TWI224138B

TWI224138B - Membrane vesicles, method for producing the same, composition containing the same, uses thereof, method for producing antibodies and method for detection of the presence of t-lymphocytes specific to antigen-MHC complexes in a biological sample

Info

Publication number: TWI224138B
Application number: TW088119348A
Authority: TW
Inventors: Philippe Benaroch; Helene Vincent-Schneider; Pamela Stumptner; Sebastian Amigorena; Christian Bonnerot
Original assignee: Inst Nat Sante Rech Med; Inst Curie; Centre Nat Rech Scient
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2004-11-21
Also published as: WO2000028001A1; CN1325441A; EA004428B1; AU1051400A; EP1127110A1; AU2004203482A1; FR2785543A1; CA2349679A1; FR2785543B1; IL142634A0; JP2002529074A; EA200100509A1; AU772451B2

Description

1224138 A7 B7 五、發明說明（6 ) - 其載有1或多個界定結構之重組分子，例如界定组成之重組肤-MHC複合物。本發明之該等囊胞有利地自實質上無内生MHC分子之肥胖細胞衍生之細胞產生。在此樣態下，已知肥胖細胞蓄積弟11類MHC分子在於其分泌粒中，特別地’肥胖細胞能以優先方式蓄積MHC-II-肽複合物於特別多胞細胞内間室’分泌粒子（RapOS〇等人，Mol. Biol· Cell 8 (1997) 2619 )。取自哺乳類之此些細胞因此含内生MHC分子。以特別有利之方式，用於本發明之細胞系係自實質上無内生 MHC分子之肥胖細胞衍生。不同之肥胖細胞系已述於文獻中。本發明將展現於下此一些細胞株具低量之]VIHC分子，及因此特別有利於實施本發明。藉説明，可提及者爲自RBL細胞（大鼠嗜鹼性白血病）之株，ATCC登記爲 CRL1378 (Kulczycki 等人，J. Exp. Med. 139 (1974) 600)， KU-812 株（Butterfield等人，白血病研究 12198) 345)，或甚至未成熟人肥胖細胞株，如HMC系（Nilsson等人， Scand. J. Immunol. 39 (1994) 489)。特殊之株實例爲 RBL· 2H3 株（Barsumian 等人Eur. J· Immunol· (11 (1981) 317)。明顯地，具上述性質之任何其他細胞可使用。爲本發明，”界定組成”一詞特別表示以下之事實，即本發明之囊胞具例如重要之抗原與單型特異性。先前技藝所述之囊胞通常表現不同之未知單型MHC分子。相反地，本發明之較佳囊胞表現重組分子，其單型以準確方式預定。”重組”一詞指出囊胞生成細胞中，分子自表現編碼 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------tr;--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138

細胞質或膜蛋白質可弓丨、貝j q用。此些更佳地爲細胞質蛋白質，即在傳統感染過程Φ音11 干實貝地不見於免疫系統，及因此在自然狀態下較少免疫生成的，或其亦可爲膜蛋白質或蛋白質斷片。作爲腫瘤源蛋白質之實例，可特別提及者爲p53蛋白貝（腫瘤中存在之野生或任何突變形式）、(特別地 MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、MAGE 5 與 MAGE 6)、MART (特別地 MART 1 )、GplOO、ras 蛋白質 (野生或突變p21)等。明顯地，重要之任何其他蛋白質可在本發明外體之表面中或上表現，使用本説明書之敎導。在此樣態下，重組抗原分子可存在於囊胞之表面上（暴露），或於囊胞之内部。事實上，以特別驚人之方式，本發明者發現本發明囊胞，在其胞質液中含重組抗原（特別地p53 )’能在動物中謗導引導對抗此抗原之抗體之極高量生產。配體受體間，通常可提及者爲天然或自基因操作衍生之任何配體受體。特別地’其可爲任何激素、生長因子、淋巴素、營養因子、抗原受體等。可特別提及者爲内白素 IL1至IL-15之受體、生長激素受體或粒狀細胞和/或巨噬細胞（G_CSF、GM-CSF、CSF等）群落刺激因子之受體。配體受體之特殊實例由單鏈抗體（ScFv)組成，其能與特定配體交互作用。本發明意義中另一個特別有利之實例由丁_淋巴球抗原受體（TcR)代表。本發明外體在其表面上表現j 或多個界定之TcR形成特殊有利之分析及診斷工具，如將詳見於其後。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） T ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂_-—_------ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 !224138 五、發明說明（11 ) 作爲醫藥產物，可提及者爲化學本質之任何活性物質，例如使用傳統化學技術製備之醫藥產物。具生物活性之任何蛋白質、多肽或肽亦可引用，例如毒素、激素 ' 細胞素、生長因子、酵素、腫瘤壓抑劑等。核酸可爲編碼如上述蛋白[多肤或藥理肤之任何DM 或反!^八，及具特殊性質（抗知覺、抗原、啓動基因、壓抑劑、轉錄因子之結合部位等）之任何其他核·。其可爲寡核菩酸、編碼相、人工染色體等。载有配體受體之本發明囊胞可用檢測在任何生物樣品中特別地低親和力之任何配體·受體型交互作用，如將更詳盡説明於本發明書之後面。而且，如此囊胞亦可用以輸送重要物質（蛋白質、月太、核酸、化學物質等）至細胞中。因此，本發明之外體通常可用於試管中、體外或體内運送與轉移任何分子至細胞。本發明因此關於如上述之任何囊胞，包括重要之異質分子，其可作爲該分子至細胞之轉移載體。在更佳之具體實施例中，本發明之外體經用以定位轉移重要物質至選定之細胞群中。結果，可能地製備本發明之囊胞，包括重要物質（毒素、激素、細胞素、重組核酸等）及在其表面上表現配體受體或受體配體，及將該等囊胞與表現相對應配體或党體之細胞接觸。與此研究途徑一起，因此可能地達成標的之有效轉移。在此樣態中’本發明之特殊目標在於如上述之囊胞中，其特徵係其表現配體受體及其包括重要之異質分子。 -------------___.__ (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 訂- .線鲁- -14- 1224138 A7

