CN100590131C

CN100590131C - 用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物

Info

Publication number: CN100590131C
Application number: CN02816094A
Authority: CN
Inventors: 阿兰·德尔凯尔; 珍-柏纳德·莱佩克
Original assignee: Anosys Inc
Current assignee: Anosys Inc
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2022-08-14
Also published as: ATE512982T1; IL160142A0; JP2005503791A; HK1062444A1; EP1417229B1; CA2454756A1; EP1417229A2; JP4662708B2; WO2003016522A2; WO2003016522A3; CA2454756C; AU2002331244B2; US20040197314A1; US7704964B2; CN1543476A

Abstract

本发明涉及用于将多肽在膜囊泡中进行选择性表达的组合物和方法。本发明还涉及了适合于生产这种膜囊泡的遗传结构和重组细胞。本发明还涉及了这样的功能化膜囊泡以及生产抗体的方法、产生或调节免疫反应的方法、以及使用它们筛选或鉴定结合配偶体的方法。更具体来说，本发明使用了天然或合成来源的lactadherin或其部分用于在膜囊泡中选择性表达多肽。本发明可用于实验、研究、治疗、预防或诊断领域。

Description

用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物

技术领域

本发明涉及用于将多肽在膜囊泡中进行选择性表达的组合物和方法。本发明还涉及适合于生产这样的膜囊泡的遗传结构和重组细胞。本发明还涉及这样的功能化膜囊泡以及生产抗体的方法、产生或调节免疫反应的方法、以及筛选和鉴定使用它们的结合配偶体的方法。具体来说，本发明使用天然或合成来源的乳粘素(lactadherin)或其部分用于在膜囊泡中选择性表达多肽。本发明可以用于实验、研究、治疗、预防或诊断领域。

背景技术

胞外体是来源于胞内体的囊泡，在后胞内体多囊泡体与细胞质膜融合后被分泌到细胞外环境中(4)。已知多种组织类型的细胞可以分泌胞外体，例如树枝状细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞和肥大细胞。不同来源的胞外体表现出含有不同类型的蛋白和脂类部分(5，6)。它们都显著地含有参与抗原呈递和免疫调节的蛋白，表明胞外体在引起调节免疫反应的细胞-细胞传递过程中发挥作用。事实上，用来自肿瘤抗原的肽刺激树枝状细胞(DC)分泌的胞外体，可以在使用匹配的肿瘤的动物模型中引发抗肿瘤反应(7，8)。生产、纯化胞外体的方法或使用胞外体用于治疗或作为研究工具已经有所描述，例如在WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中，在此引为参考。

考虑到它们的免疫原性和治疗性质，能够修饰胞外体的成分以改变它们的性质将是特别有用的。在这一方面，在本技术领域已经描述了重组的胞外体，它来自于用编码重组蛋白的质粒转染的细胞。这些重组胞外体含有质粒编码的重组蛋白(WO00/28001)。

发明概述

本发明现在公开生产重组胞外体的新方法。本发明还公开在胞外体中选择性表达多肽的方法。本发明还描述新的嵌合分子以及含有它们的重组细胞，可用于生产这些重组胞外体。本发明还涉及这样的功能化膜囊泡以及生产抗体的方法、产生或调节免疫反应的方法以及使用它们筛选和鉴定结合配偶体的方法。

本发明是基于意外的发现，即Lactadherin在许多产胞外体的细胞中表达，并且在这些细胞中，发现Lactadherin几乎专一地与胞外体相关(图1)。这种高度特异性的亚细胞定位不仅在内源的Lactadherin上发生，而且在用编码Lactadherin的质粒转染胞外体产生细胞后得到的外源Lactadherin上也发生(图2)。我们发现，通过删除Lactadherin的C1/C2结构域上的特定的短部分，Lactadherin的亚细胞定位被改变了(图2)。这些发现强烈地支持Lactadherin的C1/C2结构域含有高度特异性的定位于胞外体表面的定位基元，对Lactadherin的C1/C2结构域的修饰改变了定位到其它表面上的特异性。我们发现这种现象在几个种间是保守的，因为用编码人重组Lactadherin的质粒体外转染来自小鼠和仓鼠的胞外体产生细胞系，产生的人重组Lactadherin也几乎分别专一地结合于小鼠和仓鼠的胞外体中(图3)。此外，在仓鼠细胞系中表达的小鼠重组Lactadherin也在仓鼠胞外体中发现(图3)。

由此分析出，在一个蛋白中引入Lactadherin的部分或全部C1和/或C2结构域或其功能等价物可以使产生的嵌合蛋白定位于胞外体和其它脂质结构上。

本发明还公开允许鉴定其它的定位多肽或基因的方法，这可以用于构建嵌合基因或蛋白用于定位胞外体或在胞外体中表达。这些嵌合蛋白可以用于产生重组的囊泡，它们被定制后获得新的所需功能。由于胞外体内在的性质，即免疫原性和无毒性，得到的重组胞外体代表了一种新的工具，在研究和医学领域有广泛的用途。值得注意的是，胞外体诱导强烈的免疫反应的潜力使它们成为理想的工具，用于制备针对在重组胞外体中表达的抗原的抗体。同样，具有生物活性的嵌合蛋白也可用于产生重组胞外体，它们被定制后获得新的治疗性质。Lactadherin这种意外的定位多肽以及在胞外体中选择性表达的能力也提供了新的方法，以纯化这些多肽，包括Lactadherin本身。

因此，本发明的一个目的在于将多肽定位于胞外体的方法，包括：

a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码融合了定位多肽的所述多肽，该定位多肽包含了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；以及

b)在体内或离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生重组胞外体。

本发明的另一个目的是在胞外体表面选择性表达多肽的方法，包括：

a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的部分的所述多肽；

b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生重组胞外体；以及

c)收集该重组胞外体，其中该胞外体在其表面上带有由该嵌合的遗传结构编码的多肽。

本发明的另一个目的是制备功能化胞外体的方法，包括：

a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码一种融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的部分的多肽；

b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生功能化的胞外体，在它们的表面上呈递该多肽，以及

c)收集和/或纯化该功能化胞外体。

本发明的另一个目的是生产含有Lactadherin或其一部分的多肽的方法，该方法包括：

a)提供一种编码该多肽的遗传结构；

b)将该遗传结构引入胞外体产生细胞以产生功能化的胞外体，在它们的表面上呈递该多肽；

c)收集和/或纯化该功能化胞外体，以及

d)从该功能化胞外体中回收和/或纯化该多肽或其片段。

本发明的另一个目的是通过上述方法制备的功能化胞外体以及含有这样的功能化胞外体和可药用的赋形剂或载体的组合物。

本发明还涉及嵌合的遗传结构，它编码了一个目的多肽，该多肽与一个含有Lactadherin的C1和/或C2结构域的定位部分或下面鉴定的另一种定位多肽融合。目的多肽可以是例如抗原、细胞因子、配体、受体、免疫球蛋白、标记多肽、酶、离子通道或其一部分。这样的嵌合基因的特定例子编码从SEQ ID NO：22-27、32或33中选择的多肽或其缺失了C末端8个氨基酸残基的片段。

本发明还包括了含有上述的嵌合遗传结构的载体，以及含有嵌合遗传结构或上述载体的重组细胞。

本发明还提供了鉴定或筛选胞外体定位多肽的方法，以及产生能够选择性定位到膜囊泡(例如胞外体)上的嵌合蛋白的方法。嵌合蛋白一般是由一个多肽序列(例如天然存在的蛋白如抗原、细胞因子、配体、受体或免疫球蛋白的完整的或部分序列)融合到一个定位多肽的序列上而组成的，定位多肽通常是Lactadherin或其包括C1和/或C2功能结构域的部分，优选为C1/C2功能结构域。

因此，本发明的另一个方面在于一种筛选、鉴定或选择胞外体定位多肽的方法，该方法包括：

●提供第一个遗传结构，它编码一种侯选多肽，优选为侯选的跨膜多肽；

●将第一个遗传结构引入胞外体产生细胞，并测试侯选多肽在胞外体中的表达；

●选择一个在胞外体中表达的侯选多肽，以及制备第二个遗传结构，它编码与跨膜抗原或受体融合的该选择的多肽；

●将第二个遗传结构引入胞外体产生细胞并测试融合多肽在胞外体中的表达；以及

●选择引起跨膜抗原或受体在胞外体中有效表达的多肽。

我们的结果显示，使用上述的方法，可以鉴定、选择和/或改进不同的含有指导在胞外体中表达的特异性定位信号的蛋白或多肽。这些多肽需要在胞外体中表达和将其他分子定位到这些囊泡的能力。这些多肽可以是从跨膜蛋白衍生的，并且可以包括这样的蛋白的全部或其一部分，一般为含有至少是跨膜区的部分。这些结构特别适合于将抗原投送到胞外体中，特别是受体和跨膜蛋白。该方法可以用于选择特异性的单个定位多肽，或用于筛选遗传结构的文库。

获得的重组胞外体可用于许多研究和治疗用途，包括培养抗体、产生具有改进的治疗性质的胞外体、抗原递送以及文库筛选以鉴定蛋白-蛋白相互作用的相对物。

本发明还可有利地用于产生合成的脂质囊泡。事实上，本发明可用于将分子定位到胞外体之外的脂质结构中，例如任何天然存在的囊泡或含有质膜双层的细胞器、以及合成的含有脂的囊泡如脂质体或任何具有疏水性质的合成微粒。这样的脂质囊泡优选被改造成含有(或富集有)磷脂酰丝氨酸和/或其它的天然包含在胞外体中的脂类，以便允许嵌合分子的有效定位和结合。

此外，本发明可用于投送任何选定的与Lactadherin或其一部分人工融合的分子。在这一点上，本发明不限于遗传融合，还包含了化学融合，即任何Lactadherin与一个分子的化学(共价)复合物。

附图说明

图1：Lactadherin到胞外体的定位。

图2：外源的Lactadherin到胞外体的定位。

图3：Lactadherin的选择性表达在种间是保守的。

图4：与Lactadherin融合的生物活性的IL-2在胞外体中的选择性表达。

图5：重组人Lactadherin的纯化。

图6：免疫接种DNA时APC的交叉引发。

图7：重组的侯选跨膜多肽在胞外体中的表达。在胞外体及转化细胞的细胞裂解物中检测到重组的MelanA/MART1(组A)、CD40L(组B)和CD81(组C)。

图8：在胞外体中重组嵌合蛋白的表达。

图9：在用含Lactadherin的胞外体免疫的小鼠的血清中检测抗Lactadherin抗体。

发明详述

本发明公开生产重组胞外体的新方法及其应用。更具体来说，本发明使用一种定位多肽，例如Lactadherin或其部分，来选择性表达天然或合成来源的多肽或将此多肽定位到膜囊泡中。本发明可以用于实验、研究、治疗、预防或诊断领域。

本发明源自于发现了Lactadherin的新的意外的性质。具体来说，本发明显示Lactadherin在胞外体中选择性表达，并可以用于在这样的囊泡中选择性表达多肽。

正如上面指出的，本发明提供了在胞外体中定位或(选择性)表达多肽的方法、功能化胞外体的方法以及生产多肽的方法，这些方法使用了一个编码嵌合多肽的嵌合基因或遗传结构。嵌合多肽包含了与Lactadherin或其功能结构域融合的目的多肽。

Lactadherin

Lactadherin是一种首先在乳腺组织中被鉴定的蛋白。它是乳汁的成分，在乳汁脂肪球的表面与几种其他的蛋白相结合。Lactadherin在其N末端含有表皮生长因子样(EGF-like)区域，其中含有在整合蛋白配体中发现的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)序列基序。该基序介导了Lactadherin与α_Vβ₃和α_Vβ₅整合蛋白的结合。Lactadherin的C末端含有一个C1/C2结构域，其参与了Lactadherin与乳汁脂肪球的相互作用。几种结合于其它细胞表面的其它蛋白也有相关的C1/C2结构域。Lactadherin的C1/C2结构域已经显示出倾向于结合到含有磷脂酰丝氨酸脂质的表面(参考文献1到3)。已经发现Lactadherin出现在由鼠科动物树突状细胞产生的胞外体的表面。在这一方面，WO00/30667涉及了使用Lactadherin或其变体将抗原投送到树突状细胞或在体内介导免疫反应。US5455031公开了长形式的人Lactadherin的克隆。

本发明源自于发现了Lactadherin的新的意外的性质，即Lactadherin在胞外体中选择性表达或定位多肽的能力。

在本发明的上下文中，术语“选择性”表明细胞表达的Lactadherin(或嵌合多肽)几乎专一地出现在胞外体的表面，尽管可以观察到有残余或少量的Lactadherin出现在其它的细胞区室或膜中。本发明部分基于意外地确定了Lactadherin主要表达在胞外体的表面，并可用于生产其中富集了与Lactadherin结合的所需分子的胞外体或脂质囊泡。

