PL214884B1 - Test ELISA do wykrywania w surowicy bydlecej przeciwcial przeciwko antygenowi powierzchniowemu gp51 BLV - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania oczyszczonego antygenu gp51 BLV oraz nowy test ELISA wykorzystujący niniejszy antygen. Wynalazek znajduje zastosowanie w diagnozowaniu białaczki enzootycznej u bydła.

Enzootyczna białaczka bydła (EBL) jest chorobą zakaźną bydła wywołaną retrowirusem typu C, BLV (Bovine Leukemia Virus) i polegającą na rozroście komórek układu limfatycznego. Choroba charakteryzuje się długim okresem inkubacji (do 7 lat) i w większości przypadków (ok. 60%) przebiega bezobjawowo. U części dorosłego bydła (10-30%) dochodzi do tworzenia się torbieli limfatycznych, u 1-10% powstają mięsaki limfatyczne na różnych narządach wewnętrznych z wyraźnym wzrostem liczby limfocytów B.

U zakażonych osobników występuje silna odpowiedź humoralna, wykorzystywana w diagnostyce serologicznej. Pomimo, iż miano przeciwciał anty-BLV wzrasta wraz z rozwojem choroby, nie są one w stanie zahamować infekcji. Ponieważ choroba przez początkowy długi okres przebiega bezobjawowo, jedyną skuteczną metodą zapobiegania rozprzestrzeniania się infekcji jest częsta diagnostyka serologiczna i eliminowanie zakażonych zwierząt. Badania serologiczne przeprowadza się u zwierząt powyżej 6 miesięcy, gdy zanikają już przeciwciała matczyne. Sam wirus może być wykryty przy użyciu mikroskopu elektronowego w izolowanych obwodowych limfocytach, a wirusowe DNA można oznaczyć metodą PCR. Najczęściej w diagnostyce białaczki bydła stosowane są metody immunologiczne: test immunodyfuzji w żelu (AGID), test immunoenzymatyczny (ELISA) oraz oznaczenia radioimmunologiczne. W metodach tych wykrywa się przeciwciała przeciwko antygenowym białkom gp51 i p24.

Testy ELISA do wykonywania enzootycznej białaczki bydła opierają się na oznaczeniu poziomu przeciwciał anty-BLV w surowicy lub mleku. Do skonstruowania testu konieczne jest otrzymanie czystego antygenu powierzchniowego wirusa gp51. Antygen taki uzyskuje się z hodowli komórek FLK zainfekowanych wirusem BLV. Ponieważ do hodowli komórek używana jest powszechnie surowica cielęca (FCS) zawierająca immunoglobuliny bydlęce, co powoduje, pomimo żmudnych procedur oczyszczania, zanieczyszczenie preparatu antygenowego przeciwciałami bydlęcymi, co prowadzi do fałszywie pozytywnych wyników.

W literaturze opisano szereg pracochłonnych metod oczyszczania antygenu gp51 obejmujących precypitację, ekstrakcje, wirowanie w gradiencie sacharozy, chromatografię żelową i jonowymienną (Grunboeck M. i współpr., Polskie Archiwum Weterynaryjne 1986, 24, 327-336). W patencie ukraińskim (UA 68930 A) opisano medium hodowlane zawierające surowicę ptasią (zamiast bydlęcej). Uzyskanie czystego antygenu wymaga jednak usunięcia dużej ilości balastowych białek surowicy ptasiej.

Problemem nie rozwiązanym w stanie techniki są trudne, żmudne i kosztowne metody oczyszczania antygenu mającego zastosowanie w teście ELISA. Jednocześnie, na skutek problemów występujących na tym etapie procesu uzyskuje się zanieczyszczone preparaty antygenowe, które stosowane następnie w teście ELISA prowadzą do błędnych wyników i uniemożliwiają szybką i skuteczną diagnozę choroby.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania czystego antygenu gp51 BLV charakteryzujący się tym, że w procesie otrzymywania antygenu stosuje się media hodowlane do komórek pozbawione całkowicie surowicy bydlęcej.

W korzystnej realizacji wynalazku stosuje się media hodowlane do komórek FLK-BLV.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku media hodowlane obejmują HyQ SFM4MegaVir, HyQ PF-Vero, Gibco Opti Pro SFM.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czystego antygenu gp51 BLV do testu immunodyfuzji w żelu lub testu ELISA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest nowy test ELISA do wykrywania białaczki enzootycznej u bydła charakteryzujący się tym, że zawiera wysoko oczyszczony antygen gp51 BLV uzyskany z medium hodowlanego do komórek całkowicie pozbawionego surowicy bydlęcej.

Przykład realizacji wynalazku nie ograniczający zakresu jego ochrony przedstawiono poniżej.

P r z y k ł a d

Komórki FLK-BLV hoduje się na szalkach lub w butelkach hodowlanych w medium DMEM bez surowicy cielęcej, np. HyQ SFM4MegaVir, HyQ PF-Vero, Gibco Opti Pro SFM. Hodowlę prowadzi się 2-3 dni do uzyskanie przez komórki dużej gęstości, a następnie przez kilka kolejnych dni medium

PL 214 884 B1 znad komórek zbiera się i przechowuje w temperaturze -20°C. Zebrane medium zagęszcza się 10-krotnie przez ultrafiltrację stosując membranę Amicon YM10 i dializuje do 20 mM Tris-HCI pH 7,5, po czym oczyszcza się na kolumnie z DEAE-Sepharose FF zrównoważonej 20 mM Tris-HCI pH 7,5 i eluuje gradientem chlorku sodu (0-500 mM). Frakcje zawierające antygen gp51 łączy się, dializuje do PBS i przechowuje w temperaturze -20°C.

Tak otrzymany antygen może być stosowany do testu immunodyfuzji w żelu lub testu ELISA.

Claims (5)

1. Sposób otrzymywania czystego antygenu gp51 BLV, znamienny tym, że w procesie otrzymywania antygenu stosuje się media hodowlane do komórek pozbawione całkowicie surowicy bydlęcej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się media hodowlane do komórek FLK-BLV.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że media hodowlane obejmują HyQSFM4-MegaVir, HyQ PF-Vero, Gibco Opti Pro SFM.

4. Zastosowanie czystego antygenu gp51 BLV według zastrz. 1 do testu immunodyfuzji w żelu lub testu ELISA.

5. Test ELISA do wykrywania białaczki enzootycznej u bydła, znamienny tym, że zawiera wysoko oczyszczony antygen gp51 BLV uzyskany z medium hodowlanego do komórek całkowicie pozbawionego surowicy bydlęcej.