物可保存在任何適當裝置中，如試管、瓶子、安瓿、燒瓶小囊等，及係保存在4°C或在_20°C下爲例。根據本發明之典型組合物包括自5至500微克外體，例如自5至2〇〇 $ 克。本發明囊胞係自基因修飾細胞獲得。如上述，本發明實際上自以下發現生成，即可能地由基因途徑插入重組分子至一些細胞中，及此些分子然後以堅實之功能方式裝中表現。 "" 爲產生载有限定組成之重組分子之本發明囊胞，第工階段包含插入如上述之囊胞產生細胞，能表現選定量組分子之基因構體。用於產生細胞之基因構體通常可包括置於所用細胞中功能性啓動基因（表現匣）之控制下之編碼區域。通常，所用之啓動基因因此爲哺乳類細胞内之功能性啓動基因。其例如可爲病毒、細胞或細菌啓動基因。其可爲構成性調節之啓動基因，較佳地允許細胞内之高量蛋白質表現。在可使用之啓動基因間，可藉實例提及者爲巨細胞病毒（CMV)之緊接早期啓動基因、SV40之啓動基因、胸甞激酶基因之啓動基因，特別地HSV-1 TK、反錄病毒 LTR之啓動基因，特別地LTR_RSV，或甚至肥胖細胞之強内生啓動基因。特別佳之具體實施例包括SR從啓動基因之用途，如更詳盡述於實施例中。所用之編碼區域通常由DNA組成，互補性、基因體或合成的（經修飾以例如包括一些插入序列或以獲得密碼子之 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} Φ 訂-:— — ^------線| 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（14 ) 優先用途）。更通常地，其爲CDNA。此核酸可由任何已知分子生物技術，特別地由基因庫篩遽、放大、合切割及結紮獲得。 ' 根據使用t編碼區域類型，一些修飾亦可對構體製作。例如，在一些例中可爲特別有利地以插入編碼區域中，使表現產物能送信至細胞特殊間室之訊息發出序列，特別地朝向膜間室（内、漿等）。此送信訊息可位在上游（5，）、下游（3’）或在編碼區域内。較佳地，送信訊息位在3 ,編碼區域上，更特別地在其細胞質區域中，及在具編碼區域之讀取相中。使用送信訊息可爲特別有用地以促進表現產物在給定細胞内間室之表面中或上蓄積，特別地在分泌胞之表面中或上。此具體實施例特殊地經調適以表現一種分子如私示肽、抗原、MHC-I分子，甚至受體配體。另一方面，以特殊有利之方式，本説明書展現人MHC_n之分子可直接在囊胞分泌之肥胖細胞中表現，而無加入特殊訊息，甚至爲異種的。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製爲實施本發明，特別可能地使用作爲送信訊息之核酸斷片’具以下基因之序列部分：Lampl、CD63、LIMPII、 Cdlc、FcyR。此些基因包括編碼蛋白質送信訊息至細胞内體間室之區域（Sandoval和Bakke，細胞生物趨勢4 (1994) 292)。可用於本發明之送信訊息例如符合式，其中X代表任何胺基酸殘基。特別調適於本發明之送信訊息由具序列SHAGYQTI之LAMPI蛋白質之肽訊息組成。允許送信朝向膜間室之另一型訊息包括蛋白質穿透膜區域之 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 ____ B7 五、發明說明（15 ) 全部或部分。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表現產物送信至細胞間室使此產物能存在於外體中，亦可由融合編碼區域至編碼膜或穿透膜蛋白質區域之全部或部分而進行，特別地外體中表現之膜或穿透膜蛋白質。在本文中，本發明之特殊具體實施例伴隨著經生產細胞内重組產物之表現而插入此產物至外體中，以與膜或穿’透膜蛋白質之融合物形式。該蛋白質之特殊實例爲例如插在生產細胞中之重組MHC蛋白質，特別地卢鏈，較佳地第η類 MHC之Α鏈。因此，實施例中給定之結果顯示如此融合使重要之任何肽在外體中有效蓄積，而不影響其性質或 MHC分子者。本發明之此樣態帶來新穎概念於外體中謗導重組產物，及可施至插在任何型外體中之任何重組產物。在此樣態中，本發明因此關於任何外體，包括重要多肽與送#訊息間之重組融合分子。其可爲自肥胖細胞、樹突或腫瘤細胞或亦自B-淋巴球爲例產生之外體。重要之多肽可爲抗原（或抗原斷片）或重要之任何其他生物產物。送信訊息可爲具引導融合產物朝向膜間室，特別地如上界定之細胞内間室之性質之任何肽、多肽或蛋白質。有利地，其爲MHC分子之鏈。經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣在本發明之特殊具體實施例中，此些囊胞由插入生產細胞中嵌合型核酸而產生，其編碼包括結合至MHC分子鏈C-端之重組產物之融合蛋白質，較佳第π類MHC。在使用之構體中’編碼區域以功能性方式結合至啓動基因，如此允許其在細胞内表現。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 """' * — —---B7_________ 五、發明說明（16 ) 、而且’本發明之構體可有利地包括位在3 ·編碼區域之區域其特足化轉錄訊息端（例如多A區域）。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明〈表現11有利地爲載體、質體、病4、游離體、人工染色體型等之部份。在此樣態下，該載體有利地包括能選、、斤内s之細胞之系統。特別地，載體有利地包括編碼對劑具杬性 < 產物之基因，例如抗生素（氨苄青黴素、潮黴素基因素、新黴素、沸素等）。在特殊之具體實施例中，各載體匕括如上述之單表現g。在此具體實施例中，細胞因此在一些分子要表現於囊胞時，經插入一些载體而修飾（例如 MHC II之從鏈和0鏈）。在此具體實施例中，所用之各型載敝有利地包括不同之選擇系統，允許容易選擇多重轉移感染物。在另一個具體實施例中，載體可包括如上界定之一些表現匿’例如一個編碼MHC-II之從鏈及另一個編碼々鏈。所用之載體較佳地爲質體型的，及包括例如細菌複製源’使其易於操作及試管中產生。該等載體特別地可自型 pBR322、PUC、pBS、pSR等質體構築。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製爲產生根據本發明之外體’基因修飾之細胞因此經用以表現選足之分子。此些基因修飾之細胞由插入如上界定之選足細胞中，亦如上述之基因構體而製備。基因構體之插入可以多種方式製成，主要根據所用之細胞型。因此，核酸之轉移可使用任何已知技術製成，如電轉移、轉酸鈣沈澱、化學劑（陽離子肽、聚合物、脂質等）、印泛劑等。在病毒載體之樣態中，轉移通常由簡單 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（17 ) 感染細胞而獲得。所用之載體量亦可由熟諳此技藝者相關於轉移種類及所用之細胞而調適。在此樣態中，插入核酸至肥胖細胞之特殊有效方法包括載體之電轉移。而且，當一些構體（載體）需要插入細胞時，後者可同時或以相繼方式轉移。轉移後，已有效併入核酸之細胞經選定與選殖，基於其對化合物（例如抗生素）之抗性，經轉移DNA中存在之抗性基因。此些細胞可即席用於製備本發明之外體，或保存供未來使用。在此樣態中，細胞可在經常保存之媒液中在4 C下保存一段足夠間，以達成一些外體生產批次。細胞亦可以冷凍形式（例如在氮氣中）保存供其後用途。在此樣態中’因此可能地根據本發明以形成具特殊性質之外體產生細胞庫。特別地，可能地根據本發明以形成表現主要hla 型第II類MHC分子之細胞庫。然後將可能地根據有意之應用及根據HLA型，以自庫中選擇相對應MHC分子產生細胞，而不需依各案之基礎再構築此些細胞。在此樣態中，本發明之特殊目標爲如上界定之外體產生細胞，特別地肥胖細胞，其特徵在於其含編碼主要組織相容性複合物分子之重組核酸。本發明亦關於如上界定之任何外體產生細胞，特別地肥胖細胞，其特徵在於其含編碼 li不受鏈之重組核酸，特別地一個經修飾以包括抗原肽以替代CLIP £域’或編碼使外體能純化之肽。更特別地，其爲哺乳類細胞，特別地動物本源，特殊地售齒類的。其亦可爲人源之細胞。在特殊之具體實施例 1 i——訂^--- —έψ, (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -20-

1224138 A7 __ B7 五、發明說明（18 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 中，其爲自肥胖細胞衍生之細胞系，如特別地嗜驗性白血病之肥胖細胞系。藉特殊之實例，可提及者爲RBL系，特另1J 地RBL-2H3、KU-812 系之細胞或 HMC-1。較佳地，重組核酸編碼第II類主要組織相容性複合物分子之α鏈和/或鏈，及/或第I類主要組織相容性複合物分子。在另一個具體實施例中，細胞分別包括編碼第Η類主要組織相容性複合物分子之α鏈與卢鏈之一些核酸。有著本發明，可能地以簡單再現之方式，產生實質量之已知組成外體。爲產生外體，上述之基因修飾細胞在適當培養基中培養，及外體經收集。本發明之特殊目標因此在於一種製備含界定重組分子之外體之方法，伴隨以下之階段： a) 培養肥胖細胞或肥胖細胞衍生之細胞，含編碼該界定重組分子之重組核酸， c) 回收由該等細胞產生之外體，此些外體含該界定之重組分子。有利地，本發明方法亦包括中間階段”在此期間，細胞經刺激以謗導和/或增加外體之分泌。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製而且，有著本發明方法，可能地製備囊胞，其中界定之重組分子暴露在外體外面，或包括，全部或部分，在外體之胞質液區分内。如上示，在本發明方法中，重組分子可例如爲主要組織相容性複合物之分子、抗原分子、受體配體、配體受體或純化肽’或重要之任何其他多肽。而且，如上説明，在一 -21 -

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 Α7 -— _ Β7 五、發明說明（20 ) - 收集由該等細胞產生之外體，此些外體在其表面上表現該界定之重組MHC分子聯結著該重組肽。更特殊地，在本方法中，含編碼重組肽區域之核酸編碼不變li鏈之行生物，其中CLIP區域已刪除及由該肽取代。此具體實施例確保在形成肽_ MHC複合物之重要特異性。在另一個變異體中，核酸包括編碼肽之區域及朝向細胞内間室之送信區域。而且，核酸可含編碼相同或不同抗原肽之一些區域。較佳地，用於本方法之生產細胞爲肥胖細胞或肥胖細胞衍生之細胞。在此具體實施例中，刺激細胞以謗導釋出外體較佳地藉1或多個鈣離子載體，或IgE。在特別佳之具體實施例中，用於本發明之生產細胞實質上無内生MHC分子。本發明之進一步目標包括一種修飾外體組成之方法，包祛 -插入外體產生細胞中，編碼界定分子之核酸，其分子結合至膜間室之送信訊息，及 - 自該細胞產生外體。有著本方法，有利地可能以產生表現界定與可變重組分子之外體。本發明之外體可用於多種應用，例如作爲分析、診斷、治療或實驗工具。例如其可用於分析特異之τ抗原反應；爲研究低親和力之受體/配體交互作用，其中需要不同伴物之多重化，以期增加此些分子複合物之渴望，因而超越免疫學之應用範疇；爲診斷與療法及爲產生特殊抗體，特 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ tpr -23-