在本发明的上下文中，术语在其表面“带有”分子的胞外体(或囊泡)被定义为含有与它们的膜结合的这类分子的囊泡。分子可以暴露在囊泡外面，也可以包含在囊泡内部(即与膜的内侧结合)。一般来说，本发明允许在囊泡的表面有效地呈递分子，即在囊泡的外面暴露它们。

在执行本发明中可以使用不同来源或起源的Lactadherin。一般来说，优选使用哺乳动物的Lactadherin或其部分。哺乳动物Lactadherin包括例如人、鼠科动物、大鼠、牛、猪和马的Lactadherin。最优选的Lactadherin是人或鼠科动物的Lactadherin或其片段或其功能等价物。

在这方面，本发明优选使用：

(1)人的Lactadherin或鼠的Lactadherin，

(2)人或鼠的Lactadherin片段，其中含有C1和/或C2功能结构域，更优选为C1/C2功能结构域，或

(3)与(1)或(2)中的多肽具有至少50％一级结构同一性的多肽。

人的Lactadherin的氨基酸序列描述在SEQ ID NO：7(长形式)和8(短形式)中。相应的核酸分子的例子分别由SEQ ID NO：5和6代表。鼠的Lactadherin的氨基酸序列描述在SEQ ID NO：10中。也可参见Stubbs等(PNAS 87(21)，1990，8417)，以及Genbank登录号M38337。

在本发明的一个特定实施方案中，嵌合基因含有一种Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO：7、8、10或其含有C2功能结构域的片段。

在本发明的另一个特定实施方案中，嵌合基因含有一种Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO：7、8、10或其含有C1功能结构域的片段。

在另一个特定实施方案中，嵌合基因含有一种Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO：7、8、10的C1/C2功能结构域。

人Lactadherin的C2结构域含有SEQ ID NO：7的229到387位氨基酸残基。人Lactadherin的C1结构域含有SEQ ID NO：7的69到225位氨基酸残基。在一个典型的例子中，嵌合结构编码SEQ ID NO：7的至少229到387位或69到225位氨基酸残基。在另一个特定的实施方案中，嵌合结构编码了SEQ ID NO：7的至少69到387位氨基酸。

鼠Lactadherin的C2结构域含有SEQ ID NO：10的271到426位氨基酸残基。鼠Lactadherin的C1结构域含有SEQ ID NO：10的111到266位氨基酸残基。在一个典型的例子中，嵌合结构编码SEQ IDNO：10的至少271到426位或111到266位氨基酸残基。在另一个特定的实施方案中，嵌合结构编码SEQ ID NO：10的至少111到426位氨基酸。在其他特定的实施方案中，嵌合结构编码SEQ ID NO：10的至少109到426位氨基酸。

如上所述，定位部分可以是与上述(1)或(2)中的多肽具有至少50％一级结构同一性的多肽。同一性可以按照各种已知的技术来确定，例如通过计算机程序，优选为CLUSTAL方法。在更优选的情况下，定位多肽与(1)或(2)中的多肽具有至少60％，优选至少70％的同一性。这样的Lactadherin变体(或功能等价物)应保留将多肽定位到胞外体中的能力。这个性质可以被证实，如同在实施例中描述的那样，例如通过产生一个嵌合基因，它含有与标记多肽融合的该变体，将这个嵌合基因在胞外体产生细胞中表达，然后确定标记多肽在胞外体表面的存在。优选的Lactadherin变体与上述的(1)或(2)中的多肽具有至少85％的同一性。可能的变体包括氨基酸缺失、取代、突变和/或添加。

这样的变体或功能等价物的具体的例子包括其它含有C1/C2结构域的多肽或蛋白或其片段。具体来说，这样的功能性变体的具体例子包括Del-1、Neuropilin-1、凝集因子5和凝集因子8或其含有C1和/或C2功能结构域的片段。

定位多肽的筛选

本发明还公开了可加以生产、筛选和/或分离的其它有效的定位多肽。具体来说，本发明显示了可以根据它们在胞外体中的表达和它们将其它多肽投送到这样的囊泡中的能力来筛选多肽。本发明表明，在胞外体中天然表达的多肽并不一定代表了有效的定位多肽，而并不在这些囊泡中天然表达的多肽可以人工地产生并能够有效地投送目的的多肽。本发明还表明，一般在胞外体中不表达的多肽可以通过重组DNA技术被迫进入这些区室中。

尽管唯一在胞外体中被发现的胞外体特异性蛋白例如Lactadherin被优选用来将蛋白定位到胞外体中，但在胞外体中富集或不是专门在胞外体中存在的蛋白，对于将其它蛋白定位到胞外体中来说也是潜在的侯选者。本发明提供了鉴定和使用这种侯选者的方法。为了说明这一点，我们已经发现重组的MelanA/MART1、CD40L和CD81，在用编码这些跨膜分子的质粒转染细胞后在胞外体中得到表达。这些结果在实施例6中描述。MelanA/MART1是一种肿瘤相关的胞内膜蛋白，最近在来自肿瘤细胞的胞外体中被发现。提示这种情况的发生反映了胞外体将全长的肿瘤抗原传递到APC的能力(9)。我们的发现表明MelanA/MART1事实上是来自MelanA/MART1⁺肿瘤胞外体的胞外体的一个整合成分。CD40L是一种重要的免疫反应刺激剂，是我们的发现首次表明它可以在胞外体中检测到。与之相反，CD81是一种已知的胞外体的成分，先前已知它在来自B细胞的胞外体中富集。我们构建了包含与一个7-跨膜受体CCR7融合的MelanA/MART1或CD81的嵌合蛋白，发现MelanA/MART1-CCR7嵌合蛋白几乎专一地在胞外体中表达，而单独的CCR7只在细胞表面上检测到。相比之下，令人吃惊的是，尽管CD81由胞外体天然表达，CD81与CCR1的嵌合结构不产生任何可检测到的蛋白(见实施例6)。因此我们的方法表明存在有效的胞外体定位多肽，并允许鉴定和选择这样的多肽，用于将抗原、重要的跨膜抗原和受体定位到胞外体中。

因此，本发明的另一方面在于筛选、鉴定或选择胞外体定位多肽的方法，该方法包括：

●提供第一个遗传结构，它编码一个侯选多肽，优选为侯选的跨膜多肽；

●选择一个在胞外体中表达的侯选多肽，以及制备第二个遗传结构，它编码与被定位多肽融合的所述选定的多肽；

●选择引起被定位多肽在胞外体中有效表达的多肽。

我们的结果显示，使用上述的方法，可以鉴定、选择和/或改进不同的含有指导在胞外体中表达的特异性定位信号的蛋白或多肽。这些多肽需要在胞外体中表达和将其他分子定位到这些囊泡的能力。这些多肽可以是从跨膜蛋白衍生的，并且可以包括这样的蛋白的全部或其一部分，一般为含有至少是跨膜结构域的部分。这些结构特别适合于将抗原投送到胞外体中，特别是受体和跨膜蛋白。

在优选情况下，定位多肽是或者含有一个跨膜结构域。侯选定位多肽实际上可以来自任何含有这样的跨膜结构域的蛋白，例如受体、通道等。这样的定位多肽的具体例子包括MelanA/MART1、CD40L、CD81等或其一部分。定位多肽可以含有整个的跨膜蛋白，或仅仅是其含有至少一个跨膜结构域的部分。

由于侯选定位多肽的本质，本方法基本上适合于鉴定多肽，所述多肽适用于将跨膜多肽投送到胞外体或将多肽投送到胞外体内。最优选的定位多肽因此是那些跨膜的多肽，例如受体、跨膜抗原或其一部分。本发明具有特别的优势，因为它允许筛选能够在特定的囊泡中有效表达复合分子，例如具有几个跨膜结构域的受体(例如G蛋白偶联受体或“GPCR”)的定位多肽。

侯选定位多肽或融合多肽在胞外体中的表达可以根据多种技术进行检测，这些技术公开于本申请的整个说明书中。在一个优选实施方案中，将遗传结构引入胞外体产生细胞，从这种修饰的细胞中制备胞外体，然后测量在该胞外体中表达的多肽。可以使用多种技术测量表达，包括使用定位或被定位多肽的特异性配体。在一个特定的实施例中，使用特异性针对定位部分或在融合多肽中引入的标记序列的抗体来测定表达。

在制备融合多肽时，可以将被定位的部分放置在定位多肽的上游或下游，即C端或N端。融合的方向决定了被定位多肽的表达类型。具体来说，将被定位多肽偶联到定位多肽的细胞内部分会导致被定位多肽在囊泡内部表达(对可溶性抗原而言)。另一方面，对于表达跨膜的受体，可以由专业技术人员根据结构调整偶联的类型，以允许适当的折叠并插入到胞外体膜中。

如同后面将公开的那样，偶联可以是直接的，也可以通过一个间隔分子，胞外体产生细胞可以有各种不同的来源和起源。

此外，不同的融合可以平行方式，也可以在同样的囊泡内加以表达和试验。在这一点上，本方法可以用于选择特异性的单个定位多肽或者用于筛选遗传结构文库。

本方法允许生产改进的定位多肽和能够高度有效地在胞外体中表达的融合分子。

在这一方面，本发明还涉及生产能够表达选定的跨膜多肽的胞外体的方法，该方法包括：

●如上所述选择一种定位多肽，

●提供一种编码了与定位多肽融合的选定的跨膜多肽的遗传结构，

●将该遗传结构在胞外体产生细胞中表达，以及

●从该修饰细胞中生产和分离胞外体。

本发明还涉及生产表达GPCR或其含有至少一个跨膜结构域的部分的胞外体的方法，该方法包括：

●提供一种遗传结构，该结构编码了与含有跨膜结构域和/或如上所述选定的定位多肽融合的GPCR或其部分，

●将该遗传结构在胞外体产生细胞中表达，并且

●从该表达GPCR或其部分的修饰细胞中生产和分离胞外体。

本发明还涉及表达重组GPCR或其一部分的胞外体。

本发明还涉及含有从Melan/MART1、CD40L和CD80中选择的定位多肽以及被定位多肽的融合多肽。在更优选情况下，被定位多肽含有一个跨膜结构域。本发明还涉及任何编码这样的融合多肽的多核苷酸序列。具体来说，这样融合的说明性例子以SEQ ID NO：32和33提供。

目的多肽

本发明可用于在(从)胞外体或其它脂质结构中定位、选择性表达或生产(例如纯化)各种多肽，例如抗原、细胞因子、配体、受体、免疫球蛋白、标记多肽(例如标记蛋白，如绿色荧光蛋白或酶)、酶、离子通道等，或其一部分。一般来说，本发明可以与任何目的多肽一起使用，例如任何具有生物学或免疫学性质的多肽。此外，本发明可用于同时在胞外体中表达或定位几个不同的编码不同多肽的嵌合遗传结构，以进一步扩展活性范围或重组复合分子。

优选的多肽的例子是抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原和微生物抗原。肿瘤抗原的说明性例子是MAGE、BAGE、前列腺肿瘤抗原、癌基因等。这些抗原的氨基酸序列本身已知，并可以通过重组技术或通过合成来生产。本发明中被定位或呈递的特定的抗原包括可溶性抗原和受体的胞外结构域。

其它目的多肽的例子包括淋巴因子(IL-2、IL-4、IL-13)、营养因子(TNF、INF、GM-CSF、G-CSF等)、酶、凝集因子、激素、脂蛋白等。

另一种类型的目的多肽是具有至少一个跨膜结构域，更优选为GPCR或其部分的受体。事实上，本发明现在允许使用定位多肽将跨膜多肽在特定的囊泡中定位和表达。GPCR在囊泡中的表达允许它们对配体(无论是合成的还是天然的)、生产抗体等进行纯化、研究性质、筛选。GPCR的一个具体的例子是例如CCR7，尽管本发明也可以与其它受体一起使用。

其它的特定的例子是免疫球蛋白和其片段，例如免疫球蛋白的Fc片段。这样的Fc片段当在胞外体表面中表达时，可以将胞外体导向表达这些Fc片段的受体的细胞，例如抗原呈递细胞。这样的Fc片段的表达，不论是单独表达还是与抗原结合表达，都有利于并增强抗原呈递细胞，特别是树突状细胞对胞外体的识别，并增加了这些抗原的交叉引发。

