CN1484709A - 分离转移性癌细胞的方法与组合物,及其在检测癌转移性上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于检测、分离具有转移性的癌细胞的新方法与新组合物。本发明还涉及检测此类癌细胞转移性的方法，以及鉴定抗转移活性药物的筛选方法。本发明还提供了通过调节转移性癌细胞表面所表达丝氨酸膜内在蛋白酶[SIMP，包括seprase，二肽基肽酶IV(DPPIV)]的活性来抑制癌细胞转移的方法及组合物。

Description

分离转移性癌细胞的方法与组合物，及其在检测癌转移性上的应用
1.前言
本发明涉及检测和分离转移性癌症患者的血液、腹水和肿瘤组织中有转移性的癌细胞的新方法。本发明还涉及用作细胞粘附基质的新组合物，这些组合物可用来检测和分离癌细胞，并可用作转移性癌症患者的血液过滤器。本发明的方法及组合物还可用于试验中以衡量分离得到的癌细胞的转移性，和鉴定具有抑制转移能力的药物。此外，本发明还涉及通过调节转移性癌细胞表面表达的丝氨酸膜内在蛋白酶的活性而抑制癌细胞的转移性。本发明依据的是以下发现：从患者血液、腹水或肿瘤中分离出的癌细胞优先粘附、降解和摄取胶原性基质材料。另外，还发现转移性细胞的表面丝氨酸膜内在蛋白酶[SIMP，包括seprase，二肽基肽酶IV(dipetidyl peptidase IV)(DPPIV)亚单位]被激活。
2.发明背景
已有报道在进行传统的骨髓采集与白细胞分离置换过程中，伴随有从转移性癌症患者的组织中分离癌细胞等问题。(Campana，D.等，急性白血病微小残留的检测：方法学进展与临床意义，Blood，1995 Mar 15，85(6)：1416-34；Brugger，W.等，癌细胞与造血祖代细胞向实体瘤患者外周血内的迁移，Blood，83(3)：636-40，1994)。据估计，从一例患者采集了总数为100亿的单核细胞，其中污染有2.5万-1.2千万个癌细胞。通过遗传标记显示这些污染的癌细胞造成了肿瘤的复发。(Rill，E R et al.，实体瘤的自体骨髓移植可能回输多种肿瘤发生细胞的直接证据，Blood，84(2)：380-383，1994)。
在转移性癌患者的血循环中，也发现了大量的癌细胞。Glaves，D.，RP Huben，和L.Weiss(1988.Br.J.Cancer.57：32-35)于术前从10例肾细胞癌患者的肾静脉中采取血液，估计癌细胞以107-109个/天的速度释放出来。这些循环性癌细胞如何造成了癌转移还不清楚。主要的阻碍是，很难鉴定到极微量的循环性癌细胞亚群(从1000到100万个转移细胞)。显然，循环性癌细胞大部分已被宿主的免疫力所杀死。例如，在实验性动物肿瘤模型中(此时应用抗体介导的细胞分离法更为可靠)，在可移植的B16黑色素瘤和Lewis肺癌的生长过程中(约20天)，据估计有1000万至1亿个癌细胞释放入血，这些细胞在每只小鼠中产生不到100个肺转移灶。(Glaves，D.，1983，Br.J.Cancer，48：665-673)。
另外，在大量的实验中，将癌细胞直接引入小鼠或大鼠的血循环中，很少有超过0.01％的细胞会形成肿瘤结节。更常见的是，癌细胞的转移率较此低2个以上的数量级。这些实验数据提示，从原发肿瘤释放出的初始癌细胞不是发生转移的限制因素，因脱落的癌细胞中仅有很少的一部分是活细胞，具有侵袭性，从而具有转移性。针对这些转移性细胞，必需开发一种细胞分离及检测系统，以了解肿瘤转移的机制。
已知有数种方法可以从血液或体液中分离出癌细胞。这些方法包括，例如，应用显微解剖术将癌细胞一个一个地分离出来(Suarez-Quian等.，1999，Biotechniques，26：328-35；Beltinger and Debatin，1998，Mol.Pathol 51：233-6)，或通过抗体介导的方法采用荧光激活细胞分类(Pituch-Noworolska et al.，1998，Int.J Mol.Med.1：573-8)，利用磁场以磁性材料上包被的抗体分离癌细胞(Denis et al.，1997，Int.J.Cancer 74：540-4；Racila et al.，1998，Proc.Natl.Acad Sci USA 95-4589-94)，或利用密度梯度法分离循环中的癌细胞(Sabile etal.，1999，Am.J.Clin.Pathol.112：171-8)。