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發明說明（21 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製別地局限在mhc之抗體。此些不同應用及其他者經説明於"下0 a)用於製備抗體。本發明外體之第一應用在於製造抗體。給定本發明外體之界定組成，可能地製備具限定特異性之抗體。而且，如 π於實施例中，本發明外體具極強之免疫生成性質，特別也考里在其表面上向金度之MJJC-肽複合物、其功能性及其對免疫系統之有效表示。以此方式產生之抗體可多株或單株的。其可使用傳統免疫學技術製備，包括動物免疫化、血清收集（多株抗體）和 /或脾淋巴球與不產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞融合（以生成早株產生雜種瘤）。本發明之進一步目標因此關於由以如上述之外體免疫化產生之抗體或抗體斷片。抗體斷片可例如爲Fab、（Fab,)2、 ScFv斷片等’及更通常爲維持抗體特異性之任何斷片。特別地，本發明係關於一種製備抗體之方法，包括動物以如上述之外體免疫化，載有界定之肽 — MHC複合物及回收抗體和/或產生抗體或涉及免疫反應之細胞。有利地，有著本發明方法，可能地製備單株抗體，特別地局限於 MHC即特異於MHC-肤聯結。較佳地，在本發明方法中，使用實質上無内生MHC分子之外體，其表現重組 MHC-肽複合物，及其係自細胞產生，其係自免疫化製成之動物移出的，因此，如示於實施例中，有著本方法，可能地在不需添加物下獲得引導對抗肽之有力抗體，特別地 --------tr---------線. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224138 五、發明說明（22 ) 局限於MHC之抗體，即特異於其形能虚關之肽。如此抗：特別有利在實驗、診斷及:：：：有而且’本發明抗體可由任何已知技術(酵素性:、：射性等）標*，使用熟諳此技藝者已知之方法。勞先 '放 b) 診斷應用 ' 本發明之外體與抗體具診斷用％之有利性質 :如，根據本發明獲得之抗體或抗體斷片可用斷應用，以檢測生物樣品中相對應特定抗原之存在，冋技術《吏用，如流動細胞計數法、免疫组織化學或免产勞光法爲例。在局P艮於MHC之抗體之特殊例中，並ϋ 地允許檢視相對應MHC-肽複合物，及因此診斷相對應之病狀。此些抗體可特別地應用至病狀之診斷，涉及免疫系統 < 反應缺陷或不適當反應，以期決定先前界定，以丁_淋巴球辨別之形式之抗原表現。例如，及以非徹底之方式，以下診斷可予考慮： 7 -腫瘤病狀，其中自與第I類MHC分子有關之蛋白質如 p53、Her2、MAGE、BAGE、MART、GP100衍生之不同肽之腫瘤樣品上檢測能顯型腫瘤及促進選擇治療；經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -在感染前或潛伏階段之病毒疾病，其中病毒粒子不可檢出（肝炎、HIV、CMV或其他病毒感染） -自免疫疾病，如多發性硬化、自免疫糖尿病、自免疫甲狀腺機能障礙、類風經性關節炎、紅斑性狼瘡，其中檢測顯示自體抗原衍生肽之MHC分子可爲指示疾病進_ 步發展之先兆。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 -—_ B7 五、發明說明（23 ) 本發明之外體亦可用以檢測生物樣品中蛋白質分子之特疋伴物。因此，本發明載有MHC-肽複合物之外體可用以 .檢測生物樣品中對此些複合特異之τ_淋巴球，例如於不同 <病理狀態，特別地於上述之病狀中。在此樣態中，外體可由熟讀此技藝者所知之任何標示系統（酵素性、螢光、放射性等）標示，以允許其在生物樣品中檢出。在特殊之具體實施例中，本發明因此有關使用標示之外體，特別地如上述之螢光標示，以檢測生物樣品中特異於柷原肽_MHC複合物之τ-淋巴球。生物樣品可為血液、血清、組織、腫瘤、活體組織切片、皮膚、尿液等之任何樣品。而且，生物樣品可經預處理，例如以解離細胞、在培養物中放大細胞、製備膜區分物等。有利地，生物樣品係衍生自人類生物。為此目的，本發明亦關於一種在生物樣口口中檢測對抗原-MHC複合物特異之T·"淋巴球存在之方法’包括將該樣品與含該抗原-MHC複合物之如上述標示外體接觸，及在該樣品中檢測τ•淋巴球之標示。再者，檢視此些Τ-淋巴球不僅能檢測及因此診斷生理病理狀態，但其亦能跟隨例如免疫化程序之效力，及在不同疾病階段下免疫反應之狀態與因此評估給予治療之效力。在持殊之應.用中，載有TcR受體之本發明外體經用於檢測生物樣品中此受體之持異肽_MHc複合物。而且，載有界定組成之任何型蛋白質之本發明螢光外體亦形成能檢測潛在受體之螢光探針。由外體打開之新穎領域因此通常可延伸至體内檢測低親和力之任何蛋白質/蛋 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