本发明也明显地适合于投送治疗用蛋白或多肽。可以使用功能化的重组胞外体或脂质体，任选与在它们表面上的组织特异性配体一起，将这样的蛋白投送到特定的细胞。藉此，治疗用蛋白可以被表达在缺少内源蛋白，或表达了非功能性的内源蛋白从而产生了病理状态的细胞的表面。在这一方面，本发明的一个特定的目的是将治疗用蛋白投送到受试对象中的方法，包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的片段或使用上面公开的方法所鉴定的一种定位多肽相融合的该蛋白；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞，以在其表面产生带有该嵌合蛋白的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体，并将该胞外体或其部分注射到该病人中。

此外，因为本发明也允许将分子化学偶联到Lactadherin或其功能等价物上，本发明还扩展到非多肽化合物例如小分子、核酸、脂、多糖、糖脂等。

正如所指出的，本发明现在使通过利用Lactadherin或其功能等价物定位而将多种分子结合起来表达在胞外体中，以重构具有增强的免疫原性的人工微粒成为可能。一个典型的例子是将抗原、Lactadherin、定位多肽(例如Fc片段)和/或佐剂(例如细胞因子、包括GM-CSF等)组合在一起。

融合

嵌合的多肽或化合物可以通过遗传或化学融合来制备。

对于遗传融合，编码目的多肽的嵌合基因区域可以被融合在Lactadherin或定位多肽的上游、下游或任何内部的结构域连接处。在这一点上，实施例证明与Lactadherin的上游融合以及与定位多肽的N-端和C-端融合是有功能的。此外，结构域彼此之间可以直接融合，也可以被不改变嵌合多肽的性质的间隔区域所分隔开。这样的间隔区域包括克隆位点、切割位点、挠性结构域等。此外，嵌合的遗传结构还可以包含一个前导的信号序列以有利于将编码的嵌合多肽分泌到胞外体产生细胞的内质网中。一般来说，嵌合基因包含Lactadherin的前导序列。然而，也可以插入异源的前导序列，特别是如果利用Lactadherin的部分。此外，嵌合基因还可以含有一个标记以便于纯化或监测，例如一个myc标记、一个多聚组氨酸标记等。

对于化学融合，可以对部分或全长的Lactadherin序列进行选择或修饰，以使其末端出现一个游离的活性基团，例如巯基、氨基、羧基以交联一个可溶性的多肽、糖脂或任何小分子。在一个优选实施方案中，Lactadherin结构编码了SEQ ID NO：7的至少1到230位氨基酸，其中C1结构域(60到225位氨基酸)提供了定位到胞外体的基序，230位的半胱氨酸提供了与其它分子进行化学交联的游离巯基残基。将肽和化学物质交联到SH基团可以通过已经建立好的方法来进行(参见G.T Hermanson(1996)生物结合技术，San Diego科学出版社，785页)。本方法的优点是将本发明的范围扩展到了可以制备针对多肽以外的化合物，如糖脂、药物和有机化合物的抗体。它还提供了无需引入假定的新的表位就将多肽和化合物定位到胞外体的方法。所选的交联试剂已显示是免疫原性沉默的(上面引用的G.T Hermanson(1996))。新的表位有时在嵌合基因连接处出现，并可能会限制嵌合基因产物在特定的预防和治疗人类应用中的使用。

因此，修饰的胞外体或脂囊泡(例如脂质体)可以通过产生呈递相关的Lactadherin结构如SEQ ID NO：7的胞外体(脂质体)，然后将它们与将要连接的产物进行反应来制备。另外，交联到产物上的Lactadherin片段也可以先被制备，然后加入到纯化的胞外体或脂质体中。

载体

本发明还包括了含有上述的嵌合遗传结构的载体以及含有如上所述的嵌合遗传结构或载体的重组细胞。载体可以是质粒、噬菌体、病毒、人工染色体等。典型的例子包括质粒，例如那些从商业可获得的质粒，特别是pUC、pcDNA、pBR等衍生的质粒。其它的优选载体从病毒衍生，例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒、AAV、杆状病毒或痘苗病毒。对载体的选择可以由专业技术人员根据将要使用该载体的重组宿主细胞进行调整。在这一点上，优选使用能够转染或感染哺乳动物细胞的载体。事实上，优选的重组宿主细胞是哺乳动物细胞。它们可以是原始的细胞或建立的细胞系。说明性例子包括成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞、免疫细胞等以及它们的先祖细胞或前体细胞。最优选的哺乳动物细胞是产生胞外体的哺乳动物细胞。这些细胞包括例如肿瘤细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞或肥大细胞。

胞外体产生细胞

胞外体产生细胞包括任何生产和分泌胞内体源的膜囊泡的细胞，优选为哺乳动物源的细胞，其中的膜囊泡是由后期的胞内体多囊泡体与质膜融合产生的(4)。来自多种组织类型的细胞已经表明能够分泌胞外体，例如树突状细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞、T淋巴细胞和肥大细胞。生产、纯化胞外体的方法或使用胞外体用于治疗目的或作为研究工具已经有所描述，例如在WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中，在此引为参考。本发明的优选胞外体产生细胞是哺乳动物肿瘤细胞、哺乳动物T淋巴细胞和哺乳动物树突状细胞，一般为鼠或人来源的。在这一方面，细胞优选为永生化的树突状细胞(WO94/28113)、幼树突状细胞或肿瘤细胞(WO99/03499)。此外，为了生产抗体，使用B淋巴细胞作为胞外体产生细胞可能是有优势的，因为产生的胞外体含有附加的功能和分子，例如促进抗体产生的MHCII类分子。此外，已经表明B细胞衍生的胞外体能够结合到滤泡树突状细胞，这是抗体诱导的另一个重要特点(10)。

细胞可以在任何合适的培养基中培养和维持，例如RPMI、DMEM等。培养可以在任何合适的装置中进行，例如平板、碟子、试管、摇瓶等。

可以使用任何常规的方法将遗传结构(或载体)引入胞外体产生细胞，例如通过裸露DNA技术、阳离子脂质介导的转染、聚合物介导的转染、肽介导的转染、病毒介导的转染、物理或化学试剂或处理、电穿孔等。在这一方面，应该注意到短暂的转染足以表达相关的嵌合基因，因此不需要产生稳定的细胞系或优化转染条件。由这样的细胞产生的胞外体可以按照本领域熟知的技术收集和/或纯化，例如通过离心、层析等。优选的技术已经在WO00/44389和US09/780748中描述，在此引为参考。

本发明重组的功能化的胞外体可以用于生产抗体、调节免疫反应、投送生物活性和/或作为筛选工具以及选择任何选定的多肽的配体。

抗体的制备

在一个特定的实施方案中，本发明涉及使用上述的重组胞外体生产特异性针对任何多肽或其它抗原的抗体。

本发明的一个值得考虑的优点是在重组胞外体上抗原与免疫刺激成分相结合，这就允许针对免疫原性弱的抗原产生抗体，在这种情况下经典的制备抗体的方法都是失败的。具体来说，从B淋巴细胞产生的胞外体含有MHC II类分子，可以刺激抗体的产生。此外，不需要纯化大量的抗原就可以制备抗体。事实上，不论在其表面上表达的外源抗原的本质是什么，都可以使用单一的小规模的纯化方法分离胞外体(US09/780748)。因此，可以非常快地完成抗原制备步骤，即一般可以在少于12个小时之内。这种方法快速，可以平行处理许多样品，允许同时制备多种抗原用于免疫。在天然存在的囊泡中表达抗原，再结合温和的纯化步骤，可以帮助保护抗原的天然构象，能够产生具有潜在的治疗用途的相关抗体。此外，本发明产生在其表面含有高密度嵌合分子(例如抗原)的脂质囊泡。这样的高密度可以与聚合状态相比，通过增加抗原的亲合力极为有利于抗体的生产。本发明的另一个优点是多肽可以被胞外体产生细胞表达，因而易于进行天然的加工和翻译后修饰(糖基化等)途径。

因此本发明还涉及产生结合了多肽的抗体的方法，该方法包括用上述的表达了该多肽或其一个表位的功能化胞外体免疫非人类的哺乳动物，然后从该哺乳动物收集抗体或抗体产生细胞。该方法特别适合于生产针对上述的与Lactadherin融合的抗原的抗体，或者与定位多肽融合的跨膜受体的抗体。

本发明还涉及生产与多肽结合的抗体的方法，包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的部分融合的该多肽或其一种表位；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上呈递该多肽或表位的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体并将该胞外体或其一部分注射到非人类的哺乳动物中以产生结合了该多肽或表位的抗体；以及

(d)从该哺乳动物收集抗体或抗体产生细胞。

本发明还涉及生产与受体例如GPCR结合的抗体的方法，包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的该受体或其一种表位；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上呈递该受体或表位的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体并将该胞外体或其一部分注射到非人类的哺乳动物中以产生结合了该受体或表位的抗体；以及

(d)从该哺乳动物收集抗体或抗体产生细胞。

抗体可以是多克隆的也可以是单克隆的。从不同的物种，包括小鼠、啮齿动物、灵长动物、马、猪、兔、禽类等生产多克隆抗体的方法可以在例如Vaitukaitis等1971年的文献中发现。简单来说，抗原(在本发明中为重组胞外体)可以在含或不含佐剂(完全或不完全佐剂，例如弗氏佐剂)的情况下注射，并一般通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射的方式给药到动物。可以进行重复注射。收集血液样品，分离免疫球蛋白或血清。

生产单克隆抗体的方法可以在例如Harlow等(抗体：实验室手册，CSH出版社，1988)或Kohler等(Nature 256(1975)495)的文献中发现，在此引为参考。简单来说，这些方法包括用抗原(在本发明中为重组胞外体)免疫动物，接着回收脾或淋巴结细胞，然后与永生的细胞如骨髓瘤细胞融合。得到的杂交瘤产生单克隆抗体，并可以通过有限的稀释分离单独的克隆加以选择。

在一个特定的实施方案中，胞外体产生细胞是B淋巴细胞。

在另一个特定的实施方案中，胞外体产生细胞和/或Lactadherin和/或定位多肽来自与被免疫接种的哺乳动物相同的物种。事实上，在这样的系统中，胞外体和Lactadherin不具有免疫原性，产生的抗体基本上只针对选定的抗原。

在一个特定的实施方案中，胞外体产生细胞是鼠细胞，Lactadherin是鼠Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的部分或变体，非人类的哺乳动物是小鼠，抗原或表位来自不同的物种，例如是人类来源的。更为优选的情况下，小鼠是人源化小鼠，允许产生人源化的抗体。

为此，蛋白(抗原或表位)的核苷酸序列可以融合到小鼠Lactadherin的C1和/或C2结构域，将得到的嵌合序列使用标准的分子生物学技术克隆到一个真核表达载体中。编码嵌合蛋白的质粒被转染进一个产生胞外体的小鼠细胞系中，并在转染的细胞培养几天后收获重组胞外体，然后通过蔗糖密度梯度离心纯化重组胞外体(US09/780748)。嵌合蛋白在重组胞外体上的存在使用抗C1/C2结构域的单克隆抗体通过Western印迹分析来建立。然后将带有嵌合蛋白的重组胞外体注射到同源的小鼠中产生抗体。就此而论，只有包含在用于产生嵌合蛋白的蛋白序列中的表位才代表被免疫小鼠中的外源抗原。抗体的产生在根据抗原的本质所设计的筛选分析中被证实。如果将重组胞外体应用在筛选分析中，则需要制备第二个嵌合蛋白，其中相同的蛋白抗原序列与Lactadherin序列的扩展的C1/C2结构域融合。此外，也可以使用表达与来自不同物种的Lactadherin C1/C2结构域融合的蛋白抗原的重组胞外体。这些新的结构产生具有新的连接序列的嵌合蛋白，因此避免了检测/选择针对用于免疫的嵌合蛋白的连接处的抗体。

正如上面指出的，本方法非常具有优势，可以用于在各种不同的物种中产生针对任何选定的抗原或表位，包括肿瘤抗原、细菌抗原或病毒抗原的抗体。

展示新的生物活性的重组胞外体的制备

本发明可用于生产能够表现任何选定的生物活性的重组胞外体。它们可以通过将一个(或几个)具有特定生物学活性的多肽定位到胞外体的表面而产生，如上所述。

本发明的一个优点是，在重组胞外体上生物活性成分可以达到高的局部浓度，这就能够使胞外体获得潜在的新的生物活性，具有在靶细胞上交联受体的可能性。这种高的局部浓度也允许增加被运送分子的亲和性，因此改善了胞外体的潜力。此外，本发明还允许在胞外体上重建生物活性多组分的实体，由此将重组胞外体的应用领域扩展到多链的蛋白，而经典的方法操作这样的蛋白是困难的。

