JPH05176771A - ブタ卵透明帯ｐｚｐ−３をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３蛋白質の部分アミノ
酸配列をコードするＤＮＡ、及びこのＤＮＡを発現させ
て得られるＰＺＰ−３関連組換えペプチドの製造方法。 【効果】 ＰＺＰ−３関連組換えペプチドはブタを含む
哺乳動物の避妊又は不妊用のワクチン抗原として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブタ卵透明帯ＰＺＰ−
３蛋白質の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、この
ＤＮＡの発現によるＰＺＰ−３関連組換えペプチドの製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の卵透明帯（zona pellucida）
は、卵母細胞を取り囲む細胞外マトリックスであり、通
常、ＺＰ−１、ＺＰ−２、ＺＰ−３、ＺＰ−４等のＺＰ
糖蛋白質から構成されている。これらのＺＰ糖蛋白質
は、卵母細胞の成長初期段階及び卵胞の細胞分化の初期
段階で形成され、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞
及び胎児を保護する役割をもつ。また、精子が卵透明帯
のＺＰ糖蛋白質に付着し、卵透明帯に侵入する受精過程
においても、これらのＺＰ糖蛋白質は重要な機能を有し
ている。特に、ＺＰ−３蛋白質は、受精過程において最
初に精子と結合することが知られている（Wassarman P.
M., Ann. Rev. Biochem. 1988, 57:415-442)．従って、
精子が結合し得るＺＰ糖蛋白質をブロックすることによ
り、受精を阻害し、その結果、避妊又は不妊が可能とな
る（メルクの特開昭５３−２６３１１号公報；C.A. Mah
i-Brown ら (1985) Biol. Reprod. 32, 761〜772; Sac
co A.G.ら (1987) Biol. Reprod. 36: 481-490 ; Wood,
D.M.ら (1981) Biol. Reprod.25, 439-450 ）。もし、
ＺＰ糖蛋白質を含む卵透明帯蛋白質をワクチン抗原とし
て雌の哺乳動物に投与すると、該抗原に対する抗体がｉ
ｎ ｖｉｖｏ生成され、それがブロック剤となって受精
または、卵胞の発育が阻害される。（Skinner S.M.ら
(1984) Endocrinology 115 : 2418-2432 ）これらの抗
原はいわゆる避妊ワクチンとして知られ、また、このワ
クチンによる避妊法は、従来の避妊法であるピル、ＩＵ
Ｄ、コンドーム、リズム法、不妊手術等による方法とは
異なり免疫学的避妊法として知られる。

【０００３】避妊ワクチンとしては、例えば、特開昭５
３−２６３１１号公報（メルク）に記載の可溶化透明
帯、C.A. Mahi-Brown ら（上掲）に記載の天然ブタＺＰ
−３、特表平３−５０２５７１号公報（ゾナゲン）及び
S.E. Millarら、Science 246, 935〜938 （1989）に
記載の組換え透明帯ポリペプチド、合成ペプチドなどが
開示されている。さらにまた、ＺＰ−３蛋白質をコード
するＤＮＡとしては、マウス（M. J. RinguetteJら、上
掲）及びヒト（M.E.ChamberlinとJ. Dean (1990)Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 6014〜6018）由来のものが
報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ワクチン抗原として天
然卵透明帯を直接使用する哺乳動物の避妊法において
は、該抗原を得るために大量の卵巣を必要とする欠点が
あり、また、卵透明帯を精製するうえで他の卵巣組織が
混在し、これが副作用の原因となる可能性を有してい
る。

【０００５】これに対して、遺伝子工学技術を用いて得
られる組換え透明帯ポリペプチドを使用する避妊法は、
該ポリペプチドを高純度で且つ安価に製造することがで
きる利点をもつ。しかしながら、ブタに関しては、卵透
明帯ＺＰ−３蛋白質の一次構造は充分に解明されておら
ず、該天然蛋白質のシークエンシングによりＮ末端アミ
ノ酸約10-20 残基が決定されているにすぎない（特表平
３−５０２５７１号公報；Yurewicz,E.C. ら (1987) J.
Biol. Chem. 262, 564-571 ）。

【０００６】本発明者らは、ブタ卵透明帯ｃＤＮＡライ
ブラリーからＺＰ−３遺伝子を取得し、これをクローニ
ングして、該ＺＰ−３遺伝子の塩基配列及び推定アミノ
酸配列を決定した。

