JP2006298869A - 抗8−ニトロサイクリックグアノシン3’,5’−一リン酸抗体 - Google Patents
抗8−ニトロサイクリックグアノシン3’,5’−一リン酸抗体 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 下記の式で表される8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸を認識する抗体、及び8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸を認識する抗体の製造のために用いる抗原であって、8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸の糖部分の水酸基と血清蛋白質とが炭素鎖を介して結合した抗原。
【化1】
Description
なお、8ーニトログアニンを認識する抗体及びその製造方法が知られているが(WO 03/99869)、この抗体は8-ニトロcGMPを認識するものではない。
さらに、上記抗原を用いて哺乳類動物を免疫する工程を含む上記抗体の製造方法が本発明により提供される。
例1:8-ニトロcGMPのサクシニル化
MS (ESI, negative):計算値 C14H15N6O12P([M-H]-): 489.04、実測値489.74
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ: 2.50-2.67 (4H, m), 4.09 (1H, ddd, J= 4.6, 9.5 Hz), 4.27 (1H, t, J= 9.5 Hz), 4.49 (1H, m), 5.21 (1H, dd, J= 5.9, 9.5 Hz), 5.93 (1H, d, J= 5.9 Hz), 6.49(1H, s), 7.11(2H, br s), 11.4(1H,s)
0.1 M 2-(n-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES;同仁化学製)(pH 5.5)に溶解した 10 mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA, Sigma社)及び4.7 mg/mlの2'-サクシニル-8-ニトロcGMPをそれぞれ300μl混合した溶液に10 mg/mlの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)(WSC;同仁化学製) 150μlを添加し、遮光して攪拌しながら室温で16時間反応後、15,000 ×g、4℃、10分間遠心し上清を回収した。回収した上清をPBSにて4℃で一晩透析を行った。得られた8-ニトロcGMP-BSAをBCA 法にて蛋白定量し、抗原とした。
8-ニトロcGMP-BSAを蛋白濃度として1 mg/mlなるようにPBSに溶解した。この溶液1 mlを注射器にとり、フロイント完全アジュバント 1mlを更にとり、別の注射器と連結させ、これを交互に動かすことによりエマルジョンを作製した。抗体作製用の動物として日本白色種ウサギ2羽を採用し、当該ウサギの背部皮下に数カ所、このエマルジョンを注射した(初回免疫)。2週間後、同じく前記例1の抗原を1mg/mlとなるようにPBSに溶解させたもの1mlとフロイント不完全アジュバント 1 mlとを用い、前記のように注射器を交互に動かすことによってエマルジョンを作製し、これを注射し、追加免疫とした。この追加免疫を2週間ごとに繰り返した。2回免疫及び3回免疫の各1週間後に少量採血し、抗体の産生を8-ニトロcGMP-BSAに対して抗体が反応するかをドットブロッティング法によって確認した。初回免疫から追加免疫までの間隔、追加免疫と追加免疫との間隔は、この実施例においては共に2週間としたが、このような間隔で追加免疫を行うことに限定されるものではない。ただし、初回免疫は、抗体を産出させるためのものであり、通常、最初に抗原を注射してから4から5日で抗体が血中に現れ、次第に量が増大して10日前後にピークとなることから、初回免疫から最初の追加免疫までは2週間以上おくことが好ましい。また、追加免疫は、前記抗体をたくさん作らせるために行うものであるが、追加免疫後、すぐには抗体は増加しないので、追加免疫後1週間おいてから採血し、採血後1週間おいてから次回の追加免疫を行うこととした。
前記のように免疫した日本白色種ウサギの血液から本発明のポリクローナル抗体を得る工程は以下のように行った。まず日本白色種ウサギの心臓より大量採血を行い、37℃で1時間保温した後、4℃で一晩静置した。これを毎分3,000回転で10分間遠心し、上清を得た。その後以下に述べるアフィニティカラムを用いて抗体を精製した。
8-ニトロcGMPを認識する抗体(以下、「抗8-ニトロcGMP抗体」と呼ぶことがある。)が生成していることの証明としてcGMP-BSA、8-ニトロcGMP-BSAを抗原としたドットブロッティングを行った。すなわち、抗原タンパク質としてcGMP-BSA 0.3μg/drop もしくは8-ニトロcGMP-BSA 0.3μg/dropをポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜(Millipore社製)に吸着させ、5% スキムミルク(Becton Dickinson社)、0.1% Tween20、 0.9% NaCl、100 mM Tris-HCl(pH 7.5)(以下ブロッキングバッファー)を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。続いて、ブロッキングバッファーで1μg/mlに希釈した抗8-ニトロcGMP抗体1mlと4℃で一晩反応した。