可以使用的生物活性蛋白的一个例子是白细胞介素-2(IL-2)，其是一种激活T细胞的细胞因子，用在癌症的免疫治疗中以刺激T细胞针对肿瘤细胞的反应。这种免疫学确定的佐剂与肿瘤抗原同时出现在胞外体上可以改善胞外体的效率。在这种情况下，证实重组胞外体上的IL-2是有生物活性的功能性分析需要使用一种IL-2依赖性细胞系。

另一个生物活性蛋白的例子是CD40配体(CD40L)，它诱导辅助信号，而这是DC启动针对被捕获抗原的免疫反应所需要的。辅助信号与肿瘤抗原同时出现在胞外体上可以改善胞外体的效率。在这种情况下，监测在DC上诱导活化标记的功能性分析将被用来证实重组胞外体上的CD40L是有生物活性的。

其它的例子包括其它的淋巴因子(IL-4、IL-13)、营养因子(TNF、IFN、GM-CSF、G-CSF等)、酶、凝集因子、激素、脂蛋白等。

其它的特定的例子是能够促进胞外体定位或与特定细胞，优选为与树突状细胞相互作用的多肽。这样的定位多肽包括例如免疫球蛋白的Fc片段。这样的Fc片段当在胞外体表面表达时，可以用于将胞外体导向抗原呈递细胞。这样的Fc片段的表达与抗原(和任选上面公开的佐剂分子)的表达相结合，促进并增强了抗原呈递细胞、特别是树突状细胞对胞外体的识别，并增加了这些抗原的交叉引发。

为了生产这样的功能化的胞外体，生物活性蛋白的全长或部分cDNA序列可以融合在编码定位多肽的序列的上游或下游，将得到的嵌合序列使用标准的分子生物学技术克隆到一个真核表达载体中。定位多肽可以选自或来自人类Lactadherin序列的C1和/或C2结构域或其等价物，也可以来自使用上面公开的筛选方法鉴定的定位多肽，例如MART1/MelanA或其片段。编码嵌合蛋白的质粒被转染到一个胞外体产生细胞系中，在对转染的细胞培养几天后收获重组胞外体。然后通过蔗糖密度梯度离心纯化重组胞外体。嵌合蛋白在重组胞外体上的存在使用抗原特异性抗体(如果可以得到)和/或抗定位多肽的抗体通过Western印迹分析来建立。然后进行功能分析以证实与定位多肽融合的蛋白的生物活性得到保留。接着可以将功能化胞外体体内给药到任何需要它的哺乳动物受试对象，特别是人类受试对象。给药可以采取各种不同的途径，例如通过全身性注射，如静脉内、肌肉内、腹膜内、肿瘤内、皮下等。

使用重组胞外体将全长抗原投送到DC

除了由重组胞外体诱导的体液或抗体反应外，也可以产生针对在胞外体上表达的抗原的细胞免疫反应。如上所述制备包括编码肿瘤或微生物抗原和定位多肽的全长cDNA的嵌合序列。然后可以使用重组胞外体直接接种个体或者在体外间接脉冲DC。将全长抗原投送到DC中缓和了疫苗使用的单倍型限制。此外，通过抗原吸收和转移到DC的自然的途径投送，会使抗原得到有效的加工，并对I类和II类表位均能够呈递。因此，表达全长的肿瘤或微生物抗原的重组胞外体可以有助于改进针对癌症和传染病的疫苗。

本发明的另一个目的是一种将抗原投送到受试对象的方法，包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分的该抗原；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在它们的表面上带有该抗原的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体，并将该胞外体或其一部分注射到该受试对象中。

(c)收集该重组胞外体，并将其离体与来自该受试对象的树突状细胞接触；以及

(d)将该接触过的树突状细胞或其一部分注射到该受试对象中。

树突状细胞的一“部分”是指可以将所有接触过的DC都注射，或者如果需要，也可以注射一部分，而将其余的保留以备进一步注射或使用。此外，术语“部分”还表明尽管完整的细胞可以施用，但其中衍生的制剂也可以注射，例如由这样的树突状细胞产生的膜提取物或胞外体。

树突状细胞或其部分可以通过几种途径注射，例如通过静脉内、动脉内、腹膜内、肿瘤内、肌肉内等，例如在WO99/03499中所描述的，在此引为参考。

正如上面指出的，在特定的实施方案中，胞外体产生细胞可以与其它的嵌合遗传结构接触，这些嵌合遗传结构编码了与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的其它(附加的)分子，从而产生在其表面上带有除了抗原外的该分子的重组胞外体。该分子可以是佐剂、定位多肽、Lactadherin等。具体的例子包括免疫球蛋白的Fc片段、CD40配体、细胞因子和GM-CSF。多种遗传结构可以被包含在一个载体中或在几个分开的载体中，它们可以同时或连续地与胞外体产生细胞接触。

功能化合成脂质囊泡的生产

此外，正如上面指出的，本发明可以与多种膜囊泡一起使用，包括天然的囊泡(例如胞外体)或合成的囊泡，例如脂质体。脂质体在研究和医药中是有广泛用途的工具。它们是从天然的磷脂和胆固醇生产的小人工囊泡。这种囊泡现在正被用作药物载体，运载各种分子，包括小药物分子、蛋白、核苷酸和质粒。因此，脂质体可以有大量的应用。在本发明中，有可能通过上述的嵌合分子将分子(例如多肽、抗原、小分子等)定位到脂质体，并在受试对象中给药这样的功能化囊泡。

一般来说，脂质体应含有磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然含有的脂类，以利于对Lactadherin嵌合多肽的定位。

关于这一点，本发明涉及一种生产抗体的方法，包括：

●提供一种嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分的抗原；

●将该嵌合分子与含有磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然存在的脂类的脂质囊泡接触，以产生在它们的表面上呈递该抗原的功能化脂质囊泡；

●用这种功能化脂质囊泡免疫非人类的哺乳动物以产生结合了该抗原的抗体。

本发明的另一个目标是一种将抗原投送到受试对象的方法，包括：

●将该嵌合分子与含有磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然存在的脂类的脂质囊泡接触，以产生在它们的表面上呈递该抗原的功能化脂质囊泡；以及

●在存在Lactadherin的情况下，离体将该功能化脂质囊泡与来自该受试对象的树突状细胞接触；以及

●将该接触过的树突状细胞或其部分注射到该受试对象。

●在存在Lactadherin的情况下将该功能化脂质囊泡或其一部分注射到该受试对象中。

本发明还涉及一种含有上述的功能化脂质囊泡和Lactadherin的组合物。

脂质囊泡优选为脂质体。脂质体可以按照常规的技术生产，在优选情况下，对磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然含有的脂类进行富集。抗原可以是任何有机化合物，例如多肽、核酸、脂类、多糖、糖脂等。嵌合分子可以含有遗传(当抗原是多肽时)或化学偶联到Lactadherin的抗原，如上所述。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种生产功能化脂质囊泡的方法，包括：

●提供含有磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然含有的脂类的脂质囊泡，该囊泡带有一个活化的Lactadherin，其包括Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分，被一个反应性化学基团所活化；

●将该脂质囊泡与同该反应性化学基团相互作用的化合物接触以产生功能化的脂质囊泡，以及

●任选纯化该功能化的脂质囊泡。

如上所述，活化的Lactadherin可以是在其一端具有半胱氨酸残基的Lactadherin的一部分，因此产生了反应性的SH基团。这样一种活化的Lactadherin可以含有，例如SEQ ID NO：7的1-230位氨基酸。此外，活化的Lactadherin可以通过化学方法在Lactadherin的一端加上一个活性基团如巯基、氨基或羧基来制备。带有该活化Lactadherin的脂质囊泡可以是胞外体或合成的囊泡例如脂质体。关于这一点，在一个特定的实施方案中，本发明涉及一个呈递上述的活化Lactadherin的脂质体。在另一实施方案中，本发明涉及带有如上所述的活化Lactadherin的脂质体。这样的胞外体或合成脂质囊泡可以如上所述生产。化合物可以是任何有机分子，例如多肽、核酸、脂类、糖脂、多糖、小分子、药物(例如医药)、毒素等。此外，如上所述，脂质囊泡可以用各种多肽功能化，例如采用抗体、定位部分和/或佐剂和/或Lactadherin。典型的例子包括含有与Lactadherin或其C1和/或C2功能结构域融合的各种多肽的脂质囊泡，该多肽从抗原、定位多肽(例如免疫球蛋白的Fc片段)和佐剂(例如CD40配体、细胞因子、GM-CSF等)中选择。

基因和DNA疫苗接种

本发明也可用于在体内直接进行DNA或基因疫苗接种，使用上面公开的编码嵌合抗原分子的遗传结构。

针对基因和DNA免疫的抗原可以产生体液或抗体反应和细胞免疫反应。包括编码肿瘤或微生物抗原和定位多肽的部分或全长cDNA的嵌合序列如上所述制备。然后编码这些嵌合蛋白的病毒、非病毒载体或DNA可以被用于直接接种个体或动物。已经表明基因和DNA免疫可以诱导潜在的免疫反应，导致宿主针对微生物感染产生保护和肿瘤消退(参见Hasan等，J.Immunol.Methods 229，1-22，1999)。最近的发现表明，抗原呈递细胞(APC)的交叉引发，即APC吸收由DNA转染的非APC产生的外源抗原，是在基因和DNA接种中诱导强烈免疫反应的主导机制(Jae Ho Cho等，J.Immunol.167，5549-5557，2001)。此外，也已经发现细胞相关的抗原交叉呈递比可溶性抗原的交叉呈递要有效得多(Ming Li等，J.Immunol.166，6099-6103，2001)。从这些发现出发，相信在体内将抗原从DNA转染的非APC转移到APC的适当的方法是设计最适的基因和DNA疫苗的关键。在这一方面，根据本发明的基因疫苗接种方法为直接阐明这个判据提供了相当多的优点，因为它可以在体内产生与胞外体结合的抗原，然后被转移到APC。

因此本发明的另一个目的在于一种将抗原投送到受试对象的方法，包括给该受试对象注射一种编码了与上述的定位多肽，特别是与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的该抗原的遗传结构。

本发明的另一个目的是一种在受试对象中产生针对特定抗原的免疫反应的方法，该方法包括给该受试对象注射一种编码了与上述的定位多肽，特别是与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的该抗原的遗传结构。

基因疫苗接种可以使用多种病毒载体，例如痘苗病毒、痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒等，非病毒载体，例如与各种脂或肽成分结合的DNA，或使用纯的(例如裸露的)DNA来进行。接种可以通过多种注射途径进行，包括肌肉内、静脉内、皮下或皮内。多种多样载体投送装置或技术可用于基因疫苗接种，包括基因枪或电穿孔。动物和个体也可以使用在体外用载体转染的细胞系来免疫。选择能够释放大量胞外体的细胞系将特别有利。

在一个特定的实施方案中，该方法包括直接注射编码了嵌合多肽的裸露的DNA或RNA。裸露意味着注射的成分中不含任何帮助转染的试剂。在另一个优选实施方案中，遗传结构以裸露的形式通过肌肉内注射给药，更优选使用基因枪。

该方法允许通过胞外体交叉呈递非可溶形式的抗原，胞外体的功能是从APC周围的细胞转移抗原(交叉引发)(Wolfers等，NatureMedicine 7，297-303，2001)。图6显示了该方法的示意图。用编码含有Lactadherin的C1/C2结构域的嵌合蛋白的病毒、非病毒或裸露DNA载体免疫使得嵌合蛋白被多种多样的细胞在体内表达，包括胞外体产生细胞(步骤1)。然后重组蛋白被释放到细胞外与胞外体相关的环境(步骤2)。当带有嵌合蛋白的胞外体结合到APC时，APC的交叉引发发生(步骤3)。

在一个特定的实施方案中，抗原到APC的交叉呈递(步骤3)还可以通过与编码嵌合蛋白的遗传结构(例如DNA)、编码Lactadherin的遗传结构(例如DNA)一起给药来增强，因为结合到DC的胞外体含有Lactadherin。此外，遗传结构还可以制备成抗原的序列被插入在全长的Lactadherin序列中介于EGF结构域和C1/C2结构域之间。因此，注射一种单一的结构就可以产生通过Lactadherin的C1/C2结构域定位到胞外体的抗原，并且其中含有Lactadherin的受体结合结构域可以指导胞外体特异性投送到DC。

此外，为了进一步增强免疫反应，编码抗原以及任选Lactadherin的遗传结构可以与编码佐剂，例如促进免疫反应的因子或分子的遗传结构共同给药。这样的佐剂的例子包括CD40配体、GM-CSF、细胞因子等。

此外，为了进一步增强免疫反应，编码抗原、Lactadherin和/或佐剂的遗传结构可以与编码定位多肽，例如指导胞外体到抗原呈递细胞的因子或分子的遗传结构一起给药。这样的定位多肽的例子包括免疫球蛋白的Fc片段。

