CN1852924A - Pan－kir2dl nk－受体的抗体及其在诊断及治疗中的应用 - Google Patents

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CN1852924A CN 200480024006 CN200480024006A CN1852924A CN 1852924 A CN1852924 A CN 1852924A CN 200480024006 CN200480024006 CN 200480024006 CN 200480024006 A CN200480024006 A CN 200480024006A CN 1852924 A CN1852924 A CN 1852924A
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阿莱斯山德罗·莫雷塔
马里耶拉·德拉基耶萨
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Universita degli Studi di Genova
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Abstract

本发明涉及用于调节受治疗者的免疫应答的新颖组合物和方法。更具体地说，本发明涉及特异性抗体在哺乳动物受治疗者体内调节NK细胞活性并允许增强NK细胞的细胞毒性。本发明还涉及这类抗体的片段和衍生物、以及包括这类抗体的片段和衍生物的药物组合物和它们的应用，尤其是在治疗中的应用，以增加在受治疗者体内的NK细胞活性或细胞毒性。

Description

PAN-KIR2DL NK-受体的抗体 及其在诊断及治疗中的应用
技术领域
本发明涉及抗体、抗体片段、及其衍生物，它们与存在于NK细胞的细胞表面上的两种或更多种抑制性受体进行交叉反应并增强哺乳动物受治疗者中或生物样品中的NK细胞的细胞毒性。本发明还涉及制备这样的抗体、片段、变异体、以及衍生物的方法；包括这样的抗体、片段、变异体、以及衍生物的药物组合物、以及这样的分子和组合物的应用，尤其在治疗中，以增加受治疗者的NK细胞活性或细胞毒性。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞的亚群，涉及非常规型免疫。NK细胞可以通过本领域熟知的各种技术获得，如从血液样品、细胞单采术、收集等。
NK细胞的特性和生物性能包括：表达包括CD16、CD56、和/或CD57的表面抗原；在细胞表面上缺少α/β或γ/δTCR复合物；通过激活特异性细胞溶解酶以便结合于并杀伤未能表达“自体”MHC/HLA抗原的细胞的能力；杀伤表达NK活化受体-配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力；释放刺激或抑制免疫应答的细胞因子的能力；以及经历多回细胞分裂并产生和亲代细胞具有类似的生物性能的子代细胞的能力。在本发明的上下文中，“活性”NK细胞是指生物活性NK细胞，更具体地说，是指能够溶解靶细胞的NK细胞。例如，“活性”NK细胞能够杀伤表达NK活化受体-配体并未能表达“自体”MHC/HLA抗原(KIR-不相容细胞)的细胞。
基于它们的生物性能，在本领域已经提出各种依赖于NK细胞调节的治疗和疫苗方案。然而，NK细胞活性是通过复杂的机制加以调节的，该机制涉及刺激性和抑制性信号。因此，有效的NK细胞介导治疗可能需要刺激这些细胞以及中和抑制性信号。
NK细胞通过主要组织相容性复合物(MHC)类型I特异抑制性受体进行负调节(Krre et al.，1986；hlén et al.，1989)。这些特异性受体与其它细胞上存在的MHC类型I分子或HLA的多态决定簇相结合，并且抑制NK细胞溶解。在人类中，称作杀伤Ig样受体(KIR)的受体家族的一些成员可识别HLA类型I等位基因组。
KIR是存在于淋巴细胞的一些子集的较大的受体家族，其包括NK细胞。用于KIRs的术语是基于细胞外结构域的数目(KIR2D或KIR3D)以及细胞质尾是否是较长的(KIR2DL或KIR3DL)或较短的(KIR2DS或KIR3DS)。在人类中，单一个体所存在的NK群内，存在或缺少一个给定的KIR从一个NK细胞到另一个NK细胞是不同的。在人类种群中，还存在相对较高水平的KIR分子的多态性，其中一些KIR分子存在于某些个体中，但不是存在于所有个体中。当结合于适当配体时，一些KIR基因产物会刺激淋巴细胞活性。已证实的刺激性KIR都具有较短的细胞质尾，并具有带电荷的跨膜残基，它与具有免疫刺激基序(immunostimulatory motif，ITAM)的适配子分子相关联。其它KIR基因产物就性质上来说是抑制性的。所有证实的抑制性KIRs都具有较长的细胞质尾，并且似乎与取决于KIR亚型的HLA抗原的不同子集相互作用。抑制性KIRs在它们的胞质内部分呈现一种或几种募集磷酸酶的抑制性基序。已知的抑制性KIR受体包括KIR2DL和KIR3DL亚家族的成员。具有两个Ig结构域的KIR受体(KIR2D)确定(鉴定)HLA-C同种异型：KIR2DL2(以前称为p58.2)或紧密相关的基因产物KIR2DL3识别由组2HLA-C同种异型(Cw1、3、7、以及8)共有的抗原决定部位；而KIR2DL1(p58.1)识别由互补组1 HLA-C同种异型(Cw2、4、5、以及6)共有的抗原决定部位。由KIR2DL1的识别取决于在HLA-C等位基因的第80位存在赖氨酸(Lys)残基。KIR2DL2和KIR2DL3识别取决于在第80位存在天冬酰胺(Asn)残基。重要的是，大多数HLA-C等位基因在第80位具有天冬酰胺或赖氨酸残基。一个具有三个Ig结构域的KIR，KIR3DL1(p70)，可识别由HLA-Bw4等位基因共有的抗原决定部位。最后，具有三个Ig结构域的分子的同型二聚体KIR3DL2(p140)可识别HLA-A3和HLA-A11。
虽然抑制性KIRs和其它类型I抑制性受体(Moretta et al，1997；Valiante et al，1997a；Lanier，1998)可以由NK细胞共表达，但在任何给定个体的NK表达谱(repertoire)中都存在表达单一KIR的细胞，因而，相应的NK细胞仅被表达特异性类型I等位基因组的细胞阻断。
KIR错配的NK细胞群或克隆，即，表达KIR(其不相容于宿主的HLA分子)的NK细胞群已表明是在异基因(同种异体)移植中看到的移植物抗白血病效应的最有可能的介体(Ruggeri et al.，2002)。在给定个体中再现这种效应的一种方法是使用阻断KIR/HLA相互作用的试剂。
对于KIR2DL1特异的单克隆抗体已经表明可以阻断KIR2DL1与Cw4(或类似物)等位基因的相互作用(Moretta et al.，1993)。针对KIR2DL2/3的单克隆抗体也已有描述，其阻断KIR2DL2/3与HLACw3(或类似物)等位基因的相互作用(Moretta et al.，1993)。然而，在临床状况下使用这样的试剂将需要开发两种治疗性单克隆抗体(mAb)以治疗所有患者，而不管任何给定患者是否表达类型1或类型2HLA-C等位基因。此外，人们在决定使用哪一种治疗性抗体之前，必须预先确定每位患者正在表达哪一种HLA型，因而导致了高得多的治疗成本。
Watzl et al.， Tissue Antigens，56，p.240(2000)制备了识别KIR的多个同种型的交叉反应抗体，但那些抗体并不呈现NK细胞活性的增强。G.M.Spaggiara et al.， Blood，100，pp.4098-4107(2002)利用多种针对各种KIR的单克隆抗体进行了实验。据说，那些抗体之一，NKVSF1，可以识别CD158a(KIR2DLA)、CD158b(KIR2DL2)以及p50.3(KIR2DS4)的共同抗原决定部位。它未提示NKVSF1可以增强NK细胞活性，并且也未提示它可以用作治疗药剂。因此，迄今在本领域还未获得调节NK细胞活性的实用和有效的方案，因而仍然需要使用特异性试剂的HLA等位基因特异性干预。
发明内容
现在本发明提供了新颖的抗体、组合物、以及方法，它们可以克服目前在NK细胞激活中遇到的困难，并且提供另外的有利特点和益处。在一个典型方面，本发明提供了单一抗体，该抗体在几乎所有人类中有助于人NK细胞的激活。更具体地说，本发明提供了新颖的特异性抗体，这些抗体与各种抑制性KIR组进行交叉反应并中和它们的抑制性信号，从而导致在表达这样的抑制性KIR受体的NK细胞中增强NK细胞的细胞毒性。与多种KIR基因产物进行交叉反应的能力使得本发明的抗体能够有效地用来在大多数的人类受治疗者中增加NK细胞活性，而没有预先确定受治疗者的HLA类型的负担或费用。
在第一个方面，本发明提供了抗体、抗体片段、及其任何一种的衍生物，其中所述抗体、片段、或衍生物与在NK细胞表面上的至少两种抑制性KIR受体进行交叉反应，中和NK细胞的抑制性信号，以及增强NK细胞的活性。更优选地，该抗体与人KIR2DL受体的共同决定簇相结合。甚至更准确地说，本发明的抗体与至少KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3受体结合。对本发明目的而言，术语“KIR2DL2/3”是指KIR2DL2和KIR2DL3受体的任何一种或两者。这两种受体具有非常高的同源性，大概是相同基因的等位基因形式，并且在本技术领域被认为是可互换的。因此，对本发明目的而言，KIR2DL2/3被认为是单一抑制性KIR分子，因此仅与KIR2DL2和KIR2DL3并且不与其它抑制性KIR受体进行交叉反应的抗体不在本发明的范围内。
本发明的抗体特异性地抑制MHC或HLA分子与至少两种抑制性KIR受体结合，并有助于NK细胞活性。如在本文中所使用的，两种活性都是用术语“中和KIR的抑制性活性”来表示。在本发明的上下文中，本发明的抗体的下述能力，即“有助于NK细胞活性”、“有助于NK细胞的细胞毒性”、“有助于NK细胞”、“增强NK细胞活性”、“增强NK细胞的细胞毒性”、或“增强NK细胞”，是指抗体允许NK细胞在其表面上表达抑制性KIR受体以便能够溶解在其表面上表达特定抑制性KIR受体(例如，特定HLA抗原)的相应配体的细胞。在一个特定方面，本发明提供了一种抗体，该抗体特异性地抑制HLA-C分子与KIR2DL1和KIR2DL2/3受体结合。在另一个特定方面，本发明提供了一种有助于体内NK细胞活性的抗体。
因为KIR2DL1或KIR2DL2/3至少之一存在于至少约90％的人群中，所以本发明的更优选的抗体能够有助于针对大多数HLA-C同种异型相关细胞的NK细胞活性，分别为组1HLA-C同种异型和组2HLA-C同种异型的NK细胞活性。因而，本发明的组合物可以用来有效地激活或增强在大多数人类个体中(通常在约90％或更多的人类个体中)的NK细胞。因此，根据本发明的单一抗体组合物可以用来治疗大多数的人类受治疗者，并且很少需要确定等位基因组或使用抗体混合剂。
本发明首次表明，可以产生针对抑制性KIR的交叉反应以及中和抗体，并且这样的抗体使得能够在广泛的人类族群的范围内有效激活NK细胞。
因而本发明的一个特定目的涉及一种抗体，其中所述抗体特异性地与KIR2DL1和KIR2DL2/3人受体结合，并且逆转由这些KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。在一种具体实施方式中，该抗体与由杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200进行竞争。可选地，所述与抗体DF200竞争的抗体不是抗体DF200本身。
在另一种具体实施方式中，该抗体与单克隆抗体NKVSF1竞争，可选地其中与抗体NKVSF1竞争的抗体不是抗体NKVSF1。
在另一种具体实施方式中，该抗体与抗体1-7F9竞争。
优选地，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。
在针对特定单克隆抗体(例如，DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)时，术语“与其竞争”是指在使用重组体KIR分子或表面表达的KIR分子的结合测定中，抗体与该单克隆抗体(例如，DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)相竞争。例如，如果在结合测定中一抗体减少DF200与KIR分子的结合，那么该抗体与DF200“相竞争”。和DF200“相竞争”的抗体可以与DF200相竞争，以便结合于KIR2DL1人受体、KiR2DL2/3人受体、或KIR2DL1及KIR2DL2/3人受体。
在一优选的具体实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体结合KIR2DL1及KIR2DL2/3人受体，逆转由这些KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，并且与DF200、1-7F9、或NKVSF1竞争结合于KIR2DL1人受体、KIR2DL2/3人受体、或KIR2DL1和KIR2DL2/3人受体。可选地，所述抗体不是NKVSF1。所述抗体可任选为嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与KIR2DL1及KIR2DL2/3人受体结合，逆转由这些KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制，并且与EB6竞争结合于KIR2DL1人受体，与GL183竞争结合于KIR2DL2/3人受体，或与EB6竞争结合于KIR2DL1人受体以及与GL183竞争结合于KIR2DL2/3人受体。可选地，所述抗体不是NKVSF1；可选地，所述抗体不是DF200。所述抗体可任选为嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
在一有利的方面，本发明提供了一种抗体，该抗体与DF200竞争并且对与单克隆抗体DF200实质上或本质上相同、或完全相同的在KIR分子上的抗原决定部分或“抗原决定位点”进行识别、相结合或具有免疫特异性。优选地，所述KIR分子是KIR2DL1人受体或KIR2DL2/3人受体。
本发明的一个特定目的涉及一种抗体，其中所述抗体与存在于KIR2DL1及KIR2DL2/3人受体中的共同决定簇结合，并逆转由这些KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。该抗体更特异性地结合在KIR的抗原决定部位上，它与单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生)或抗体NKVSF1(由杂交瘤NKVSF1产生)实质上相同，其中该抗体不是NKVSF1。
在一优选的具体实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的最优选的抗体是由杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200。
产生抗体DF200的杂交瘤已保藏在CNCM培养物保藏中心(CNCM culture collection)，识别号(Identification no.)为“DF200”，登记号为CNCM I-3224，于2004年6月10日登记，CollectionNationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur，25，Rue duDocteur Roux，F-75724 Paris Cedex 15，France。抗体NKVSF1可获自Serotec(Cergy Sainte-Christophe，France)，目录参考号MCA2243。在本文中NKVSF1还称作pan2D单克隆抗体(pan2D mAb)。
本发明还提供了本文中所描述的抗体的功能性片段和衍生物，其具有实质上类似的抗原特异性和活性(例如，其可以与亲代抗体进行交叉反应并且其增强表达抑制性KIR受体的NK细胞的细胞毒活性)，包括但不限于Fab片段、Fab’2片段、免疫粘附素、双功能抗体(diabody)、CDR、以及ScFv。而且，本发明的抗体可以是人源化抗体、人抗体、或嵌合抗体。
本发明还提供了包括本发明抗体的抗体衍生物，其共轭或共价结合于毒素、放射性核素、可检测部分(detectable moiety)(例如，荧光体)、或固相支撑体。
本发明还提供了药物组合物，这些组合物包括如上所披露的抗体、其片段、或抗体或其片段的衍生物。因此，本发明还涉及如在本文中所披露的抗体在制药方法中的应用。在优选的具体实施方式中，所述药剂或药物组合物是用于治疗癌症或其它增生性病症、感染，或用于移植。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种组合物，包括与至少两个不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体，其中所述抗体在表达至少所述两个不同的人抑制性KIR受体之一的NK细胞上能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，其中所述抗体被结合到脂质体之中。可选地，所述组合物包括一种另外的物质，该物质选自：递送用于基因治疗的基因核酸分子；递送用于抑制NK细胞中的基因的反义RNA、RNAi、或siRNA的核酸分子；或用于靶向杀伤另外被结合到所述脂质体之中的NK细胞的毒素或药物。
本发明还提供了在体外、活体外、或体内调节人NK细胞活性的方法，包括用有效量的本发明的抗体、这样的抗体的片段、其任何一种的衍生物、或包括至少任何上述之一的药物组合物与人NK细胞相接触。优选的方法包括给予有效量的本发明的药物组合物，最优选的是在活体外或体内，并且目的在于在受治疗者体内增加人NK细胞的细胞毒活性，其中所述受治疗者患有癌症、传染性疾病、或免疫性疾病。
在另外的方面，本发明提供了一种杂交瘤，包括：(a)来自哺乳动物宿主(通常为非人哺乳动物宿主)的B细胞，其已用一种包括存在于抑制性KIR多肽上的抗原决定部位的抗原加以免疫，融合到(b)永生化(终生获得免疫)细胞(例如，骨髓瘤细胞)，其中所述杂交瘤产生单克隆抗体，其结合至少两种不同的人抑制性KIR受体，并且在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体的NK细胞种群中至少实质上能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。可选地，所述杂交瘤并不产生单克隆抗体NKVSF1。优选地，所述抗体结合KIR2DL1及KIR2DL2/3受体。优选地，所述抗体与存在于KIR2DL1及KIR2DL2/3上的共同决定簇相结合。优选地，所述杂交瘤产生一种抑制在第80位具有赖氨酸(Lys)残基的HLA-c等位基因分子与人KIR2DL1受体结合，以及抑制在第80位具有天冬酰胺(Asn)残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体结合的抗体。优选地，所述杂交瘤产生一种与由杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200实质上相同的抗原决定部位结合的、抗原决定部位在KIR2DL1上或在KIR2DL2/3上、或在KIR2DL1和KIR2DL2/3二者上的抗体。这样的杂交瘤的一个实例是DF200。