【０００７】従って、本発明の目的は、ブタ卵透明帯Ｐ
ＺＰ−３蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡを提供
することである。

【０００８】本発明の目的はまた、該ＤＮＡを適当な発
現系で発現させて、ＰＺＰ−３関連組換えペプチドを製
造する方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１で
表わされる、ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３蛋白質の部分アミ
ノ酸配列の全部又は一部をコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡを提供する。

【００１０】ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３遺伝子のクローニ
ングは、一般的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うことが
できる。このような技術の中には、細胞又は組織からの
全ＲＮＡの抽出、オリゴ−ｄＴによるｍＲＮＡの精製、
ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、ＰＣＲ（Polymerase Cha
in Reaction）増幅、表現型マーカーを含むベクター内
へのＤＮＡの挿入、コンピテント宿主細胞の形質転換、
コロニーライブラリーからの目的ｃＤＮＡクローンのス
クリーニング、陽性ｃＤＮＡクローンからのベクターＤ
ＮＡの単離、ＤＮＡの配列決定などが含まれる。

【００１１】具体的なＤＮＡ配列決定手順の例を以下に
示す。

【００１２】５週齢のブタ卵巣から得た全ＲＮＡを、例
えばＷａｒｄら（J.Virol., 9, 61(1972) ）の方法に従
って抽出する。即ち、凍結、粉砕した卵巣をホモジナイ
ズし、遠心した後、細胞を溶解し、遠心により核をペレ
ット化し、全ＲＮＡを含む上清をフェノール／クロロホ
ルム抽出により精製し、塩化ナトリウムの存在下水相に
エタノールを加えて全ＲＮＡを沈殿させる。次に、オリ
ゴーｄＴセルロースクロマトグラフィーを用いて、全Ｒ
ＮＡ調製物からｍＲＮＡを精製する（Oppermann ら、Vi
rology, 108, 47 (1981) ）。

【００１３】ポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡに対してランダムプ
ライマー、オリゴ−ｄＴプライマー等を用いて逆転写酵
素により相補鎖ＤＮＡを伸長し、さらにＲＮＡａｓｅ
ＨによりＲＮＡを分離し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用い
て二本鎖ｃＤＮＡを合成する。

【００１４】ｃＤＮＡライブラリーを作るため、得られ
た二本鎖ｃＤＮＡの両末端にリンカーを連結して、λフ
ァージベクターに導入し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングを行い、ファージ粒子を得る。このファージ
粒子を大腸菌株に感染させ、寒天培地上に培養して、λ
ファージの溶菌プラークを形成させる。プラークをニト
ロセルロース膜に移動、固定した後、イムノスクリーニ
ングまたは、ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーシ
ョンによりＰＺＰ−３蛋白質をコードするＤＮＡが組み
込まれたファージプラークを同定する。

【００１５】得られたファージＤＮＡを制限酵素消化
し、得られるＤＮＡ断片を同様の制限酵素部位をもつプ
ラスミドにサブクローニングする。

【００１６】得られたＰＺＰ−３蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含むプラスミドを各種の制限酵素により消化し、
各フラグメントをＭ１３ファージベクターにサブクロー
ニングする。

【００１７】得られたファージプラークから一本鎖ＤＮ
Ａを調製し、Ｍ１３ジデオキシ法により各フラグメント
の塩基配列を決定する。

【００１８】この操作段階中λファージベクターに導入
することなく、ＰＺＰ−３蛋白質をコードする遺伝子を
増幅するために、該遺伝子を含むｃＤＮＡをＰＣＲ法
（Saiki,R.K.ら(1985) Science 230, 1350-1354 ;Lee,
C.C. ら (1988) Science 239, 1288-1291;Frohman,M.A.
ら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-900
2）に掛けることができる。使用されるプライマーは、
マウス卵透明帯ＭＺＰ−３（M. J. Ringuette ら（198
8） Dev. Biol. 127, 287〜295 ）又はヒト卵透明帯
ＨＺＰ−３（M. E. Chamberlinと J. Dean (1990) Pro
c. Natl. Acad. Sci USA 87, 6014〜6018）の公知の遺
伝子配列に基づいて推定され、作製し得る。例えば、プ
ライマーとして、 プライマー１：５’ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡ
ＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴ３’ プライマー２：５’ＡＧＧＡＡ［Ｇ，Ｔ］ＡＴＣＡＧ
［Ｇ，Ｔ］ＧＧＣＣＣ［Ｃ，Ｔ］ＡＣ［Ｇ，Ａ］ＧＴＧ
ＡＣＡＴＣ［Ｔ，Ａ］ＧＣＴＴＣ３’ を使用し得る（［］はミックスを表わす）。