1224138 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（24 ) 白質交互作用。本發明之進_步目的因此爲外體之用途，較佳標示的，特別地由如上述之螢光， -以檢測生物樣品中蛋白質分子之特定受體。在此具體實施例中，所用之外體因此在其表面上包括該界定結構之生物分子， _以檢測生物樣品中配體之存在。在此具體實施例中，所用之外體因此在其表面上含該配體之特定受體。 C) 治療應用局限之抗體或其斷片潛在地能抑制τ_淋巴球之受體與其特異之MHC-肽複合物間之交互作用。同樣地，在其表面上載有單型MHC-肽複合物之外體可由與特異於此些複合物之Τ-淋巴球交互作用，而與其天然配體，τ•淋巴球競爭，及導致其去活性化。局限之抗體及外體因此可用於任何情況，其中其需要降低或壓抑由證實對生物有害之[淋巴球中介之免疫反應，如以下之例子，例如於：器官移植或骨髓移植，其中其經企圖以中和宿主對移植之反應，通常藉強劑量之免疫壓抑劑； -自免疫疾病或病素病狀，在此期間T CD8或CD4免疫反應慢性地導致組織破壞； • 過敏與氣喘。在此些類型之病狀中，在其表面上表現界定肽-MHC複合物之本發明外體，其已知涉及病理狀態之發展，因此可用以封阻免疫反應之發展，及因此病理反應之發展。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 Α7 ___ Β7 五、發明說明（25 ) 載有MHC-肽複合物之本發明外體亦可用以體外放大（擴展）細胞毒性T-淋巴球之群體。直接自血樣品使用，其因此可形成細胞療法之基礎以對抗不同細胞標的。因此，外體可用以挑選可變組合之T細胞，特異於由代表治療標的之細胞，如腫瘤細胞或病毒感染之細胞所表現之複合物。本發明進一步目標因爲使用如上述之外體以選殖放大和/ 或刺激細胞毒性和/或輔助T-淋巴球。本發明亦關於一種體外選殖放大（或擴展）T-淋巴球之方法，特別地細胞毒性淋巴球，其伴隨含T-淋巴球之生物樣品與含界定肽-MHC複合物之如上述外體接觸，收集特異之τ_淋巴球及其放大。此方法特別有利於選殖放大特異於MHC分子與腫瘤或病毒抗原肽間之複合物之細胞毒性Τ-淋巴球。本發明囊胞特殊重要之進一步應用爲轉移分子朝向細胞。經其組成，本發明囊胞能在試管中、體外及體内轉移分子朝向細胞中扮演載體之角色。在此樣態中，本發明係關於使用含重要物質之如上述外體以製備意在轉移該物質至細胞之組合物。有利地，其爲在其表面上含配體受體或受體配體之外體，可能地定位轉移朝向1或多個細胞群體。本發明亦關於一種試管中、體外或體内轉移物質至細胞之方法，其伴隨該細胞與含該物質之本發明囊胞接觸。更佳地，所用之囊胞亦表現配體受體及本發明方法能定位轉移物質朝向表現相對應配體之細胞。爲體内實施，本發明囊胞由傳統途徑（靜脈、動脈、肌肉、皮下注射等）施用 (較佳地至哺乳類，特別地人）。爲試管中或體内用途，細 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） /I-----------^-----訂· — h------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1224138 A7 B7 五、發明說明（26 胞由適當之設備（盤、燒瓶、囊、安報等）中，較佳地在無菌條件下培養接觸。接觸製作階段之參數（囊胞量、接觸時間、溫度、培養基等）可易由熟諳此技藝者相關於設定目的及本説明書之敎導而調整。 d) 研究領域之應用此些明顯關於所有上述之應用以分析在抗體呈現之分子機制’經使用说檢測及分析不同正常或病理狀態中形成 MHC-肽複合物階段之抗體。其亦關於分析與分子特性化能辨別限制MHC-肽複合物之T-淋巴球群體，經使用螢光外體及其檢測之能力。在此些不同應用（診斷、治療、實驗、產生τ-淋巴球等）中，本發明外體可以如此，或以在支撑媒體上固定化形式實施。因此，實施例中給定之結果顯示可能地固定在支撑媒體上，而不惡化其功能特性，特別地例如其抗原特異性。在此樣態中，本發明之特殊目的在於含在撑體媒體上固疋化外體之組合物。支撑媒體較佳地爲固體或半固體撑體如小珠、濾、紙或相似物。其較佳地爲在塑膠材料上之撑體，例如乳膠珠。明顯地，任何其他合成或生物物質可使用，祇要其不導致外體或細胞品質之任何實質惡化。有利地，使用具1至10微米之珠體，例如2至5微米。外體在支撑媒體之固定化有利地由共價鍵獲得，例如由醛或其他任何化學結合劑之活化。通常，外體之固定化由外體與撑體在溶液中培養，在允許固定之條件製成，然後撑體由離心收集。以此方式獲得之官能化撑體可用以特性化外體或以 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------tp----------線‘ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明説明（27 ) 檢測或試管中放大T -淋巴球，如將詳述於實驗一節中。本發明之其他樣態及優點將在閱讀以下實施例時見到，其經認為是說明性的及非限制性的。而且，在本發明書中所引之所有文獻以提及之方式併入。圖式簡單說明圖1 . RBL 2H3株中官能MHC-DR1-HA肽複合物之產生。 A. 在RBL 2H3株中轉移感染編碼DR1 α與冷鏈之cDNA 前（左）及後（右），人MHC-II DR1分子表面表現之流動細胞計數儀分析。DR1分子由L243抗體（黑線）自身檢測，其由山羊血清抗小鼠-IgG與FITC偶合而發展。 B. 表現不變鏈之株（liHA)中DR1之表面表現，其中 CLIP肽已由自流感病毒紅血球凝集素衍生之308-3 19肽置換。DR1分子在RBL DR1 liHA株與由相同單型EBV (Hom2) 轉形之B-淋巴球上由L243抗體（黑線）檢測。 C. 特異於DR1-HA複合物之T-淋巴球由表現此複合物之RBL株或相同單型之B-EBV刺激。株RBL DrlliHA與B-EBV Hom2在培養皿中以對DR1 HA株複合物特異之T-淋巴球稀釋。株B-EBV Hom2亦在飽和濃度（10毫莫耳濃度） Η A肽之存在下培養。在培養上清液中IL2之產生經用以評估THA淋巴球（特異於HA肽之T-淋巴球）之刺激。IL2藉氚化胸甞併入試驗在CTLL2株中測定，其增殖為IL2-依賴的。 D. RBL DR1 liHA株之Η A肽飽和分析。細胞Hom2與 RBL DR1 liHA在增加濃度HA肽與THA淋巴珠之存在下培 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1224138 A7 B7 五、發明說明（28 ) 養（每盤100個細胞）。淋巴球之刺激如前地評估。圖2 : DR1分子在RBL 2H3之分泌間室中之蓄積。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A. RBL 2H3中DR1分子之細胞内蓄積部位分析。細胞 RBL DRLHA以0.5%戊二醛固定，然後以0.05%植物皀質滲透。DR1分子與不變鏈分別以抗體L243與ΡΙΝΙ檢測，然後與TITC偶合之驢血清抗小鼠_IgG。血清素使用以與德克薩斯紅偶合之驢血清抗兔_IgG發展之特異兔血清檢測。影像由共焦顯微鏡（Leica)獲得。節厚度爲5微米。 B. RBL DrlliHA外體之純化。DMEM中清洗後，細胞在1毫莫耳濃度離子黴素存在下在37°C下培養3 0分鐘。外體由示差超離心自細胞上清液純化。放回PBS懸浮液之外體殘留物由SDS-PAGE分開（5毫克），然後轉至尼龍膜上。DR1之0鏈在相同條件下遷移之RBLDRLHA與Hom2 細胞之解離物（相當於每盤105個細胞）中在外體製備物及控制上以單株抗體IB5檢測。圖3 ··使用外體產生抗DR1 HA抗體 A. 自以外體免疫化之小鼠之增加稀釋量血清與表現 (右）或不表現（左）DR1 HA分子之RBL細胞培養。獲得之標示由流動細胞計數儀分析。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B. 自以外體免疫化之大鼠之血清（稀釋至1/100)與表現或不表現（左）DR1 HA分子之RBL細胞培養。在右邊，表現DR1之細胞經或未經先前在37°C下與10毫莫耳濃度 Η A肽培養2小時，然後以相同稀釋與自免疫大鼠之血清。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 _ B7 五、發明說明（29 ) C. 免疫大鼠之脾與X63A8株在傳統製備條件下爲單株抗體而融合。不同融合瘤之上清液由免疫螢光法在表現或不表現DR1或DR1 HA分子之RBL 2H3細胞上測試。選體 a40、b82及al5爲獲得抗體之代表性實例。 1土：使用外體檢測特異於DR1 HA複合物之T-淋巴球。 A·細胞RBL DR1 liHA在5亳莫耳濃度，，綠示踪劑"（蓄積在細胞水溶體間室中之螢光脂質）之存在下在37〇c下培養3 0分鐘’然後清洗及在3 7 C下在無螢光示踪劑下再培養1小時。細胞經固定（3 %三聚甲醛），然後在共焦顯微鏡下分析。 B·同樣地，外體DR1 HA自A中所述之細胞純化。樣品中存在之螢光以螢光計定量及在共焦顯微鏡下直接顯像。 C.D·螢光外體DR1 HA在50毫克/毫升下與特異於DR1 HA複合物之THA淋巴球或與特異於另一種複合物（d)之 TH30淋巴球在37°C下在疊氮化物存在以封阻内在化下培養2小時。細胞之螢光由流動細胞計數儀評估。圖5 ：載有第II類MHC分子之外體之製備。 A· 第11類分子IAb之表現由單株抗體Y3P檢測及由流動細胞計數儀分析。細胞RBL 2H3中獲得之轉移感染物表現與B414控制組B-淋巴瘤相似下由Y3P辨別之第η類分子量。 Β. 分子IAb在RBL中表現之西方墨點分析。1 〇毫克細胞解離物及自細胞RBL IAbli衍生之外體製備物由西方墨 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -IAW--------訂---------線秦經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 ., A7 B7 五、發明説明（31 ) 表現與B414控制組B-淋巴瘤相似下，由Y3P辨別之第Π類分子量。 B. RBL中分子DR1 GFP表現之西方墨點法分析。1 0微克細胞解離物及2 0微克自細胞RBL DR1 GFP衍生之外體製備物以一對GFP-特異之單株抗西方墨點分析。 C. 外體組成之流動細胞計數儀分析。乳膠珠以牛胎兒血清（FCS)或以自細胞RBL DR1 GFP衍生之外體塗布。 DR1分子由L243抗體及由1^243抗體和與藻紅質偶合之二級抗體檢測，而GFP之存在直接在槽FL 1中檢測。圖8 :由R B L - 2 Η 3產生之外體之功能性特性化 Α. 螢光外體特異Τ-細胞結合。自以綠細胞示踪劑標示之RBL DR1 liHA細胞產生之外體在2型Τ-細胞存在下培養：具對HLA-DR1/HA複合物特異TCR之THA，及不含此受體之野生T-Jurkat。螢光外體在37°C下與2株T-淋巴球培養3小時及生成之標示然後經FACS分析。 B. 獲取具特異標示T-細胞之外體示踪劑。如A之相同標示經製成，但外體與T-細胞之結合（未以綠細胞示踪劑標示）以小鼠單株抗體AD 1抗大鼠CD63檢測，其後以標示著藻紅質之驢抗體抗小鼠IgG發展（傑克森免疫研究，西格拉夫，賓州）。相同標示同樣地在未暴露於外體之丁-細胞上進行。 C. 淋巴球由外體之刺激。自DR1 GFP細胞純化之外體在以為流動細胞計數儀之相同方式製備之乳膠珠上交聯，但在完整培養基中清洗。各珠殘留物經收集100微升，5 0 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1224138 A7 B7 五、發明說明（32 ) 微升經置於96格多格盤之第1格，及5〇微升以2倍增量稀釋。T-細胞（T-Jurkat和ΤΗΑ1·7)經調至106個細胞/毫升及 50微升在有或無5微莫耳濃度ηΑ3〇7_319肽下置入各格中’培養盤置於培養箱（37。^，5〇/0 c〇2，Η20)中20小時’然後上清液經收集及IL2之濃度以CTLL2試驗評估。 H : HMC-I細胞與外體之特性化 A. HMC-I細胞之流動細胞計數儀分析，粗實線：細胞本身；細實線：抗小鼠抗體FITC本身；粗點線：特異抗體+抗小鼠-FITC。 B · 緊黏至乳膠珠之HMC-I外體之流動細胞計數儀分析，粗實線：乳膠珠-HMC-I外體本身，·細實線··抗小鼠抗體-FITC本身；粗點線：參考乳膠珠·SVf +特異抗體+抗小鼠- FITC ;虛線：外體_乳膠珠+特異抗體+抗小鼠-FITC。 C. MHC-I細胞解離物之西方墨點分析，與其夕卜體比較；每格10或3微克蛋白質；HC10 : 1/10上清液；IB5 : 1/10上清液；CD63 : 5微克/升，Lampl : 2微克/毫升； Η68·4 : 1/10上清液。外體似乎增濃於CD63、Lampl、 TfR。第II類MHC不存在於解離物及於外體中確認細胞螢光分析。第I類MHC之比値似乎在細胞解離物及在外體上皆相同。材料與方法細胞在實驗部分中用以製備外體之細胞爲鼠或人肥胖細胞。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % -**·' 1 · t J --------訂---------綠在經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（33 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 更特殊地，黏膜肥胖細胞表現型之嗜鹼腫瘤株，命名爲 RBL-2H3，經使用（Barsumian 等人，Eur. J. Immunol. (11 (1981) 317)。其他肥胖細胞，特別地其他株，可使用，如自RBL細胞衍生之株（大鼠嗜驗白血病），保存於ATCC在編號 CRL1378 下（Kulczycki 等人，J· Exp. Med. 139 (1974) 600) ° 能在人MHC-II文脈（DR1)中辨別特殊抗原之T-淋巴球株亦可使用。特別地，Jurkat株以編碼T (”Τ-ΗΑΠ)細胞受體之cDNA轉移感染，其特異於與HLA-DR1有關之流感病毒血球凝集素之肽306-318 (Sidhu等人，J· Exp· Med. 176 (1992) 875 )。由非洲淋巴細胞瘤病毒（Hom-2株）轉形之人 B細胞株經作爲對HLA-DR1限制反應之控制組。細胞經培養於DMEM培養基（Gibco BRL)、RPMI或 "CLICK，，： RPMI培養基補充以10%牛胎兒血清（Sigma)、1 毫克/毫升青徽素鏈徽素、1毫克/毫升越醯胺酸、5毫莫耳濃度丙酮酸鈉及5毫莫耳濃度/?·氫硫基乙醇。調適以培養眞核細胞，特別地哺乳類之任何其他培養基明顯地可使經濟部智慧財產局員工消費合作社印製細胞主要地培養於2 5或1 5毫升培養瓶。因爲RBL-2H3 細胞爲黏著之細胞，所以其自其撑體使用胰蛋白酶_EDTA (Seromed)提舉。以期大量產生後者，亦可能地在”纺織機 •f中培養至106個細胞/毫升之密度。質體爲基因修飾肥胖細胞，以下之基因構體經製成。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（34 ) 編碼人 HLA-DR1 π 鏈（Larhammer 等人，細胞 30 (1982) 153)、人 HLA-DR1 卢鏈（Bell等人，PNAS 82 (1985) 3405 ) 及不變人鏈 p33 li (Ciaesson 等人，PNAS 80 (1983) 7395 )之 cDNA經分離。編碼不變鏈p33 li之cDNA然後由PCR修飾，以由限制部位置換編碼CLIP肽（殘基87-102 )之區域。有著此cDNA，可能地插入替代CLIP肽之編碼抗原肽之任何重要 cDNA 斷片（Stumptner 等人，EMBO J. 16 (1997) 5807)。在精確實例中，編碼流感病毒血球凝集素HA308-319肽之DNA斷片經插入此編碼嵌合型1 i多肽之cDNA (HA308-309) ° 上述之核酸然後在SR α啓動基因之控制下，經分開殖入 pSRa 質體（Takebe 等人，Mol. Cell· Bio· 8 (1988) 466)。各質體然後經修飾，如以併入不同抗性基因，允許各質體之選定，及因此各鏈；鏈α具對新黴之抗性基因；鏈具對潮黴素之抗性基因，及不變鏈具對沸菌素之抗性基因。轉移感染爲插入不同核酸至肥胖細胞中，相對應之質體載體以 Seal限制酵素線性化。各質體5 0微克經線性化，然後乙醇沈澱，及殘留物在1.107個細胞/毫升之濃度下在RBL-2H3 細胞存在下再懸浮。穩定之轉形物由電轉形5 X 106個細胞而獲得，使用"基因脈衝器”（Bio-Rad，里奇蒙，加州），在以下條件：260伏特，960微法拉弟。電轉形7 2小時，轉移感染物由培養於選擇培養基中選定，包括250微克/毫升G418 (基因素，Gibco)、1毫克/毫升潮黴素及500微克/ - 37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -Γ.-------------------1T----------線* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 亳升沸菌素。選擇培養基中8天培養後，存在之60至90% 胞、、π轉私感染。轉移感染物然後表能開始個別化黏著群落之濃度下接種於具選擇培養基之培養皿中。以此方式獲得之選體經收集及分開置於培養物中。此些選體可保存爲冷凍形式，供未來使用。抗體 Υ3Ρ (MHC-I (ΙΑ))爲小鼠單株抗體，其辨別IAb a卢複合物（Janeway等人，η84)。抗^爲引導抗^^鏈細胞質部分〈兔血清。抗_GFP爲引導對抗"線螢光蛋白質••之2種單株抗（逼敝7.1和13.1)之混合物，由BoehringerMannheim行銷。在流動細胞計數儀實驗中，使用之第2個抗體爲 F(ab’)2斷片，偶合至藻紅質，由驢產生及引導對抗小鼠 IgG (H+L)(傑克森免疫研究實驗室）。珠體乳膠珠：無界面活性劑之白醛/硫酸鹽乳膠，D : 3.9微米，分界面動力公司，波特蘭，奥勒岡州，美國。電子顯微鏡以HLA-DR1轉移感染之RBL_2H3細胞以2 %三聚甲醛在 0.2莫耳濃度嶙酸鹽緩衝液pH 7.4 (P B緩衝液）中固定。固定後’細胞以P B緩衝液5 0毫莫耳濃度甘胺酸清洗，然後在10%明膠中塗布。固化塊經製備後，灌入2·3莫耳濃度蔗糖及在液氮中冷凍。超細冷凍切片經製備及以引導對抗 HLA-DR分子之多株抗體免疫標示。此些抗體以與1〇毫微米膠體黃金粒子偶合之Α蛋白質顯像。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）