本发明还提供了产生抗体的方法，该抗体与多种KIR2DL基因产物进行交叉反应，并且中和这样的KIR的抑制活性，所述方法包括以下步骤：
(a)用包括KIR2DL多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；
(b)由所述经免疫的哺乳动物制备抗体，其中所述抗体与所述KIR2DL多肽结合，
(c)选择(b)的与至少两种不同的KIR2DL基因产物进行交叉反应的抗体，以及
(d)选择(c)的增强NK细胞的抗体。在一具体实施方式中，所述非人哺乳动物是一种转基因动物，其经基因工程化来表达人抗体表达谱(例如，包括人免疫球蛋白基因座和天然免疫球蛋白基因缺失的非人哺乳动物，如XenomouseTM(Abgenix-Fremont，CA，USA)，或包括人Ig-编码基因的小基因座的非人哺乳动物，如HuMab-mouseTM(Medarex-Princeton，NJ，USA))。可选地，该方法进一步包括选择一种抗体，该抗体与灵长类，优选为食蟹猴，的NK细胞或KIR多肽结合。可选地，本发明进一步包括评估抗体的方法，其中将根据上述方法制备的抗体给予灵长类，优选为食蟹猴，优选其中食蟹猴是用来观察存在或缺少抗体毒性的指征。
本发明还提供了一种制备与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；
b)由所述经免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，
c)选择(b)的与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物进行交叉反应的抗体，以及
d)选择(c)的能够对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒抑制作用的抗体，其中步骤(c)和(d)的次序可随意颠倒并且任何数目的步骤可随意重复1次或多次。优选地，用于免疫作用的抑制性KIR多肽是KIR2DL多肽，并且在步骤(c)中选择的抗体与至少KIR2DL1和KIR2DL2/3进行交叉反应。优选地，所述抗体识别存在于至少两种不同的KIR受体基因产物上的共同决定簇；最优选地，所述KIR是KIR2DL1和KIR2DL2/3。可选地，所述方法进一步包括选择一种与灵长类，优选为食蟹猴，的NK细胞或KIR多肽结合的抗体。可选地，本发明进一步包括评估抗体的方法，其中将根据上述方法制备的抗体给予灵长类，优选为食蟹猴，优选其中食蟹猴是用来观察存在或缺少抗体毒性的指征。
可选地，在上述方法中，在步骤c)或d)中选择的抗体不是NKVSF1。优选地，在上述方法的步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。优选地，在上述方法的步骤(c)中选择的抗体可抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。优选地，在上述方法的步骤(d)中选择的抗体可增强NK细胞毒性，例如，任何显著的增强，或至少增强5％、10％、20％、30％或更大的NK细胞毒性，例如，至少增强约50％的靶NK细胞毒性(例如，增强至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％(如约65-100％)的NK细胞的细胞毒性)。优选地，该抗体与在KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的单克隆抗体实质上相同的抗原决定部位结合。优选地，所述方法还包括或可替换地包括另外的步骤：制备选定单克隆抗体的片段，制备选定单克隆抗体的衍生物(例如，通过与放射性核素、细胞毒制剂、报道分子(reporter molecule)、或类似物的共轭结合)，或制备抗体片段的衍生物，其中抗体片段产生自或包括与这些单克隆抗体的序列相对应的序列。
本发明进一步提供了一种制备抗体的方法，该抗体与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合，其中所述抗体在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
(a)从文库或表达谱中选择与至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物进行交叉反应的单克隆抗体或抗体片段，以及
(b)选择(a)的能够在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞种群中中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒抑制作用的抗体。优选地，该抗体与存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇结合。可选地，在步骤(b)中选择的所述抗体不是NKVSF1。优选地，在步骤(b)中选择的抗体可抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-c等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。优选地，在步骤(b)中选择的抗体可增强NK细胞毒性，例如，任何显著的增强，或增强至少5％、10％、20％、30％或更大的NK细胞毒性，例如，增强至少约50％的靶NK细胞毒性(例如，增强至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％(如约65-100％)的NK细胞的细胞毒性)。优选地，该抗体结合于与在KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的单克隆抗体DF200实质上相同的抗原决定部位。可选地，该方法包括另外的步骤：制备选定单克隆抗体的片段，制备选定单克隆抗体的衍生物，或制备选定单克隆抗体片段的衍生物。
另外，本发明提供了一种制备与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)在容许产生所述单克隆抗体的条件下培养本发明的杂交瘤；以及
b)由所述杂交瘤分离所述单克隆抗体。可选地，该方法包括另外的步骤：制备所述单克隆抗体的片段，制备单克隆抗体的衍生物，或制备这样的单克隆抗体片段的衍生物。优选地，该抗体与存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇结合。
本发明还提供了制备抗体的方法，该抗体与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合，其中所述抗体在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)由本发明的杂交瘤分离对所述单克隆抗体进行编码的核酸；
b)任选对所述核酸进行的修饰以便获得一个经修饰的核酸，它包括一个序列对经修饰的或衍生的抗体进行编码，该抗体包括对应于单克隆抗体的功能序列或实质上与其类似的氨基酸序列(例如，至少约65％、至少约75％、至少约85％、至少约90、至少约96％(如约70-99％)与这样的序列相同)，选自人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体的免疫反应片段、或包括这样的免疫反应片段的融合蛋白；
c)将所述核酸或修饰的核酸(或相关的为相同的氨基酸序列编码的核酸)插入表达载体中，其中，当所述表达载体存在于在适宜条件下生长的宿主细胞中时，所述编码的抗体或抗体片段能够被表达；
d)用所述表达载体转染宿主细胞，其中所述宿主细胞并不用其它方法产生免疫球蛋白；
e)在引起所述抗体或抗体片段表达的条件下培养所述经转染的宿主细胞；以及
f)分离由所述经转染的宿主细胞产生的抗体或抗体片段。优选地，该抗体与存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇结合。
应当明了，本发明还提供了一种组合物，该组合物包括一种与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体，其中所述抗体在表达所述至少所述两种不同的人抑制性KIR受体之一的NK细胞中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述抗体存在有效量以可检测地增强患者的或包括NK细胞的生物样品的NK细胞的细胞毒性；以及一种可药用的载体或赋形剂。优选地，该抗体与存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇相结合。所述组合物可任选进一步包括第二治疗药剂，其选自，例如，免疫调节剂、激素药物、化疗药物、抗血管形成剂、凋亡剂、结合于并抑制抑制性KIR受体的第二抗体、抗感染药、靶向剂、或附加化合物。有利的免疫调节剂可以选自白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、α-干扰素、β-干扰素、或γ-干扰素。
所述化疗药物的实例包括烷化剂、抗代谢药、细胞毒抗生素、阿霉素、更生霉素、丝裂霉素、洋红霉素(去甲柔红霉素)、道诺霉素、多柔比星(多索鲁比辛)、他莫昔芬、紫杉酚(泰素)、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、噻替派、甲氨蝶呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨基蝶呤、康布瑞塔卡汀(考布他汀)、其它长春花生物碱、以及其衍生物或前药。激素药物的实例包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟他胺、尼鲁地平、环丙孕酮、比卡鲁胺、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、法倔唑、甲羟孕酮(medroxy)、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH促效剂、其它抗雌激素药、其它抗雄激素药、其它芳香酶抑制剂、以及其它孕激素。优选地，所述结合于并抑制抑制性KIR受体的第二抗体是抗体或抗体的衍生物或片段，其结合于不同于由所述抗体结合的抗原决定部位的抑制性KIR受体的抗原决定部位，其中所述抗体与存在于至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物上的共同决定簇相结合。
本发明进一步提供了在有需要的患者体内可检测地增强NK细胞活性的方法，包括将根据本发明的组合物给予所述患者的步骤。需要增强NK细胞活性的患者可以是患有病症或障碍的任何患者，其中这样的增强可以有助于、增强、和/或诱导治疗效应(或在至少相当大比例的患有病症或障碍以及和患者有实质上类似特性的患者中有助于、增强、和/或诱导这样的效应，如可以由例如临床试验所确定的效应)。需要这样的治疗的患者可以患有，例如癌症、另一种增生性病症、传染性疾病或免疫障碍。优选地，所述方法包括将适宜的另外的治疗药剂给予所述患者的另外步骤，其中另外的治疗药剂选自免疫调节剂、激素药物、化疗药物、抗血管形成剂、凋亡剂、结合于并抑制抑制性KIR受体的第二抗体、抗感染药、靶向剂、或附加化合物，其中所述另外的治疗药剂作为连同所述抗体的单剂型或作为分开的剂型给予所述患者。抗体(或抗体片段/衍生物)的剂量和另外的治疗药剂的剂量共同以足以可检测地诱导、帮助、和/或增强患者的包括增强NK细胞活性的治疗反应。在分开给药的情况下，最好是在对患者产生可检测地结合治疗益处的条件下(例如，关于时间、剂量次数等)给予抗体、片段、或衍生物以及另外的治疗药剂。
另外，本发明包括本发明的能够特异性地结合非人灵长类，优选为猴，的NK细胞和/或猴KIR受体的抗体。还包括用于评估本发明的抗体的毒性、剂量和/或活性或效力的方法，其中本发明的抗体是候选药剂。在一个方面，本发明包括一种用于通过将本发明的抗体给予具有NK细胞的非人灵长类受体动物来确定对动物或靶组织有毒的抗体剂量，以及用于评估药剂对动物、或优选对靶组织的任何毒性反应或有害效应或有害反应的方法。在另一个方面，本发明是一种用于通过将本发明的抗体给予具有NK细胞的非人灵长类受体动物来鉴定对动物或靶组织有毒的抗体，以及用于评估药剂对动物、或优选对靶组织的任何毒性反应或有害效应或有害反应的方法。在另一个方面，本发明是一种用于通过将本发明的抗体给予感染的、患病的或癌症的非人灵长类模型来鉴定可有效治疗感染、疾病或肿瘤的抗体，以及用于鉴定可改善感染、疾病或癌症、或其症状的抗体的方法。优选地，本发明的所述抗体是一种(a)与在人NK细胞表面上的至少两种抑制性人KIR受体进行交叉反应，以及(b)与非人灵长类的NK细胞或KIR受体进行交叉反应的抗体。
另外，本发明包括在生物样品或活生物体中检测在它们的细胞表面上带有抑制性KIR的NK细胞存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用本发明的抗体与所述生物样品或活生物体接触，其中所述抗体是共轭或共价结合于可检测的部分；以及
b)在所述生物样品或活生物体中检测所述抗体的存在。
本发明还提供了由在它们的细胞表面上带有抑制性KIR的样品NK细胞进行纯化的方法，该方法包括以下步骤：
a)在使得在它们的细胞表面上带有抑制性KIR的所述NK细胞能够结合于所述抗体的条件下，用本发明的抗体与所述样品接触，其中所述抗体是共轭或共价结合于固相支撑体(例如，珠、基质等)；以及
b)自所述共轭或共价结合于固相支撑体的抗体上洗脱所述结合的NK细包。
在一另外的方面，本发明提供了如图12所示的包括抗体DF200或抗体Pan2D的轻可变区或一个或多个轻可变区CDR的抗体、抗体片段、或其任何一种的衍生物。在又一个方面，本发明提供了包括一种高度类似于所有或实质上所有的DF200或Pan2D的轻可变区序列或一种或两种这些抗体的一个或多个轻可变区CDR的序列的抗体、抗体片段、或其任何一种的衍生物。
在一另外的方面，本发明提供了如图13所示的包括抗体DF200的重可变区或一个或多个轻可变区CDR的抗体、抗体片段、或其任何一种的衍生物。在又一个方面，本发明提供了抗体、抗体片段、或其任何一种的衍生物，它们包括一种序列高度类似于所有的或实质上所有的DF200的重可变区的序列。
本发明的这些和另外的有利方面和特点可以进一步在本文的其它地方加以描述。
附图说明
图1示出结合于各种人KIR2DL受体的共同决定簇的单克隆抗体DF200。
图2示出单克隆抗体DF200在Cw4阳性(正)靶细胞上中和KIR2DL-介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
图3示出单克隆抗体DF200、DF200的Fab片段以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特异的常规抗体在Cw4阳性靶细胞上中和KIR2DL-介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性的抑制作用，以及在Cw3阳性靶细胞上中和KIR2DL-介导的KIR2DL2/3阳性NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
图4示出在有DF200和EB6抗体的F(ab’)2片段存在的情况下，通过HLA Cw4阳性靶细胞的NK克隆对细胞溶解的重构(重建)。
图5和图6示出单克隆抗体DF200、NKVSF1(pan2D)、人抗体1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1、以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特异常规抗体在Cw4阳性靶细胞(图5中的Cw4转染细胞以及图6中的EBV细胞)上中和KIR2DL-介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
图7示出抗原决定部位图，其显示了通过表面等离子共振(BIAcore)分析获得的抗-KIR抗体对于KIR2DL1的竞争性结合实验的结果，其中重叠圆表示结合于KIR2DL1的重叠。结果表明：1-7F9与EB6和1-4F1、但不与NKVSF1和DF200在KIR2DL1上竞争。抗体1-4F1依次与EB6、DF200、NKVSF1、以及1-7F9竞争。抗体NKVSF1与DF200、1-4F1、以及EB6，但不与1-7F9在KIR2DL1上竞争。DF200与NKVSF1、1-4F1、以及EB6，但不与1-7F9在KIR2DL1上竞争。
图8示出抗原决定部位图，其显示了通过BIAcore分析获得的抗-KIR抗体对于KIR2DL3的竞争性结合实验的结果，其中重叠圆表示结合于KIR2DL3的重叠。结果表明：1-4F1与NKVSF1、DF200、g1183、以及1-7F9在KIR2DL3上竞争。1-7F9与DF200、g1183、以及1-4F1，但不与NKVSF1在KIR2DL3上竞争。NKVSF1与DF200、1-4F1、以及GL183，但不与1-7F9在KIR2DL3上竞争。DF200与NKVSF1、1-4F1、以及1-7F9，但不与GL183在KIR2DL3上竞争。
图9示出抗原决定部位图，其显示了通过BIAcore分析获得的抗-KIR抗体对于KIR2DS1的竞争性结合实验的结果，其中重叠圆表示结合于KIR2DS1的重叠。结果表明，抗体1-4F1与NKVSF1、DF200、以及1-7F9在KIR2DS1上竞争。抗体1-7F9与1-4F1，但不与DF200和NKVSF1在KIR2DS1上竞争。NKVSF1与DF200以及1-4F1，但不与1-7F9在KIR2DS1上竞争。DF200与NKVSF1以及1-4F1，但不与1-7F9在KIR2DS1上竞争。
图10示出NKVSF1(pan2D)单克隆抗体(mAb)滴定，其表明该单克隆抗体(mAb)结合于食蟹猴NK细胞。食蟹猴NK细胞(NK主体(bulk)，第16天)用不同量的Pan2D单克隆抗体接着用PE-结合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗体进行孵育。阳性细胞的百分数是用同种型对照(纯化的鼠IgG1)加以确定的。将样品制成双份。平均荧光强度＝MFI。
图12提供了抗体DF200和Pan2D mAb的轻可变区和轻可变区CDR的氨基酸序列的比较排列。
图13提供了抗体DF200的重可变区。
具体实施方式
抗体
本发明提供了新颖的抗体和片段或其衍生物，其与人抑制性KIR受体的共同决定簇(优选存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上的决定簇)结合，并且增强表达至少那些KIR受体之一的NK细胞。本发明首次披露，可以产生这种进行交叉反应并中和的抗体，其表现出意想不到的结果并打开了通向新颖和有效的基于NK的治疗途径，尤其是在人类受治疗者中的治疗途径。在一优选的具体实施方式中，该抗体不是单克隆抗体NKVSF1。