然而，这些癌细胞分离方法取决于得到肿瘤特异性抗体，或取决于不同癌细胞独特的浮力密度及形态学。因此极其需要在造血细胞移植时，能清除掉癌细胞的有效方法(Gulati，S C et al.自体干细胞移植中净化的理论基础。Journal ofHematotherapy，2(4)：467-71，1993)。
正如在早期研究中证实的那样，原发肿瘤在转移形成的早期即开始向血循环脱落癌细胞(Fidler IJ，1973，European Journal of Cancer 9：223-227；Liotta LAet al.，1974，Cancer Research 34：997-1004)。癌细胞一旦脱落到血循环中，即粘附到血管壁的基底膜，并侵入邻近的结缔组织，形成微小转移灶(Liotta et al.，1991，Cell 64：327-336)。据推测，在侵入性生长前沿存在着癌细胞并脱落到循环中，这在转移进程中起着重要的作用。
肿瘤的转移过程很复杂，包括癌细胞从原发肿瘤中脱落出来，转移到一个新的部位，在此处扎根生长。为达到成功地转移，侵袭性癌细胞必须拥有以下转移特性：(i)从原发癌瘤上脱落下来，(ii)在循环中存活，并在血管壁上生长，(iii)有能力侵入(粘附，随后降解并摄取)胶原性基质，以及(iv)渗出，定居，并与新血管生成过程相协同(Chambers et al.，1998，Cancer和Metastasis Review 17：263-269)。
与癌细胞逃逸到淋巴管或血管的过程相关的各步骤基本上都是一样的，都涉及到基本的细胞特性，即，细胞的侵袭性。肿瘤的侵袭性要求侵入的癌细胞粘附、降解和摄取胞外基质(extracellular matrix，ECM)，并伴有这些细胞向ECM的转位或迁移。
这些细胞活动发生在称为侵入伪足的膜突起部位，此处存在着动态的膜流动，ECM粘附，以及降解。近期有证据表明，丝氨酸膜内在蛋白酶[SIMP，包括二肽基肽酶肽酶IV(DPPIV)/CD26和seprase]参与了细胞表面的蛋白水解过程(Chen，W-T，1996，Enzyme Protein 49：59-71)。
SIMP成员是II型跨膜蛋白，其N末端为含有6个氨基酸的胞质尾部，继之为20个氨基酸(seprase)或22个氨基酸(DPPIV)的跨膜区，其C末端有200个氨基酸，含有催化活性的丝氨酸以非经典取向构成催化区(Goldstein，LA et al.，1997，Biochem.Biophys.Acta.1361：1119)。DPPIV可特异性地将倒数第二位含有L-脯氨酸、L-羟脯氨酸或L-丙氧酸寡肽的N-端二肽去除。这些肽包括神经肽Y和其它肽激素(Heins，J et al.，1988，Biochini.Biophys.Acta 954：161-169；Walter，R et al.，1980，Mol.Cell Biochem.30：111-126)。此外，近期的一项报告显示，DPPIV也具有seprase样的明胶酶和肽链内切酶活性，提示它也参与了胶原的降解(Bermpohl F et al.，1998，FEBS Letters 428：152-156)。另外，DPPIV在小肠和肾脏上皮细胞的刷状缘膜上组成性表达，(Yaron and Naider，F，1993，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28：31-81；Morimoto C.and Schlossman SF，1994，Immunologist 2：4-7)，在T-细胞中也有一过性表达，提示DPPVI可能是T-细胞活化的一种标志(Morimoto C.and Schlossman SF，1994，Immunologist2：4-7)。