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五、發明說明（36 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 外體以2%三聚甲醛在〇·2莫耳濃度磷酸鹽緩衝液pH 7.4 (PB緩衝液）中固定，及放置在以破酸化甲渥膜覆蓋之電顯玻片上。外體經顯影及塗佈乙酸鉀和甲基纖維素之4 %液。或在塗布前以引導對抗第II類分子之抗體免疫標示。抗體以與 10毫微米膠體黃金粒子偶合之A蛋白質影像。結果 I-DR1 HA外體之製備 1.1 基因修飾生產細胞之構築及特性化以期以控制方式製備載有界定成份之MHC-肽複合物，第11類MHC分子之鏈a和b之外體在RBL 2H3 1〇肥胖細胞株中表現，其衍生自大鼠驗性白血病。爲此目的，分別載有編碼各鏈之2種載體在SRa啓動基因控制下同時在細胞中轉移感染（見材料與方法）。由流動細胞計數儀獲之結果顯示轉移感染之細胞有效地表現DR1分子（圖1 A)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此些RBL-2H3細胞然後經製成易受於精確組成之給定肽，以期生成界定組成之MHC-肽複合物。爲此目的，不同技術可予考慮。在簡單之具體實施例中，肽可直接與外體培養。在另一個變異法中，編碼肽之核酸可插入細胞中，如亦以表現此肽。在實施此特殊實例以產生含單一抗原特異性之呈現細胞中，選定之抗原肽以與不變人1 i鏈基因融合之形成插入細胞中。更特別地，不變鏈之CLIP肽由選定肽之序列置換，其自已知與DR1分子結合之流感病毒血球凝集素（HA308-309)衍生。此構體（liHA)在細胞中 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 B7 五、發明說明（37 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在述於材料與方法之條件下轉移感染。表現於rBL_2H3 DR+細胞之雜交鏈能構築細胞，其在相似於dri單型控制 B-EB V (Hom2)株之量下表現由L243抗體辨別之DR1分子 (圖1 B )。此些結果因此顯示本發明之肥胖細胞有效地表現預定、控制組成之人、功能性肽-MHC複合物。由本發明細胞表現之肽_MHC複合物之功能特質由特異於細胞載有之DR1_HA組合物之T-淋巴球之刺激試驗確認。爲此目的，本發明之細胞在THA淋巴球存在下培養，及刺激由測定釋出至上清液之内白素_ 2決定，由IL_2依賴之細胞株之生長試驗。使用之控制組爲以DR1單型EBV (Hom2)轉形之B·淋巴球株，其以飽和濃度（10毫莫耳濃度) Η A肤脈斷。得到之結果經給定於圖1 C及1 D。其顯示本發明之肥胖細胞表現能刺激特異於此組合物之T·淋巴球之DRI -HA複合物。其亦顯示在本發明細胞存在下所得之刺激較由飽和濃度（10毫莫耳濃度）HA肽脈衝之控制組細胞（DR1單型之B-EBV)產生者更有效。最後，得到之結果顯示dri分子似乎僅呈現Η A肽，因爲加入飽和濃度肽不顯著增加 RBL DRI li HA細胞刺激THA淋巴球之能力（圖1 D )。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製所有此些結果因此展現產生之肽-MHC複合物之功能特質。其亦説明得到細胞之特異特質及因此本發明方法之特異特質，其使能獲得載有界定、控制組成分子之細胞（及外體）。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 B7 五、發明說明（39 ) 顯示在本發明外體之表面上之高密度肽_MHC複合物。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁} 以下實施例特別地説明使用DR1 HA外體以製備特異於此組合物之抗體，及DRl HA外體結合特異於此相同組合物之T-淋巴球之能力。 2· 特異於DRl HA複合物之抗體之產生此實施例説明使用本發明外體以製備抗體，特別地所謂··限制”抗體”，即異於與MHC分子有關之抗原肽。此實施例特別地説明本發明外體之極強免疫生成性質，因爲其能在無任何添加劑下製備抗體。自RBL DRl HA細胞之上清液純化之外體（實施例1 )經再懸浮於PBS。此些外體然後在其任何添加劑下，用以免疫注射Balb/c小鼠或LOU大鼠，與以下之實驗計劃一致： - 小鼠由皮下途徑，在由3週之時段分開之2次注射中，注射以10微克外體，然後30微克由腹膜内途徑，及最後30微克在血清收集前3天由靜脈内途徑。 - 大鼠由腹膜内途徑（10微克），在由3週之時段分開之2次注射中，注射以外體，然後在血清收集前3天由靜脈内途徑（5 0微克）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如示於圖3 A ’自免疫化小鼠收集之血清顯示對rbl株之極強反應性，不論是否表現或不表現DRl HA複合物，但僅在細胞DRl HA上可檢測低至3萬倍之血清稀釋。如示於圖3B，免疫化大鼠之血清以驚人之方式顯示對表現DRl HA複合物之RBL株之反應性，而相同血清對初 RBL-2H3株以較低強度反應。而且，力口入η A肽至DR1表 •42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 _ B7 五、發明說明（4Q ) 現細胞（RB1-2H3 DR1 )帶來產生抗血清反應性之增加（圖 3B)。此些結果因此顯示RBL株之外體能謗導抗體反，其以未預期之方式主要地在大鼠中引導對抗DR1 HA複合物。免疫大鼠之脾與X63A8株之細胞融合。得到之混合瘤由選殖稀釋使用傳統免疫學技術挑選，然後由免疫螢光法選定產生之單株抗體之特異性。不同之單株抗體以此方式獲得，一些引導對抗RBL株之蛋白質，其他對抗DR1單型人第II類分子之單型決定物，及最後一些對抗由與自流感病毒HA蛋白質衍生之肽有關之DR1分子構成之複合物（圖 3 C )。此些後者單株抗體形成限制抗體，及因此具特別有利之性質於診斷或治療應用。 3 -特異於DR1 HA禮合物之T-淋巴球之掄測。此實施例説明使用本發明之外體以在生物樣品中檢測特異T-淋巴球。此實施例亦顯示如何外體可用以選擇及放大特殊T-淋巴球群體，其特別地意在再注射至個體（細胞療法）。此研究途徑可明顯地延展至使用述於實6施例2之限制抗體，及至檢測任何配位特異之受體。爲實施此應用，標示之外體經產生。爲此目的，在純化 DR1 HA株之外體前，後者與螢光示踪劑一起培養，其強烈蓄積於内含於分泌粒中之外體。使用之示踪劑”綠示踪劑’’爲螢光脂質，其蓄積於細胞水溶體中。細胞在共焦顯微鏡下之分析，在固定後，顯示螢光標示存在於細胞之分泌粒中（圖4 A )。螢光外體然後經產生及自此些細胞在述 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------tr---------線赢經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 Α7 — Β7 五、發明說明（41 ) 於實施例1之件下純化。因此製成螢光性之此些外體（圖 4B)經用以在生物樣品中檢測特異於DR1 ha組合物之T-淋巴球（THA淋巴球）之存在。明顯，任何其他標示可在本發明之範疇内使用，應用至生產細胞或至產生之外體上。為此目的，外體在THA淋巴球及特異於另一種複合物之 TH30淋巴球之樣品存在下培養。由流動細胞計數儀得到之結果顯示表現DRLHA之外體以特異之方式與thA淋巴球結合（圖4 C )，其中此些相同外體不能辨別具另一種特異性之淋巴球（圖4 D )。此些結果顯示由本發明肥胖細胞株產生之外體檢視特異於此相同複合物之淋巴球之獨特、未預期能力。此應用可使用任何型之生物樣品實施。而且，此技術可以相同方式施至表現MHCI-肽複合物之外m之製備及用途。有者本發明，因此可能地在呈現細胞’甚至腫瘤細胞之表面上檢測自腫瘤表現之抗原衍生之 MHC第I類與第11類肽分子之呈現。本發明因此亦能檢測’甚至純化能辨別此些相同複合物之丁_淋巴球。其因此可用以放大特異於特殊肽-MHC複合物之T·淋巴球群體，例如為其治療用途目的之CTL淋巴球群體。癌症或病毒感染之不同免疫療法研究途徑例如已發展，基於自個體收集淋巴球樣品及體内擴展特異於涉及病症之抗原（例如腫瘤或病母k原）之T-淋巴球特殊選體。此些放大選體然後經再施至個體作為治療劑。本發明帶來更大之簡便性以選擇與放大τ_淋巴球特異選體，及因此以潛在應用與實施此些治療途徑。 -44- 本紙張尺度顧+國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) -----------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-l·—.-----線. 1224138 A7 B7 五、發明說明（42 ) 4 -載有鼠MHC第II類分子之外體之i備（圖5A、5B)。編碼IAb单型鼠第II類分子之鍵從和卢與不變鼠鏈之互補DNA經插入N T眞核生物表現載體，其中cdnA轉錄係在 “SR啓動基因之控制下。各質體亦載有對潮黴素（如從IAb 鏈）、對新黴素（如；5 IAb鏈）或沸徽素（如不變鏈）之抗性基因。RBL 2H3細胞由電轉形轉移感染（材料與方法）後，細胞基於其對3種抗生素之抗性選定，然後抗性細胞由限制稀釋法選殖，及由流動細胞計數儀使用特異之Y3P抗體特性化IAb分子之表現。圖5顯示得到之一些結果。流動細胞計數儀分析顯示 RBL IAbli細胞由Y3P抗體（特異於IAb分子）以對B-淋巴球株B414之相當方式辨別，而在初RBL株上未檢出標示（圖 5 A)。因爲顯微鏡之形態分析建立鼠第II類IAb分子，如人DR1分子一樣，蓄積在細胞之分泌粒中（未示出），此導致吾等搜尋其在外體中之定位。細胞之外放作用由添加1 毫莫耳濃度離子黴素而起始，及得到之外體由示差性超離心純化（參閲實施例1、2 )。此些外體製備物之西方墨點法顯示其含與該等控制組細胞解離物中檢測者完全相同之第 II類MHC鼠分子（圖5B)。此些結果展現第II類人分子（DR1 )以及鼠分子（IAb)可經表現，及可蓄積於相對應RBL 2H3株之外體中。 5 _由RBL 2H3產生之外體之形態特性化（圖6 ) 在共焦顯微鏡在RBL細胞之冷凍免疫標示切片上之觀察透露出存在著充滿膜之多數細胞内間室。此些膜之大多數 •45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ: ί, --------旬--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 ________ B7 五、發明說明（43 ) 部分相對應於充滿間室腔之囊胞（圖6 a)。當在此些細胞中轉移感染時，第II類分子蓄積在具内胞之間室中，及特別地在與此些胞膜有關下經顯像（圖6 a )。當RBL細胞經刺激，如以謗導其去粒化（IgE_抗原或離子 Μ素）時，細胞内間室與槳膜融合。第II類分子與其有關之内胞經釋至細胞内媒液中。此些囊胞然後經稱爲外體。電子顯微鏡中檢測外體之形態與其蛋白質内容物之精選方法爲"全固定”方法。有著此技術，可能地顯像無任何其他細胞内容物之全外體。有著此方法，亦可能地在高效力下檢測與外體膜有關之分子。藉使此技術，吾等觀察到 RBL細胞分泌之外體爲自3 〇至12〇毫微米之異質大小及對黾子具可麦之金度（圖6Β)。第II類分子係豐富於具8〇至 100笔微米大小及對電子具平均密度之胞群。富含第Η類分子之大多數此些囊胞爲碟形的（圖6C)。 6· 在支撑媒體上外體之固定化（圖5C) 〇本實施例描述外體固定在固體撑體上，及顯示以此方式固疋之外體維持其功能性質。此些新穎產品（外體撑體）可用以特性化及分析外體；或作爲診斷或試劑產品以檢測和 /或刺激試管中，例如Τ-淋巴球。由是否表現第II類人或鼠分子之RBL細胞產生之不同外體製備物與由醛硫酸鹽活化之4微米乳膠珠培養。更特別地，自RBL 2Η3去粒化上清液純化之外體在pBS中清洗 (在50000 rpm下在TLA 100.4上離心30分鐘）。3〇微克外體與1 0微升無菌收集之乳膠珠混合，均質，然後在室溫 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公璧） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1224138 五、發明說明（44 ) 下培養1 0分鐘至1 5分鐘。珠體積然後以lx PBS加至1毫升，然後在室溫下培養2小時。其後，以外體交聯之珠體爲： " 由加入終1〇〇毫莫耳濃度甘胺酸飽和（在室溫下3〇分鐘）， - 在2200 g下在4°C下離心2分鐘，然後珠殘留物在1毫升 lx PBS 3% SVF 0.01% NaN3 中收集。爲使用珠體供細胞螢光法： - 在lx PBS 3% SVF 0.01 % NaN3中清洗珠殘留物2至3 次， - 在1毫升lx PBS 0.01 NaN3中收集， - 使用每點在5微升至2 0微升間及傳統地在第1格中培養第2種抗體。讀取在Facscalibur (見克頓迪克生）中進行0 有著此技術，可能地覆蓋此些乳膠珠之表面以外體，而保留其結構。當外體在珠體上時，其操作經變成更簡單。其例如可在低速下離心及由傳統流動細胞計數法技術檢測。圖5 C顯示由流動細胞計數法檢測進入外體組成之不同蛋白質之一些實例。以勝硫版鹽活化之乳膠珠與由非轉移感染RBL 2H3細胞產生之外體，或與表現第人分予DR1和〖出八構體或第II類鼠分子〗Ab之RBL 2H3細胞之外體培養，或與牛胎兒血清（FCS )作爲控制組。以此方式製備之乳膠珠然後與不同單株抗體培養；辨別存在於RBL 2H3分泌粒中 -47- 本紙張尺錢财@國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） β 1111--1--------------訂---------線▲ C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（45 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CD63分子之AD1，特異於分子IAb之Y3P抗體，及特異於 DR1分子之L243抗體。此些不同抗體由與藻紅質偶合之第 2種抗體暴露，然後得到之標示由流動細胞計數儀以 FACScalibur (貝克曼）分析。因此觀察到CD63分子明顯地存在於自細胞RBL衍生之所有外體，不論是否表現第II類分子，而以IBb外體塗布之乳膠珠特異地由Y3P及非由L243辨別，而相反地， DRIiHA夕卜體由L243而非由Y3P辨別。此些抗體無一者辨別覆蓋以牛胎兒血清之乳膠珠（圖5 C )。此些結果顯示此技術能敏感、特異檢測進入外體組成之不同蛋白質之表現。實施例8亦顯示藉如此產物（外體撑體），可能地亦能檢測或刺激特異乙淋巴球之增殖。 7- 外體組成之操作處理（圖7 ) 外體爲脂質雙層所界園的囊胞，其中經插入大數目分子，如先前所提及第II類MHC分子或CD63。此些囊胞内部經發現前面穿透膜分子之細胞質區域，亦含自細胞質液衍生之可溶性蛋白質。爲展現可能地任意修飾此些囊胞之内容物，吾等使用綠螢光蛋白質（GFP )作爲示踪劑。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製編碼GFP之cDNA在人DR1分子0鏈之COOH末端上融合。此構體，經插入載有對潮黴素之抗性基因之NT表現載體中，在細胞RBL 2H3中與載有DR1 α鏈及對新黴素之抗性基因之載體共同轉移感染。對此些兩種抗生素具抗性之細胞經選定，然後正面地挑選GFP之表現。更特別地，吾等製成結合DR；5鏈之細胞質部分（在C端 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224138 A7 B7 五、發明說明（46 ) 上）至GFP之N端之構體。DR/?之cDNA在位置565上具 PstI部位。此cDNA 3·側之約200個鹼基對斷片由PCR自載體pcDNA3/RSV/Dra放大，藉包括5’PstI部位及3’NcoI部位之2個寡核甞酸，其附加地消除停止密碼子。得到之PCR 斷片以PstI與Ncol消化，及在載體pEGFP N1 (Clontech)之相同部位中選殖，以PstI與Ncol消化之生成質體能在GFP 後釋出相對應於Dra最後3 0個胺基酸之斷片。同樣地，質體pcDNA3/RSV以EcoRV/Psti消化，因而釋出相對應於DRa 鏈剩餘部分之斷片（選自部位PstI開始）。2個斷片然後經組合及在pcDNA3/CMV中在EcoRV與Xbal間選殖。此些細胞（DR1 GFP )由流動細胞計數法分析顯示由L243 抗體辨別而特異於DR1分子之細胞亦放射在管道FL1中檢測之綠螢光，而以未包括GFP之DR1從與鏈轉移感染之細胞在管道FL1中未放射任何螢光（圖7 A )。以期展現GF P眞的内含於細胞RBL 2H3之外體中，自細胞RBL DR1 GFP衍生之外體由示差超離心製備，然後由西方墨點法分析（圖7 B )，及在乳膠珠上交聯後之流動細胞計數法（圖7 C )。在西方墨點法下，GFP之特異抗體在細胞DR1 GFP及在其外體中檢測相對應於與GFP融合之DR1 鏈分子量之65 kDa蛋白質（圖7 B )，而無訊息檢出於細胞RBL 2H3之細胞解離物中，不論是否單獨表現DR1分子。以牛胎兒血清，或以自DR1 GFP細胞衍生之外體交聯之乳膠珠間之比較顯示單獨地以外體塗布之珠體在管遒 FL1中謗導螢光（FITC)，及由L243抗體辨別，其特異於 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---1-----------訂---------線{ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 _B7_ 五、發明說明（47 ) DR1，由與藻紅質偶合之第2種抗體檢測。此些結果因此展現可能地插入外生蛋白質在由RBL 2H 細胞產生之外體内部。此些結果進一步顯示可能地由在生產細胞中表現而引導蛋白質至外體上，以與穿透膜分子如 MHC分子融合之形式。 8 外體之功能性特性化（圖8 ) 此實施例顯示由RBL 2H3細胞產生而載有第II類MHC分子之外體能結合抗原肽及能刺激表現此肽-MHC第II類複合物之特異抗體之T_淋巴球。自以綠細胞示踪劑標示之RBL DR1 IiHA細胞產生之外體在2型T細胞存在下培養。具特異於HLA-DR1/HA複合物之 TCR之THA，及無該受體之野生T Jurkat。結合實驗使用圓底格之96格多重盤，在補充以10%牛胎兒血清，緩衝以 1 〇毫莫耳濃度Hipis之RPMI 1640培養基中，在每格多至 5 0微升終體積，每格105個T細胞及可變量之螢光外體下在37°C下培養3小時。然後在分析以FACS在400微升PBS 中收集之細胞前，2次清洗在相同培養基中進行。經製訂之劑量作用範圍顯示THA之標示強度與使用之外體量成比例。108個RBL DR1 IiHA細胞得到700微升外體。每格自3 2至2微升外體範圍之劑量經測試。每點1 6微升而得之標示經保持，其相對應於由2300萬個細胞製成之外體生產（結果未示出）。得到之結果顯示THA群體由螢光外體標示，其在FL1上由細胞螢光法產生可檢出之螢光，而野生Jurkat則未經修 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------IT*---------線 i (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 __ B7 五、發明說明（48 ) 飾（圖8A)。同型標示經進行，但外體結合後，T細胞與AD1小鼠單株抗體抗大鼠CD63培養，其後由藻紅質標示之驢抗體抗小鼠IgG發展（傑克森免疫研究，西格洛夫，賓州）。相同標示同樣地在T細胞上製成，其未曾暴露至外體。可見地 (圖8 B )，僅外體結合THA細胞，如由其螢光在FL1上證實，亦在FL2上標示，其指示在其表現上新存在著大鼠 CD63。吾等結果因此顯示螢光外體可由流動細胞計數法用以顯像T-淋巴球群體，其特異於由外體載有之HLA-DR/抗原肽複合物。以依賴肽存在之方式，爲評估外體刺激T_淋巴球之能力，自DR1 GFP細胞獲得之外體在乳膠珠上交聯，然後在 T Jurkat淋巴球株之細胞存在下培養，不論是否表現複合物DR1-HA肽307-319之特異T受體。乳膠珠以如爲流動細胞計數法之相同方式製備，但在完整培養基（RPMI，10%牛胎兒血清，i %青黴素鏈黴素麩醯胺酸、0.1% P -氫硫基乙醇、4%丙酮酸鋼）中清洗。爲刺激T-淋巴球’各珠殘留物在1〇〇微升中收集：5〇微升，放在9 6格多重盤之第1格及5 〇微升以半數稀釋。控制組以前面之相同方式與牛胎兒血清中培養之珠體進行。τ細胞 (T Jurkat巴斯德及THAI·7 )經調至1〇6個細胞/亳升及每格經放置50微升。在完整培養基中稀釋至15微莫耳濃度之肽亦加入至每格5 0微升之比値。在無肽系列中，5 〇微升 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * · · ·焉一 - -------訂---------線<