在本发明的上下文中，“共同决定簇”表示由人抑制性KIR受体的几个基因产物共有(共用)的决定簇或抗原决定部位。优选地，共同决定簇由KIR2DL受体组的至少两个成员共有。更优选地，该决定簇由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共有。本发明的一些抗体，除识别KIR2DL的多基因产物以外，还可以识别存在于其它抑制性KIR，如KIR3DL受体组的基因产物上的决定簇。该决定簇或抗原决定部位可以表现为由所述成员共有的肽片段或构象抗原决定部位。在一种更特殊的具体实施方式中，本发明的抗体特异性地结合于由单克隆抗体DF200识别的实质上相同的抗原决定部位。这种决定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上。
在本发明的上下文中，术语抗体与一个共同决定簇“相结合”表示一个抗体借助于特异性和/或亲和性与所述决定簇相结合。
如在本文中所使用的，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体，以及指所述多克隆和单克隆抗体的片段和衍生物，除非另有说明或明显同上下文相矛盾。根据重链中恒定结构域的类型，全长抗体通常被确定为五个主要类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM。其中一些被进一步分成亚类或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。相应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定区被分别称为“α”、“β”、“ε”、“γ”以及“μ”。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。IgG和/或IgM是在本发明中使用的优选类型的抗体，因为它们是在生理状况下最通常的抗体并且因为它们在实验室装置中最容易制备。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。因为本发明的目的之一是阻断抑制性KIR和其相应的HLA配体在体内的相互作用而不消除(耗竭)NK细胞，相应于介导低效应物功能的Fc受体的同种型，如IgG4，通常是优选的。
本发明的抗体可以通过本领域熟知的各种技术加以制备。通常，它们是通过借助免疫原对非人动物、优选小鼠进行免疫作用来加以制备，其中所述免疫原包括抑制性KIR多肽，优选为KIR2DL多肽，更优选为人KIR2DL多肽。抑制性KIR多肽可以包括人抑制性KIR多肽的全长序列、或其片段或衍生物，通常为免疫原片段，即，包括暴露在表达抑制性KIR受体的细胞表面上的抗原决定部位的多肽部分。这样的片段通常包含成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选为至少约10个连续氨基酸。这些片段通常实质上衍生自受体的细胞外结构域。甚至更优选的是包括全长KIRDL多肽的至少一个、更优选为两个细胞外Ig结构域，并且能够模拟存在于KIR2DL受体中的至少一个构象抗原决定部位的人KIR2DL多肽。在其它的具体实施方式中，所述多肽包括KIR2DL1多肽的氨基酸位置1-224的细胞外Ig结构域的至少约8个连续氨基酸(根据描述KIR基因家族的PROW万维网站的氨基酸编号，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm)。
在一种最优选的具体实施方式中，免疫原包括在脂质膜中的野生型人KIR2DL多肽，通常在细胞表面。在一特定的具体实施方式中，免疫原包括完整NK细胞，尤其是完整的人NK细胞，可任选进行处理或溶解。
用抗原对非人哺乳动物进行免疫的步骤可以用本领域中熟知的任何方式来刺激小鼠产生抗体(参见，例如，E.Harlow and D.Lane，Antibodies：A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY(1988))。然后将免疫原悬浮或溶解于缓冲液中，可任选一种佐剂，如完全弗氏佐剂。用于确定免疫原量、缓冲液类型以及佐剂量的方法对于本领域技术人员来说是熟知的，并且不以任何方式限制本发明。对于不同的免疫原，这些参数可以不同，但容易加以说明。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫作用的位置和频率也是本技术领域熟知的。在一种典型的免疫作用方案中，非人动物在第1天被腹膜内注射抗原并在约1周后再次注射。接着在约第20天回忆注射抗原，可任选用佐剂如不完全弗氏佐剂。该回忆注射在静脉内进行并且可以连续重复几天。接着在第40天进行加强注射，经静脉或腹膜内，通常不用佐剂。这种方案导致在约40天以后产生的B细胞能产生抗原特异性抗体。也可以使用其它方案，只要它们导致产生的B细胞表达的抗体指向在免疫作用中使用的抗原。
对于多克隆抗体制剂，血清获自经免疫的非人动物并且其中存在的抗体通过熟知的技术加以分离。该血清可以利用任何上述的连接于载体的免疫原加以亲和纯化，以便获得与抑制性KIR受体反应的抗体。
在一种可替换的具体实施方式中，来自未免疫的非人哺乳动物的淋巴细胞被分离，在体外生长，然后暴露于在细胞培养中的免疫原。然后采集这些淋巴细胞并进行下文描述的融合步骤。
对于单克隆抗体，下一步骤是从经免疫的非人哺乳动物分离脾细胞以及其后用永生化细胞融合那些脾细胞，以便形成产生抗体的杂交瘤。从非人哺乳动物中分离脾细胞是本技术领域熟知的，并且通常涉及从麻醉的非人哺乳动物中除去脾，将它切成小片，并从脾囊挤压脾细胞并通过细胞滤过器的尼龙筛孔进入适宜的缓冲液，以便产生单细胞悬浮液。这些细胞被洗涤，离心并再悬浮于溶解任何红细胞的缓冲液中。再次离心溶液并将在沉淀中的剩余淋巴细胞最后重新悬浮在新鲜的缓冲液中。
一旦分离并存在于单细胞悬浮液中以后，这些淋巴细胞可以被融合于一个永生化细胞系。这通常是鼠骨髓瘤细胞系，虽然在本领域已知许多其它永生化细胞系可用于产生杂交瘤。优选的鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于那些衍生自MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤的细胞系，其可获自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.U.S.A.，X63 Ag8653和SP-2细胞，其可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MarylandU.S.A.)。融合利用聚乙二醇或类似物来完成。然后将得到的杂交瘤在选择的培养基中生长，该选择培养基包含一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷)(HAT培养基)，这些物质可阻止HGPRT缺乏细胞的生长。
杂交瘤通常生长在巨噬细胞的喂养层。巨噬细胞优选来自用来分离脾细胞的非人哺乳动物的同窝仔，并且通常在平皿培养杂交瘤数天前用不完全弗氏佐剂或类似物加以初次激活。在Goding，“Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，”pp.59-103(Academic Press，1986)中描述了融合方法，将其披露的内容以引用方式结合于本文中。
细胞被允许在选择培养基中生长足够的时间以便形成菌落和产生抗体。这通常是在约7天和约14天之间。然后测定杂交瘤菌落产生的针对与多种抑制性KIR受体基因产物进行交叉反应的抗体。该测定通常是比色ELISA型测定，虽然可以采用任何可以适用于杂交瘤在其内生长的孔的测定。其它测定包括免疫沉淀和放射免疫测定。对于产生所希望的抗体为阳性的孔进行检查，以确定是否存在一个或多个独特的菌落。如果存在一个以上的菌落，则可以对细胞进行再克隆和生长，以确保仅由单一细胞生成了产生所希望抗体的菌落。通常对具有单个表观菌落的阳性孔进行再克隆和再测定以保证仅检测和产生一种单克隆抗体。如在Ward et al.， Nature，341(1989)p.544中所披露的，还可以通过免疫球蛋白的组合文库的选择来产生抗体。
本发明的抗体能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用；尤其是由KIR2DL受体介导的抑制作用以及更加尤其是至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3两者的抑制作用。因而这些抗体是“中和”或“抑制性”抗体，这是基于下述意义而言的：当它们与MHC类型I分子相互作用时，它们，至少部分地和可检测地，阻断由KIR受体介导的抑制性信号通路。更重要的是，这种抑制性活性是相对于若干几种类型的抑制性KIR受体、优选为几种KIT2DL受体基因产物、以及更优选为至少KIR2DL1和KIR2DL2/3而呈现，以致这些抗体可以高效地用于各种受治疗者。对KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用的抑制可以通过各种测定或试验进行评估，如结合或细胞测定。
一旦与多种抑制性KIR受体进行交叉反应的抗体被鉴定以后，可以试验它对那些在完整NK细胞中的KIR受体的抑制性效应进行中和的能力。在一特定的变化方案中，中和活性可以通过所述抗体借助于HLA-C阳性靶的KIR2DL阳性NK克隆重构溶解的能力来加以说明。在另一特定的具体实施方式中，抗体的中和活性是通过抗体抑制HLA-C分子结合于KIR2DL1和KIR2DL3(或紧密相关的KIR2DL2)受体的能力来加以定义的，进一步优选地作为抗体改变下述的能力：
-选自Cw1、Cw3、Cw7、以及Cw8的HLA-C分子(或在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C分子)结合于KIR2D2/3；以及
-选自Cw2、Cw4、Cw5以及Cw6的HLA-C分子(或在第80位具有赖氨酸残基的HLA-C分子)结合于KIR2D1。
在另一种变化方案中，本发明的抗体的抑制性活性可以用如在本文提供的实施例中所披露的基于细胞的的细胞毒性测定来加以评估。
在另一种变化方案中，本发明的抗体的抑制性活性可以用细胞因子释放测定来加以评估，其中NK细胞用试验抗体孵育，而表达一种HLA-C等位基因的靶细胞系通过NK种群的KIR分子加以识别，以刺激NK细胞的细胞因子的产生(例如γ-干扰素和/或GM-CSF产生)。在一示范性方案中，由PBMC产生的γ-干扰素(IFN-γ)通过细胞表面和胞质内染色法以及通过流式细胞计数法分析在培养约4天以后来加以评估。简单地说，布雷菲德菌素A(Brefeldin A，Sigma Aldrich)可以用约5μg/ml的终浓度加入，并进行最少约4小时的培养。然后可以在渗透作用(IntraPrepTM；Beckman Coulter)以及用PE-抗-γ-干扰素(PE-抗-IFN-γ)或PE-IgG1(Pharmingen)染色之前，用抗-CD3及抗-CD56单克隆抗体(mAb)孵育细胞。由多克隆激活的NK细胞产生的GM-CSF和γ-干扰素(IFN-γ)可以利用ELISA在上清液中进行测量(GM-CSF：DuoSetElisa，R&D Systems，Minneapolis，MN；IFN-γ：OpeE1A set，Pharmingen)。
本发明的抗体可以部分或完全中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。如在本文中所使用的，术语“中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用”是指：当表达给定KIR的NK细胞种群与表达关连MHC类型I分子(由表达在NK细胞上的KIR所识别)的靶细胞接触时，与在没有抗体的情况下获得的特异性溶解水平相比，增加到特异性溶解的至少约20％、优选至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多(例如，约25-100％)的能力，其中所述特异性溶解是在与NK细胞或NK细胞系(其未被它们的KIR阻断)相同比率下获得的，如通过细胞毒性经典铬释放试验所测得的。例如，本发明的优选抗体能够诱导匹配的或HLA相容的或自体同源靶细胞种群(即在没有所述抗体存在的情况下，不会被NK细胞有效溶解的细胞种群)的溶解。因此，本发明的抗体也可以定义为在体内有助于NK细胞活性。
可替换地，术语“中和KIR介导的抑制作用”是指：在利用表达一种或数种抑制性KIR的NK细胞克隆或转染子以及仅表达一种HLA等位基因(其由NK细胞上的KIR之一加以识别)的靶细胞的铬测定中，借助抗体获得的细胞毒性水平应是借助已知的阻断抗MHC类型I分子(如W6/32抗MHC类型I抗体)获得的细胞毒性的至少约20％、优选至少约30％、至少约40％、至少约50％(例如，约25-100％)、或更多。
在一特定具体实施方式中，该抗体结合实质上与单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生的)相同的抗原决定部位。在本文中这样的抗体被称作“DF200样抗体”。在一另外的优选具体实施方式中，该抗体是单克隆抗体。本发明的更优选的“DF200样抗体”是不同于单克隆抗体NKVSF1的抗体。最优选的是单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生的)。
术语“结合于实质上与感兴趣的抗体相同的抗原决定部位或决定簇”是指抗体和所述感兴趣的抗体“竞争”。术语“结合于实质上与单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位或决定簇”是指抗体和DF200“竞争”。一般来说，“结合于实质上与感兴趣的单克隆抗体相同的抗原决定部位或决定簇”的抗体(例如，DF200、NKVSF1、17F9)是指该抗体与所述感兴趣的抗体“竞争”更多KIR分子的任何一种，优选为一种KIR分子，其选自由KIR2DL1和KIR2DL2/3构成的组。在其它实施例中，结合于实质上与感兴趣的抗体相同的在KIR2DL1分子上的抗原决定部位或决定簇的抗体与感兴趣的抗体“竞争”结合于KIR2DL1。结合于实质上与感兴趣的抗体相同的在KIR2DL2/3分子上的抗原决定部位或决定簇的抗体与感兴趣的抗体“竞争”结合于KIR2DL2/3。
术语“结合于本质上与感兴趣的抗体相同的抗原决定部位或决定簇”是指抗体与所述感兴趣的抗体“竞争”任何及所有KIR分子，所述感兴趣的抗体特异性地结合于这些KIR分子。术语“结合于本质上与单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位或决定簇”是指抗体与DF200“竞争”任何及所有KIR分子，DF200特异性地结合于这些KIR分子。例如，结合于本质上与单克隆抗体DF200或NKVSF1相同的抗原决定部位或决定簇的抗体分别与所述DF200或NKVSF1“竞争”结合于KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1以及KIR2DS2。
利用各种免疫筛选测定(其中可以评估抗体竞争性)的任何一种，可以容易地鉴定一种或多种抗体，这些抗体结合于实质上或本质上与本文中描述的单克隆抗体相同的抗原决定部位。许多这样的测定被常规实施，并且在本技术领域是熟知的(参见，例如，1997年8月26日发行的美国专利第5,660,827号，将其特别地以引用方式结合于本文中)。应当明了，实际上确定本文描述的抗体与其结合的抗原决定部位决不需要鉴定结合于与本文描述的单克隆抗体相同的或实质上相同的抗原决定部位的抗体。
例如，在要检查的试验抗体是获自不同来源的动物、或甚至是具有不同的Ig同种型的情况下，可以采用简单的竞争测定，其中将对照抗体(例如，DF200)与试验抗体混合(或预吸附)并施加于含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的样品，其中已知KIR2DL1及KIR2DL2/3各自被DF200结合。基于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白质印迹法(Western blotting)的方案，以及BIACORE分析的应用(如在实施例部分所陈述的)适用于这样的简单竞争研究。
在一些具体实施方式中，在施加到抑制性KIR抗原样品之前，可以用不同量的试验抗体(例如，约1∶10或约1∶100)与对照抗体(例如，DF200)预混合一段时间。在其它的具体实施方式中，可以在暴露于KIR抗原样品期间，简单地混合对照抗体和不同量的试验抗体。只要可以将结合抗体和游离抗体区别开(例如，利用分离或洗涤技术以消除未结合的抗体)以及将DF200和试验抗体区别开(例如，利用物种特异性或同种型特异性次级抗体或通过用可检测的标记物特异性地标记DF200)，就可以确定是否试验抗体可降低DF200结合于两种不同的KIR2DL抗原，其表示试验抗体识别实质上与DF200相同的抗原决定部位。在没有完全不相关抗体存在的情况下，(标记的)对照抗体的结合可以作为对照高值。通过用完全相同类型的未标记抗体(DF200)孵育经标记的(DF200)抗体，就可以获得对照低值，其中可能发生竞争并降低标记抗体的结合。在试验测定中，在有试验抗体存在的情况下，标记抗体反应性的显著降低预示可识别实质上相同的抗原决定部位的试验抗体，即，一种与经标记的(DF200)抗体“交叉反应”的试验抗体。在DF200∶试验抗体为约1∶10和约1∶100之间的任何比率下，降低DF200与每种KIR2DL1及KIR2DL2/3抗原的结合至少约50％，如至少约60％，或更优选至少约70％(例如，约65-100％)的任何试验抗体都可以被认为是结合于实质上与DF200相同的抗原决定部位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体将降低DF200与每种KIR2DL抗原的结合至少约90％(例如，约95％)。
例如，可以通过流式细胞计数法试验对竞争性进行评估。在这样的试验中，带有给定KIR的细胞可以首先用例如DF200加以孵育，然后用荧光色素或生物素标记的试验抗体加以孵育。如果在用饱和量的DF200预孵育以后获得的结合是在没有用DF200预孵育的情况下由抗体获得的结合(如借助于荧光测得的)的约80％、优选约50％、约40％或更小(例如，约30％)，则认为抗体与DF200竞争。可替换地，如果在用饱和量的试验抗体预孵育的细胞上用(通过荧光色素或生物素)标记的DF200获得的结合是在没有用抗体预孵育的情况下获得的结合的约80％、优选约50％、约40％、或更小(例如，约30％)，则认为抗体与DF200竞争。