在这一方面，在一个特定的实施方案中，该方法包含了给受试对象注射编码嵌合抗原的遗传结构和编码Lactadherin或与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的辅助分子的遗传结构。编码Lactadherin或嵌合辅助分子的结构可以与编码嵌合抗原的结构同时注射，也可以分开注射。当进行分开注射时，它们可以在几乎同样的时间进行，也可以不这样。具体来说，可以首先注射编码嵌合抗原的结构，然后注射编码Lactadherin或嵌合辅助分子的结构。但是优选的是各种各样嵌合蛋白同时在体内出现并被同样的胞外体表达。在一个特定的实施方案中，蛋白从包含在单个载体如病毒载体(如痘苗病毒)的遗传结构上表达。

在这一方面，本发明还包含了一种组合物，它含有一种编码与定位多肽融合的抗原的遗传结构，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；以及(2)通过上述方法鉴定的定位多肽，和(a)一种编码与定位多肽融合的免疫辅助分子(例如一个佐剂或细胞定位多肽)的遗传结构，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述方法鉴定的定位多肽，和/或(b)一种编码Lactadherin的遗传结构。事实上，本发明允许在直接体内表达与Lactadherin或其部分融合的各种功能分子的基础上，在胞外体的表面有效地组合这些功能分子。这种组合的表达使得免疫反应得到增强，它模拟了抗原微粒或免疫复合物。

优选的例子是包含下列成分的组合物：

(a)一种编码与定位多肽融合的抗原的遗传结构，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述方法鉴定的定位多肽，

(b)一种编码与定位多肽融合的辅助多肽的遗传结构，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述方法鉴定的定位多肽，该辅助多肽是一个细胞因子，如GM-CSF或IL-2或CD40L，和/或

(c)一种编码与定位多肽融合的免疫球蛋白的Fc片段的遗传结构，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述方法鉴定的定位多肽，和/或

(d)一种编码Lactadherin的遗传结构

如上所述，遗传结构可以是任何DNA或RNA分子，一般为质粒、病毒载体、病毒粒子、裸露的DNA或任何含有它们的细胞。不同的遗传结构可以被包含在单个载体中，也可以在分别的载体中或其任意的组合。组合物一般还含有可药用的赋形剂或载体，例如稀释剂、缓冲剂、等渗溶液等。组合物还可以包括协助转染的试剂，如上所述。

按照本发明将全长或部分的抗原投送到DC缓和了疫苗使用的单倍型限制。此外，通过抗原吸收和转移到DC的自然的生理途径投送，会使抗原得到有效的加工，并对I类和II类表位均能够呈递。因此，使用编码定位到胞外体的肿瘤或微生物抗原的载体进行基因和DNA疫苗接种有助于改进针对癌症和传染病的基因和DNA疫苗。

一个具体的针对HIV的DNA疫苗组合物的例子包括了一种遗传结构，它编码了与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的抗原，该抗原从逆转录酶、gag、env、nef和tat多肽或其部分中选择。

此外，除了基因疫苗之外，蛋白疫苗也可以以同样的方式使用。在这一方面，可以使用纯化形式的重组嵌合抗原给药到病人。在给药之后，具有Lactadherin的C1和/或C2结构域的嵌合抗原将在体内被装载进病人自己的循环胞外体中，从而产生免疫反应。

因此本发明的另一个目的包括了一种在受试对象中产生针对一个特定抗原的免疫反应的方法，该方法包括给该受试对象注射含有与定位多肽融合的该抗原的嵌合多肽，该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述方法鉴定的定位多肽。

本发明的另一个目的是一种将抗原投送到受试对象中的方法，包括：

(a)提供一种编码了与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的该抗原的嵌合遗传结构；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上带有该嵌合抗原的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体并纯化该嵌合抗原；以及

(d)给该病人注射纯化的嵌合抗原。

重组胞外体作为蛋白-蛋白相互作用研究的工具

随着基因组测序计划提供的信息的丰富，正在开发基因组范围内的基因发现和功能确定的方法。重组胞外体构成了一种新的研究蛋白-蛋白相互作用的技术，可以允许对文库进行高通量的筛选以鉴定每一种蛋白-蛋白相互作用的对应物。

对于这样的应用，蛋白被表达在两个具有不同蛋白图谱的重组胞外体物种中。来自每个重组胞外体物种的嵌合蛋白彼此间的相互作用可以使用重组胞外体上的特殊标记通过标准的基于ELISA的分析方法来检测。该方法可以用于鉴定一个已知的配体或受体的对应物。

因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种选择或鉴定一个多肽的配体或结合配偶体的方法，包括：

(a)提供一种嵌合遗传结构，它编码与上述的定位多肽，特别是与Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分融合的该多肽；

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上呈递该多肽的重组胞外体；

(c)将(b)中的重组胞外体与侯选化合物接触，并测定该侯选化合物与该胞外体上的该多肽结合的能力。

侯选化合物可以是一个被分离的产物、产物的混合物或化合物的文库。侯选化合物的例子包括小分子(例如有机产物)及其文库、DNA文库、蛋白文库、可以被噬菌体或其它展示系统展示的抗体(或其片段)文库等，但不限于此。侯选化合物可以平行方式或作为复合混合物测试。

测定侯选化合物结合该多肽(或抗原)的能力的方法包括，例如分离胞外体并用其免疫非人类的哺乳动物。在该哺乳动物中抗体的产生表明侯选化合物与胞外体复合，并允许对该分子进行鉴定。

该技术可用于产生针对一个分子的配体的抗体。例如，根据本发明，将需要抗体的受体的配体表达在脂质囊泡的表面。这样的囊泡与含有该受体的制剂(例如生物样品)接触。对胞外体进行清洗和纯化，然后注射到非人类的哺乳动物中。可以从该哺乳动物中分离出针对受体的抗体。这种策略对于生产针对复合分子、不稳定的分子或甚至那些不能得到分离形式的分子的抗体是非常有利的。

重组多肽的纯化

本发明还提供了一种从上述的功能化胞外体中生产多肽的方法。该方法是源于Lactadherin令人意外地在胞外体中选择性表达或定位多肽的性质。因此，胞外体构成了一个重要的Lactadherin或各种含有Lactadherin片段的嵌合多肽的来源，从中可以回收和/或纯化这些蛋白。这种方法的一个特别的优势是胞外体的制备为相对富集和浓缩需要纯化的蛋白提供了一种快速的手段，允许从大规模的细胞培养物中以小的样品体积纯化蛋白。在这种方法中，可以生产Lactadherin或含有Lactadherin的C1和/或C2功能结构域的嵌合多肽，它们可以使用标准的生物化学方法从胞外体中直接提取出来，例如包括用去污剂或盐裂解胞外体以及用脂类或肽特异性释放蛋白。此外，当在蛋白合C1-C2结构域间插入了特异性位点时，在对嵌合多肽进行蛋白水解切割后可以从胞外体中直接释放(天然的)蛋白。将这样的位点加以充分表征，包括例如furin、肠激酶、因子X等的切割位点。然后可以使用标准的层析方法，包括阴离子或疏水层析和/或在共价结合了凝集素、特异性抗体、受体或配体和标记对应物的柱上进行亲和层析来纯化提取出的蛋白。该技术也适合于纯化与上述方法鉴定的定位多肽融合的多肽。

因此本发明的另一个目的在于一种生产含有Lactadherin或其一部分的多肽的方法，该方法包括：

a)提供一种编码了该多肽的遗传结构；

b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上呈递该多肽的功能化胞外体；

c)任选收集和/或纯化该功能化胞外体，以及

d)从该功能化胞外体中回收和/或纯化该多肽或其片段。

正如已经指出的，多肽可以是Lactadherin，例如野生型的Lactadherin或其片段。在这一方面，本发明提供了一种有效的生产(和纯化)Lactadherin的方法，包括将编码Lactadherin的遗传结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面上呈递该多肽的功能化胞外体，任选收集和/或纯化该功能化胞外体，以及从该功能化胞外体中回收和/或纯化Lactadherin。

多肽可以是一种由嵌合遗传结构编码的嵌合多肽，其中嵌合多肽含有一种与Lactadherin的C1和/或C2功能结构域融合的多肽。在这种情况下，可以从胞外体中回收整个的嵌合多肽或仅仅是其一部分，例如多肽与Lactadherin的C1和/或C2功能结构域分开后被释放。在这一方面，本发明的另一个目的是一种生产多肽的方法，包括：

a)提供一种遗传结构，它编码了与定位多肽融合的该多肽，其中该定位多肽选自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能结构域的一部分；和(2)通过上述公开的方法鉴定的定位多肽，其中该多肽通过一种含有切割位点的间隔序列融合到该定位多肽上；

c)任选收集和/或纯化该功能化胞外体；

d)用一种切割该切割位点的试剂处理该功能化胞外体，以及

e)回收和/或纯化该多肽。

下面提供的实施例作为说明而不是作为任何限制。

实施例1：肿瘤细胞系表达的人类Lactadherin几乎专一地在胞外体中被发现

人源的肿瘤细胞以大约80％汇合被接种到175cm²的三角瓶中，然后在完全培养基(添加了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640)中于37℃5％CO₂气氛下培养4天。在培养的第4天，对于每个培养物如下制备胞外体裂解液和细胞裂解液：

收获培养上清液，依次以200g离心和通过0.2μm的滤器过滤以除去细胞碎片。然后将澄清的上清液在4℃以100000g离心90分钟以使胞外体沉淀。将沉淀重新悬浮在100μl冰冷的PBS中，获得的组分被留做胞外体(E)。

肿瘤细胞在10ml Versene(Invitrogen)中于室温保温10分钟后从培养平板上分离下来。然后在4℃以200g离心10分钟以使细胞沉淀。沉淀在由50mM磷酸钠pH8.0、200mM NaCl、10mM咪唑和0.5％Tween20以及混合蛋白酶抑制剂(Sigma)组成的100μl冰冷的裂解缓冲液(LB)中重新悬浮和裂解。裂解液在冰上保温10分钟，然后通过在4℃以10000g离心10分钟来除去不溶物质。得到的上清液被留做细胞裂解液(CL)。

在32μl E和CL中加入8μl 5X SDS-PAGE样品缓冲液(SB)，在100℃保温5分钟，然后通过SDS-PAGE进行分析。通过半干电转移后胶上的蛋白被转移到PVDF膜上，然后使用稀释2500倍的针对人Lactadherin的RGD基元的多克隆抗体(Sebastian Amigorena博士馈赠)通过免疫检测来证实样品中人Lactadherin的存在。与Lactadherin结合的抗体使用稀释5000倍的与辣根过氧化物酶(JacksonImmunoResearch)结合的第二个抗兔IgG抗体和生色底物(CN/DAB，Pierce)来检测。

CL和E样品的分析分别显示在图1的板A和板B中。在这个分析中，来自胚胎的肾细胞293(第1道)、黑素瘤细胞FON-T1(第2道)和M10(第3道)、肺癌细胞NCI-N226(第4道)和NCI-H520(第5道)、黑素瘤细胞FM3(第6道)、B类淋巴母细胞Raji(第7道)的CL和E被试验。

来自乳汁的部分纯化的人Lactadherin被用做阳性对照(第9道)，而来自CHO(仓鼠卵巢细胞系)的E和CL被用做阴性对照(分别为板A和板B中的第8道)。

结果：来自293(第1道)、FON-T1(第2道)、M10(第3道)、NCI-H520(第5道)和FM3(第6道)的E中检测到了Lactadherin(板B)，但是在来自同样细胞系的CL中没有检测到特异的带(板A)。在来自NCI-N226(第4道)、Raji(第7道)和阴性对照CHO(第9道)的E和CL中均没有检测到Lactadherin。