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224138 A7 B7 五、發明說明（49 ) 完整培養基經加入每格中。培養盤經置於培養箱（37°C， 5% C02，20 )中2 0小時，然後上清液經收集，及IL2之濃度以CTL.L2試驗評估。經見到加入Η A肽（5毫莫耳濃度）特異地謗導表現DR1-HA (THA)複合物受體之T Jurkat細胞之刺激，而其對控制組T-淋巴球（T Jurkat)不具影響。而且，一些外體在無HA 肽存在下不能刺激THA (圖8 C )。 9. 人肥胖細胞株之外體（圖9 ) 本實施例顯示根據本發明修飾之外體可自其他細胞產生，特別地人細胞。特別地，吾等得到之結果展現人 MHCI源之肥胖細胞株能在脈衝增加細胞内鈣下及在與該等謗導由大鼠株RBL 2H3分泌外體之完全相同條件下產生外體。由流動細胞計數法特性化MHCI株指出此些細胞之表面表現第I類MHC分子（W6.32)，但非第II類分子（L243 )。而且，其對分子CD9、CD63和CD81爲陽性的，但對分子 Lamp 1和Lamp 2爲陰性的（圖9 A)。外體自MHCI株經加入離子黴素（1毫莫耳濃度）產生，但自上清液由示差超離心純化。其組成在乳膠珠上交聯後由流動細胞計數法及由西方墨點法分析。以使用乳膠珠之方法分析外體顯示其載有分子Lamp 1、 CD9、CD63、CD81及第I類MHC分子，但非第II類分子，亦非Lamp 2分子（圖9B)。此外，在此些外體之電子顯微鏡下觀察之形態與該等由RBL 2H3株產生者完全相同。最 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------tr*---------線 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1224138 Α7 ---—_ Β7 五、發明說明（5G ) 後’由西方墨點法所見之蛋白質組成確認此些結果，因爲有此技術’吾等發現分子CD63、Lamp 1、MHC第I類，而 Lamp 2、MHC第11類仍爲陰性的（圖9 )。總結株MHCI似乎爲rbl 2H3大鼠株之人同質物，在增加細胞内鈣後，經其能力以產生具相同結構與分子特徵之外體。有著此些細胞，其因此可能地產生表現第Η類 MHC分子或特異性表達至其之任何其他分子之重組人外體0 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Claims

