JP6856233B2 - ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法 - Google Patents
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Description
<1> ウシ白血病ウイルスに感染可能な細胞と、
遺伝子構築物と、を含み、
上記遺伝子構築物は、1)デルタレトロウイルスのLTRに由来し、U5領域の活性が低下しているか有さないがU3領域のプロモータ活性を有する発現制御配列と、2)当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されているレポーター遺伝子と、を含んでなり、
上記遺伝子構築物が、発現可能に上記細胞内に導入されている、細胞。
<2> 上記発現制御配列は、U5領域の活性を有さない、<1>に記載の細胞。
<3> 上記発現制御配列は、上記U3領域に含まれる糖質コルチコイド応答エレメント(GRE)の活性が低下しているか活性を有さない、<1>または<2>に記載の細胞。
<4> 上記発現制御配列は、配列番号1に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有するU3領域を含む、<1>から<3>の何れかに記載の細胞。
<5> 上記デルタレトロウイルスは、ウシ白血病ウイルスである、<1>から<4>の何れかに記載の細胞。
<6> 上記レポーター遺伝子は、発光を触媒する酵素をコードするか、発光タンパク質をコードする、<1>から<5>の何れかに記載の細胞。
<7> ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットであって、
<1>から<6>の何れかに記載の細胞を含む、キット。
<8> ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法であって、
<1>から<6>の何れかに記載の細胞と、評価対象となる試料とを接触させる接触工程を含む、方法。
<9> 上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現に基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、<8>に記載の方法。
<10> 上記接触工程の開始後に、シンシチウムの形成と、上記レポーター遺伝子の発現とに基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、<8>に記載の方法。
<11> 上記試料が、血液由来である、<8>から<10>の何れかに記載の方法。
本発明の細胞は、ウシ白血病ウイルス(BLV)に感染可能な細胞内に、後述する遺伝子構築物が発現可能に導入されてなるものである。本発明の細胞は、一例として、後述の〔3.ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法〕において、BLVの感染を評価するために用いられるため、以下、レポーター細胞と称する場合もある。
本発明において、細胞はBLVに感染可能である。「BLVに感染可能である」とは、BLVに対する感染感受性を有することをいう。動物の個体がBLVに感染するか否かとは関りなく、BLVに感染可能な細胞は、哺乳動物に広く見出すことができる。具体的には例えば、ウシ(Bos taurus)、コブウシ(Bos indicus)、スイギュウ(Bubalus bubalis)、ヒツジ、ヤギ等のウシ科の哺乳動物;ブタ;マウス;ラット;ウサギ;ネコ;コウモリ;サル;ヒト等の哺乳動物に由来する細胞の中から、BLVに感染可能な細胞を見出すことができる。BLVに感染可能な細胞として、より具体的には、例えば、ネコ由来の細胞(CRFK、CC81)、ヒツジ由来の細胞(FLK)、マウス由来の細胞(NIH3T3)、コウモリ由来の細胞(Tb1Lu)、ヒト由来の細胞(HeLa, 293T)、イヌ由来の細胞(D17)、ウシ由来の細胞(MDBK)等が挙げられる。
上記遺伝子構築物は、以下に記載の「発現制御配列」と、当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されている「レポーター遺伝子」と、を含んでなる。
(1)U5領域の配列を含まない、(2)U3領域のGREの活性が低下しているかまたは有さない、(3)R領域の活性が低下しているかまたは有さない。
本発明のウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットは、上記レポーター細胞を構成要素として含んでいる。
本発明に係るウシ白血病ウイルス(BLV)の感染性の評価方法は、上記レポーター細胞と、評価対象となる試料とを接触させる工程(以下「接触工程」とも称する)を含む方法である。
(評価対象となる試料)