Seprase，最初被认定为是一种170-kDa的膜结合明胶酶，在高侵袭性黑色素瘤LOX的侵入伪足上有表达(Aoyama A.and Chen，W.T.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：8296-8300；Mueller，SC et al.，1999，J.Biol Chem.274：24947-24952；Monsky，WL et al.，1994，Cancer Res.54：5702-5710)。已从LOX细胞的细胞膜和脱落的囊泡分离到此活性酶。Seprase是97-kDa亚基的均二聚体(Pineiro-Sanchez，ML et al.，1997，J Biol.Chem.272：7595-7601)。分析了编码97-kDa亚基的cDNA推导的氨基酸序列，发现这种97-kDa亚基与DPPIV同源，并与成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)基本相同(Goldstein et al.，1997Biochem.Biophys.Acta.1361，11-19；Scanlon，M.J et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：5657-5661)。FAPα在上皮癌和正
愈合创口处的反应性基质成纤维细胞上有表达，但在成人的组织中没有表达(Garin-Chesa，P.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：7235-7239)。
然而在癌瘤中，FAPα未见表达于癌细胞或内皮细胞上(Garin-Chesa et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：7235-7239)。Seprase与FAPα的区别主要是在于与高度保守基序GXSXG(其含有活性丝氨酸部位)相邻的一段45个氨基酸残基上(Scanlan et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5657-5661；Goldstein etal.，1997 Biochem.Biophys.Acta.1361，11-19)。近期，从人黑色素瘤细胞系LOX中鉴定到另一种剪接的seprase mRNA，它编码一种新的截短的27-kDa seprase同功酶，正好与97-kDa的seprase羧基末端催化区重叠(Goldstein and Chen，2000 J.Biol.Chem.275：2554-2559)。这种剪接变体mRNA是由于编码seprase97-kDa亚基的胞质尾、跨膜区以及胞外区的膜近侧中心区[缬氨酸(5)一直到丝氨酸(412)]部分的1223个碱基对的外显子区的框外缺失而产生。很可能seprase兼具明胶酶和甘-脯二肽酶的活性，而截短的seprase仅具有后者二肽酶活性。
长期以来人们都认为胶原的重塑是由基质金属蛋白酶(MMP)介导的。然而在癌患者中进行的MMP抑制剂(马马司他(Marimastat)，AG3340)和血管生成抑制剂(血管生成抑制素(angiostatin)与内皮抑制素(endostatin))试验，未能获得抗转移、抗侵袭作用的明确证据。这些资料表明，在肿瘤的侵入前沿，需要有其它酶系统来代替MMP。
癌细胞的体外侵袭性可能是肿瘤转移性的一个直接指针。了解细胞的侵袭性表型，对于开发癌治疗方案，提高患者的生存率以及生活质量等非常重要，作为诊断工具检测癌症的进展和转移也非常重要。因此，作为癌瘤转移性的一个特征，大量精力已投入到测定癌细胞的侵袭性上。
细胞的侵袭性通常用其细胞表面的蛋白水解活性表示，这种蛋白水解活性可使胞外基质(ECM)成分降解，并使ECM片段内化。体外检测此类活性的试验常常因其它细胞表面现象，如粘附、细胞表面蛋白水解和膜的流动性而变得复杂。一种设计用来检测细胞侵袭性的专用试验涉及将荧光标记的或放射性标记的纤连蛋白(或其它ECM成分)共价连接到交联的明胶基底层的表面(Chen et al.，1984，J.Cell Biol 98：1546-1555；Chen，et al.，1985，Nature，316：156-158；Chen et al.，1989，J.Exp.Zool.251：167-185；Chen et al.，1994，J Tiss.Cult.Meth.16：177-181；Meuller et al.，1989，J.Cell.Biol.109：3455-3464)。在这种专用技术中，纤连蛋白被标记并用来包被过度固定的蛋白质膜。然后用此膜来测定细胞表面的蛋白水解活性以及检测蛋白膜上侵入伪足伸展部位和表面凹痕外的细胞侵袭性表型。