结论：来自多种不同肿瘤组织的细胞系能表达Lactadherin。这些细胞系表达的Lactadherin主要被发现在胞外体中。

实施例2：重组人Lactadherin几乎专一地表达在被转染细胞产生的胞外体中，并且这种高度特异性的定位加密在C1/C2结构域中

从来自血液的总cDNA，分别使用引物对LTDNf15/LTDNr8和LTDNf2/LTDNr13(分别为SEQ ID NO：1-4)扩增了两个重叠的人LactadherincDNA片段。LTDNf15和LTDNr13从它们的5’端延伸，包括了一个HindIII和一个AgeI限制性位点。用LTDNf2/LTDNr13扩增Lactadherin cDNA的3，端产生了多个产物，其中最长的对应于已知的Lactadherin cDNA(Lactlf，SEQ ID NO：5)。较短的形式的序列(Lactsf，SEQ ID NO：6)缺少一段153个核苷酸，导致在Lactadherin的C2结构域缺失了51个氨基酸。5’端cDNA用HindIII和EcoRI消化，Lactlf和Lactsf cDNA都用EcoRI和AgeI消化。将5’端和3’端cDNA一起连接到事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。得到的质粒(pcDNA6hLactlf/His和pcDNA6hLactsf/His)编码与(His)₆标记融合的全长重组人Lactadherin(分别为SEQ ID NO：7和8)。使用脂质转染胺试剂(Invitrogen)将它们转染到293细胞，一株人类胚胎肾细胞系(ATCC)。在完全培养基中培养的第4天(培养条件和培养基的描述参见实施例1)，如实施例1描述的那样从每个培养物中制备EL和CL(EL是通过将胞外体重新悬浮于LB而不是PBS中而制备的)。在这个实验中，在100000g离心沉淀胞外体的步骤后获得的上清液(S)也被保留。Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)被加到所有的组分中以仅分离含有组氨酸标记的重组蛋白。在摇动平台上于4℃保温2小时后，在4℃以200g下离心沉淀珠子。用调整到20mM咪唑的LB清洗3次后，珠子被重新悬浮在40μl 1X SB中，并在100℃保温5分钟。收集SB，用图1描述的SDS-PAGE和免疫印迹来分析。

CL、S和EL样品分别分析在图2的板A、B和C中。来自用pcDNA6hLactsf/His和pcDNA6hLactlf/His转染的293的CL、S和EL分别被显示在每个板的第1和2道。

来自乳汁的部分纯化的人Lactadherin被用做阳性对照(第4道)，而来自用空的pcDNA6质粒转染的293细胞的CL、S和EL被用做阴性对照(每个板的第3道)。

结果：在EL中检测到了Lactadherin的长形式(板C的第2道)，但是在从同样培养物中获得的S和CL中只检测到背景水平(分别为板A和B的第2道)。相反，只在CL中检测到了在其C2结构域中缺失了51个氨基酸的Lactadherin的短形式(板A第1道)，而在S和EL中没有检测到(分别为板B和C的第1道)。

结论：在293细胞中表达的重组Lactadherin几乎专一地被发现在胞外体中。重组Lactadherin到胞外体的这种高度特异性定位可能是由这个蛋白的C2结构域介导的，因为在C2结构域中的缺失废止了胞外体定位，并且可能也影响了C1结构域的构象。事实上，缺少功能性胞外体定位信号的重组短形式的Lactadherin被发现在不同的细胞区室中。

实施例3：Lactadherin的C2结构域中的胞外体定位信号在多种哺乳动物物种之间是保守的

以小鼠Lactadherin cDNA(Sebastian Amigorena博士馈赠)为模板，使用引物LTDNf20(SEQ ID NO：9)和LTDNr13(SEQ ID NO：4)扩增了小鼠Lactadherin的全长cDNA。这些引物在它们的5’端延伸，对于LTDNf20和LTDNr13引物分别包括了一个HindIII和一个AgeI限制性位点。扩增产物用HindIII和AgeI消化，然后连入事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。得到的质粒(pcDNA6mLact/His)编码与(His)₆标记融合的重组小鼠Lactadherin(SEQ ID NO：10)。完全按照实施例2中描述的方法将该质粒和pcDNA6hLactlf/His(按照实施例2中的描述制备)转染到293、CHO和WEHI(小鼠纤维肉瘤)细胞中，并从每个培养物中制备EL。样品的制备和Lactadherin表达的监测如实施例1中所述。来自表达小鼠Lactadherin的人293细胞的EL表示在图2的板A中，来自表达人Lactadherin的小鼠WEHI细胞的EL表示在板B中，以及来自表达人Lactadherin的仓鼠CHO细胞的EL表示在板C中。来自用编码Lactadherin的质粒转染的细胞的EL表示在每个板的第2道。来自用空的pcDNA6质粒转染的细胞的EL被用做阴性对照(每个板的第1道)。来自乳汁的部分纯化的人Lactadherin被用做阳性对照(板C第3道)。

结果：在小鼠细胞和仓鼠细胞中表达的人Lactadherin被发现于由这些细胞产生的胞外体中(分别为板B和C的第2道)。小鼠Lactadherin也被发现在由来自不同的物种即人类细胞产生的胞外体中(板A，第2道)。

结论：在几种哺乳动物种间胞外体定位信号是保守的。

实施例4：嵌合蛋白的制备

嵌合蛋白是通过将一个蛋白的核苷酸序列与Lactadherin的全长或部分序列融合而产生的。

Lactadherin的全长序列一般被融合在蛋白序列的上游。只包含C1结构域、只包含C2结构域或同时包含C1和C2结构域的部分Lactadherin序列一般被融合在蛋白序列的下游。不含有内在前导序列的蛋白可以被插入到Lactadherin的前导序列和C1/C2结构域之间。

通过将一个蛋白的核苷酸序列与一个C结构域和在其N端至少延伸了10个氨基酸的匹配的C结构域的核苷酸序列进行融合，可以制备具有不同连接的嵌合蛋白。或者，也可以使用Lactadherin的C1和C2结构域或使用来自两个物种的C结构域来制备具有不同连接的嵌合蛋白。例如，含有蛋白X和人源的C1、或人源的延伸的C1、或人源的C2、或鼠源的C1作为融合配偶体的嵌合蛋白具有不同的连接。

C1/C2片段的制备

以pcDNA6-hLaclf/His为模板，使用引物对LTDNf24(SEQ IDNO：13)/LTDNr26(SEQ ID NO：15)、LTDNf22(SEQ ID NO：11)/LTDNr26、LTDNf25(SEQ ID NO：14)/LTDNr13、LTDNf23(SEQ IDNO：12)/LTDNr13、LTDNf24/LTDNr13和LTDNf22/LTDNr13分别扩增了编码C1、延伸的C1、C2、延伸的C2、C1/C2和延伸的C1/C2结构域的Lactadherin DNA片段。以pcDNA6-mLact/His为模板，使用引物对LTDNf30(SEQ ID NO：16)/LTDNr26、LTDNf31(SEQ ID NO：17)/LTDNr26、LTDNf33(SEQ ID NO：19)/LTDNr13、LTDNf32(SEQ IDNO：18)/LTDNr13、LTDNf30/LTDNr13和LTDNf31/LTDNr13扩增了来自小鼠Lactadherin的匹配的C1/C2片段。所有的正向引物(LTDNf)在其5’端被磷酸化，而所有的反向引物(LTDNr)在其5’端延伸以包含一个AgeI限制性位点。扩增产物在与融合配偶体连接(见下)前用AgeI消化。

白细胞介素-2-C1/C2嵌合体的制备

以人活化的T细胞cDNA为模板，使用引物IL2f1(SEQ IDNO：20)和IL2r2(SEQ ID NO：21)扩增了全长的IL-2cDNA。IL2f1在其5’端延伸以包括一个HindIII限制性位点，而IL2r2在其5’端被磷酸化。扩增产物用HindIII消化，并与上述制备的每种C1/C2 DNA片段一起连入事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。IL2片段的磷酸化的3’端和C1/C2片段的磷酸化的5’端之间的平末端连接产生了IL2-C1/C2嵌合序列。IL2片段5’端的HindIII位点和C1/C2片段3’端的AgeI位点使得嵌合序列可以插入到pcDNA6His中，得到的质粒(pcDNA6-His/IL2-C1、IL2-延伸的C1、IL2-C2、IL2-延伸的C2、IL2-C1/C2和IL2-延伸的C1/C2)编码了与(His)₆标记融合的重组嵌合蛋白(含有人源的C1/C2结构域的嵌合蛋白序列为SEQ ID NO：22-27)。在SEQ ID NO：22-27中，1-153位的残基对应于嵌合多肽的hIL2部分的氨基酸序列，嵌合多肽的C端最后8个氨基酸残基(TGHHHHHH)对应于组氨酸标记。其余的残基对应于来自Lactadherin的序列。

在胞外体中表达生物活性的IL-2

将上述编码SEQ ID NO：22-27的质粒转染到WEHI细胞。如实施例1所述制备EL、CL和S组分。重组蛋白的表达通过实施例1中所述的Western印迹进行评估，只是在此所用的检测抗体是兔抗IL2抗体。

CL、S和EL样品分别分析在图4的板A、B和C中。来自用pcDNA6IL2-延伸的C1/His、pcDNA6IL2-延伸的C2/His、pcDNA6IL2-延伸的C 1/C2/His、pcDNA6IL2-C 1/His、pcDNA6IL2-C2/His和pcDNA6IL2-C1/C2/His转染的细胞的CL、S和EL分别被显示在每个板的第1到6道。

重组IL2被用做阳性对照(板C的第8道)，而来自未转染的细胞的CL、S和EL被用做阴性对照(每个板的第7道)。

结果：所有制备的嵌合IL-2-C1/C2基因都表达了能够与抗IL-2抗体反应的重组蛋白(板C的第1到6道)。此外，这些蛋白几乎被专一地发现在EL中，而在S和CL中只检测到低的表达或背景表达(分别为板A和B的第1到6道)。为了确定在胞外体中检测到的IL2-C1/C2嵌合蛋白是否表现IL-2活性，将CTLL-2(一株IL-2依赖性细胞系)与带有IL2-C1/C2嵌合蛋白的重组胞外体或来自未转染细胞的胞外体一起保温。我们发现与重组胞外体保温的细胞掺入了3H-胸腺嘧啶，而与来自未转染细胞的胞外体保温的细胞则没有掺入(数据未显示)。

结论：将IL-2与Lactadherin的C1/C2结构域融合导致了IL-2在胞外体中的表达，这表明这些结构域能够特异性地指导抗原表达到胞外体中。C1和C2结构域在功能上是独立的。含有单个C结构域的嵌合蛋白的产量高于同时含有C1和C2结构域的嵌合蛋白。最后，融合产生了含有生物活性的IL2的嵌合蛋白，表明IL2维持了天然的构象。因此，使用Lactadherin的C1/C2结构域将蛋白定位到胞外体，事实上可以导致产生具有新的生物功能的重组胞外体。

实施例5：重组人Lactadherin的纯化

按照实施例2中的描述制备编码了与(His)₆标记融合的全长人重组Lactadherin的质粒pcDNA6hLactlf/His(SEQ ID NO：7)。使用脂质转染胺试剂(Invitrogen)将该质粒转染到CHO细胞(一株仓鼠卵巢细胞系)(ATCC)。在完全培养基(添加了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和2％胎牛血清(FBS)的CHO-SFM)中于37℃5％CO₂气氛下培养的第1天，在添加2μg/ml灭瘟素的培养基中选择稳定转染的细胞。在培养4天后，通过有限稀释技术分离出稳定的克隆。通过使用实施例2中描述的Western印迹方法分析在胞外体中表达的重组Lactadherin以选择能够大量生产Lactadherin的克隆。将克隆CHO-3.2在1升旋转摇瓶中扩培，并在不含FBS的完全培养基中培养以大量生产Lactadherin。细胞培养7天后，上清液被转移到250ml离心瓶中，2000rpm离心5分钟以沉淀细胞。然后将上清液通过0.2μm的抽滤瓶过滤，使用截留分子量为500K的纤维芯将其浓缩到100ml。然后将浓缩的上清液于4℃在100000xg下离心1小时15分钟。含有胞外体的沉淀被重新悬浮在1ml MLBII(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/10mM咪唑/0.5％Tween)中，然后转移到含有2ml Ni-NTA浆液(预先离心以除去乙醇)的试管中。在4℃在摇床上保温2到3小时后，将样品注入一根BioRad的柱子，并在4℃放置。柱子先用10ml MWBI(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/20mM咪唑/0.5％Tween)，然后用20ml MWBII(50mM NaPO4pH8/500mM NaCl/10mM咪唑)清洗。结合在柱子上的蛋白用8ml MEBII(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/250mM咪唑)洗脱。使用截留分子量为10000的MilliporeUltrafree-4装置将洗脱蛋白浓缩并将缓冲液更换为pH7.4的PBS。蛋白样品分成等份保存在-20℃。对SDS-PAGE进行考马斯染色以分析纯度。图5显示了两个重组Lactadherin制备液(分别为A和B)在浓缩前和浓缩后的分析(分别为第1道50μl和第2道1μg)。