也可以有利地采用一种简单的竞争测定，其中试验抗体被预吸附并以饱和浓度施加于一个表面，其上还固定了KIR2DL1及KIR2DL2/3。在此简单的竞争测定中的表面优选为BIACORE芯片(或其它适用于表面等离子共振分析的介质)。然后将对照抗体(例如，DF200)与具有KIR2DL1及KIR2DL2/3饱和浓度的表面接触，并测量对照抗体的KIR2DL1及KIR2DL2/3表面结合。将对照抗体的这种结合与在没有试验抗体的情况下对照抗体与含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的表面的结合进行比较。在一试验测定中，在有试验抗体存在的情况下，对照抗体对含有KIR2DL1及KIR2DL2/3的表面的结合的显著降低表明，试验抗体识别实质上与对照抗体相同的抗原决定部位，以致该试验抗体与对照抗体进行“交叉反应”。降低对照抗体(如DF200)与每种KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原的结合至少约30％或更优选约40％的任何试验抗体都可以被认为是结合于实质上与对照抗体(例如，DF200)相同的抗原决定部位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体将降低对照抗体(例如，DF200)与每种KIR2DL抗原的结合至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、或更大)。应当明了，对照抗体和试验抗体的次序可以颠倒：即，对照抗体可以首先结合于表面，其后在竞争测定中将试验抗体与表面接触。优选地，对于KIR2DL1及KIR2DL2/3抗原具有更高亲和性的抗体被首先结合于含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，如可以预期的，对于第二抗体所看到的结合降低(假定抗体正进行交叉反应)将具有更大的幅度。这样的测定的另外的实施例在实施例中提供以及在，例如，Saunal and Regenmortel，(1995)J.Immunol.Methods 183：33-41中提供，将其披露的内容以引用方式结合于本文中。
虽然为了举例的目的在DF200的范围内加以描述，但应当明了，上述免疫筛选测定也可以用来鉴定和NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183、以及根据本发明的其它抗体进行竞争的抗体。
在脊椎动物或细胞中进行免疫作用和产生抗体以后，可以进行特定的选择步骤，以分离如要求保护的抗体。在这方面，在一特定的具体实施方式中，本发明还涉及产生这样抗体的方法，包括：
(a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；
(b)由所述经免疫的动物制备抗体，其中所述抗体与所述KIR多肽相结合，
(c)选择(b)的抗体，这些抗体与至少两种不同的抑制性KIR基因产物进行交叉反应，以及
(d)选择(c)的抗体，这些抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
选择与至少两种不同的抑制性KIR基因产物进行交叉反应的抗体可以通过相对于两种或更多种不同的抑制性KIR抗原，例如，如上所述的抗原，对抗体进行筛选来实现。
在一种更优选的具体实施方式中，在步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。因而，如在本文中所使用的，术语“从所述经免疫的动物制备抗体”包括由经免疫的动物获得B细胞以及利用那些B细胞以产生表达抗体的杂交瘤，以及直接由经免疫动物的血清获得抗体。在另一优选的具体实施方式中，在步骤(c)中选择的抗体是那些与至少KIR2DL1及KIR2DL2/3进行交叉反应的抗体。
在又一优选的具体实施方式中，与在和NK细胞(未被它们的KIR阻断)相同的效应物/靶比率下获得的溶解或细胞毒性相比，相对于表达关连HLA类型1分子，在步骤(d)中选择的抗体引起至少约10％的由NK细胞(显示至少一种由抗体识别的KIR)介导的特异性溶解，以及优选至少约40％的特异性溶解，至少约50％的特异性溶解，或更优选至少约70％的特异性溶解(例如，约60-100％的特异性溶解)，如用标准铬释放测定所测得的。可替换地，当在步骤(d)中选择的抗体用于铬测定时，其中铬测定采用表达一种或数种抑制性KIR的NK细胞克隆以及仅表达一种HLA等位基因(其由NK克隆上的KIR之一加以识别)的靶细胞，用该抗体获得的细胞毒性水平应是用阻断抗MHC类型I单克隆抗体如W6/32抗MHC类型I抗体所获得的细胞毒性的至少约20％，优选至少约30％，或更多。
可以改变以上刚刚描述的方法的步骤(c)和(d)的次序。可选地，该方法还可以或可替换地可以进一步包括另外的步骤：制备单克隆抗体的片段或单克隆抗体或这样的片段的衍生物，例如，如在本文中的其它地方所描述的。
在一优选的具体实施方式中，用来根据本发明的可适用方法产生抗体的非人动物是哺乳动物，如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)、牛、猪、马、兔、山羊、绵羊等。此外，非人哺乳动物可以被基因修饰或基因工程化以产生“人”抗体，如XenomouseTM(Abgenix)或HuMAb-MouseTM(Medarex)。
在另一种变化方案中，本发明提供了获得抗体的方法，包括：
(a)从单克隆抗体的文库或表达谱中选择单克隆抗体、单克隆抗体的片段、或二者任一种的衍生物，其与至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物进行交叉反应，以及
(b)选择(a)的抗体、片段、或衍生物，其在表达所述至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞种群中能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
所述表达谱可以是抗体或其片段的任何(重组体)表达谱，可任选通过何种适宜的结构(例如，噬菌体、细菌、合成的复合物等)加以显示。抑制性抗体的选择可以如上所披露的那样进行，并进一步在实施例中加以说明。
根据另一具体实施方式，本发明提供了包括来自非人宿主的B细胞的杂交瘤，其中所述B细胞产生一种抗体，该抗体与存在于至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产品上的决定簇相结合，并且所述抗体能够中和所述受体的抑制性活性。更优选地，本发明的此方面的杂交瘤不是产生单克隆抗体NKVSF1的杂交瘤。根据本发明的此方面的杂交瘤，可以如上所述通过用永生化细胞系融合来自经免疫的非人哺乳动物的脾细胞来产生。如在本文的其它地方所描述的，可以对于这样的交叉反应抗体的存在，筛选通过这种融合所产生的杂交瘤。优选地，该杂交瘤产生一种抗体，其可识别存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上的决定簇，以及增强表达至少那些KIR受体之一的NK细胞。甚至更优选地，该杂交瘤产生一种抗体，该抗体结合于实质上与DF200相同的抗原决定部位或决定簇并且该抗体增强NK细胞活性。最优选地，所述杂交瘤是产生单克隆抗体DF200的杂交瘤DF200。
已经证实产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以更大量地生长在适宜的培养基中，如DMEM或RPMI-1640。可替换地，该杂交瘤细胞可以在体内如动物的腹水瘤中生长。
在足够生长以产生所希望的单克隆抗体以后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水液)与细胞分开，并纯化存在于其中的单克隆抗体。纯化通常是借助于凝胶电泳、透析、利用蛋白A或蛋白G琼脂糖凝胶的层析法、或连接于载体如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠的抗鼠Ig来实现(例如，全部描述在the Antibody Purification Handbook，Amersham Biosciences，publication No.18-1037-46，Edition AC，将其披露的内容以引用方式结合于本文中)。结合的抗体通常是利用低pH缓冲液(pH为3.0或更低的甘氨酸或乙酸缓冲液)洗脱自蛋白A/蛋白G柱，同时立即中和包含抗体的部分。按需要，对这些部分进行集中、透析、以及浓缩。
根据一种可替换的具体实施方式，一种抗体结合在存在于至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的决定簇上，对该抗体进行编码的DNA分离自本发明的杂交瘤，并置于适宜的表达载体中，用于转染到适宜的宿主。然后该宿主被用于重组产生抗体、或其变异体，如单克隆抗体的人源化形式、抗体的活性片段、或包括抗体的抗原识别部分的嵌合抗体。优选地，在本具体实施方式中使用的DNA所编码的一种抗体可识别存在于至少两种不同的KIR2DL基因产物上的决定簇，并使表达至少那些KIR受体之一的NK细胞得到增强。甚至更优选地，该DNA编码的一种抗体结合于实质上与DF200相同的抗原决定部位或决定簇并且增强NK细胞活性。最优选地，所述DNA对单克隆抗体DF200进行编码。
利用常规程序(例如，利用能够特异性地结合于编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可容易地分离对本发明的单克隆抗体进行编码的DNA并进行测序。一旦分离以后，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如，本来并不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，从而在重组体宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。在细菌中重组表达抗体编码的DNA在本技术领域是熟知的(参见，例如，Skerra et al.， Curr.Opinion in Immunol.，5，pp.256(1993)；以及Pluckthun， Immunol.Revs.，130，pp.151(1992))。
单克隆抗体的片段和衍生物
本发明的抗体的片段和衍生物(如在本申请中所使用的，其由术语“抗体”所涵盖，除非另有说明或明显与上下文相矛盾)，优选为DF-200-样抗体，可以通过本技术领域已知的技术来产生。“免疫反应片段”包括完整抗体的一部分，通常是抗原结合部位或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、以及Fv片段；双功能抗体；任何抗体片段，其是具有一级结构的多肽，其中一级结构由邻近氨基酸残基的一个未中断序列(在本文中称作“单链抗体片段”或“单链多肽”)构成，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽，或其包含轻链可变结构域的三个CDR、而没有相联的重链部分的片段以及(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽，或其包含重链可变区的三个CDR、而没有相联的轻链部分的片段；以及形成自抗体片段的多特异性抗体。例如，Fab或F(ab′)2片段可以按照常规技术通过蛋白酶消化分离的抗体来产生。应当明了，可以利用已知方法来修饰免疫反应片段，例如为了放慢体内清除率和获得更合乎要求的药物动力学曲线，可以用聚乙二醇(PEG)对片段进行修饰。用于将PEG偶联于以及部位特异性地结合于Fab′片段的方法描述在，例如，Leong et al， Cytokine 16(3)：106-119(2001)以及Delgado etal， Br.J.Cancer 73(2)：175-182(1996)中，将其披露的内容以引用方式结合于本文中。
在一特定方面，本发明提供了抗体、抗体片段、以及抗体衍生物，其包括如图12示出的DF-200的轻链可变区序列。在另一个特定方面，本发明提供了抗体，抗体片段，以及抗体衍生物，其包括如图12示出的Pan2D的轻链可变区序列。在另一个方面，本发明提供了抗体，抗体片段，以及其衍生物，其包括如图12示出的DF-200的一个或多个轻可变区CDR。在又一个方面，本发明提供了抗体，抗体片段，以及其衍生物，其包括如图12示出的Pan2D的一个或多个轻可变区CDR。通过利用标准技术，在这些所披露的氨基酸序列中进行适当的取代、添加、和/或缺失，就可以产生这类序列的功能性变异体/类似物，其可以在序列比较的帮助下进行。因而，例如，保存在Pan2D和DF-200之间的CDR残基可以是用于修饰的适宜的靶标，因为这样的残基在这些抗体相对于本文披露的其它抗体的竞争中不会影响不同的图形(虽然Pan2D和DF-200确实竞争)，因而不会影响这些抗体对于它们特定的相应抗原决定部位的特异性。在另一个方面，残基存在于这些抗体之一的序列中但不存在于另一种抗体序列中的位置可以适用于缺失、取代、和/或插入。
在一特定方面，本发明提供了抗体，抗体片段，以及抗体衍生物，其包括如图13示出的DF-200的重链可变区序列。在另一个方面，本发明提供了抗体，抗体片段，以及其衍生物，其包括如图13示出的DF-200的一个或多个重可变区CDR。通过利用标准技术，在这些所披露的氨基酸序列中进行适当的取代、添加、和/或缺失，就可以产生这类序列的功能性变异体/类似物，其可以在序列比较的帮助下进行。在另一个方面，残基存在于这些抗体之一的序列中但不存在于另一种抗体序列中的位置可以适用于缺失、取代、和/或插入。
可替换地，产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA，优选为DF-200-样抗体，可以加以修饰以便为本发明的片段加以编码。然后将经修饰的DNA插入表达载体中，并用来转化或转染适当的细胞，然后由其表达所希望的片段。
在一种可替换的具体实施方式中，产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA，优选为DF-200-样抗体，可以在插入表达载体中以前加以修饰，例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域，以代替异体同源非人序列(例如，Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，81，pp.6851(1984))，或通过将用于非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接于免疫球蛋白来编码序列。用此方式，可以制备“嵌合”或“杂交”抗体，这些抗体具有最初抗体的结合特异性。通常，用这样的非免疫球蛋白多肽代替本发明的抗体的恒定结构域。
因而，根据另一具体实施方式，本发明的抗体，优选为DF-200-样抗体，被人源化。根据本发明抗体的“人源化”形式是特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2，或抗体的其它抗原结合亚序列)，其包含衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自最初抗体(供体抗体)的CDR的残基代替来自受体的互补决定区(CDR)的残基，同时保持最初抗体的所希望的特异性、亲和力、以及能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区残基可以被相应的非人残基所代替。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或在输入的CDR或骨架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括实质上所有的可变结构域的至少一种、以及通常两种可变结构域，其中所有或实质上所有的CDR区对应于最初抗体的那些CDR区，并且所有或实质上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳还将包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节参见Jones et al.，Nature，321，pp.522(1986)；Reichmann et al.， Nature，332，pp.323(1988)：以及Presta， Curr.Op.Struct.Biol.，2，pp.593(1992)。
对本发明的抗体进行人源化的方法在本技术领域是熟知的。通常，根据本发明的人源化抗体具有一种或多种从最初抗体引入的氨基酸残基。这些鼠或其它非人氨基酸残基经常称作“输入”残基，这些残基通常取自“输入”可变结构域。实质上可以按照Winter以及合作者的方法进行人源化(Jones et al.， Nature，321，pp.522(1986)；Riechmann et al.， Nature，332，pp.323(1988)；Verhoeyenet al.， Science，239，pp.1534(1988))。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly et al.，美国专利第4,816,567号)，其中显著小于完整的人可变结构域的可变结构域已被来自最初抗体的相应序列所取代。实际上，根据本发明的人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自最初抗体中的类似位点(部位)的残基所取代。
为了降低抗原性，对用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻可变结构域和重可变结构域)的选择是非常重要的。根据所谓的“最佳配合”方法，本发明的抗体的可变结构域的序列是针对已知的人可变结构域序列的整个文库加以筛选的。然后将最接近鼠序列的人序列当作人源化抗体的人骨架(FR)(Sims et al.， J.Immunol.，151，pp.2296(1993)；Chothia和Lesk，J .Mol.Biol.，196，pp.901(1987))。另一种方法使用特定的骨架，该骨架是来自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列。相同的骨架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，pp.4285(1992)；Presta et al.， J.Immunol.，51，pp.1993))。
更重要的是，对抗体进行人源化时保留对多种抑制性KIR受体的高亲和力以及其它有利的生物性能。为了达到此目的，根据一种优选的方法，人源化抗体是通过利用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产物来制备的。通常可获得三维免疫球蛋白模型，并且为本领域技术人员所熟知。可获得计算机程序，其说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些显像允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即，分析残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。这样，可以选择FR残基并使之由共有序列和输入序列组合，以致可以获得所希望的抗体特性，如对于靶抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接并最显著地涉及影响抗原结合。