【００１９】上述の手順に従って決定されたブタ卵透明
帯ＰＺＰ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、ＰＺＰ
−３リーディングフレーム全長の５０％以上に相当する
と予想される、配列番号１の配列で示される７７４ bp
のヌクレオチド配列から成る。このＤＮＡ配列から推定
されるアミノ酸配列も同様に配列番号１として示されて
おり、Ａｓｐ¹ ………Ｌｅｕ²⁵⁸ の２５８アミノ酸から
構成される。

【００２０】本発明のＤＮＡの１つの具体例が、配列番
号１で表わされる塩基配列の全部又は一部である。その
他の例として、配列番号１の配列中、アミノ酸の遺伝コ
ドンの縮重に基づく対応する全ての塩基を含む全ての可
能な塩基配列が挙げられる。これらの塩基配列はいずれ
も、本発明の一部を構成するものである。

【００２１】図１、図２及び図３、並びに図４、図５及
び図６に、本発明のブタ卵透明帯ＰＺＰ−３蛋白質の推
定アミノ酸配列を、M. J. Ringuette ら ( Dev. Biol.
127,287 〜295 ）の報告したマウス卵透明帯ＭＺＰ−３
蛋白質の推定アミノ酸配列及び M. E. Chamberlin ら(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6014-6018)の報告して
いるヒト卵透明帯ＨＺＰ−３蛋白質の推定アミノ酸配列
と比較して示しているが、比較の範囲内での両アミノ酸
配列の相同性は高く、その相同率はプライマー領域も含
めるとそれぞれ７１．５％及び８０％であることが判明
した。 S. E. Millar（Science 246, 935〜938 ；I.
J. Eastら(1985) Dev. Biol. 109,268 ）らは、ＭＺ
Ｐ−３アミノ酸配列中（図３）Ｐｈｅ³³⁶ ………Ａｒｇ
³⁴² の１６アミノ酸から成るペプチドに貝由来の蛋白質
ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin ）を結合したもの
を雌マウスに免疫することによってその雌マウスを不妊
にすることができることを報告しており、従って、本発
明のＤＮＡを発現させて得られるＰＺＰ−３関連組換え
ペプチドも雌ブタに免疫すればマウスの場合と同様にブ
タを避妊又は不妊にすることができると推測される。ま
た、天然のＰＺＰ−３を雌イヌ（C.A.Mahi-Brownら (19
85) Biol. Reprod. 32, 761〜772 ）又は雌ザル（Sacc
o, A.G. ら (1987) Biol. Reprod., 36, 481-490) 、哺
乳動物間でアミノ酸レベルでかなり相同性が高いと予想
され、従って、ＰＺＰ−３関連組換えペブチドは種々の
哺乳動物例えばヒト及び、、特にネコ、イヌ、ウサギ、
モルモット等のペット類の避妊又は不妊にも使用できる
と考えられる。

【００２２】本発明はさらに、配列番号１で表わされ
る、ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３蛋白質の部分アミノ酸配列
の全部又は一部を含む組換えペプチドの製造方法を提供
する。この方法は、配列番号１で表わされるアミノ酸配
列の全部又は一部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
を、複製可能な適切な発現ベクターに組み込む工程、得
られた発現ベクターで適切な宿主を形質転換する工程、
得られた形質転換体を適切な培地中で培養し、前記ＤＮ
Ａを発現させる工程、及び得られた組換えペプチドを回
収する工程、を包含する。