評価対象となる試料は、BLVの感染性の評価対象となる試料であって、感染性のウイルス粒子またはウイルス遺伝子を含有する細胞の何れかまたは両方を含み得る試料である。ウイルス粒子は、通常、細胞外に存在する。評価対象となる試料の由来は、被験動物由来の試料であってもよいし、培養された試料(例えば、培養細胞や培養組織、培養上清等)であってもよいが、一例において、被験動物由来の試料であることが好ましい。また、被験動物由来の試料は、細胞を含む試料であってもよいし、細胞を含まない試料であってもよい。一実施形態において、被験動物由来の試料は、BLVの主要な感染対象細胞である白血球を含む試料であることが好ましい。なお、試料は、ウイルス粒子またはウイルス遺伝子を含有する細胞の何れかまたは両方を含むことが疑われる試料であることが好ましいが、(結果として)ウイルス粒子およびウイルス遺伝子を含有する細胞の何れも含まない場合もあり得る。
上記レポーター細胞と、評価対象となる試料とを接触させる工程では、例えば、BLVの細胞間感染が成立しうる条件にて、レポーター細胞と試料とを接触させる。
上記評価工程は、上記接触工程の開始後に行われる工程であり、レポーター細胞における、レポーター遺伝子の発現を指標にして、上記試料におけるBLVの感染性を評価する。好ましくは、評価工程では、1)レポーター遺伝子の発現と、2)シンシチウムの形成とを指標にして、上記試料におけるBLVの感染性を評価する。
レポーター遺伝子の発現は、当該レポーター遺伝子の種類に応じた、公知の方法で検出すればよい。例えば、レポーター遺伝子が発光関連遺伝子である場合は、レポーター遺伝子の発現により生じる発光を検出する。発光を検出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、顕微鏡(例えば、蛍光顕微鏡等の光学顕微鏡)観察、発光の画像解析(例えば、プレートリーダーを用いた解析を含む)、受光素子(例えば、CCD等)を用いた発光量の解析、これら方法の組合せ等の方法を挙げることができる。
シンシチウムの形成の検出は、例えば、レポーター遺伝子の発現が見られるレポーター細胞に関して、融合細胞の形成が生じているか否かを検出すればよい。レポーター遺伝子が発光関連遺伝子である場合は、レポーター遺伝子の発現により発光しているレポーター細胞に関して、例えば、顕微鏡(例えば、光学顕微鏡)観察、発光の画像解析、または、これら方法の組合せ等の方法によって、シンシチウムの形成を検出する。シンシチウムが形成されると、形成前と比較して発光のスポットが明らかに大きくなるため、シンシチウムの形成を容易に検出可能である。当該検出は、一定範囲(例えば、顕微鏡の一視野内)におけるシンシチウムの形成の検出であってもよい。
レポーター遺伝子の発現とシンシチウムの形成とを指標にして、上記試料におけるBLVの感染性を評価する他の形態として、評価対象となる試料における検出結果と、比較用試料(コントロール)における検出結果とを比較して評価をしてもよい。この形態において、上記試料および比較用試料における、レポーター遺伝子の発現およびシンシチウムの形成の検出方法は、上記したものと同様の方法を採用すればよい。
本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から試料を採取する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料を前処理して細胞試料を調製する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料を前処理して細胞を含まない試料を調製する工程を含み得る。生物学的な試料の前処理としては、例えば、公知の方法に従って、採取された全血液から白血球を精製する(あるいは、赤血球や血小板等の他の細胞を除去する)こと、採取された全血液から細胞以外の成分を精製すること等が挙げられる。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養して得られた培養液から培養細胞を回収する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養して得られた培養液から上清を回収する工程を含み得る。
感染性牛白血病ウイルス(BLV)クローンpBLV-IFをテンプレートとして用い、BLV long terminal repeat(LTR)のU3領域216bpおよびR領域上流側49bpをPCRによりクローニングした。PCRは、ForwardプライマーとしてAAAATTAATTGTATGAAAGATCATGCCGACCTAGG(配列番号8)を用い、ReverseプライマーとしてAAGAGAGCTCAGGACCGAGAG(配列番号9)を用い、酵素としてKOD plusを用い、以下の条件で実施した。
293T細胞を1×105cells/mLの濃度で10%FBS/DMEMに懸濁し、0.5mLずつ24ウェルプレート(nunc)に播種し、37℃で16時間静置した。26μL Opti-MEM(Gibco)を1.5mLチューブに入れ、0.2μgのpBLU3-EGFPレポータープラスミドと、0.5μgのTax強制発現プラスミドpME18/BTax-FLAG(発明者らの自作)または感染性BLV発現プラスミドpBLV-IF(発明者らの自作)と、2μL FuGENE HD regentとを添加し、よく混合した後、室温で10分間静置し、transfection mixtureとした。それぞれのプラスミドの陰性コントロールとして、親株であるpME18neoプラスミドおよびpKSIIプラスミドを用いて同様にtransfection mixtureを調製した。