然而，这种纤连蛋白-明胶膜试验价值有限，原因在于：(i)它采用的是常规的过度固定的蛋白膜；(ii)对于检测中等程度侵袭性细胞，如大多数培养的癌细胞系，成纤维细胞以及血管生成性内皮细胞的蛋白水解活性，这种方法缺乏敏感性，(iii)癌细胞不摄取交联的明胶片段，(iv)以纤连蛋白和交联明胶材料很难建构三维培养凝胶系统。因此，检测此类细胞侵袭性的可靠方法将对癌症的临床诊断及治疗产生显著影响。
本发明为从转移瘤患者的血液、腹水和原发肿瘤组织中分离各种类型的癌细胞和从正常献血者的血液中分离包括内皮细胞的外周血单核细胞提供了一种独特的以功能为基础的细胞分离方法。另外，本发明提供了证据，证明在侵袭性癌细胞和活化的成纤维细胞(或其它组织细胞)以及恶性组织的新生内皮细胞中，选择性地诱导了seprase和/或DPPIV表达，从而为抑制肿瘤侵袭和转移的药物开发提供了靶标。
3.发明概述
本发明是关于一种可迅捷有效地从癌症患者的血液、腹水和/或组织中检测并选出侵袭性癌细胞的新型癌细胞捕获系统，在晚期癌症患者中，已发现某些癌细胞能与血液成分结合形成大的细胞聚集团。
这种细胞聚集团可能造成晚期癌症相关的器官功能不全。本发明提供的组合物和方法可以检测具有转移灶的癌症患者血中的此类细胞，并可用来清除患者血液、腹水和/或组织中的上述细胞聚集团以及游离的单个活性癌细胞。
与早期抗体介导的癌细胞分离和检测方法相比，本发明的细胞分离系统根据的是癌细胞的功能性质，即其粘附、降解以及摄取细胞外基质的能力。因此，本发明的细胞分离及试验系统设计用来鉴定和分离癌症患者血液、腹水和肿瘤组织中非常少量的具有侵袭性和转移性的活性癌细胞。
例如，可以利用该富集的癌细胞群来测定其转移性和确定最有效的治疗方案。还可利用该富集的细胞与树突状细胞融合来开发癌疫苗。
本发明涉及到转移性癌症患者的血液过滤器，作为细胞粘附基质的天然纤维组合物，其包括血源性粘附分子包被的胶原、纤维蛋白、棉纤维及塑料纤维。例如，取自胎盘组织或大鼠尾的I型胶原，对于制备这种基质特别有用，通过多轮聚合和解聚处理可以很容易地装配成任何形式和包被在血管的表面。该胶原基质可用各种各样的源自血液的粘附分子包被，包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白等。单个癌细胞或细胞集落可粘附于这种细胞粘附基质为细胞分离提供了基础。
例如，此类组合物可用于清除癌细胞和富集血液或骨髓中的造血祖代细胞用作骨髓移植的供体细胞。此外，应用本发明的细胞分离法可以从全血中浓集不同癌种的特殊癌细胞，经活体外增殖用来与树突状细胞相互作用，开发有效的抗肿瘤疫苗。除此之外，还可分离患者循环血中的癌细胞，接受体外化疗方案的攻击。这样，就可以给予同一患者有效剂量的药物或药物组合。
本发明的组合物和方法为癌症患者血液、腹水及组织中侵袭性癌细胞的检测和分离提供了一种快捷的方法。此类癌症包括但不限于：前列腺，乳腺，结肠，肺，头颈部，脑，膀胱，淋巴瘤，卵巢，肾脏和睾丸，黑色素瘤，肝，胰或其它胃肠道癌等。可采用免疫细胞化学法和本发明的细胞功能试验，即胶原降解与摄取试验，检测癌细胞并对其定性。
本发明的方法可以用于开发检测癌症患者血液、腹水或肿瘤组织中的侵袭性癌细胞的敏感方法，用于预后、监测治疗和外科手术的疗效以及癌的早期检测。采用本领域技术人员已知的其他试验，诸如检测癌细胞的组织来源，测定细胞的血管生成能力，以及检测减少的白细胞或补体结合等等，可进一步提高癌转移性检测的敏感性及准确性。
本发明的细胞粘附基质还提供了一种捕获癌细胞的方法，可以获得高产量并将活性癌细胞从全血、白细胞层、外周血干细胞制品或骨髓中有效地清除掉。本发明的细胞分离方法目的是用于治疗性血液成分部采集和白细胞分离置换进行自体输血清除掉其中的污染性癌细胞。本发明为从以下癌症患者的全血中清除癌细胞提供了一种高效方法：前列腺，乳腺，结肠，肺，头颈部，脑，膀胱，淋巴瘤，卵巢，肾脏和睾丸，黑色素瘤，肝，或胰及其它胃肠道癌。