【００２３】本明細書中「ペプチド」なる用語は、短鎖
及び長鎖ペプチドの両方を意味する。ここで、長鎖ペプ
チドは蛋白質をも包含する。

【００２４】本発明ＤＮＡを発現させるためのベクター
は、ファージ又はプラスミドであり、通常、複製部位と
選択マーカー配列を含む。複製部位は、形質転換される
宿主細胞に適合するプロモーター、ターミネーター、複
製起点、リボソーム結合部位などの配列を適宜含み得
る。特に、プロモーターとしては、原核生物を宿主とす
る場合には常用のｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモー
ター、バクテリオファージλプロモーター等が、酵母を
宿主とする場合にはアルコールデヒドロゲナーゼや解糖
系酵素類に対するプロモーター等が、動物細胞を宿主と
する場合にはＳＶ４０ウイルスプロモーターのようなウ
イルスプロモーター等が挙げられる。また、選択マーカ
ー配列としては、アンピシリン、テトラサイクリン耐性
遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が常用される。

【００２５】発現すべき外来遺伝子は、プロモーターの
下流に挿入される。

【００２６】宿主細胞は、原核及び真核生物の両方を使
用し得る。原核生物には、大腸菌、枯草菌、放線菌等の
細菌類が含まれ、また、真核生物には、酵母、昆虫細
胞、植物細胞、動物細胞等が含まれる。これらの宿主細
胞は、対象とするペプチドの糖鎖構造の有無に応じて適
宜選択され、一般に、糖鎖を含むペプチドを合成したい
場合には、真核生物が利用される。しかし、その糖鎖構
造は、必要な免疫能が達成される限り、対象とする天然
ペプチドと必ずしも一致していなくてもよい。

【００２７】本発明方法で得られる組換えペプチドは、
避妊ワクチン抗原として雌ブタに投与したときに、ｉｎ
ｖｉｖｏでブタ卵透明帯ＰＺＰ−３糖蛋白質に結合し
て精子の結合、または、卵胞の発育を阻止することが可
能な該ペプチドに対する抗体を生成するものであればよ
い。従って、このような機能を損わない範囲で置換、欠
失、付加、リン酸化や硫酸化のような修飾等の改変を前
記ペプチドに施してもよい。この改変は、遺伝子レベ
ル、ペプチドレベルの両方で実施し得る。

【００２８】本発明の範囲外であるが、上記のペプチド
は化学的ペプチド合成によっても作り得ることは、当業
者には自明であろう。

【００２９】ＰＺＰ−３組換えペプチドは、前述したよ
うに、マウス由来のＭＺＰ−３と高い相同性をもつこと
が判明しており、避妊ワクチンとして使用し得る。この
とき、ワクチンは、組換えペプチドの他に、通常、水酸
化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Freundの完全又
は不完全アジュバント等のアジュバント、油類及び適切
な希釈剤を含み、溶液、乳濁又は懸濁形態で処方され得
る。

【００３０】また、別の種類のワクチン抗原としては、
ＰＺＰ−３組換えペプチド中のＰＺＰ−３精子結合領域
関連エピトープまたは、卵胞の発育抑制を招くような抗
体を誘導するエピトープに対するポリクローナル又はモ
ノクローナル抗体の抗イディオタイプ抗体が挙げられ
る。これらの抗体は常法に従って調製し得る。

