濃度が、反応中少なくとも0.01mMであり、かつ反応中最大で10mMであることを特徴とする、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- デオキシリボヌクレオチドdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPが、0.2mM〜2mMの濃度で存在することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- バッファーが6〜10の範囲のpHを有し、かつMg2+イオンを含むことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ポリアデニル化活性を有する酵素が、原核生物起源、真核生物起源、ウイルス起源、古細菌起源、および植物起源の酵素を含む群から選択されることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- ポリアデニル化活性を有する酵素が、大腸菌由来のポリ(A)ポリメラーゼ、酵母由来のポリ(A)ポリメラーゼ、ウシ由来のポリ(A)ポリメラーゼ、カエル由来のポリ(A)ポリメラーゼ、およびヒトポリ(A)ポリメラーゼを含む群から選択されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 逆転写酵素活性を有する酵素が、ウイルス、細菌、古細菌、真核生物に由来する酵素、およびそれらの遺伝子配列変異誘発の変化により、または対応するバッファー条件の結果としてのみ、当該機能を得る酵素を含む群から選択されることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 逆転写酵素活性を有する酵素が、熱安定性生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 逆転写酵素活性を有する酵素が、HIV逆転写酵素、M−MLV逆転写酵素、EAIV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、サーマスサーモフィルス(Thermus thermophilus)DNAポリメラーゼI、およびM−MLV RNase H-を含む群から選択されることを特徴とする、請求項17または18に記載の方法。
- 工程c)における作用物質のインキュベーションを、第1酵素および第2酵素が活性を示すように選択された1以上の温度工程において行う、請求項1〜19のうちの1項に記載の方法。
- ポリアデニル化活性を有する第1酵素、逆転写酵素活性を有する第2酵素、バッファー、少なくとも1つのリボヌクレオチド、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド、およびポリ−(T)ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチド、ランダムプライマー、ホモポリマー状核酸、およびDNA合成活性を有する酵素、を含む反応混合物。
- ポリアデニル化活性を有する第1酵素、逆転写酵素活性を有する第2酵素、バッファー、少なくとも1つのリボヌクレオチド、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、ランダムプライマー、ホモポリマー状核酸、およびDNA合成活性を有する酵素、少なくとも1つの特異的プライマー、を含み、プライマーまたはDNA合成活性を有する酵素等の増幅工程のために必須の成分が同じ容器内にあり、ただし一時的に不活性化されるか、または最初にその他の試薬と空間的に分離されることを特徴とする、請求項21に記載の反応混合物。
- 請求項21または22に記載の反応混合物を含むキット。
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