1224138 「EII !修 ί ?日- Λ 年I A BCD |_11934δ號專利申請案一---一一一十文仲請專利範圍替換本(93年8月) 六、申請專利範圍 L 一種以控制方式製備含界定組成肽_MHC複合物之膜囊胞之方法，該方法包括下列步驟： a) 在適於培養哺乳動物細胞之培養基，培養肥胖細胞或肥胖細胞衍生細胞，該細胞含有一或數種重組核酸，其包括在啟動子調控下編碼人類第11類河11(：之界定重組HLA-DR1分子之序列， b) 刺激a)之細胞以謗發或增加膜囊胞之分泌，該刺激包括在鈣離子或具有對IgE受體強親合力之化合物存在下處理細胞，. 〇自b)之細胞培養物懸浮液回收由該等細胞產生之膜囊胞，该膜囊胞包括圍繞胞質部份之脂質雙層，及該囊胞在其表面表現該人類第π類Μ H C之界定重組 H L A - D R 1分子，此囊胞由包括至少一種離心或超離心該懸浮液之方法回收；及 d)將自c)回收之囊胞，在可使胜肽-HLA-DR1第II 類Μ H C衩合物在該囊胞表面形成之條件下，與胜肽或一群胜肽接觸。 2. —種以控制方式製備含界定組成肽-μ H C複合物之膜囊胞之方法，該方法包括下列步驟： a)在適於培養哺乳動物細胞之培養基，培養肥胖細胞或肥胖細胞衍生細胞，該細胞含有（i) 一或數種重組核酸，其包括在啟動子調控下編碼人類第11類Μ H C之本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 8 3 24 12 A B c D 六、申請專利範圍界定重組H L A - D R 1分子之序列，及（i1)在啟動子調控下編碼界定重組胜肽之核酸； b )刺激a)之細胞以謗發或增加膜囊胞之分泌，該刺激包括在妈離子或具有對I g E受體強親合力之化合物存在下處理細胞， c )自b)之細胞培養物懸浮液回收由該等細胞產生之膜囊胞，該膜囊胞包括圍繞胞質部份之脂質雙、層，及該囊胞在其表面表現與該重組胜肽相關之人類第Π類 MHC之HLA-DR1界定重組分子，此囊胞由包括至少一種離心或超離心該懸浮液之方法回收。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中適於培養哺乳動物細胞之培養基係選自D Μ Ε Μ、Β Ρ Μ I及C L I C K。 4. 如申請專利範圍第2項之方法，其特徵在於編碼重組肽之核酸編碼1 i非變異鏈之衍生物，其中C L I Ρ區域經刪除及由該肽取代。 5. 如申請專利範圍第1、2或4項之方法，其特徵在於a)之囊胞產生細胞實質無内生Μ H C分子。 6· —種以控制方式修飾膜囊胞組成之方法，該方法包括： -製造一包括在啟動子調節下編碼界定重組分子之核酸序列之載體，該界定重組分子包括一多肽區域及一送信訊號使該多肽區域朝向細胞内體間室，該送信訊 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐）