【００３１】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説
明する。

【００３２】実施例 ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３ ｃＤＮＡライブラリーの作
製 ：５週齢のブタ卵巣１ｇを液体窒素中で凍結した後、
ブレンダーを用いて粉末状に粉砕した。これを、市販の
ｍＲＮＡ抽出用キット（FastTrack mRNA ISOLATIONKIT,
Invitrogen）の指示された抽出方法に従って、ブタ卵
巣ｍＲＮＡを調製した。具体的には、凍結粉末状の卵巣
１ｇに対しキット中のＬｙｓｉｓ溶液１０mlを加えＤｏ
ｕｎｃｅ Ｈｏｎｍｏｇｅｎｉｚｅｒでホモジナイズ
（１０−１２ストローク）する。これをさらに１８Ｇの
注射筒を通過させた後４５℃で２時間ゆっくりと振盪さ
せる。インキュベーション終了後４０００×ｇ，１０分
間遠心し、沈殿をとらないように注意して上清を回収す
る。この上清に０．５Ｍとなるように５Ｍ ＮａＣｌ溶
液を加え、混合後生じた白沈殿を２１Ｇの注射筒に通し
て切断する。これに、別途にキット内のＢｉｎｄｉｎｇ
溶液で調製してあるオリゴｄＴセルロース５０mgを加え
室温で１時間転倒混和して反応させる。反応終了後２０
００×ｇ，１０分間遠心しオリゴｄＴセルロースを回収
する。このセルロースペレットを再度２０mlのＢｉｎｄ
ｉｎｇ溶液に懸濁させて洗う。この操作を３回繰り返し
てオリゴｄＴセルロースを洗浄する。こうして洗浄の終
了したセルロースをキットについているスピンオカラム
につめる。このスピンオカラムにつめた段階でさらにＢ
ｉｎｄｉｎｇ溶液で洗い、スピンカラムを２０００×
ｇ，１０秒間遠心し回収溶液のＯＤ₂₈₀ が０．０５以下
になるまで繰り返し洗う。洗浄終了後Ｂｉｎｄｉｎｇ溶
液を遠心除去し、キット内の溶出溶液０．２mlを加えて
セルロースペレットを十分に懸濁させる。２０００×
ｇ，１０秒間遠心し溶出液を回収する、再びこのセルロ
ースペレットに０．１５mlの溶出溶液を加え再度懸濁後
２０００×ｇ，１分間遠心して完全に溶出液をセルロー
スペレットより回収する。この２回の溶出操作で０．３
５mlの回収液が得られる。これにキットについている２
Ｍ酢酸ナトリウム溶液を０．１５容加え、さらに１００
％エタノールを２．５容追加して混合後、−７０℃に凍
るまで放置する。凍結後１６０００×ｇ，１５分間遠心
しｍＲＮＡを回収する。冷７０％エタノールで２回ｍＲ
ＮＡペレットを洗浄、真空エバポレーターで乾燥させた
後、適当量の滅菌水に溶解する。一部を適当に希釈して
ＯＤ_320-230 間のスキャンニングを行ないＯＤ₂₆₀ の吸
光度値よりｍＲＮＡ量を算出する。こうして１ｇの卵巣
より７．７μｇのｍＲＮＡを精製した。取り扱う試薬、
器具等はすべてＲＮａｓｅによる分解を防ぐための処理
を施しておいた。

【００３３】次に、得られたｍＲＮＡを市販の Gubler
& Hoffman 法に基づいたｃＤＮＡ合成キット（Pharmaci
a Oligo-dT）を用いて、メーカーの指示に従ってｃＤＮ
Ａに変換し、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。具体的に
は、ｍＲＮＡ１μｇをｄＴプライマー０．５μｇと混合
後７０℃、５分間インキュベートし、その後室温に戻し
これにキットのファーストストランド合成試薬（ファー
ストストランドバッファー，ジチオスレイトール溶液，
デオキシヌクレオシド三リン酸混液，リボヌクレアーゼ
インヒビター溶液，ピロリン酸ナトリウム溶液，ＡＭＶ
逆転写酵素）を加え、４２℃，１時間反応した。次にキ
ットのセカンドストランド合成試薬（セカンドストラン
ドバッファー，ジチオスレイトール，ＮＡＤ溶液，ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ，ＲＮａｓｅＨ，リガーゼ）を追加し
て１４℃，２時間反応させた。反応終了後、７０℃，１
０分間の加温処理をした後、氷冷しさらにこれにＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩを加え３７℃，１０分間反応させ、
０．２Ｍ ＥＤＴＡで反応を終了させた。こうして作製
したｃＤＮＡを次のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用す
る。

【００３４】得られた鋳型ＤＮＡを増幅するために、市
販のＰＣＲキット試薬（GeneAmp DNA Amplification Re
agent Kit, Perkin Elmer Cetus ）及びＰＣＲ自動化装
置（DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer Cetus）を用い
て、メーカーの指示に従ってＰＣＲ反応を実施した。反
応条件は次のとおりである。１）熱変性ステップ：９４
℃，１分間、２）プライマーのアニーリングステップ：
６０℃，２分間、３）プライマーの伸長ステップ：７２
℃，３分間から成る３つのステップを１サイクルとして
合計３０サイクル行った後、７２℃，７分間のプライマ
ーの伸長ステップを１回行って１ラウンドのＰＣＲを終
了した。