制备“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用XenoMouse(Abgenix，Fremont，CA)作为用于免疫作用的小鼠。XenoMouse是根据本发明的鼠宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人免疫球蛋白基因所取代。因而，由此鼠产生的或在制备自这种鼠的B细胞的杂交瘤中的抗体已经被人源化。美国专利第6,162,963号描述了XenoMouse，将该专利全文以引用方式结合于本文中。利用HuMAb-MouseTM(Medarex)可以实现一种类似的方法。
按照各种其它技术也可以制备人抗体，如，为了免疫，利用其它转基因动物，这些转基因动物已加以基因工程化以表达人抗体表达谱(Jakobovitz et al.，Nature 362(1993)255)，或通过利用噬菌体显示法选择抗体表达谱。这样的技术对于本领域技术人员来说是已知的，并且如在本申请中所披露的可以从单克隆抗体开始进行实施。
本发明的抗体，优选为DF-200-样抗体，也可以被衍生为“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与最初抗体的相应序列相同或异体同源，同时链的剩余部分与在一些抗体中的相应序列相同或异体同源，其中所述抗体衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类、以及这样的抗体的片段，只要它们呈现所希望的生物活性(Cabilly et al.，supra；Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，81，pp.6851(1984))。
在本发明范围内的其它衍生物包括官能化抗体，即，将抗体共轭或共价结合于：毒素，如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、相思豆毒素和假单胞菌外毒素；可检测部分，如荧光部分、放射性同位素或成像剂；或载体，如琼脂糖珠或类似物。将这些其它药剂与抗体共轭或共价结合的方法在本技术领域是熟知的。
共轭于毒素可用于靶向杀伤NK细胞，这些细胞在其细胞表面呈现为交叉反应KIR受体之一。一旦本发明的抗体结合于这样细胞的细胞表面以后，它被内在化并将毒素释放在细胞内，从而选择性地杀伤所述细胞。这样的应用是本发明的一种可替换的具体实施方式。
当本发明的抗体用于诊断目的时，共轭于可检测部分是有用的。这样的目的包括但不限于测定生物样品中存在其细胞表面带有交叉反应KIR的NK细胞，以及检测活生物中存在带有交叉反应KIR的NK细胞。这样的测定和检测方法也是本发明的可替换具体
实施方式。
本发明的抗体共轭于固相支撑体可用作亲和纯化来自如生物液的在它们的细胞表面上带有交叉反应KIR的NK细胞的工具。这种纯化方法是本发明的另一种可替换的具体实施方式，作为得到的NK细胞的纯化种群。
在一种可替换的具体实施方式中，与存在于至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物上的共同决定簇相结合的抗体可以单独或与另一种用于靶向递送到动物的物质一起结合到脂质体(“免疫脂质体”)中，其中所述抗体对表达本发明的所述两种不同的人抑制性KIR受体的至少之一的NK细胞能够中和KIR-介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，包括NKVSF1。这样的其它物质包括递送用于基因治疗的基因或递送用于抑制NK细胞中基因的反义RNA、RNAi或siRNA的核酸，或用于靶向杀伤NK细胞的毒素或药物。
基于它们公布的晶体结构，对KIR2DL1、-2和-3(KIR2DL1-3)的细胞外结构域的计算机模拟(Maenaka et al.(1999)，Fan et al.(2001)，Boyington et al.(2000))，预测在KIR2DL1和KIR2DL1-3交叉反应鼠单克隆抗体DF200以及NKVSF1之间的相互作用中涉及KIR2DL1、-2和-3的某些区。因而，在一种具体实施方式中，本发明提供了唯一结合于由氨基酸残基(105，106，107，108，109，110，111，127，129，130，131，132，133，134，135，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，181，192)限定的区之内的KIR2DL1的抗体。在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1和KIR2DL2/3而不与在由残基(105，106，107，108，109，110，111，127，129，130，131，132，133，134，135，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，181，192)所限定的区以外的氨基酸残基相互作用的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1而不结合于KIR2DL1的其中R131是丙氨酸的突变体的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1而不结合于KIE2DL1的其中R157是丙氨酸的突变体的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1而不结合于KIE2DL1的其中R158是丙氨酸的突变体的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1残基(131，157，158)的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DS3(R131W)、但不结合于野生型KIR2DS3的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4的抗体。
在另一种具体实施方式中，本发明提供了结合于KIR2DL1和KIR2DL2/3、但不结合于KIR2DS4的抗体。
确定抗体是否结合在上述限定的抗原决定部位区之一以内可以用本领域技术人员已知的方式进行。作为这样的作图/表征方法的一个实例，用于抗-KIR抗体的抗原决定部位区可以通过利用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白中的暴露的胺/羧基的化学修饰的抗原决定部位“足迹法”来确定。这样的足迹技术的一个特定的实例是使用HXMS(通过质谱测定法检测的氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及逆向交换，其中参与蛋白结合的主链酰胺基免受逆向交换，因此将仍然是氘化的。这里，相关区可以通过胃蛋白水解、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷射电离质谱测定法加以鉴定。参见，例如，Ehring H，Analytical Biochemistry，Vol.267(2)pp.252-259(1999)和/或Engen，J.R.和Smith，D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。适宜的抗原决定部位鉴定技术的另一个实例是核磁共振(NMR)抗原决定部位作图，其中通常比较在二维NMR谱中游离抗原和与抗原结合肽(如抗体)复合的抗原的信号位置。抗原通常用15N选择性地进行同位素标记，以致在NMR谱中仅看到对应于抗原的信号而看不到来自抗原结合肽的信号。起源于氨基酸(涉及与抗原结合肽的相互作用)的抗原信号在复合物的谱中与游离抗原的谱相比通常将移动位置，因而用这种方式可以鉴定涉及结合的氨基酸。参见，例如，Ernst Schering Res Found Workshop.2004；(44)：149-67；Huang et al，Journal of Molecular Biology，Vol.281(1)pp.61-67(1998)；以及Satio和Patterson，Methods.1996 Jun；9(3)：516-24。
抗原决定部位作图/表征也可以利用质谱测定法来进行。参见，例如，Downward，J Mass Spectrom.2000 Apr；35(4)：493-503以及Kiselar和Downard，Anal Chem.1999 May 1；71(9)：1792-801。
蛋白酶消化技术也可以用于抗原决定部位作图和鉴定。抗原决定簇相关区/序列可以通过蛋白酶消化加以确定，例如，利用胰蛋白酶与KIR2DL1或KIR2DL2/3按约1∶50比率在37℃以及pH7-8下进行消化，接着通过用于肽鉴定的质谱测定法(MS)进行分析。由抗KIR粘合剂保护而免受胰蛋白酶断裂的肽可以随后通过将经受胰蛋白酶消化的样品和用抗体孵育、然后再经受例如胰蛋白酶消化的样品进行比较来加以鉴定(从而揭示粘合剂的足迹)。其它酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等也可以或可替换地用于类似的抗原决定部位表征方法中。并且，酶消化可以提供快速方法，用来在未表面暴露的抗KIR多肽的范围内分析一个潜在的抗原决定簇序列是否在KIR2DL1的区内，因而就免疫原性/抗原性而言最可能不相关。对于类似技术的讨论，参见，例如，Manca，Ann Ist Super Sanita.1991；27(1)：15-9。
与食蟹猴的交叉反应度
已经发现，抗体NKVSF1也结合于来自食蟹猴的NK细胞，参见实施例7。因此本发明提供了一种抗体、以及其片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物与在人NK细胞表面的至少两种抑制性人KIR受体进行交叉反应，而且此外它还与来自食蟹猴的NK细胞相结合。在关于此的一具体实施方式中，该抗体不是抗体NKVSF1。本发明还提供了一种抗体、以及其片段和衍生物的毒性的试验方法，其中所述抗体、片段或衍生物与在人NK细胞表面的至少两种抑制性人KIR受体进行交叉反应，其中该方法包括试验在食蟹猴体内的抗体。
组合物和给药
本发明还提供了药物组合物，包括一种抗体、以及其片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物与在NK细胞表面的至少两种抑制性KIR受体进行交叉反应，并且在患者体内或在包括NK细胞的生物样品中以任何适宜的载体和可检测地增强NK细胞的细胞毒性的有效量来中和它们的抑制信号并增强那些细胞的活性。该组合物进一步包括药用可接受的载体。这样的组合物也称作“本发明的抗体组合物”。在一具体实施方式中，本发明的抗体组合物包括在上述的抗体具体实施方式中所披露的抗体。抗体NKVSF1包括在可以存在于本发明的抗体组合物中的抗体的范围内。
如在本文中所使用的，术语“生物样品包括但不限于生物液(例如血清、淋巴液、血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓)。
可以在这些组合物中使用的药用可接受载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人清血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇以及羊毛脂。
本发明的组合物可以用于增强患者或生物样品中的NK细胞活性的方法中。该方法包括用所述组合物与所述患者或生物样品接触的步骤。这样的方法将可用于诊断和治疗目的。
为了与生物样品一起使用，可以通过与样品简单混合或直接施加于该样品来给予抗体组合物，其取决于样品的特性(液体或固体)。生物样品可以与在任何适宜装置(平板、囊、瓶等)中的抗体直接接触。为了与患者一起使用，该组合物必须加以配制以便为患者给药。
本发明的组合物可以通过下述方式给药：口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口颊、阴道或经过植入的贮存器。如在本文中所使用的，术语“肠胃外”包括皮下，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸内，鞘内，肝内，病灶内及颅内注射或输注技术。优选地，这些组合物是通过口服、腹膜内或静脉内来给药。
本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。根据本领域已知的技术，并使用适宜的分散剂或湿润剂及悬浮剂就可以配制这些悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在非毒性的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受载体和溶剂当中有水、林格氏液以及等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油按常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何刺激性小的不挥发油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射物的制备，同样有天然药用可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是以它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制包括乳剂和混悬剂的药用可接受剂型。其它通常使用的表面活性剂，如吐温，司盘及其它乳化剂或通常用于制造药用固体、液体、或其它剂型的生物利用度增强剂也可以用于配制的目的。
本发明的组合物可以用任何口服可接受剂型口服给药，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液。在用于口服的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式进行的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水性混悬剂用于口服时，活性组分则和乳化剂和悬浮剂结合。如果需要的话，也可以加入某些甜味剂、香味剂或着色剂。
可替换地，本发明的组合物可以用栓剂的形式给药，用于直肠给药。这些栓剂可以通过将药剂和适宜的非刺激性赋形剂进行混合来加以制备，其中赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。这样的物质包括可可脂、蜂蜡及聚乙二醇。
本发明的组合物也可以局部给药，尤其当治疗的靶标包括通过局部施加容易达到的区域或器官时，包括眼、皮肤、或下肠道的疾病。对于这些区域或器官适宜的局部剂型很容易制备。
用于下肠道的局部应用可以用直肠栓剂剂型(参见上述)或以适宜的灌肠剂剂型进行。也可以使用局部透皮贴剂。
对于局部应用，这些组合物可以配制在适宜的悬浮或溶解在一种或多种载体中的含有活性成分的软膏剂中。本发明化合物局部给药的载体包括但不限于：矿物油、液态石蜡、白矿蜡、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡以及水。可替换地，这些组合物可以配制在适宜的悬浮或溶解在一种或多种药用载体中的含有活性成分的洗液或乳膏中。适宜的载体包括但不限于矿物油、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蜡、十六/十八醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、苯甲醇以及水。
对于眼科使用，这些组合物可以配制成在等渗、pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或优选地，配制成在等渗、pH调节的无菌盐水中的溶液，其中含有或不含有防腐剂如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)。可替换地，对于眼科使用，这些组合物可以配制在油膏如凡士林中。
本发明的组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入剂给药。这样的组合物是根据药剂剂型技术领域中熟知的技术加以制备的，并且可以制备成盐水溶液，其中采用苯甲醇或其它适宜的防腐剂、用以增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其它常规的增溶剂或分散剂。
数种单克隆抗体已经表明在临床状况下是有效的，如美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗，Rituximab)、赫斯汀(Herceptin)(曲妥珠单抗，Trastuzumab)或Xolair(奥马佐单抗，Omalizumab)，并且类似的给药方案(即，剂型和/或剂量和/或给药程序)可以和本发明的抗体一起使用。本发明药物组合物中抗体的给药时间进程和剂量可以按照用于这些产品的已知方法加以确定，例如利用制造商的说明书。例如，存在于本发明药物组合物中的抗体可以用10mg/mL的浓度在100mg(10mL)或500mg(50mL)的单次使用小瓶中供药。产品是配制在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80、以及注射用灭菌水中，用于IV给药。pH被调节到6.5。用于本发明的药物组合物中的抗体的典型的适宜剂量范围可以是在约10mg/m2和500mg/m2之间。然而，应当明了，这些规范是示范性的，并且考虑到在药物组合物中的特定抗体的亲和力和可耐受性(其必须用临床试验确定)，可以采用最佳的规范和方案。在本发明的药物组合物中使NK细胞饱和24小时、48小时、72小时或一周或一个月的抗体的注射量和时间进程，将鉴于抗体的亲和力以及其药物动力学参数来加以确定。
根据另一种具体实施方式，本发明的抗体组合物可以进一步包括另一种治疗药剂，该药剂包括通常用于特定治疗目的(为其给予该抗体)的药剂。该另外的治疗药剂将通常以一定量存在于组合物中，所述量通常是在单药治疗中对于要治疗的特定疾病或病情所使用的量。这样的治疗药剂包括但不限于：用于治疗癌症的治疗药剂、用来治疗传染性疾病的治疗药剂、用于其它免疫疗法的治疗药剂、细胞因子(如白介素-2或白介素-15)、其它抗体及其它抗体的片段。
例如，多种治疗药剂可用于治疗癌症。本发明的抗体组合物和方法可以和任何通常用于治疗特定的疾病，尤其是肿瘤、癌症、或患者呈现的其它疾病或障碍的其它方法结合。只要特定的治疗方式对患者状态本身不是已知有害，以及不显著地抵消本发明的药物组合物中的抗体的活性，则可以设想其与本发明的结合。
有关实体肿瘤治疗，本发明的药物组合物可以与经典的方式联合在一起加以使用，如外科手术、放射疗法、化学疗法等等。因此本发明提供了综合治疗，其中本发明的药物组合物和外科手术或放射治疗同时使用、在外科手术或放射治疗之前或之后使用；或与常规化疗药物、放射治疗药剂或抗血管形成剂、或靶向免疫毒素或凝血配基(coaguligands)同时、之前、或之后给予患者。