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申清專利範圍號係選自包括G Υ χ χ I序列之胜肽，其中x表示任何胺基酸；一 Lamp、CD63、LIMPPn、Cdlc 及 FcgR 之胜肽片段；及一蛋白質之膜或穿透膜區域， -利用選自電轉殖、磷酸鈣沈澱、脂質媒介轉染、聚合物媒界轉染、陽離子胜肽媒介轉染及病毒媒介轉染之方法，將該載體插入至肥胖細胞或肥胖細胞衍生細胞中，及 ••自該修飾之肥胖細胞或肥胖細胞衍生細胞製造膜囊胞，該囊胞之製造係利用下列方法製得，包括（i)視需要刺激細胞以增加膜囊胞分泌，該刺激包括在鈣離子或具有對I g E受體強親合力之化合物存在下處理細胞，及自細胞培養物懸浮液回收由該等細胞產生之膜囊胞，該膜囊胞包括圍繞胞質部份之脂質雙層，及該囊胞在其表面表現該界定重組分子，此囊胞由包括至少一種離心或超離心該懸浮液之方法回收。 7. —種製備抗體之方法，包括以膜囊胞免疫化非人類動物，該囊胞（i)係由重組肥胖細胞或肥胖細胞衍生細胞所分泌，其包括編碼人類第11類主要組織相容性複合物之H L A - D R 1分子之第一重組核酸；（i i)包括圍繞胞質部份之脂質雙層，及（Πί)在其表面上包括由該第一重組核酸編碼之功能性重組人類H L A - D R 1第π類主要組織相容性分子與界定肽所形成之複合物，及藉由自 -3- ^張尺度適國家標準(CNS) A4規格(21Q X 297公董） 1224138 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍收抗體特別地該免疫化非人類動物回收血清或對應細胞而和/或產生抗體或涉及免疫性反應之細胞。 8.如申請專利範圍第7項之方法以製備單株抗體對於Μ H C -肽複合物具專一性。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）