反応後、ブロッキングバッファーで3回洗浄し、同バッファーで3,000倍希釈したHRP標識抗ウサギヤギ抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)と室温で1時間反応した後、膜をブロッキングバッファーで2回、さらに0.1% Tween20、 0.9% NaCl、100 mM Tris-HCl(pH 7.5)で回洗浄した。検出はECL plus Western Blotting Detection System(Amersham Biosciences社製)を用いた化学発光法により行い、Hyperfilm ECL(Amersham Biosciences社製)に2秒間露光した。フィルムはFPM800A(FUJI FILM社製)にて現像した。結果を図1に示す。精製した抗体が8-ニトロcGMPのみを特異的に認識する抗体であることが確認できた。
例1で得た抗原を1mg/mlとなるようにPBSに溶解させた。この溶液150μlと生理食塩水350μlを注射器にとり、フロイント完全アジュバント 500μlを更にとり、別の注射器と連結させ、これを交互に動かすことによりエマルジョンを作製した。抗体作製用の動物として雌5週齢BALB/cマウス3匹を採用し、当該マウスの背部皮内に数カ所、このエマルジョンを注射した(初回免疫)。3週間後、同抗原を1mg/ml、90μl、生理食塩水410μlとフロイント不完全アジュバント 500μlとを用い、前記のように注射器を交互に動かすことによってエマルジョンを作製し、これを注射し、追加免疫とした。この追加免疫を1週間ごとに繰り返した。初回免疫から7週間後にマウス尾部より少量採血し、抗体の産生を8-ニトロcGMP-BSAに対するELISA法によって確認した。初回免疫から追加免疫までの間隔、追加免疫と追加免疫との間隔は、この実施例においては、2週間、1週間としたが、このような間隔で追加免疫を行うことに限定されるものではない。
8-ニトロcGMP-BSA、cGMP-BSA又は8-ニトログアノシン-BSAをそれぞれ50 mM 炭酸塩緩衝液(pH 9.7)に溶解して各5μg/mlとし、これらの溶液を0.1 mlずつ96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、室温で1時間静置して固相化した。0.05% Tween 20を含むPBS(PBS-T)0.4 mlで3回洗浄した後、各ウェルに0.5% gelatinを含む50 mM 炭酸塩緩衝液(pH 9.7)0.2 mlを加え室温で1時間静置し、以後の非特異的な吸着を防ぐためにブロックした。各ウェルをPBS-Tで3回洗浄後、抗8-ニトロcGMP抗体産生細胞培養上清0.1 mlを加え室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄し、HRP標識抗マウスヤギIgG抗体をPBS-Tで5,000倍希釈したもの0.1 mlを加えてさらに1時間静置した後、ウェルをPBS-Tで4回洗浄し、過酸化水素水0.6μlを含む1,2-フェニレンジアミン(0.55 mg/ml) 0.1 mlで発色させた。0.1 mlの1 mol/l 硫酸で発色を停止し、490 nmの吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。
次に競合ELISA法を用いて本抗体の認識構造(エピトープ)が8-ニトロcGMPであることを8-ニトロcGMPの類縁体との交差反応により検討した。競合ELISA法では被検物質を蛋白質に固相化する必要がなく、低分子の被検物質をそのままELISA系に添加することで抗原抗体反応の有無を検出できため、通常は蛋白質に結合することが難しい核酸塩基構造だけでも検討することができ、より詳細な類似構造への交差反応の有無が検出できる。被検物質としては8-ニトロcGMPのほか、cAMP、ニトロキサンチン、グアノシン、8-ニトログアノシンを競合物質として用いた。
Claims (8)
- 下記の式で表される8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸を認識する抗体。
- ポリクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の抗体を用いて試料に含まれる8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸を酵素免疫学的に測定する方法。
- 8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸を認識する抗体の製造のために用いる抗原であって、8-ニトロサイクリックグアノシン3',5'-一リン酸の糖部分の水酸基と血清蛋白質とが炭素鎖を介して結合した抗原。
- 血清蛋白質がアルブミンである請求項5に記載の抗体。
- 血清蛋白質がウシ血清アルブミンである請求項6に記載の抗体。
- 請求項5ないし7のいずれか1項に記載の抗原を用いて哺乳類動物を免疫する工程を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の抗体を製造する方法。
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WO2003099869A1 (fr) * | 2002-05-28 | 2003-12-04 | Dojindo Laboratories Co., Ltd. | Anticorps capable de reconnaitre la 8-nitroguanine |
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