总而言之，在此描述的步骤产生了高纯度的重组Lactadherin。

实施例6：筛选用于将抗原定位到胞外体的胞外体蛋白

使用MelanA/MART1、CD40L和CD81评估了胞外体定位结构域在其它蛋白中的存在及它们在将抗原定位到胞外体中的应用。

在第一组实验中，使用特异的引物，从FM3细胞cDNA(MelanA/MART1)和小鼠脾细胞cDNA(Clonetech；CD40L，CD81)上扩增了编码MelanA/MART1、CD40L和CD81的cDNA。为了克隆的目的，引物在其5’端延伸至包含一个限制性位点。扩增产物用限制性酶消化，分别连入预先用匹配的酶消化过的pCDNA6A-His(Invitrogen)。得到的质粒(分别为pcDNA6-MART1、pcDNA6-CD40L和pcDNA6-CD81)编码重组的MelanA/MART1(SEQ ID NO：28)、CD40L(SEQ ID NO：29)和CD81(SEQ ID NO：30)。重组的MelanA/MART1和CD81被融合到Myc标记上，其后是载体上所提供的His标记。更具体来说，在SEQ ID NO：28中，1-118位的残基对应于MelanA/MART1，120-129位的残基对应于Myc标记，以及133-140位的残基对应于His标记。同样，在SEQ ID NO：30中，1-236位的残基对应于CD81，238-247位的残基对应于Myc标记，以及251-258位的残基对应于His标记。

分别用编码SEQ ID NO：28-30的质粒通过电穿孔(对于EL4用220V、950μF；对293F用400V、200μF)转染EL4和293F细胞。按照实施例1中的方法制备EL和CL组分，除了将胞外体和细胞沉淀直接重悬浮于1X SB中用于SDS-PAGE。也按照实施例1中描述的Western印迹方法评估重组蛋白的表达，除了这里用的检测抗体对MelanA/MART1和CD81来说是鼠抗Myc标记的抗体，而对CD40L来说是抗CD40L抗体。MelanA/MART1、CD40L和CD81样品分别分析在图7的板A、B和C中。转染和未转染的细胞的EL和转染和未转染的细胞的CL分别显示在每个板的第1到4道。

在第二组实验中，使用特异引物，从活化的树突状细胞中扩增了编码7-跨膜受体CCR7的cDNA。两个引物都在其5’端延伸至包含一个AgeI限制性位点。扩增产物用AgeI消化，并连入预先用AgeI消化过的编码SEQ ID NO：29的质粒。AgeI消化的产物也被连接到一个编码CD81的截短形式的质粒中(pcDNA6-CD81E，SEQ ID NO：31)，它使用特定引物制备而来，象SEQ ID NO：30一样。SEQ ID NO：31中CD81的C端跨膜区域被截短是维持CCR7在细胞膜脂双层中的适当定向所需要的。在SEQ ID NO：31中，1-200位的残基对应于CD81E，202-211位的残基对应于Myc标记，以及215-222位的残基对应于His标记。将编码SEQ ID NO：28和31的质粒连接导致CCR7cDNA插入到受体质粒的Myc标记和His标记之间。通过PCR筛选方法选择出其中CCR7插入方向为5’到3’的质粒。选定的质粒(pcDNA6-MART1/CCR7和pcDNA6-CD81E/CCR7)编码与His标记融合的重组嵌合蛋白(分别为SEQ ID NO：32和33)。在SEQ ID NO：32中，1-118位的残基对应于MelanA/MART1，120-129位的残基对应于Myc标记，135-488位的残基对应于CCR7，以及489-496位的残基对应于His标记。在SEQ ID NO：33中，1-200位的残基对应于CD81E，202-211位的残基对应于Myc标记，217-570位的残基对应于CCR7，以及571-578位的残基对应于His标记。

分别用编码SEQ ID NO：32和33的质粒通过电穿孔转染EL4细胞，并按照上述的方法制备EL和CL组分。也按照上述的Western印迹方法评估重组蛋白的表达。EL和CL样品分别分析在图8的板A和B中。来自用pcDNA6-MART 1/CCR7和pcDNA6-CD81E/CCR7转染的细胞和未转染的细胞的样品分别显示在每个板的第1到3道。

结果：在转染细胞的胞外体和细胞裂解液(分别为每个板的第1到3道)中检测到了重组的MelanA/MART1(图7板A)、CD41L(图7板B)和CD81(图7板C)。值得注意的是，预期的长形式的CD40L(跨膜形式)在CL中被检测到(板B的第3道)，而大多数的短形式(可溶形式)在胞外体中被检测到(板B的第1道)。在板B的第3道中检测到分子量较小的产物，极可能是由于在细胞裂解液中CD81的未被控制的蛋白水解作用。在转染细胞的胞外体中检测到了重组的嵌合MelanA/MART1-CCR7，但是在其细胞裂解液中没有检测到(分别为图8的板A和B的第1道)。使用FACS分析，我们证实了仅仅编码CCR7的对照结构产生了预期的能够在转染细胞的表面但不能在其胞外体中检测到的重组受体(数据未显示)。最后，编码嵌合蛋白CD81E/CCR7的质粒在任何测试的组分中均不能产生可检测到的蛋白水平(图8板A和B的第2道)。在来自未转染细胞的组分中没有检测到蛋白(图7板A到C的第2和4道，图8板A和B的第3道)。

结论：如同使用Lactadherin所证明的，其它的胞外体蛋白也可以被鉴定并用于定位抗原和重要的受体。事实上，MelanA/MART1被鉴定为主要表达在胞外体中，它与7-跨膜受体CCR7的融合触发了CCR7在胞外体中的表达。这种现象是融合配偶体特异性的，因为使用其它的胞外体蛋白如CD81E作为融合配偶体时不能检测到CCR7。因此，对胞外体蛋白将其它蛋白定位到胞外体中的能力进行筛选，将导致鉴定出新的象MelanA/MART1那样的候选物，可用于与使用Lactadherin的C1C2结构域相同的应用。应该注意到，尽管事实上没有检测到CD81E/CCR7，CD81仍然可能适合于将CCR7之外的其它抗原定位到胞外体中。

实施例7：展示在胞外体上的重组蛋白的免疫原性

按照实施例3中的描述制备来自用pcDNA6hLactlf/His转染的WEHI细胞的小鼠胞外体。按照实施例5中的描述制备纯化的人重组Lactadherin。9只Balb/C小鼠被安排成3个免疫组，每组3只。对每只小鼠进行腹膜内注射免疫，使用大约20ng重组人Lactadherin的PBS(第1组)、大约20ng重组人Lactadherin的1∶1的PBS/完全弗氏完全佐剂混合物(第2组)或含有大约20ng的人Lactadherin的重组WEHI胞外体的PBS(第3组)。在第一次注射后两个星期对动物进行一次加强免疫，使用同样的样品，除了在第2组中抗原被悬浮于1∶1的PBS/不完全弗氏佐剂混合物中。第二次免疫后对动物取血，通过ELISA测试抗人Lactadherin抗体。在ELISA中，50ng人Lactadherin的PBS被包被在微量滴定板的孔中，于37℃保温1小时。含有0.05％Tween-20和6％脱脂奶粉的PBS的封闭缓冲液被加到孔中，室温放置1小时以饱和剩余的游离结合位点。然后在孔中加入用封闭缓冲液稀释1000倍的免疫小鼠的血清，室温保温1小时。用封闭缓冲液清洗孔3次后，使用稀释10000倍的与辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch)偶联的第二个抗小鼠IgG抗体和化学发光底物(Amersham)检测结合的抗体。结果显示在图9中。

结果：在用含Lactadherin的胞外体免疫的小鼠的血清中检测到了抗Lactadherin抗体，但是当Lactadherin单独或作为弗氏佐剂乳液中给药时没有产生抗体反应。当使用弗氏佐剂时即使在4次注射接种后也没有检测到抗体，但是在接受带有Lactadherin的胞外体的小鼠的血清中抗体的滴度随着连续的注射而增加(数据未显示)。

结论：带有抗原的胞外体在不存在任何佐剂的情况下是强有力的免疫原，可以使用非常低的抗原量诱导抗体反应，所述量对经典和已经潜在的佐剂如弗氏佐剂是无效的。

参考文献

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人乳腺上皮抗原BA46的克隆和序列分析发现了一个在上皮生长因子样结构域上呈递的RGD细胞粘附序列(Cloning and sequenceanalysis of human breast epithelial antigen BA46 reveals an RGD celladhesion sequence presented on an epidermal growth factor-likedomain)。

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牛PAS-6/7通过两个结构域结合αVβ5整合蛋白和阴离子型磷脂(Bovine PAS-6/7binds alpha v beta 5integrins and anionic phospholipidsthrough two domains)。

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3.Andersen M.H.，Graversen，H.，Fedosov，S.N.，Petersen，T.E.和Rasmussen，J.T.

牛lactadherin的两个细胞结合结构域的功能分析(Functionalanalyses of two cellular binding domains of bovine lactadherin)。

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吞噬体的蛋白质组：对吞噬体功能的了解(The phagosomeproteome：insight into phagosome functions)。

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5.Thery，C.，Regnault，A.，Garin，J.，Wolfers，J.，Zitvogel，L.，Ricciardi-Castagnoli，P.，Raposo，G.和Amigorena，S.

来自树突状细胞的胞外体的分子表征。热休克蛋白hsc73的选择性积累(Molecular characterization of dendritic cell-derived exosomes.Selective accumulation of the heat shock protein hsc73)。

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6.Thery，C.，Boussac，M.，Veron，P.，Ricciardi-Castagnoli，P.，Raposo，G.，Garin，J.和Amigorena，S.

来自树突状细胞的胞外体的蛋白质组分析：一种不同于凋亡囊泡的分泌的亚细胞区室(Proteomic analysis of dendritic cell-derivedexosomes：a secreted subcellular compartment distinct from apoptoticvesicles)。

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肿瘤衍生的胞外体是用于CTL交叉引发的共享的肿瘤排斥抗原的一个来源(Tumor-derived exosomes are a source of shared tumorrejection antigens for CTL cross-priming)。

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8.Zitvogel，L.，Regnault，A.，Lozier，A.，Wolfers，J.，Flament，C.，Tenza，D.，Ricciardi-Castagnoli，P.，Raposo，G.和Amigorena，S.

使用一种新的无细胞疫苗根除建立的鼠肿瘤：树突状细胞衍生的胞外体(Eradication of established murine tumors using a novel cell-freevaccine：dendritic cell-derived exosomes)。

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滤泡树突状细胞在它们的表面带有表达II类MHC的微囊泡(Follicular dendritic cells carry MHC class II-expressing microvesicles attheir surface)。

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序列表

<110>阿诺塞斯公司(ANOSYS，INC.)

<120>用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物

(Methods and Compounds for the Targeting of Protein to Exosomes)

<130>SCT040192-47

<160>30

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin cDNA的正向引物

<400>1

tataagctta gcatgccgcg cccccgcctg 30

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin cDNA的反向引物

<400>2

ggattggcgc atccgttcag c 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin cDNA的正向引物

gccctggata tctgttcc 18

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin cDNA的反向引物

<400>4

ataaccggta cagcccagca gctccaggcg 30

<210>5

<211>1164

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc 60

ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120

atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180

tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240

attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300

tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360

agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420

gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480

gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540

gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600

gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660

gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720

atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780

agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840

gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca 900

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gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc 1020

agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg 1080

cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg 1140

cgcctggagc tgctgggctg ttag 1164

<210>6

<211>1008

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc 60

ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120

atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180

tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240

attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300

tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360

agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420

gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480

gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540

gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600

gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660

gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720

atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780

agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840

gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag atcttccctg gcaactggga caaccactcc 900

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<210>7

<211>395

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys

20 25 30

His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp

35 40 45

Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn

50 55 60

His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu

85 90 95

Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly

100 105 110

Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile

115 120 125

Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln

130 135 140

Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val

145 150 155 160

Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn

165 170 175

Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His

180 185 190

Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr

195 200 205

Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly

210 215 220

Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser

225 230 235 240

Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly

245 250 255

Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln

260 265 270

Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp

275 280 285

Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr

290 295 300

Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys

305 310 315 320

Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro

325 330 335

Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser

340 345 350

His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg

355 360 365

Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His

385 390 395

<210>8

<211>343

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys

20 25 30

His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp

35 40 45

Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn

50 55 60

His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu

85 90 95

Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly

100 105 110

Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile

115 120 125

Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln

130 135 140

Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val

145 150 155 160

Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn

165 170 175

Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His

180 185 190

Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr

195 200 205

Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly

210 215 220

Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser

225 230 235 240

Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly

245 250 255

Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln

260 265 270

Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp

275 280 285

Leu Gln Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn

290 295 300

Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val

305 310 315 320

Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr

325 330 335

Gly His His His His His His

340

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增小鼠Lactadherin cDNA的正向引物

<400>9

ataaagctta gcatgcaggt ctcccgtgtg 30

<210>10

<211>434

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>10

Met Gln Val Ser Arg Val Leu Ala Ala Leu Cys Gly Met Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ala Ser Gly Leu Phe Ala Ala Ser Gly Asp Phe Cys Asp Ser Ser Leu

20 25 30

Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Leu Thr Gly Gln Asp Asn Asp Ile Tyr