本发明还提供了试验方法，可用于筛选能够抑制癌细胞转移，从而控制癌细胞转移性的药物。
此类试验涉及，在待测药物存在下使细胞粘附基质与癌细胞样品接触，然后检测和定量癌细胞的粘度和降解或摄取基质的情况。本发明的试验系统也可以用于监测治疗过程中可能具有抗肿瘤作用的药物的疗效。例如，可在治疗前或治疗期间，测定全血中癌细胞的转移性。可通过比较整个治疗过程中癌细胞的转移性变化而确定该药物的效果。显示有效的药物是那些能够降低癌侵袭性，提高宿主免疫力并抑制癌增殖但不影响或很小影响正常组织细胞的药物。例如，这种抗转移性药物筛选试验系统已鉴定出针对seprase-DPPIV复合物的单克隆抗体和肽抑制剂，它们能阻抑转移性细胞粘附、降解及侵入胶原性基质的能力(图13和14)。此外，此类试验系统显示，针对seprase和DPPIV的反义核酸和核糖酶构建物能够降低乳腺癌细胞的侵袭性(图19)。
本发明提供了用于抑制癌细胞转移性的方法及组合物，包括给予丝氨酸膜内在蛋白酶调节剂。本发明这一方面内容的根据是以下观察：一种包括seprase和DPPIV的新的蛋白酶复合物的形成是细胞侵入胶原基质的前提。这类蛋白酶抑制剂包括但不限于那些能够抑制DPPIV和seprase活性的化合物。seprase和DPPIV活性被激活是细胞侵袭和转移的前提，这一发现为鉴定癌细胞转移抑制剂的药物筛选试验提供了靶分子。
4.附图说明
图1A-B.细胞粘附基质的成分与制备。
图1A.制备I型胶原为基础的细胞粘附基质，此图显示基质制备、细胞分离和癌细胞侵袭性显微镜检的7个步骤。图1B.应用以I型胶原为基础的细胞粘附基质，对细胞总胶原降解进行微量滴定测定。癌细胞所降解和摄取的Bodipy-rhodamine胶原基质用荧光微量滴定板读数仪以红色荧光的增加量进行测定。下图显示，在细菌胶原酶存在下，37℃孵育30分钟，释放出的荧光单位(RFU)与覆盖在各微量滴定孔上的Bodipy-rhodamine胶原的量成正比。
图2A-B.以细胞粘附基质为基础的细胞分离及试验系统在诊断和治疗中的应用。图2A.可用于诊断的细胞分离和试验方法，包括诊断、监测治疗或手术反应，以及早期肿瘤检测。图中显示分离、检测、定性血液、腹水或组织细胞群中癌细胞的步骤。图2B.本发明可用于治疗及预防的细胞分离和试验方法。图中显示分离及培养血液、腹水或组织细胞群中癌细胞的步骤。
图3A-F.患者及对照血液样品的癌细胞分离分析。图中显示接种于完全培养液中，或正常献血者对照或膀胱癌(BLC)患者血液中的荧光标记Hs578T乳腺癌细胞的代表性范例。将红色荧光标记的Hs578T乳腺癌细胞加入3ml培养液或血液样品中，细胞被微量滴定小孔内的胶原性基质所捕获，培养18小时。显示的图片是在良好的荧光照明和相差条件下摄制的，仅代表了微量滴定孔的一部分。图3A.对加入培养液中的Hs578T乳腺癌细胞(500个细胞)进行荧光分析。估计有495个细胞呈现为粘附或散布于基质上的亮点。图3B.对接种于正常献血者血液中的Hs578乳腺癌细胞(500个细胞)进行荧光分析。在存留的基质底层上估计有415个呈红色荧光的癌细胞混在培养的其它血细胞(无荧光信号)中。图3C.对接种于正常献血者血液中的Hs578T乳腺癌细胞(19个细胞)进行荧光分析。在存留的基质底层上估计有11个呈红色荧光的癌细胞混在培养的其它血细胞(无荧光信号)中。图3D.对接种于BLC患者血液中的Hs578T乳腺癌细胞(200个细胞)进行荧光成像。估计癌症患者血液中有182个Hs578T乳腺癌细胞与循环性BLC细胞一起被捕获。Hs578T细胞倾向与患者单核血细胞(图中为黑点)聚集成团。图3E.被基质捕获的接种于BLC患者血液中的Hs578T乳腺癌细胞(19个细胞)的荧光分析。估计有16个呈红色荧光的癌细胞混在其它血细胞中，视野中可看到一个Hs578T乳腺癌细胞。图3F图3E所示为基质捕获的Hs578T乳腺癌细胞以及循环性BLC细胞的免疫荧光分析。
此地Hs578T乳腺癌细胞与源自血液的4个膀胱癌细胞被偶联了荧光素的抗细胞角蛋白PCK抗体着染。在患者血液中的膀胱癌细胞的细胞角蛋白标记的绿色荧光中，可见到Hs578T乳腺癌细胞(在图4E中显示为红色荧光)。图片大小：A-D，662μm×478μm；图片大小：E-F，331μm×239μm.