ネコ腎由来細胞株CC81を10%FBS(hyclone)/DMEM(Gibco)に懸濁し、1×105cells/mLに調製した。3mLを6ウェルプレート(nunc)に播種し、37℃で16時間静置した。
CC81−BLU3G細胞を1×105cells/mLの濃度で10%FBS/DMEMに懸濁し、60mm grid dish2枚に2mLずつ播種し、37℃で16時間培養した。上清を除き、5μg/mL polybrane(SIGMA)含有10%FBS/DMEMまたは恒常的BLV発現細胞株FLK−BLVを3×104cells/mLに懸濁した5μg/mL polybrane含有10%FBS/DMEMを2mL加えた。37℃で3日間培養後、上清を除き、25ng/mL ヘキスト33342含有3.6%ホルムアルデヒド/PBSを加え、室温で60分間静置した。細胞を固定し、蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000(Olympus)を用いて観察、撮影した。
BLV感染牛および非感染牛から10mL採血を行い、1mLをDNA抽出用に用い、CoCoMo−qPCR法により105細胞中のプロウイルス量を測定した。
CC81−BLU3G細胞を5x Penicillin-Streptomycin-Glutamine(Gibco)、1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution(Gibco)、5ug/mL polybrane(SIGMA)含有10%FBS/DMEMに2×105cells/mLの濃度で懸濁し、12ウェルプレートに播種した。そこにPBMCまたはFLK−BLV細胞を2×105cells/wellずつ添加し、37℃で3日間培養した。上清を交換し、蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000(Olympus)を用いて観察、撮影した。さらに37℃で培養を続け、24時間おきに同条件で観察、撮影を行った。
テンプレートとしてpGL3(Promega)を用い、ルシフェラーゼ遺伝子1653bpをPCRによりクローニングした。PCRは、ForwardプライマーとしてAAAGGATCCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC(配列番号12)を用い、ReverseプライマーとしてAAAGCGGCCGCTACACGGCGATCTTTCCGCC(配列番号13)を用い、酵素としてKOD plusを用い、以下の条件で実施した。
pBLU3−EGFPレポーター細胞と同様の方法で、pBLU3−Lucレポーター細胞の構築し、pBLU3−Luc安定導入CC81細胞株、CC81−BLU3L細胞として樹立した。
CC81−BLU3L細胞を2×105cells/mLの濃度で10%FBS/DMEMに懸濁し、50μLずつ96ウェルプレートに10ウェル播種した。そこにBLV産生株FLK−BLV細胞を10%FBS/DMEMに6×105、2×105、2×104、2×103cells/mLの濃度で懸濁したものを50μLずつ2ウェルに加えた。37℃で24時間、5%炭酸存在下で共培養した後、上清を除き、ウェルをPBSで洗浄した。そこにPBSで5倍希釈したピッカジーン培養細胞溶解剤Luc(東洋ビーネット)100μLを加え、室温で15分間静置した。溶解液を1.5mLチューブに回収し3,000rpm、室温で3分間遠心し、上清10μLを96well white plateに移した。50μLのピッカジーン発光キット(東洋ビーネット)を添加し、EnSightマルチモードプレートリーダー(PerkinElmer)により発光を測定時間0.1秒で測定した。その結果、FLK−BLV細胞の添加量依存的な発光量増加が見られ、細胞数100〜30000の間でR2=0.9997で比例を示した(図3)。
pBLU3-Lucレポータープラスミドをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPrimeSTAR MaxDNA Polymerase(TaKaRa)を用いて、LTRのU3領域に存在するglucocorticoid response element(GRE)配列に変異を導入した。
Forward primer:CGAAAAATCCTATCCCACAGTAGCTGACCTCACC(配列番号16)
Reverse primer:GGTGAGGTCAGCTACTGTGGGATAGGATTTTTCG(配列番号17)
Forward primer:GTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC(配列番号10)
Reverse primer:GCCCATATCCTTGCCTGATAC(配列番号14)