当在治疗方案中一种或多种药剂与本发明的含有抗体的组合物联合使用时，并不要求联合用药的结果是当分开进行每种治疗时所观察到的效应的相加。虽然一般希望至少为相加效应，但任何高于单项治疗的抗癌效应的增加都将是有益的。此外，并不特定要求综合治疗呈现协同效应，虽然这无疑是可能的和有利的。
为了实施综合抗癌治疗，可以用在动物体内有效导致它们的联合抗癌作用的方式，简单地将本发明的抗体组合物连同另一种抗癌药剂给予动物。因此，将提供有效量的所述药剂以及一段有效的时间用以导致它们在肿瘤脉管系统中的联合存在以及它们在肿瘤环境中的联合作用。为了达到此目的，本发明的抗体组合物和抗癌药剂可以同时给予动物，既可用单一的联合组合物，或利用不同给药途径作为两种性质不同的组合物。
可替换地，本发明的抗体组合物的给药可以在抗癌药剂治疗之前或以后，间隔范围，例如，为数分钟至数周以及数月。应当确保，抗癌药剂和本发明的抗体组合物中的抗体对癌症施加有利的联合效应。
在抗血管形成治疗中，大多数抗癌药剂是在给予本发明的抑制性KIR抗体组合物以前给药。然而，当在本发明的抗体组合物中使用抗体的免疫连接物时，则可以同时或连续给予各种抗癌药剂。
在一些情况下，甚至可以希望显著延长治疗时间，其中在相应的给予抗癌药剂或抗癌治疗与给予本发明的抗体组合物之间间隔数天(2，3，4，5，6或7)、数周(1，2，3，4，5，6，7或8)或甚至数月(1，2，3，4，5，6，7或8)。这在下述情况下是有利的：抗癌治疗是用来实质上破坏肿瘤，如外科手术或化学治疗，而给予本发明的抗体组合物是用来防止微转移或肿瘤再生长。
还可以预期，利用本发明的抑制性KIR抗体基组合物或抗癌药剂时将会多于一次给药。基于交替的数天或数周，可以可互换地给予这些药剂；或在用本发明的抑制性KIR抗体组合物进行的治疗周期以后进行抗癌药剂治疗周期。在任何情况下，为了利用综合治疗达到肿瘤消退，全部的需要就是以一个联合有效量递送两种药剂，以施加抗肿瘤效应，无论给药时间如何。
就外科手术而论，可以与本发明结合实施任何外科介入。在放射治疗方面，可以设想在癌细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，如γ-辐照、X-射线、紫外线辐照、微波以及甚至电子发射等等。也可以设想向癌细胞定向递送放射性同位素，并且这可以连同靶向抗体或其它靶向方式一同使用。
在其它方面，可以与本发明的抗体组合物结合或作为本发明的抗体组合物的一部分给予免疫调节化合物或摄入。免疫调节化合物的优选实例包括细胞因子。在这样的联合方式中可以采用各种细胞因子。可用于由本发明设想的联合中的细胞因子的实例包括白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素。在本发明的联合治疗或组合物中使用的细胞因子是按照标准方案给药的，并符合临床指征如患者状态和细胞因子的相对毒性。
在一些具体实施方式中，本发明的包括交叉反应抑制性KIR抗体的治疗组合物可以与化疗药物或激素药剂联合给药，或可以进一步包括化疗药物或激素药剂。在本文披露的联合治疗方法中可以使用各种激素治疗药剂和化疗药物。设想为示范性的化疗药物包括但不限于烷化剂，抗代谢药，细胞毒抗生素，长春花生物碱，例如，阿霉素，更生霉素，丝裂霉素，洋红霉素(去甲柔红霉素)，道诺霉素，多柔比星(多索鲁比辛)，他莫昔芬，紫杉酚(泰素)，泰索帝，长春新碱，长春碱，长春瑞宾，依托泊苷(VP-16)，5-氟尿嘧啶(5FU)，阿糖胞苷，环磷酰胺，噻替派，甲氨蝶呤，喜树碱，放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨基蝶呤，康布瑞塔卡汀(考布他汀)，以及其衍生物和前药。
激素药物包括但不限于，例如，LHRH促效剂如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、以及布舍瑞林；抗雌激素药物如他莫昔芬和托瑞米芬；抗雄激素药物如氟他胺、尼鲁地平、环丙孕酮以及比卡鲁胺；芳香酶抑制剂如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑以及法倔唑；以及孕激素如甲羟孕酮(medroxy)、氯地孕酮以及甲地孕酮。
如本领域技术人员所明了的，化疗药物的适当剂量将接近那些已经在临床治疗中采用的剂量，其中该化疗药物单独或与其它化疗药物联合给药。仅就举例而言，可以使用药剂如顺铂，以及其它烷化DNA。顺铂已经被广泛用来治疗癌症，其中在临床应用中所用的有效剂量为20mg/m2，每3周5天，总共三个疗程。顺铂口服不吸收，因此必须经过静脉、皮下、肿瘤内或腹膜内注射来递送。
另外有用的化疗药物包括那些干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物，以及那些中断多核苷酸前体的合成和重现性的药剂。用于综合治疗的多种典型的化疗药物列在美国专利第6,524,583号的表C中，将其所披露的药剂和适应症以引用方式结合于本文中。列出的每一种药剂是示范性的和非限制性的。本领域技术人员被“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，尤其是624-652页所教导。取决于要治疗的病情，可以改变剂量。实施治疗的医师将能够为个别受治疗者确定适当的剂量。
本发明的交叉反应抑制性KIR抗体组合物可以与任何一种或多种其它抗血管形成疗法联合使用，或可以进一步包括抗血管形成剂。这样药剂的实例包括中和抗体、反义RNA、siRNA、RNAi、RNA适体以及核酶，将每种制剂对准VEGF或VEGF受体(美国专利第6,524,583号，将其披露的内容以引用方式结合于本文中)。如在WO 98/16551中所描述的，也可以采用具有拮抗性能的VEGF的变异体，将其内容以引用方式结合于本文中。可连同综合治疗使用的另外的典型抗血管形成剂列在美国专利第6,524,583号的表D中，将其所披露的药剂和适应症特别以引用方式结合于本文中。
本发明的抑制性KIR抗体组合物也可以有利地与诱导凋亡的方法一起联合使用，或者也可以包括凋亡剂。例如，已经鉴定了多种抑制凋亡、或程序性细胞死亡的癌基因。在此种类中的典型的癌基因包括但不限于：bcr-abl，bcl-2(不同于bcl-1、细胞周期蛋白D1；基因库访问号码M14745，X06487；美国专利第5,650,491号以及第5,539,094号；将每一个以引用方式结合于本文中)以及家族成员，其包括Bcl-x1、Mcl-1、Bak、A1、以及A20。首先在T细胞淋巴瘤中发现了bcl-2的过表达。癌基因bcl-2通过结合和灭活Bax，一种在凋亡途径中的蛋白质，而起作用。bcl-2功能的抑制可防止Bax的失活，并使凋亡途径能够继续进行。这类癌基因的抑制，例如，可以预期利用反义核苷酸序列、RNAi、siRNA或小分子化合物供本发明之用以增强凋亡(美国专利第5,650,491号、第5,539,094号、以及第5,583,034号，将其每一个以引用方式结合于本文中)。
本发明的抑制性KIR抗体组合物也可以包括或与一些分子联合使用，其中所述分子包括靶向部分，例如，抗体、配体、或其轭合物，其指向靶细胞的特异性标记物(“靶向剂”)，例如靶肿瘤细胞。一般来说，供本发明的这些另外方面之用的靶向剂将优选识别易接近的肿瘤抗原，这些肿瘤抗原优先地、或特异性地表达在肿瘤部位。通常该靶向剂将结合于肿瘤细胞的表面表达成分、表面可及成分或表面定域成分。这些靶向剂还将优选呈现较高亲和力的性能；并且将不会对维持生命的正常组织在体内施加显著的副作用，如选自下述的一种或多种组织：心脏、肾、脑、肝、骨髓、结肠、胸、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经纤维、胰、皮肤、或人体中的其它维持生命的器官或组织。如在本文中所使用的，术语“不施加显著的副作用”是指以下事实：当在体内给药时，靶向剂将仅产生可忽略的或临床上易处理的副作用，如那些通常在化疗期间遇到的副作用。
在治疗肿瘤时，本发明的抗体组合物可以另外包括或可以与附加化合物联合使用。附加化合物可以包括例如镇吐药如血清素拮抗剂和治疗药如吩噻嗪，取代的苯甲酰胺，抗组胺，丁酰苯，皮质类固醇，苯并二氮杂类，以及大麻素；二磷酸盐如唑来膦酸和帕米膦酸；以及造血生长因子如红细胞生成素和G-CSF，例如非格司亭、来格司亭以及darbepoietin。
在另一种具体实施方式中，本发明的具有不同交叉反应度的两种或更多种抗体(包括NKVSF1)可以结合在单个组合物中，以便中和尽可能多的抑制性KIR基因产物的抑制效应。包括结合本发明的交叉反应抑制性KIR抗体、或其片段或衍生物的组合物将允许进行甚至更广泛的应用，因为可能存在小百分比的人群，其可能缺乏由单一交叉反应抗体识别的每一种抑制性KIR基因产物。类似地，本发明的抗体组合物可以进一步包括一种或多种抗体，这些抗体识别单一抑制性KIR亚型。这样的结合将再次提供在治疗调整中的更广泛的应用。
本发明还提供了为有需要的患者增强NK细胞活性的方法，该方法包括将根据本发明的组合物给予所述患者的步骤。该方法更具体地涉及在患有疾病(其中增加的NK细胞活性是有益的)的患者中增加NK细胞活性，其涉及、影响或由对由NK细胞进行的溶解敏感的细胞所引起，或其由不足的NK细胞活性所引起或特点在于NK细胞活性不足，如癌症、另一种增生性病症、传染性疾病或免疫性疾病。更具体地说，本发明的方法用于治疗各种癌症以及其它增生性病症，其包括但不限于：癌，包括膀胱癌，乳房癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰癌，胃癌，颈癌，甲状腺癌以及皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病，急性淋巴细胞白血病，急性成淋巴细胞白血病，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多毛细胞淋巴瘤以及伯基特淋巴瘤(Burkitts lymphoma)；骨髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞源性白血病以及前髓细胞白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤，精原细胞瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤以及胶质瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤，成神经细胞瘤，胶质瘤，以及神经鞘瘤(施万鞘瘤)；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，以及骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑色素瘤，着色性干皮病，角化棘皮瘤，精原细胞瘤，甲状腺滤泡性癌以及畸胎癌。
根据本发明可以治疗的优选病症包括：淋巴样谱系的造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症如T前淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑样细胞型；优选T细胞型的大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)；塞泽里综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；周围/后胸腺T细胞淋巴瘤(多形和成免疫细胞亚型)；血管成免疫细胞T细胞淋巴瘤；血管源性(鼻)T细胞淋巴瘤；间变性(退行性)(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T成淋巴细胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
根据本发明也可以治疗其它增生性病症，包括例如增生，纤维化(尤其是肺纤维化，而且其它类型的纤维化如肾纤维化)，血管发生，银屑病，血管中的动脉粥样硬化和平滑肌增生，如狭窄或血管成形术以后的再狭窄。
本发明的交叉反应抑制性KIR抗体可以用来治疗或预防传染性疾病，优选包括由病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌引起的任何感染。这样的病毒传染性生物包括但不限于：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、棘病毒(echinovirus)、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒以及人免疫缺陷病毒I型或II型(HIV-1、HIV-2)。
根据本发明可以治疗的细菌性感染包括但不限于由下述引起的感染：葡萄球菌属；链球菌属，包括化脓链球菌；Enterococcl；杆菌属，包括炭疽杆菌；乳酸杆菌属；利斯特杆菌属；白喉棒状杆菌；加德纳氏菌属，包括阴道加德纳氏菌；诺卡氏菌属；链霉菌属；普通高温放线菌；密螺旋体属；螺旋体属(Treponerna)；假单胞菌属，包括Raeruginosa；军团菌属；奈瑟菌属，包括淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌；黄杆菌属，包括脑膜脓毒性黄杆菌和芳香黄杆菌；布鲁氏菌属；博德特氏杆菌属，包括百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌；埃希氏菌属，包括大肠埃希氏菌；克雷白氏菌属；肠杆菌属；沙雷氏菌属，包括粘质沙雷氏菌和液化沙雷氏菌；爱德华菌属；变形杆菌属，包括奇异变形杆菌和普通变形杆菌；链杆菌属；立克次体科，包括立氏立克次体(R.rickettsii)；衣原体属，包括鹦鹉热衣原体和沙眼衣原体；分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、以及鼠麻风分枝杆菌；以及诺卡氏菌属。
根据本发明可以治疗的原生动物感染包括但不限于由利什曼原虫、kokzidioa、以及锥虫属引起的感染。在疾病控制中心(CDC)的传染病国家中心(NCID)的万维网站(http：//www.cdc.gov/ncidod/diseases/)，可以找到传染病的完整清单，将该清单以引用方式结合于本文中。所有所述疾病都是利用本发明的交叉反应抑制性KIR抗体进行治疗的候选疾病。
这样的治疗各种传染性疾病的方法可以采用本发明的抗体组合物，单独或与已知用于治疗这样的疾病的其它治疗和/或治疗药剂联合使用，包括抗病毒药、抗真菌药、抗菌药、抗生素、抗寄生虫药以及抗原虫药。当这些方法涉及用另外的治疗药剂进行另外的治疗时，那些药剂可以作为单剂型或作为分开的多剂型与本发明的抗体一起给药。当作为分开的剂型给药时，另外的药剂可以在给予本发明的抗体以前、同时、或以后给药。
本发明的另外方面和优点将在以下的实验部分加以披露，其应被认为是说明性的而不限制本申请的保护范围。
实施例1
PBL的纯化以及多克隆或克隆NK细胞系的产生
借助Ficoll Hypaque梯度和排除可塑粘附细胞，PBL衍生自健康供体。为了获得富集的NK细胞，用抗CD3、抗CD4以及抗HLA-DR单克隆抗体(在4℃下 30分钟)，接着用山羊抗鼠磁珠(Dynal)(在4℃下30分钟)对PBL进行温育，然后用本技术领域已知的方法进行免疫磁性选择(Pende et al.，1999)。在照射喂养细胞和100U/ml白介素2(普罗留因，Chiron公司)以及1.5ng/ml植物血凝素A(Gibco BRL)上培养CD3-、CD4-、DR-细胞，以获得多克隆NK细胞种群。通过限制稀释克隆了NK细胞，并且NK细胞的克隆通过用于细胞表面受体表达的流式细胞计数法来表征。
使用的单克隆抗体是JT3A(IgG2a，抗CD3)、EB6和GL183(分别为IgG1抗KIR2DL1和KIR2DL3)、XA-141 IgM(抗KIR2DL1，具有和EB6相同的特异性)、抗CD4(HP2.6)以及抗DR(D1.12，IgG2a)。可以使用可商业获得的具有相同特异性的单克隆抗体(Beckman Coulter公司，Fullerton，CA)代替由本申请人制备的JT3A、HP2.6、以及DR1.12。EB6和GL183可商业获得(Beckman Coulter公司，Fullerton，CA)。XA-141不能商业获得，但EB6如在(Moretta et al.，1993)中所描述的可以用于溶解的对照重构。
用适宜的抗体(在4℃下30分钟)、接着用PE或FITC共轭的多克隆抗鼠抗体(Southern Biotechnology Associates Inc)对细胞进行染色。用FACSAN仪器(Becton Dickinson，Mountain View，CA)并通过细胞荧光测定分析对样品进行分析。
下述克隆用于本研究中。CP11、CN5以及CN505是KIR2DL1阳性克隆并且用EB6(IgG1抗KIR2DL1)或XA-141(IgM抗KIR2DL1，和EB6抗体相比其具有相同的特异性)加以染色。CN12和CP502是KIR2DL3阳性克隆，并且用GL183抗体(IgG1抗KIR2DL3)进行染色。
NK克隆的细胞溶解活性是通过标准4小时51Cr释放测定来评估的，其中用Cw3或Cw4阳性细胞系(因其对NK细胞溶解的敏感性而众所周知)对效应物NK细胞进行试验。在微量滴定板中以5000个细胞/孔使用所有的靶标，并且效应物∶靶的比率表示在图中(通常为4效应物/靶细胞)。在有或没有指定的以1/2稀释的单克隆抗体的上清液的情况下，进行细胞溶解测定。该程序实质上与在(Moretta et al.，1993)中描述的相同。
实施例2
新单克隆抗体的产生
如在(Moretta et al.，1993)中所述，通过用激活的多克隆或单克隆NK细胞系免疫5周龄Balb C小鼠来产生单克隆抗体。在不同的细胞融合以后，考虑到单克隆抗体与EB6和GL183阳性NK细胞系进行交叉反应以及克隆的能力，首先对单克隆抗体进行选择。针对它们的重构溶解的能力，对阳性单克隆抗体进一步进行筛选，其中溶解是分别通过Cw4或Cw3阳性靶的EB6阳性或GL183阳性NK克隆进行的。
细胞染色是按如下所述进行的。用一组抗体(1μg/ml或50μl上清液，在4℃下30分钟)、接着用PE共轭的山羊F(ab′)2片段抗-鼠IgG(H+L)或PE共轭的山羊F(ab′)2片段抗-人IgG(Fcγ)抗体(Beckman Coulter)对细胞进行染色。用Epics XL.MCL仪器(Beckman Coulter)进行细胞荧光测定分析。
研究发现，单克隆抗体之一，DF200 mAb，与KIR家族的各种成员(包括KIR2DL1、KIR2DL2/3)进行反应。用DF200mAb鲜明地对KIR2DL1+和KIR2DL2/3+NK细胞进行染色(图1)。