图4A-I.循环性细胞粘附于细胞粘附基质。图4A-C.头颈部(HN)鳞状细胞癌患者血液中的循环性细胞聚集于一片组织片段上。这种细胞-组织集落被捕获于采用胶原性基质的底层上，培养4天(图A中的d4)，5天(图B中的d6)，以及13天(图C中的d13)。图4D.转移性前列腺癌(PC)患者血液中的细胞聚集在一片组织片段上，培养3天(d3)。图4E.转移性前列腺癌(PC)患者的循环性癌细胞聚集在一根纤维蛋白纤维上(纤维蛋白)，培养3天(d3)。图4F.转移性前列腺癌(PC)患者的循环性细胞聚集在塑料片上(塑料)，培养3天(d3)。视野中可见体积较大的癌细胞更易于粘附在塑料片上。图4G.与图4F同样培养的循环性细胞，但培养12天(d12)。视野中可见体积较大的癌细胞更易于粘附在塑料片上。图4H.转移性前列腺癌(PC)患者的循环性细胞聚集在纯棉上(棉质)，培养3天(d3)。图4I.聚集于纯棉(棉质)上的脑癌(BN)患者的癌细胞的生长，培养20天(d20)。图片大小A-G，662μm×478μm；图片大小H-I，1324μm×956μm。
图5A-H.粘附于以I型胶原为基础的细胞粘附基质上的循环性细胞。图5A-C转移性胰腺癌(PnC)患者的细胞聚集团被采用I型胶原基质的底层所捕获，洗涤后，在基质上培养5天(A)，9天(B)，以及16天(C)。
这些图显示以I型胶原为基础的细胞粘附基质与侵入该基质并在塑料表面生长的癌细胞的相差显微镜表现。大多数正常供献血者血中并不存在的癌细胞有着独特的形态学特征，在培养过程中其细胞体积和数量增大增多，而同时分离得到的白细胞体积较小，在培养过程中数量减少。图5d转移性胰腺癌(PnC)患者的循环性细胞聚集团被捕获在采用I型胶原基质的底层上，从基质上洗脱的细胞在塑料表面(塑料)以完全培养液培养7天。在细胞群落的周边有梭形细胞与上皮细胞样癌细胞相伴。图5E-F.基质成纤维细胞侵入I型胶原底层中。从头颈部(HN)鳞状细胞癌患者的肿瘤活检样品中分离的细胞。在基质表面可分离到两种形态学截然不同的细胞类型：HN鳞状细胞在基质表面保持静止不动(E)，而基质成纤维细胞则侵入胶原凝胶中(F)在Nikon Eclipse TE300倒置显微镜下经精细调节后，在图5E所观察的平面以下约80μm处。图5G以I型胶原为基础的细胞粘附基质的形态学，图示基质和从结肠癌(CC)患者血液中分离得到的粘附性癌细胞的透射电子显微镜表现。图5H.图5H中所示的胶原纤维的高倍镜观察，图示装配好的胶原纤维的透射电镜表现。图片大小A-F，662μm×478μm；图片大小G-H，如图中比例尺条带所示。
图6A-D.循环癌性细胞侵袭性表型的形态学基础。图6A-B.转移性结肠癌(CC)患者的循环性细胞团。细胞刚刚分离出来，培养1天(d1)和9天(d9)。图中所示为以I型胶原为基础的细胞粘附基质被癌细胞降低产生的小孔的相差显微镜表现，以及癌细胞的特征，其独特的形态学特征，即在培养了1天时体积小(A)，但培养9天后体积增大，呈上皮细胞样(B)。在培养过程中，癌细胞的细胞体积增大，数量增多，而同时分离所得的白细胞体积小，数量减少。另外，在细胞群落中，梭形细胞与上皮细胞样的癌细胞相伴(B)。图6C-D.转移性胃癌(SC)患者的循环性细胞团。细胞被捕获在应用I型胶原基质的底层上，培养19天。上皮细胞样癌细胞在胶原膜被降解的小孔内的塑料表面生长(C)，或沿着胶原膜的边缘呈线性生成(D)。图片大小A-B，1324μm×956μm；图片大小C-D，662μm×478μm.
图7A-D.以细胞分离方法自对照的血液样品得到的细胞。图7A.自39岁正常献血者的血液中分离得到的细及其下面的I型胶原基质。培养7天后，仅有极少量细胞存活，而基质膜保持完整。图7B.自良性结肠肿瘤(CTN)患者血液中分离得到的细胞及其下面的I型胶原基质。仅有极少量细胞被分离出来，基质膜保持完整。图7C-D.转移性乳腺癌(BC)患者的循环性细胞及其下面的I型胶原基质。在化疗期间收集血液样品。经1天和4天培养，仅有相当少量的细胞被分离出来并存活，且基质膜保持完整。图片大小A-D，662μm×478μm。