【００３５】このとき使用したプライマーは、マウス卵
透明帯由来ＭＺＰ−３（M. J. Chamberlinら(1988) De
v. Biol. 127, 287〜295 ）及びヒト卵透明帯由来Ｈ
ＺＰ−３（M. E. ChamberlinとJ. Dean (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87, 6014〜6018）の遺伝子配列か
ら推定した、 プライマー１：５’ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡ
ＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴ３’ プライマー２：５’ＡＧＧＡＡ［Ｇ，Ｔ］ＡＴＣＡＧ
［Ｇ，Ｔ］ＧＧＣＣＣ［Ｃ，Ｔ］ＡＣ［Ｇ，Ａ］ＧＴＧ
ＡＣＡＴＣ［Ｔ，Ａ］ＧＣＴＴＣ３’ （但し、［］はミックスを表わす。）である。

【００３６】増幅生成物を、０．８％アガロースゲル電
気泳動に掛け、エチジウムブロマイド染色により約８０
０ bp 程度のDNA が増幅されているのを確認した。この
ＤＮＡをゲルから市販のＤＮＡ抽出キット（GENECLEAN
II, BIO101）を用いて、メーカーの指示に従って精製
し、市販のベクターへサブクローニングを行なった。

【００３７】ＰＺＰ−３ ｃＤＮＡの配列決定 得られたｃＤＮＡを DNA Blunting Kit （TAKARA）を用
いて、メーカーの指示に従って平滑末端化し、ＤＮＡラ
イゲーションキット（TAKARA）を用いてｐＵＣ１１９ベ
クターのＳｍａＩ部位に連結した。その後、コンピテン
トセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに常法に従って形質転換
した。形質転換株を、２０μｇ／mlのＸｇａｌ，１００
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレートに播いて
増えてきた白色のコロニーを拾い上げた後、培養培地
（アピシリン−LB培地）中で小スケール培養を行った。

【００３８】市販のプラスミド調製用キット（QIAGEN H
i Purity Plasmid Kit, QIAGEN）を用いて、メーカーの
指示に従ってプラスミドを回収し、常用の二本鎖ＤＮＡ
シークエンス法に従ってアルカリ変性処理を行った後、
ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキット（SEQU
ENSE VERSION 2.07-deaza-dGTP Kit, USB ）を用いてＰ
ＺＰ−３ ｃＤＮＡの塩基配列及び推定アミノ酸配列を
決定した。決定されたこれらの配列はともに、配列表中
配列番号１として示した。得られたＰＺＰ−３遺伝子
は、２５８アミノ酸をコードする７７４ bp のヌクレオ
チド配列を構成するものであった。