35 40 45

Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Thr Gly Leu Val Cys Asn Glu Thr Glu

50 55 60

Arg Gly Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Tyr Asn Asp Ala Lys Cys Leu

65 70 75 80

Val Thr Leu Asp Thr Gln Arg Gly Asp Ile Phe Thr Glu Tyr Ile Cys

85 90 95

Gln Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Ile His Cys Glu Thr Gly Cys Ser

100 105 110

Thr Gln Leu Gly Met Glu Gly Gly Ala Ile Ala Asp Ser Gln Ile Ser

115 120 125

Ala Ser Tyr Val Tyr Met Gly Phe Met Gly Leu Gln Arg Trp Gly Pro

130 135 140

Glu Leu Ala Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Ile Val Asn Ala Trp His Ala

145 150 155 160

Ser Asn Tyr Asp Ser Lys Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Lys

165 170 175

Met Arg Val Ser Gly Val Met Thr Gln Gly Ala Ser Arg Ala Gly Arg

180 185 190

Ala Glu Tyr Leu Lys Thr Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asp Gly Arg

195 200 205

Lys Phe Glu PheIle Gln Asp Glu Ser Gly Gly Asp Lys Glu Phe Leu

210 215 220

Gly Asn Leu Asp Asn Asn Ser Leu Lys Val Asn Met Phe Asn Pro Thr

225 230 235 240

Leu Glu Ala Gln Tyr Ile Arg Leu Tyr Pro Val Ser Cys His Arg Gly

245 250 255

Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu His Gly Cys Leu

260 265 270

Glu Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Thr Ile Pro Asp Ser Gln Met Ser

275 280 285

Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Asn Leu Arg Ala Phe Gly Trp Tyr

290 295 300

Pro His Leu Gly Arg Leu Asp Asn Gln Gly Lys Ile Asn Ala Trp Thr

305 310 315 320

Ala Gln Ser Asn Ser Ala Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Thr

325 330 335

Gln Arg Gln Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asp Phe Gly

340 345 350

His Ile Gln Tyr Val Glu Ser Tyr Lys Val Ala His Ser Asp Asp Gly

355 360 365

Val Gln Trp Thr Val Tyr Glu Glu Gln Gly Ser Ser Lys Val Phe Gln

370 375 380

Gly Asn Leu Asp Asn Asn Ser His Lys Lys Asn Ile Phe Glu Lys Pro

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Phe Met Ala Arg Tyr Val Arg Val Leu Pro Val Ser Trp His Asn Arg

405 410 415

Ile Thr Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His

420 425 430

His His

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin Cl/C2cDNA的正向引物

<400>11

ccctcgtaca cctgcacgtg cc 22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin C2cDNA的正向引物

<400>12

cccacgagct gccacacggc c 21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin C1/C2cDNA的正向引物

<400>13

aaatgtgtcg agccactggg c 21

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin C2cDNA的正向引物

<400>14

ggatgcgcca atcccctgg 19

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人Lactadherin C1cDNA的反向引物

<400>15

gaaggaaccg gtacagccca gtagctcaaa gcg 33

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增小鼠Lactadherin C1/C2cDNA的正向引物

<400>16

ggatgttcta cacagctggg ca 22

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增小鼠Lactadherin C1/C2cDNA的正向引物

<400>17

accgaataca tctgcca 17

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增小鼠Lactadherin C2cDNA的正向引物

<400>18

cctgtttcgt gccaccgcgg c 21

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增小鼠Lactadherin C2cDNA的正向引物

<400>19

ggatgtctcg agcccctgg 19

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人白介素-2cDNA的正向引物

<400>20

aggaggaagc ttatgtacag gatgcaactc c 31

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人白介素-2cDNA的反向引物

<400>21

agtcagtgtt gagatgatg 19

<210>22

<211>318

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C1结构域嵌合蛋白

<400>22

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly

145 150 155 160

Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val

165 170 175

Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg

180 185 190

Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp

195 200 205

Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr

210 215 220

Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu

225 230 235 240

Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe

245 250 255

Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn

260 265 270

Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln

275 280 285

Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg

290 295 300

Phe Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His

305 310 315

<210>23

<211>336

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C1结构域嵌合蛋白

<400>23

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys

145 150 155 160

Leu Lys Gly Tyr Ala GlyAsn His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro

165 170 175

Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser

180 185 190

Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu

195 200 205

Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser

210 215 220

Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp

225 230 235 240

Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu

245 250 255

Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe

260 265 270

Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn

275 280 285

Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu

290 295 300

Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr

305 310 315 320

Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His

325 330 335

<210>24

<211>320

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C2结构域嵌合蛋白

<400>24

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly

145 150 155 160

Leu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser

165 170 175

Tyr Lys Thr Trp Gly Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala

180 185 190

Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr

195 200 205

Gly Asn Asp Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val

210 215 220

Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe

225 230 235 240

Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr

245 250 255

Glu Tyr Gln Asp Pro Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn

260 265 270

Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu

275 280 285

Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala

290 295 300

Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His

305 310 315 320

<210>25

<211>340

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C2结构域嵌合蛋白

<400>25

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

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Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

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Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala

145 150 155 160

Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala

165 170 175

Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr

180 185 190

Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly Leu His Leu Phe Ser Trp Asn

195 200 205

Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val

210 215 220

Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser

225 230 235 240

Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly

245 250 255

Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser

260 265 270

Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile

275 280 285

Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu Phe Glu

290 295 300

Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala Trp His

305 310 315 320

Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His

325 330 335

His His His His

340

<210>26

<211>480

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C1/C2结构域嵌合蛋白

<400>26

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

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145 150 155 160

Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser GlnIle Ala Ala Ser Ser Val

165 170 175

Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu

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Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser

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Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr

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Gly Asn Asp Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val

370 375 380

Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe

385 390 395 400

Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr

405 410 415

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Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu

435 440 445

Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala

450 455 460

Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His

465 470 475 480

<210>27

<211>498

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人IL2-人Lactadherin C1/C2结构域嵌合蛋白

<400>27

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys

145 150 155 160

Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro

165 170 175

Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser

180 185 190

Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu

195 200 205

Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser

210 215 220

Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp

225 230 235 240

Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu

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Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe

260 265 270

Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn

275 280 285

Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu

290 295 300

Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys Hi s Thr Ala Cys Thr

305 310 315 320

Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro

325 330 335

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Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His

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His His

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人CD40L cDNA的正向引物

<400>28

ggaaggaccg gtcatagaag gttggacaag 30

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人CD40L cDNA的反向引物

<400>29

ggaaggaccg gtgagtttga gtaagccaaa gg 32

<210>30

<211>612

<212>PRT

<213>人工分子

<220>

<221>MISC_特征

<223>人Lactadherin-人CD40L嵌合蛋白

<400>30

Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys

1 5 10 15

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20 25 30

His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp

35 40 45

Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn

50 55 60

His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu

85 90 95

Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly

100 105 110

Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile

115 120 125

Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln

130 135 140

Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val

145 150 155 160

Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn

165 170 175

Lys Lys His Lys Glu Phe Val GlyAsn Trp Asn Lys Asn Ala Val His

180 185 190

Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr

195 200 205

Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly

210 215 220

Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys AsnAsn Ser

225 230 235 240

Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly

245 250 255

Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln

260 265 270

Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr GlyAsn Asp Gln Trp

275 280 285

Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr

290 295 300

Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys

305 310 315 320

Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro

325 330 335

Arg Thr Gly Ser Ser Lys IIe Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser

340 345 350

His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg

355 360 365

Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Gly Cys Thr Gly His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg

385 390 395 400

Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn

405 410 415

Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser

420 425 430

Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr

435 440 445

Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln

450 455 460

Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val

465 470 475 480

Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val

485 490 495

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580 585 590

Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Thr Gly His His

595 600 605

His His His His

610

Claims

1.一种将多肽定位到胞外体的方法，包括：

(1)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的该多肽，该定位多肽的组成如下：

-选自SEQ ID NO：7的氨基酸残基69-225、SEQ ID NO：7的氨基酸残基229-387或SEQ ID NO：7的氨基酸残基69-387的人乳粘素C1和/或C2功能结构域，或者

-选自SEQ ID NO：10的氨基酸残基111-266、SEQ ID NO：10的氨基酸残基271-426、SEQ ID NO：10的氨基酸残基109-426或SEQ IDNO：10的氨基酸残基111-426的鼠乳粘素C1和/或C2功能结构域；

(2)离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生重组胞外体。

2.一种在胞外体表面选择性表达多肽的方法，包括：

a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的该多肽，该定位多肽的组成如下：

b)离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生重组胞外体；以及

3.权利要求1或2的方法，其中嵌合的遗传结构含有前导信号序列，以便将编码的嵌合多肽分泌到该胞外体产生细胞的内质网中。

4.权利要求1或2的方法，其中该多肽被融合在定位多肽的上游、下游或任何内部结构域的连接处。

5.权利要求1或2的方法，其中该多肽从抗原、细胞因子、配体、受体、免疫球蛋白、标记多肽、酶和离子通道或其部分中选择。

6.权利要求1或2的方法，其中几种编码不同多肽的独特嵌合遗传结构被引入到该胞外体产生细胞中。

7.权利要求1或2的方法，其中该胞外体产生细胞是哺乳动物细胞。

8.一种制备功能化胞外体的方法，包括：

a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的多肽，该定位多肽的组成如下：

b)离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生在它们的表面上带有该多肽的功能化胞外体，以及

c)收集和/或纯化该功能化胞外体。

9.一种功能化的胞外体，其由权利要求8的方法制备。

10.一种组合物，其含有权利要求9的功能化胞外体以及可药用的赋形剂或载体。

11.一种生产与多肽结合的抗体的方法，包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的该多肽或其一种表位，该定位多肽的组成如下：

(b)离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面呈递该多肽或表位的重组胞外体；

(c)收集该重组胞外体并用该胞外体或其一部分免疫非人类的哺乳动物以产生可结合该多肽或表位的抗体；以及

(d)从该哺乳动物收集抗体或抗体产生细胞。

12.由细胞产生的胞外体或其一部分在制备用于免疫受试对象抵抗抗原的药物中的应用，所述细胞中导入了嵌合的遗传结构，该遗传结构编码与定位多肽融合的所述抗原，该定位多肽的组成如下：

-选自SEQ ID NO：10的氨基酸残基111-266、SEQ ID NO：10的氨基酸残基271-426、SEQ ID NO：10的氨基酸残基109-426或SEQ IDNO：10的氨基酸残基111-426的鼠乳粘素C1和/或C2功能结构域。

13.权利要求12的应用，其中抗原是肿瘤、病毒或微生物抗原。

14.一种选择或鉴定多肽的配体或结合配偶体的方法，包括：

(a)提供一种嵌合遗传结构，它编码与定位多肽融合的该多肽，该定位多肽的组成如下：

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面呈递该多肽的重组胞外体；

15.接触过的树突状细胞或其一部分在制备用于免疫受试对象抵抗抗原的药物中的应用，所述接触过的树突状细胞的制备步骤包括：

(a)提供一种嵌合的遗传结构，它编码与定位多肽融合的该抗原，该定位多肽的组成如下：

(b)将该结构引入胞外体产生细胞以产生在它们的表面上带有该抗原的重组胞外体；以及

(c)收集该重组胞外体，并且将其与来自该受试对象的树突状细胞离体接触。

16.接触过的树突状细胞或其一部分在制备用于免疫受试对象抵抗抗原的药物中的应用，所述接触过的树突状细胞制备步骤包括：

●提供一种嵌合分子，它包含与定位多肽融合的抗原，该定位多肽的组成如下：

●在存在乳粘素的情况下，将该功能化脂质囊泡与来自该受试对象的树突状细胞离体接触。

17.功能化脂质囊泡或其一部分在制备用于免疫受试对象抵抗抗原的药物中的应用，其中功能化脂质囊泡的制备步骤包括：

●将该嵌合分子与含有磷脂酰丝氨酸或其它在胞外体中天然存在的脂类的脂质囊泡接触，以产生在它们的表面上呈递该抗原的功能化脂质囊泡。

18.一种生产与定位多肽融合的多肽的方法，包括：

a)提供一种遗传结构，它编码与定位多肽融合的该多肽，该定位多肽的组成如下：

-选自SEQ ID NO：10的氨基酸残基111-266、SEQ ID NO：10的氨基酸残基271-426、SEQ ID NO：10的氨基酸残基109-426或SEQ IDNO：10的氨基酸残基111-426的鼠乳粘素C1和/或C2功能结构域，其中将该多肽通过一个含有切割位点的间隔序列融合到该定位多肽上；

b)离体将该结构引入胞外体产生细胞以产生在其表面呈递该多肽的功能化胞外体；

c)任选收集和/或纯化该功能化胞外体；

d)用一种切割该切割位点的试剂处理该功能化胞外体，以及

e)回收和/或纯化该多肽。