图8A-L.采用荧光标记的胶原的细胞侵袭性表型分离和实验系统，以及用抗上皮细胞标记抗体测得的循环性癌细胞的免疫细胞化学特征。细胞来自乳腺癌(BC，A-C)，头颈部鳞状细胞癌(HN，D-F)，结肠癌(CC，G-I)，前列腺癌(PC，K)等患者和正常献血者(对照，L)的血液，以及Hs578T乳腺癌细胞系(Hs578T，J)。细胞被捕获在含罗丹明-胶原基质的基底层上，培养1天(d1)或63天(d63)。图8A-C.以摄入的罗丹明-胶原斑点为乳腺癌(BC)患者的循环性癌细胞侵袭性表型的标志。将细胞接种在基质上，培养18小时，固定，进行观察。在大量的白细胞的背景下，可见单个的或成簇的推定癌细胞(PH，相差图像见A所示)摄入了罗丹明-胶原碎片，标以Col+(红色荧光见B所示)。拼接后的C表明罗丹明-胶原斑点与推定癌细胞正好匹配。这提示，每ml患者血液中含有2,067个Col+细胞。图8D-F.以摄入罗丹明-胶原斑点作为头颈部鳞状细胞癌(HN)患者的循环性癌细胞侵袭性的标志。如图所示，大簇或单个推定癌细胞(PH，相差图像见D所示)，与广谱的细胞角蛋白亚基(PCK+，见E中所示)抗体染色阳性细胞相吻合，这些细胞中带有罗丹明-胶原Col+(红色荧光，如F所示)。这提示，每ml患者血液中分别有20,814个PCK+细胞和18,003个Col+细胞。PCK+细胞的数量多于Col+细胞，可能是抗体染色阳性和粘附于细胞粘附基质的活性癌细胞较少。
图8G-I.以摄入罗丹明-胶原斑点为结肠癌(CC)患者的循环性癌细胞侵袭性表型的标志。成簇和单个推定癌细胞(相差干扰成像，如G所示)，以抗上皮细胞表面抗原抗体进行标记(ESA+，在G中为红染)。如图所示，ESA+细胞与用抗内皮细胞标记因子VIII的抗体染色的细胞(F8+，在H中为绿色荧光细胞)相吻合，这些细胞摄入了罗丹明-胶原碎片Col+(在I中为红色荧光细胞)。这提示，每ml患者血中分别有2,284个ESA+，7,308个F8+和1,978个Col+细胞。F8+细胞远多于Col+或ESA+细胞，可能是因为血中存在有正常的内皮细胞。图8J.Hs578T乳腺癌细胞系以抗-PCK抗体染色，作为肿瘤(上皮细胞)标记对照。图8K.培养了63天的PC细胞(d63)，ESA染色阳性。注意这些大细胞含有多个核，与G图中的d1细胞相比，它们的直径增加了5倍以上。图8L.培养正常献血者的循环血细胞1天后罗丹明-胶原基质保持完整。图片大小A-C，1324μm×956μm，图片大小DF，331μm×239μm；图片大小G-L，662μm×478μm。
图9A-L.循环性癌细胞的血管生成倾向。细胞来自以下患者的血液：头颈部鳞状细胞癌(HN，A-C；I-J)，结肠癌(CC，D-F)和前列腺癌(PC，G-H)。细胞被捕获在用胶原基质的底层，培养1-11天，以d1或d11表示。图9A-C.一大簇和7个单个HN细胞(相差图像，所A所示)F8+强阳性(B)和摄入的胶原碎片Col+(C)。在相差(PH)图像(A)显示HN细胞与同一视野内F8抗体反应阳性细胞(B)以及那些摄入了罗丹明-胶原基质的细胞(C)紧密相伴。这提示，在每ml患者血中分别有42,495个F8+和15,611个Col+细胞。F8+细胞远多于Col+细胞，这是因为血中有F8+内皮细胞。图9D-F.CD31+和F8+的细胞亚组代表了Col+CC细胞。将罗丹明-胶原基质上的细胞以抗内皮细胞标记物CD31的抗体和偶联了荧光素的抗内皮细胞标记因子VII(F8)的抗体进行标记。如相差干涉(DIC)图像(D)中所示，鲜红色的CD31+细胞与CC细胞相伴。同一视野内的CC细胞对F8抗体呈阳性反应(E)，并摄入罗丹明-胶原基质(F)。这提示，在每ml患者血中分别有11,693个CD31+细胞，6,577个F8+和2,558个Col+细胞。CD31+与F8+细胞远多于Col+细胞，这是因为在血中存在着CD31+和F8+阳性内皮细胞。图9G-H.掺入了乙酰化低密度脂蛋白(LDL)的PC细胞。如相差干涉(DIC)图像(G)所示，染成鲜红色的上皮细胞表面抗原(ESA)阳性细胞摄入了荧光素-LDL(H)。
这提示，在每ml患者血中分别有9,744个ESA+和34,105个LDL+细胞。LDL+细胞远多于ESA+细胞，这是因为存在有能掺入乙酰化LDL的其它内皮细胞。图9I-J.掺入了乙酰化LDL的原代HN细胞。注意，如素-罗丹明-Hoechst三染图像所示(J)，仅有一种特殊的朝向中心的细胞，掺入了荧光素-LDL和罗丹明-胶原，提示这种细胞代表了在培养12天后仍保留侵袭性的细胞。