表达这些HLA类型I特异抑制性受体的一种或另一种(或甚至两者)的NK克隆用作相对于表达一种或多种HLA等位基因的靶细胞的效应物细胞。如下所述进行了细胞毒性测定。用标准4小时51Cr释放测定评估了YTS-KIR2DL1或YTS-Eco细胞系的细胞溶解活性。用HLA-Cw4阳性或阴性EBV细胞系和HLA-Cw4转染721.221细胞试验了效应物细胞。在微量滴定板中以3000细胞/孔使用所有的靶标。效应物/靶比率表示在图中。在有或没有单克隆鼠或人抗体的指定全长或F(ab′)2片段的情况下，进行细胞溶解测定。如所预期的，KIR2DL1+NK克隆对表达HLA-Cw4的靶细胞显示很小的(如果有的话)细胞溶解活性，而KIR2DL3+NK克隆对Cw3阳性靶标显示很小的活性或不显示活性。然而，在有DF200mAb(用来掩蔽它们的KIR2DL受体)存在的情况下，NK克隆变得不能识别它们的HLA-C配体并对Cw3或Cw4靶标显示强的细胞溶解活性。
例如，由KIR2DL1+NK克隆(CN5/CN505)未杀伤C1R细胞系(CW4+EBV细胞系，ATCC n℃RL1993)，但利用DF200或常规的抗KIR2DL1 mAb可有效逆转抑制作用。另一方面，表达KIR2DL2/3+KIR2DL1-表型(CN12)的NK克隆有效地杀伤了C1R细胞并且这种杀伤不受DF200mAb的影响(图2)。对Cw3阳性靶标用KIR2DL2-或KIR2DL3-阳性NK克隆获得了类似的结果。
类似地，KIR2DL1+转染NK细胞未杀伤Cw4+221 EBV细胞系，但利用DF200，一种DF200 Fab片段，或常用的抗KIR2DL1 mAbEB6或XA141可有效逆转抑制作用。此外，由KIR2DL2+NK细胞未杀伤Cw3+221 EBV细胞系，但利用DF200或一种DF200 Fab片段可逆转这种抑制。最后，由KIR2DL3+NK细胞未杀伤后者Cw3+221 EBV细胞系，但利用DF200 Fab片段或常用的抗KIR2DL3mAb GL183或Y249可逆转这种抑制作用。结果示于图3中。
为了确定它们重构Cw4阳性靶标的溶解能力还对F(ab′)2片段进行了试验。DF200和EB6 Abs的F(ab′)2片段均能够逆转通过Cw4转染的221细胞系和Cw4+TUBO EBV细胞系的KIR2DL1转染的NK细胞的溶解的抑制作用。结果示于图4中。
实施例4
新的人单克隆抗体的产生
人单克隆抗KIR抗体(Abs)是通过使转基因鼠免疫而产生，该转基因鼠经工程化用重组体KIR蛋白来表达人抗体表达谱。在不同的细胞融合以后，首先相对于它们与经固定的KIR2DL1及KIR2DL2蛋白进行交叉反应的能力来选择单克隆抗体。研究发现，数种单克隆抗体，包括1-7F9、1-4F1、1-6F5以及1-6F1，与KIR2DL1以及KIR2DL2/3反应。
相对于它们通过表达Cw4阳性靶细胞的KIR2DL1的EB6阳性NK转染子重构溶解的能力，进一步筛选阳性单克隆抗体。表达HLA类型I特异抑制性受体的NK细胞用作相对于表达一种或多种HLA-C等位基因的靶细胞的效应物细胞(图5和图6)。如上所述进行细胞毒性测定。效应物/靶比率表示在图中，并且以10μg/ml或30μg/ml使用抗体。
如所预期的，KIR2DL1+NK细胞相对于表达HLA-Cw4的靶细胞显示很小的(如果有的话)细胞溶解活性。然而，在有1-7F9 mAb存在的情况下，NK细胞变得不能识别它们的HLA-C配体并且对Cw4靶标显示强的细胞溶解活性。例如，KIR2DL1+NK细胞未杀伤两个试验的细胞系(HLA-Cw4转染的721.221和CW4+EBV细胞系)，但利用Mab 1-7F9或常规抗KIR2DL1 mAb EB6可有效逆转抑制作用。将抗体DF200和panKIR(也称作NKVSF1)与1-7F9进行比较。另一方面，抗体1-4F1、1-6F5以及1-6F1不能重构NK细胞对Cw4阳性靶标的细胞溶解。
实施例5
DF200 mAb/KIR2DL1以及DF200 mAb/KIR2DL3相互作用的Biacore分析
重组体蛋白的产生和纯化
在大肠埃希氏菌(大肠杆菌)中产生KIR2DL1及KIR2DL3重组体蛋白。分别由pCDM8克隆47.11载体(Biassoni et a1，1993)及RSVS(gpt)183克隆6载体(Wagtman et al，1995)并通过PCR对编码KIR2DL1和KIR2DL3的整个细胞外结构域的cDNA进行扩增，其中使用以下引物：
有义：
5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3’
反义：5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’
它们被克隆进入pML1表达载体，与对生物素化信号进行编码的一个序列符合读框(Saulquin et al，2003)。
在BL21(DE3)细菌株(Invitrogen)中进行蛋白质表达。经转染的细菌在37℃下并在补充以氨苄西林(100μg/ml)的培养基中生长到OD600＝0.6，并用1mM IPTG诱导表达。
在变性条件(8M脲)下从包含体(包涵体)中回收蛋白质。在20mM的Tris、pH为7.8、NaCl为150mM的缓冲液(含有L精氨酸(400mM，Sigma)以及β-巯基乙醇(1mM))中并在室温下，通过在6步透析中降低脲浓度(分别为4、3、2、1、0.5以及0M脲)，对重组体蛋白进行再折叠。在0.5和0M脲透析步骤期间加入还原和氧化谷胱甘肽(分别为5mM和0.5mM，Sigma)。最后，相对于10mM的Tris、pH为7.5、NaCl为150mM的缓冲液彻底透析蛋白质。浓缩可溶的、再折叠蛋白质，然后用Superdex 200大小排阻柱(Pharmacia；AKTA system)进行纯化。
用Biacore仪器(Biacore)进行表面等离子共振测量。在所有的Biacore实验中，补充以0.05％表面活性剂P20的HBS缓冲液用作流动缓冲液。
蛋白质固定
将如上所产生的重组体KIR2DL1及KIR2DL3蛋白共价固定到在传感器芯片CM5(Biacore)上的葡聚糖层中的羧基基团。将传感器芯片表面用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，Biacore)激活。将在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH为4.5)中的蛋白质注入。利用100mM、pH为8的乙醇胺(Biacore)进行剩余激活基团的失活作用。
亲和力测量
为了进行动态测量，将不同浓度的可溶性抗体(1×10-7至4×10-10M)施加到经固定的样品上。以20μl/min的连续流速进行测量。对于每一循环，传感器芯片的表面是通过注入5μl的10mM、pH为11的NaOH进行再生的。将BIAlogue动力学评价(BIAlogueKinetics Evaluation)程序(BIAevaluation 3.1，Biacore)用于数据分析。可溶性被分析物(40μl，以各种浓度)以在HBS缓冲液中20μl/min的流速被注射到分别含有500或540反射单位(RU)、以及1000或700RU的KIR2DL1和KIR2DL3的葡聚糖层上。数据代表6个独立的实验。结果示于以下的表1中。
表1.结合于经固定的KIR2DL1和KIR2DL3的DF200 mAb的BIAcore分析
  蛋白质   KD(10-9M)
  KIR2DL1   10.9+/-3.8
  KIR2DL3   2.0+/-1.9
KD：解离常数。
实施例6
鼠和人抗KIR抗体的Biacore竞争性结合分析
用如前所述(Gauthier et al 1999，Saunal和van Regenmortel1995)的鼠抗-KIR 2D抗体DF200、Pan2D、gl183和EB6，以及人抗-KIR 2D抗体1-4F1、1-6F1、1-6F5和1-7F9，对经固定的KIR 2DL1(900RU)、KIR 2DL3(2000RU)以及KIR 2DS1(1000RU)进行抗原决定部位图分析。
所有实验是在5μl/min的流速下、在HBS缓冲液中并在2分钟注射不同抗体(15μl/ml)的情况下进行的。对于每对抗体，竞争性结合分析分两步进行。在第一步骤，将第一单克隆抗体(mAb)注射到KIR 2D靶蛋白上，接着是第二单克隆抗体(没有除去第一单克隆抗体)，然后监测第二单克隆抗体的RU值(RU2)。在第二步骤中，首先直接在裸露的KIR 2D蛋白上注射第二单克隆抗体，然后监测单克隆抗体的RU值(RUl)。第一单克隆抗体对结合于KIR2D蛋白的第二单克隆抗体的抑制百分比是通过100*(1-RU2/RU1)加以计算的。
结果示于表2、表3以及表4中，其中称为“第一抗体”的抗体被列在垂直列中，而“第二抗体”被列在水平行中。对于每个试验的抗体结合，抗体对于芯片的直接结合水平(RU)的值列在表中，其中第二抗体与KIR2D芯片的直接结合列在表区的上部，而当第一抗体存在时第二抗体与KIR2D芯片的结合值列在表区的下部。列在每个表区右边的是第二抗体结合的抑制百分比。表2表示在KIR2DL1芯片上的结合，表3表示抗体与KIR2DL3芯片的结合，而表4表示抗体与KIR2DS1芯片的结合。评估了鼠抗体DF200、NKVSF1和EB6，以及人抗体1-4F1、1-7F9和1-6F1对于经固定的KIR2DL1、KIR2DL2/3以及KIR2DS1的竞争性结合。来自对于抗-KIR抗体结合于KIR2DL1的实验的抗原决定部位作图(图7)表明：(a)抗体1-7F9与EB6以及1-4F1竞争，但不与NKVSF1以及DF200竞争；(b)抗体1-4F1依次与EB6、DF200、NKVSF1以及1-7F9竞争；(c)NKVSF1与DF200、1-4F1以及BE6竞争，但不与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1、1-4F1以及EB6竞争，但不与1-7F9竞争。来自对于抗-KIR抗体的结合于KIR2DL3的实验的抗原决定部位作图(图8)表明：(a)1-4F1与NKVSF1、DF200、gl183以及1-7F9竞争；(b)1-7F9与DF200、gl183以及1-4F1竞争，但不与NKVSF1竞争；(c)NKVSF1与DF200、1-4F1以及GL183竞争，但不与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1、1-4F1以及1-7F9竞争，但不与GL183竞争。来自对于抗-KIR抗体的结合于KIR2DS1的实验的抗原决定部位作图(图9)表明：(a)1-4F1和与NKVSF1、DF200以及1-7F9竞争；(b)1-7F9与1-4F1竞争，但不与DF200以及NKVSF1竞争；(c)NKVSF1与DF200以及1-4F1竞争，但不和与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1以及1-4F1竞争，但不与1-7F9竞争。
实施例7
抗-KIR mAb滴定食蟹猴NK细胞
对抗-KIR抗体NKVSF1进行了试验，以确定其结合于来自食蟹猴的NK细胞的能力。该抗体与猴NK细胞的结合示于图10中。
猴PBMC的纯化以及多克隆NK细胞主体的产生
食蟹猕猴PBMC制备自柠檬酸钠CPT管(Becton Dickinson)。NK细胞纯化是通过负排空来进行的(猕猴NK细胞富集试剂盒，Sten Cell Technology)。在经照射的人喂养细胞、300U/ml白介素2(普罗留因，Chiron公司)以及1ng/ml植物血凝素A(Invitrogen，Gibco)上培养NK细胞，以获得多克隆NK细胞种群。
Pan2D mAb滴定食蟹猴NK细胞
将食蟹猴NK细胞(NK主体(bulk)，第16天)用不同量的Pan2D mAb接着用PE-共轭的山羊F(ab’)2片段抗-鼠IgG(H+L)抗体进行孵育。阳性细胞的百分数用同种型对照(纯化的鼠IgG1)进行确定。将样品制成双份。平均荧光强度＝MFI。
                            表2：KIR2DL1抗原决定部位作图
                                    ←第二抗体→
  第一抗体(以下)   DF200   Pan2D   EB6   1-4F1   1-7F9  1-6F1  1-6F5
  DF200   80％   90％   490   92％40   480   27％350  540  15％460  400  15％340
  Pan2D   90％   90％   900   95％50   860   2％840  750  12％660  600  13％520
  EB6   60％   40％   460   57％200   370   48％190   490   65％170  260  23％200  未获得(nd)
  1-4F1
  1-7F9   600   10％545   545   2％534   460   60％180   360   95％16  330  9％300  未获得(nd)
  1-6F1   350   11％310   475   7％440   260   18％320   360   23％275   490   10％440  未获得(nd)
  1-6F5   350   17％290   475   7％440   未获得(nd)   360   17％300   未获得  290  40％170
                        表3：KIR2DL3抗原决定部位作图
                                ←第二抗体→
  第一抗体(以下)   DF200   Pan2D   gl183   1-4F1   1-7F9   1-6F1   1-6F5
  DF200   75％   20％   1270  75％320   520   62％200   550  16％460   440  4％420
  Pan2D   95％   85％   2250  68％730   880   15％750   840  8％770   560  18％460
  gl183   8％   40％   1300  75％330   670   76％160   530  18％430   未获得(nd)
  1-4F1   1140  82％210   2400  63％890   1240  73％330   1050  87％140
  1-7F9   770  42％450   870   5％830   800   75％200   1000  63％270
  1-6F1   790  4％760   990   0％1090   620   8％570
  1-6F5   800  5％760   990   4％950   未获得(nd)
                  表4：KIR2DS1抗原决定部位作图
                          ←第二抗体→
  第一抗体(以下)   DF200   Pan2D   1-4F1   1-7F9
  DF200   70％   660  87％80   975  15％825
  Pan2D   100％   650  100％-8   920  45％*500
  1-7F9   900   17％1090   1350  11％1200   660  96％23
实施例8
结合于KIR2DL1的DF200和pan2D的抗原决定部位作图
基于它们公布的晶体结构，对KIR2DL1、-2和-3(KIR2DL1-3)的细胞外结构域进行计算机模拟( Maenaka et al.(1999)，Fan et al.(2001)，Boyington et al.(2000))，预测在KIR2DL1和KIR2DL1-3交叉反应鼠单克隆抗体(mAb’s)DF200以及pan2D之间的相互作用中涉及氨基酸R1311(1单信息氨基酸密码)。为了验证以上所述，制备了包括KIR2DL1的完整细胞外结构域(氨基酸H1-H224)的融合蛋白，野生型或点突变(例如，R131W2)，并融合于人Fc(hFc)(2在KIR2DL1中在第131位的氨基酸(来自N末端)用R取代W)。已经描述了用来产生和评价各种KIR2DL1-hFc融合蛋白的材料和方法(Winter and Long(2000))。简而言之，通过CL42-Ig的基于PCR的突变发生(Quickchange II，Promega)产生了KIR2DL1(R131W)-hFc编码的cDNA-载体，其中CL42-Ig是公布的用于产生野生型KIR2DL1-hFc的cDNA-载体(Wagtmann et al.(1995))。KIR2DL1-hFc和KIR2DL1(R131W)-hFc是在COS7细胞中产生的并分离自组织培养基，尤其是如(Wagtmann et al.(1995))所述。为了试验它们的正确折叠，将KIR2DL1-hFc和KIR2DL1(R131W)-hFc用LCL721.221细胞进行孵育，其中LCL721.221细胞表达HLA-Cw3(不是KIR2DL1配体)或HLA-Cw4(KIR2DL1配体)，然后通过FACS(一种用于研究在细胞表面上的蛋白质相互作用的标准技术)分析了KIR-Fc融合蛋白与细胞之间的相互作用。独立实验的一个实例在图11的图片A中给出。如由文献预测的，没有KIR2DL1-hFc融合蛋白与表达LCL721.221细胞的HLA-Cw3结合。相反，KIR2DL1-hFc与KIR2DL1(R131W)-hFc两者均与表达LCL721.221细胞的HLA-Cw4结合，从而证实了它们的正确折叠。
利用ELISA(一种研究蛋白质相互作用的标准技术)研究了KIR2DL1(R131W)-hFc及KIR2DL1-hFc与KIR特异性单克隆抗体(DF200、pan2D、EB6以及GL183)的结合。简而言之，借助于山羊抗-人抗体，将KIR2DL1(R131W)-hFc及KIR2DL1-hFc连接于96孔板，其后加入各种浓度(0-1μg/ml，在PBS中)的KIR特异性单克隆抗体。通过分光光度法(450nm)，使KIR2DL1-hFc变异体与单克隆抗体之间的相互作用直观化，其中利用对鼠抗体特异的过氧化物酶偶联的第二抗体用以转化TMB底物。独立实验的一个实例在图11的图片B中给出。尽管KIR2DL2-3特异性单克隆抗体GL183不能结合任何KIR2DL1-hFc融合蛋白，但KIR2DL1特异性单克隆抗体EB6、DF200以及pan2D以剂量依赖方式与KIR2DL1-hFc变异体结合。单点突变(R131W)影响DF200与pan2D的结合，并与以约10％的最高浓度的单克隆抗体(1μg/ml)的野生型相比降低了结合，这证实在KIR2DL1的细胞外结构域2中R131是DF200和pan2D的结合部位的一部分。
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在本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请以及专利，以引用方式结合于此，如同每个单独公开出版物或专利申请被各自或特定指出的那样通过引证合并入本文中。
所有标题以及小标题在本文中是为了方便起见加以使用而不应看作是以任何方式限制本发明。
上述要素(以其任何可能的变化形式)的结合包括在本发明中，除非在本文中另有说明或在不同的情况下明显与上下文相矛盾。
除非在本文中另作说明或与本文的内容明显矛盾，在描述本发明的上下文中所使用的术语“一”和“该”以及类似的指代词应理解为包括单数和复数。