pEGFP-N1およびpBLU3GREM-Lucを10U/50μL BamHI(TOYOBO)および10U/50μLNotI(TaKaRa)により37℃で2時間処理を行い、0.8%アガロースゲルで電気泳動後、それぞれ741bp、3649bpのバンドを切り出し、FastGene Gel/PCR Extraction kit(日本ジェネティクス)を用いて精製した。それぞれ3.5μLと0.5μLをligation high ver2.0(TaKaRa)と混合し、16℃で30分間反応させた。5μLのLigation反応液を100μLのXL-10Gold competent cells(Agilent)に添加し、氷上で60分間静置し、42℃で60秒間ヒートショックした後、氷上に戻した。500μLのSOB培地を加え37℃で60分間前培養した後、カナマイシン含有LBプレートに植菌して培養し、PCRを用いて標的遺伝子導入大腸菌クローンを選択した。PCRは、酵素としてGoTaq green Master Mix(Promega)を用い、ForwardプライマーとしてGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC(配列番号10)を用い、ReverseプライマーとしてGGCCGTTTACGTCGCCGTCC(配列番号11)を用い、以下の条件で実施した。
CC81細胞を1×105cells/mLの濃度で10%FBS/DMEMに懸濁し、100μLずつ96well white plate(nunc)に24ウェル播種し、37℃で16時間、5%炭酸存在下で培養した。200μL Opti-MEMに0.4ug pNL1.1PGK(Promega)および8μL P3000 regent(invitrogen)を添加し、20μLずつ8本の1.5mLチューブに分注した。そのうち4本に0.2μg pME/BLV-Taxおよび0.2μg pBLU3GREM-LucまたはpBLU3-Lucを加えた。残りの4本には0.2μg pME18neoおよび0.2μg pBLU3GREM-LucまたはpBLU3-Lucを加えた。
CC81細胞を1×105cells/mLの濃度で10%FBS/DMEMに懸濁し、1mLずつ12ウェルプレート(nunc)に6ウェル播種し、37℃で16時間、5%炭酸存在下で培養した。500μLOpti-MEMに20μL P3000 regent(invitrogen)を添加し、50μLずつ6本の1.5mLチューブに分注した。そのうち3本に0.5μg pME/BLV-Taxおよび0.5μg pBLU3GREM-EGFPまたはpBLU3-EGFPを加えた。残りの3本には0.5μg pME18neoおよび0.5μg pBLU3GREM-EGFPまたはpBLU3-EGFPを加えた。
Claims (10)
- ウシ白血病ウイルスに感染可能な細胞と、
遺伝子構築物と、を含み、
上記遺伝子構築物は、1)デルタレトロウイルスのLTRに由来し、U5領域の活性が低下しているか有さないがU3領域のプロモータ活性を有する発現制御配列と、2)当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されているレポーター遺伝子と、を含んでなり、
上記遺伝子構築物が、発現可能に上記細胞内に導入されており、
上記発現制御配列は、上記U3領域に含まれる糖質コルチコイド応答エレメント(GRE)の活性が低下しているか活性を有さず、
上記GREの塩基配列は、配列番号3に示す塩基配列の4番目、5番目、6番目、10番目、11番目、14番目および15番目に相当する塩基のうちの少なくとも1つに変異を有している、細胞。 - 上記発現制御配列は、U5領域の活性を有さない、請求項1に記載の細胞。
- 上記発現制御配列は、配列番号1に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有するU3領域を含む、請求項1または2に記載の細胞。
- 上記デルタレトロウイルスは、ウシ白血病ウイルスである、請求項1から3の何れか一項に記載の細胞。
- 上記レポーター遺伝子は、発光を触媒する酵素をコードするか、発光タンパク質をコードする、請求項1から4の何れか一項に記載の細胞。
- ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットであって、
請求項1から5の何れか一項に記載の細胞を含む、キット。 - ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法であって、
請求項1から5の何れか一項に記載の細胞と、評価対象となる試料とを接触させる接触工程を含む、方法。 - 上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現に基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、請求項7に記載の方法。
- 上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現と、シンシチウムの形成とに基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、請求項7に記載の方法。
- 上記試料が、血液由来である、請求項7から9の何れか一項に記載の方法。
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