【００３９】

【発明の効果】ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３蛋白質の部分ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現させて得られ
るＰＺＰ−３関連組換えペプチドは、ブタ避妊又は不妊
用のワクチン抗原として有用である。また、他の哺乳動
物の卵透明帯ＺＰ−３蛋白質と相同なアミノ酸配列を該
ワクチン抗原として用いる場合には、ブタ以外の哺乳動
物の避妊又は不妊も可能となろう。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７７４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起 源： 生物名：雌ブタ 組織の種類：卵巣 配列： GAT GCC CTG GTG TAC AGC ACC TTC CTG CGC CAT GAC CCC CGC CCT GCA 48 Asp Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Arg His Asp Pro Arg Pro Ala 1 5 10 15 GGA AAC CTG TCC ATC CTG AGG ACG AAC CGT GCG GAG GTC CCC ATC GAG 96 Gly Asn Leu Ser Ile Leu Arg Thr Asn Arg Ala Glu Val Pro Ile Glu 20 25 30 TGT CAC TAC CCC AGG CAG GGC AAC GTG AGC AGC TGG GCC ATC CTG CCC 144 Cys His Tyr Pro Arg Gln Gly Asn Val Ser Ser Trp Ala Ile Leu Pro 35 40 45 ACC TGG GTG CCC TTC AGG ACC ACT GGT GTC TCC GAG GAG AAG CTG GTG 192 Thr Trp Val Pro Phe Arg Thr Thr Gly Val Ser Glu Glu Lys Leu Val 50 55 60 TTC TCT CTG CGC CTG ATG GAG GAA AAC TGG AGC GCC GAG AAG ATG ACG 240 Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu Asn Trp Ser Ala Glu Lys Met Thr 65 70 75 80 CCC ACC TTC CAG CTG GCG GAC AGA GCC CAC CTC CAG GCC CAA GTC CAC 288 Pro Thr Phe Gln Leu Ala Asp Arg Ala His Leu Gln Ala Gln Val His 85 90 95 ACC GGC AGC CAC GTG CCA CTG AGG CTG TTT GTG GAC CAC TGT GTG GCC 336 Thr Gly Ser His Val Pro Leu Arg Leu Phe Val Asp His Cys Val Ala 100 105 110 ACG CTG ACG CCG GAC TGG AAC ACC TCC CCC TCT CAC ACC ATC GTG GAC 384 Thr Leu Thr Pro Asp Trp Asn Thr Ser Pro Ser His Thr Ile Val Asp 115 120 125 TTC CAC GGC TGT CTC GTG GAC GGT CTC ACT GAG GCC TCA TCT GCT TTC 432 Phe His Gly Cys Leu Val Asp Gly Leu Thr Glu Ala Ser Ser Ala Phe 130 135 140 AAA GCA CCT AGA CCT GGA CCA GAG ACG CTC CAG TTC ACC GTG GAT GTG 480 Lys Ala Pro Arg Pro Gly Pro Glu Thr Leu Gln Phe Thr Val Asp Val 145 150 155 160 TTC CAT TTT GCT AAT GAT TCC AGA AAC ACG ATC TAC ATC ACC TGC CAT 528 Phe His Phe Ala Asn Asp Ser Arg Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Cys His 165 170 175 CTG AAG GTC ACT CCG GCT GAC CGA GTC CCG GAC CAA CTC AAC AAA GCC 576 Leu Lys Val Thr Pro Ala Asp Arg Val Pro Asp Gln Leu Asn Lys Ala 180 185 190 TGT TCC TTC AGC AAG TCC TCC AAC AGG TGG TCC CCG GTG GAA GGG CCT 624 Cys Ser Phe Ser Lys Ser Ser Asn Arg Trp Ser Pro Val Glu Gly Pro 195 200 205 GCT GTT ATC TGT CGT TGC TGT CAC AAG GGG CAG TGT GGT ACC CCA AGC 672 Ala Val Ile Cys Arg Cys Cys His Lys Gly Gln Cys Gly Thr Pro Ser 210 215 220 CTT TCC AGG AAG CTG TCT ATG CCG AAG AGA CAG TCT GCT CCC CGC AGT 720 Leu Ser Arg Lys Leu Ser Met Pro Lys Arg Gln Ser Ala Pro Arg Ser 225 230 235 240 CGC AGG CAC GTG ACA GAT GAA GCA GAT GTC ACT GTA GGG CCA CTG ATA 768 Arg Arg His Val Thr Asp Glu Ala Asp Val Thr Val Gly Pro Leu Ile 245 250 255 TTC CTG 774 Phe Leu

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、遺伝子工学手法により決定されたマ
ウス及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比
較を示す。

【図２】この図は、遺伝子工学手法により決定されたマ
ウス及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列（図
１の配列の続き）の比較を示す。

【図３】この図は、遺伝子工学手法により決定されたマ
ウス及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列（図
２の配列の続き）の比較を示す。

【図４】この図は、遺伝子工学手法により決定されたヒ
ト及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比較
を示す。

【図５】この図は、遺伝子工学手法により決定されたヒ
ト及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列（図４
の配列の続き）の比較を示す。

【図６】この図は、遺伝子工学手法により決定されたヒ
ト及びブタ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列（図５
の配列の続き）の比較を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表わされる、ブタ卵透明帯
   ＰＺＰ−３蛋白質の部分アミノ酸配列の全部又は一部を
   コードする塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記塩基配列が、配列番号１で表わされ
   る塩基配列の全部又は一部である請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列番号１で表わされる、ブタ卵透明帯
   ＰＺＰ−３蛋白質の部分アミノ酸配列の全部又は一部を
   含む組換えペプチドの製造方法であって、請求項１又は
   ２記載のＤＮＡを複製可能な適切な発現ベクターに組み
   込み、得られた発現ベクターで適切な宿主を形質転換
   し、得られた形質転換体を適切な培地中で培養し、前記
   ＤＮＡを発現させ、及び得られた組換えペプチドを回収
   する、ことを包含する方法。