除非在本文中另作说明，在本文中数量范围的描述仅仅是作为落入该范围内的单独涉及到的各离散值的简略表达方法，并且将各离散值合并入本说明书中如同在本文中单独说明的那样。除非另作说明，本文中给出的所有确定值是相应的近似值的代表(例如相对于一个特定因子或测量值所提供的所有的示例性准确数值也可以被认为提供相应的近似测量值，恰当的时候，可以修改为“约”)。
本文中描述的所有方法可以按任何适宜的顺序实施，除非在本文中另作说明或明显与本文内容相矛盾。
除非另作说明，本文中使用的任意和所有的实施例(具体实施方式、实例)、或示例性语言(例如“如”、“例如”)仅仅用于更好地描述本发明，并不对本发明的范围造成限制。除非作明确表述，本说明书中没有词语可以被解释为任何一个要素是完成本发明所必需的。
本文中专利文献的引用和结合在此仅仅是为了方便起见，并不反映对这些专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的观点。
在本发明的任何一个方面或具体实施例的描述中，相对于一种要素或多种要素使用术语如“包括”、“具有”、“包含”或“含有”是为了对“由......组成”，“实质上由......组成”或“主要包括”该特定要素或多种要素的本发明的类似方面或实施例提供支持，除非在其它处加以说明或明显与本文内容相矛盾(例如，本文中所描述的包括特定成分的组合物也应当理解为描述了一种由该成分组成的组合物，除非在其它处加以说明或明显与本文内容相矛盾)。
本发明包括由可适用法律最大限度允许的、在本申请的各个方面或权利要求中所叙述的发明主题的所有变化和等效物。

Claims (55)

1.一种与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体，其中所述抗体在表达至少所述两种不同的人抑制性KIR受体之一的NK细胞中能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
2.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体不是NKVSF1。
3.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3相结合。
4.根据权利要求3的抗体，其中所述抗体抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。
5.根据权利要求4的抗体，其中所述抗体结合于实质上与单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位。
6.根据权利要求5的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或单克隆抗体的片段。
7.根据权利要求6的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体DF200或其片段。
8.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是一抗体片段，它选自Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、双功能抗体、单链抗体片段、或包括多个不同抗体片段的多特异性抗体。
9.根据权利要求6的抗体，其中所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
10.一种杂交瘤，包括：
a)来自非人哺乳动物宿主的B细胞，其已用包括存在于抑制性KIR多肽上的抗原决定部位的抗原加以免疫，融合到
b)永生化细胞，
其中所述杂交瘤产生的单克隆抗体与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合，并且对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
11.根据权利要求10的杂交瘤，其中所述杂交瘤并不产生单克隆抗体NKVSF1。
12.根据权利要求10的杂交瘤，其中所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3相结合。
13.根据权利要求12的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生的一种抗体抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。
14.根据权利要求12的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生的一种抗体结合于实质上与由杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位。
15.根据权利要求14的杂交瘤，其中所述杂交瘤是DF200。
16.一种产生与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)用包括抑制性KIR多肽的免疫原对非人哺乳动物进行免疫；
b)由所述经免疫的动物制备抗体，其中所述抗体与所述KIR多肽相结合，
c)选择(b)的抗体与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物进行交叉反应，以及
d)选择(c)的抗体，所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，
其中所述步骤(c)和(d)的次序可随意颠倒。
17.根据权利要求16的方法，其中在步骤c)或d)中选择的所述抗体不是NKVSF1。
18.根据权利要求16的方法，其中在步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。
19.根据权利要求16的方法，其中用于免疫作用的所述抑制性KIR多肽是KIR2DL多肽，而在步骤(c)中选择的所述抗体至少与KIR2DL1和KIR2DL2/3进行交叉反应。
20.根据权利要求19的方法，其中在步骤(c)中选择的所述抗体抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-c等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。
21.根据权利要求16的方法，其中在步骤(d)中选择的所述抗体引起NK细胞毒性至少增强约50％。
22.根据权利要求16的方法，其中所述抗体或抗体片段结合于实质上和单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位。
23.根据权利要求18的方法，包括另外的制备所述选择的单克隆抗体的片段的步骤。
24.一种产生与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)从文库或表达谱中选择单克隆抗体或抗体片段，所述单克隆抗体或抗体片段与至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物进行交叉反应，以及
b)选择(a)的抗体，所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用。
25.根据权利要求24的方法，其中在步骤b)中选择的所述抗体不是NKVSF1。
26.根据权利要求24的方法，其中在步骤(b)中选择的所述抗体抑制在第80位具有赖氨酸残基的HLA-c等位基因分子与人KIR2DL1受体的结合、以及在第80位具有天冬酰胺残基的HLA-C等位基因分子与人KIR2DL2/3受体的结合。
27.根据权利要求24的方法，其中在步骤(b)中选择的所述抗体引起NK细胞毒性增强至少50％。
28.根据权利要求24的方法，其中所述抗体结合于实质上和单克隆抗体DF200相同的抗原决定部位。
29.根据权利要求24的方法，包括另外的制备所述选择的单克隆抗体的片段的步骤。
30.一种产生与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)在引起所述单克隆抗体表达的条件下培养权利要求10至15中任一项所述的杂交瘤；以及
b)从所述杂交瘤中分离所述单克隆抗体。
31.根据权利要求30的方法，包括另外的制备所述单克隆抗体的片段的步骤。
32.一种产生与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体的方法，其中所述抗体对表达所述至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物的NK细胞种群能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述方法包括以下步骤：
a)从权利要求10至15中任一项所述的杂交瘤中分离出对所述单克隆抗体进行编码的DNA；
b)任选对所述DNA进行的修饰以便为选自人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或抗体的免疫反应片段的经修饰或衍生的抗体进行编码；
c)将所述DNA或经修饰的DNA插入表达载体，其中，当所述表达载体存在于在适宜条件下生长的宿主细胞中时，所述抗体或抗体片段能够被表达；
d)用所述表达载体转染宿主细胞，其中所述宿主细胞并不用另外产生免疫球蛋白；
e)在引起所述抗体或抗体片段表达的条件下培养所述转染的宿主细胞；以及
f)分离由所述转染的宿主细胞产生的抗体或抗体片段。
33.一种药物组合物，包括一种与至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物相结合的抗体，其中所述抗体对表达所述至少所述两种不同的人抑制性KIR受体之一的NK细胞能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，所述抗体的存在量有效地对患者的或包括NK细胞的生物样品的NK细胞的细胞毒性产生可检测的增强；以及一种药用载体或赋形剂。
34.根据权利要求33的组合物，进一步包括一种治疗药剂，它选自免疫调节剂、激素药物、化疗药物、抗血管形成剂、凋亡剂、与抑制性KIR受体相结合并使其受抑制的第二抗体、抗感染药、靶向剂或附加化合物。
35.根据权利要求34的组合物，其中所述免疫调节剂选自白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、α-干扰素、β-干扰素、或γ-干扰素。
36.根据权利要求34的组合物，其中所述化疗药物选自烷化剂、抗代谢药、细胞毒抗生素、阿霉素、更生霉素、丝裂霉素、洋红霉素、道诺霉素、多柔比星、他莫昔芬、紫杉酚、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、噻替派、甲氨蝶呤、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨基蝶呤、康布瑞塔卡汀、其它长春花生物碱、以及其衍生物或前药。
37.根据权利要求34的组合物，其中所述激素药物选自亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟他胺、尼鲁地平、环丙孕酮、比卡鲁胺、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、法倔唑、甲羟孕酮、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH促效剂、其它抗雌激素药、其它抗雄激素药、其它芳香酶抑制剂、以及其它孕激素。
38.根据权利要求34的组合物，其中所述附加化合物选自吩噻嗪、取代的苯甲酰胺、抗组胺、丁酰苯、皮质类固醇、苯并二氮杂类、大麻素、唑来膦酸、帕米膦酸、红细胞生成素、G-CSF、非格司亭、来格司亭、darbepoietin、其它镇吐药、其它血清素拮抗剂、其它二磷酸盐或其它造血生长因子。
39.根据权利要求34的组合物，其中所述凋亡剂是一个反义核苷酸序列、RNAi、siRNA或小分子化合物，它抑制选自bcr-abl、bcl-2、Bcl-x1、Mcl-1、Bak、A1、或A20的基因表达。
40.根据权利要求34的组合物，其中所述抗血管形成剂选自中和抗体、反义RNA、siRNA、RNAi、RNA适体或核酶，其对准编码VEGF的基因、编码VEGF受体的基因、VEGF、或VEGF受体；或对VEGF具有拮抗性能的VEGF的变异体。
41.根据权利要求34的组合物，其中所述与抑制性KIR受体相结合并使其受抑制的第二抗体是一种抗体或其衍生物或片段，它结合于抑制性KIR受体的抗原决定部位，而所述抗原决定部位不同于由所述抗体结合的存在于至少两种不同的人抑制性KIR受体基因产物上的共同决定簇的抗原决定部位。
42.一种在有需要患者体内增强NK细胞活性的方法，包括将权利要求33所述的组合物给予所述患者的步骤。
43.根据权利要求42的方法，其中所述患者患有癌症、另外一种增生性病症、传染性疾病或免疫性疾病。
44.根据权利要求43的方法，其中所述患者患有鳞状细胞癌，白血病，急性淋巴细胞白血病，急性成淋巴细胞白血病，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多毛细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，急性或慢性髓细胞源性白血病，前髓细胞白血病，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤；黑色素瘤，精原细胞瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤，胶质瘤，星形细胞瘤，成神经细胞瘤，胶质瘤，神经鞘瘤；纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，骨肉瘤，黑色素瘤，着色性干皮病，角化棘皮瘤，精原细胞瘤，甲状腺滤泡性癌，畸胎癌，其它膀胱癌，乳房癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰癌，胃癌，颈癌，甲状腺癌或皮肤癌，其它淋巴样谱系的造血肿瘤，其它骨髓样谱系的造血肿瘤，其它间充质起源的肿瘤，其它中枢或周围神经系统的肿瘤，或其它间充质起源的肿瘤。
45.根据权利要求44的方法，其中所述患者患有淋巴样谱系的造血肿瘤。
46.根据权利要求45的方法，其中所述肿瘤选自包括小细胞和脑样细胞型的T前淋巴细胞白血病(T-PLL)；T细胞型的大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)；塞泽里综合症(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；多形或成免疫细胞亚型的周围/后胸腺T细胞淋巴瘤；血管成免疫细胞T细胞淋巴瘤；血管源性(鼻)T细胞淋巴瘤；间变性(Ki1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T成淋巴细胞白血病；或淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
47.根据权利要求42的方法，其中所述患者患有选自增生、纤维化、血管发生、银屑病、动脉粥样硬化、狭窄或血管成形术以后的再狭窄、以及其它以血管中平滑肌增生为特点的疾病这样的增生性病症。
48.根据权利要求42的方法，其中所述患者患有由选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、棘病毒、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒或人免疫缺陷病毒I型或II型(HIV-1、HIV-2)的病毒引起的传染性疾病。
49.根据权利要求42的方法，其中所述患者患有由细菌、原生动物或寄生物引起的传染性疾病，所述细菌、原生动物或寄生物选自葡萄球菌属，酿脓葡萄球菌，Enterococcl，炭疽杆菌，乳酸杆菌属，利斯特杆菌属，白喉棒状杆菌，阴道加德纳氏菌；诺卡氏菌属；链霉菌属；普通高温放线菌；密螺旋体属；螺旋体属；Raeruginosa；军团菌属；淋病奈瑟菌；脑膜炎奈瑟菌；脑膜脓毒性黄杆菌；芳香黄杆菌；布鲁氏菌属；百日咳博德特氏菌；支气管败血博德特氏菌；大肠埃希氏菌；克雷白杆菌属；肠杆菌属；粘质沙雷氏菌；液化沙雷氏菌；爱德华菌属；奇异变形杆菌；普通变形杆菌；链杆菌属；立氏立克次体(Rrickettsii)；鹦鹉热衣原体；沙眼衣原体；结核分枝杆菌，胞内分枝杆菌，偶发分枝杆菌(M.fortuitum)，麻风分枝杆菌(M.leprae)，鸟分枝杆菌，牛结核菌，非洲分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，胞内分枝杆菌；鼠麻风分枝杆菌；诺卡氏菌属，其它链球菌，其它芽胞杆菌，其它加德纳菌属，其它假单胞菌属，其它奈瑟菌属，其它黄杆菌属，其它博德特氏菌属，其它埃希氏菌属，其它沙雷氏菌属，其它变形杆菌属，其它立克次体科，其它衣原体属，其它分枝杆菌属，利什曼原虫，kokzidioa，锥虫，衣原体或立克次体。
50.根据权利要求42的方法，包括将适宜的另外的治疗药剂给予所述患者的另外步骤，其中所述另外的治疗药剂选自免疫调节剂、激素药物、化疗药物、抗血管形成剂、凋亡剂、结合于并抑制抑制性KIR受体的第二抗体、抗感染药、靶向剂或附加化合物，其中所述另外的治疗药剂作为连同所述抗体的单剂型或作为分开的剂型给予所述患者。
51.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体共轭或共价结合于毒素、可检测部分、或固相支撑体。
52.一种在生物样品或活生物中检测存在NK细胞的方法，其中所述NK细胞在它们的细胞表面上带有抑制性KIR，所述方法包括以下步骤：
a)用权利要求51所述的抗体接触所述生物样品或活生物，其中所述抗体共轭或共价结合于可检测部分(moiety)；以及
b)在所述生物样品或活生物中检测所述抗体的存在。
53.一种从样品中对细胞表面上带有抑制性KIR的NK细胞进行纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在允许细胞表面上带有抑制性KIR的所述NK细胞与所述抗体结合的条件下，用权利要求51所述的抗体接触所述样品，其中所述抗体共轭或共价结合在一固相支撑体上；以及
b)从共轭或共价结合在该固相支撑体上的所述抗体洗脱所述结合的NK细胞。
54.一种组合物，包括一种抗体，所述抗体与至少两个不同的人抑制性KIR受体基因产物上存在的共同决定簇相结合，其中所述抗体在表达所述两个不同的人抑制性KIR受体至少之一的NK细胞上能够中和KIR介导的NK细胞的细胞毒性的抑制作用，其中所述抗体被结合到一脂质体之中。
55.根据权利要求54的组合物，其中所述脂质体中另外结合了另一种物质，它选自：用于在基因疗法中递送基因的核酸分子；用于递送反义RNA、RNAi或siRNA的核酸分子，以此抑制NK细胞中基因；或用于靶向杀伤NK细胞的毒素或药物。
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