图9K-L.循环性CC细胞在胶原凝胶上生成毛细血管网。在将循环性CC细胞接种到厚度0.5mm的I型胶原凝胶板上，2天后，可观察到血管网形成(K)和条索状结构形成(L)。图片大小A-C；GJ，331μm×239μm；图片大小D-F；K-L，662μm×478μm。
图10A-L.培养基中循环性癌细胞的免疫癌杀伤和生长。以胶原基质分离结肠癌(CC，A-E)，前列腺癌(PC，F-I)或膀胱癌(BLC，J-L)患者血液中的细胞，并培养在含10-20％人血浆的培养基中。图10A-C.CD34+外周血干细胞与F8+/Col+CC细胞聚集成团。在相差干涉(DIC)图像(A)中，鲜红染色的CD34+细胞与CC细胞相伴。同一视野中的CC细胞对F8抗体(B)呈阳性反应，并摄入了罗丹明-胶原(C)。这表示，在每ml患者血中分别有111,082个CD34+，7,673个F8+和2,558个Col+细胞。CD34+及F8+细胞多于Col+细胞，这是因为在血液中存在着CD34+的干细胞和F8+的内皮细胞。图10D-E.CD45+的白细胞与Col+CC细胞聚集成团。在罗丹明-胶原基质上分离的细胞，经抗白细胞共同抗原CD45抗体标记。在DIC图像(D)中，显示了鲜红染色的CD45+白细胞与CC细胞相伴。在同一视野内的CC细胞显示摄入了罗丹明-胶原基质(E)。这表示，在每ml患者血中分别有125,670个CD45+的白细胞和1,827个Col+细胞。图10F-I.预后良好的前列腺癌(PC)患者的免疫细胞与癌细胞簇细胞溶解的系列图片。大部分癌细胞受到白细胞攻击，培养1天后变成碎片(F-H)。然而，在相同培养基中，7天后白细胞消失了，留下少量的PC群落(I)。
图10J-L.同一患者自身免疫性血浆使其膀胱癌(BLC)细胞发生细胞溶解。将BLC细胞培养在含有同一位癌症患者的10％自体血浆的培养基中(J-K中的au.血浆表示自体血浆)，或在含有10％正常供体血浆的培养基中进行培养(L中的n.血浆表示正常人血浆)。在含有自体血浆的培养基中，BLC细胞在第2天溶解，颜色变成棕色(J-K中的au血浆表示自体血浆)，但在含有正常人血浆的培养基中，BLC细胞一直存活达6周以上(L中的n血浆表示正常人血浆)，提示自身癌抗体在补体介导的细胞溶解中发挥着作用，提示了宿主免疫力在对抗转移方面的重要性。图片大小A-L，662μm×478μm。
图11A-B.检测Sepharase和DPPIV的凝胶柱过滤色谱与免疫印迹。图11A.以Sepharase 12(Pharmacal-LKB，Piscataway，N.J.)的凝胶过滤柱从W1 38细胞中分离得到的WGA-纯化的清洁剂可溶解的蛋白质。用以校准过滤柱的蛋白标准品是维生素B-12(1.35-kDa)，肌红蛋白(17-kDa)，卵白蛋白(44-kDa)，γ-球蛋白(158-kDa)，过氧化氢酶(232-kDa)，铁蛋白(440-kDa)，以及甲状腺球蛋白(670-kDa)。图11B.利用抗seprase和DPPIV单抗，应用免疫斑点印迹法对各片段进行分析。在200-kDa(片段17)，440-kDa(片段14)，以及670-kDa(片段13)区，发现有Seprase和DPPIV，提示seprase-DPPIV复合物大小为440-670kDa。
图12A-D.W138人胚胎肺成纤维细胞的Seprase-DPPIV复合物的特性。图12A.表面生物素化的W138成纤维细胞的免疫沉淀反应(Ip)。抗seprase(D28)和抗DPPIV(EI9)的单克隆抗体均鉴定出一种RIPA-可溶性蛋白质复合物，包括170-以及200-kDa 2个主要条带，分别对应着seprase和DPPIV。图12B.Ip和免疫印迹法(Ib)显示的seprase-DPPIV复合物。WI38 RIPA裂解物中分离得到的Seprase-或DPPIV-免疫沉淀在seprase-或DPPIV-免疫印迹中得以证实，但在β1和β3整联蛋白印迹中未得到证实，提示这种蛋白酶复合物与RIPA中的β1和β3整联蛋白没有相关性。图12C.seprase-DPPIV液化明胶的活性。在没有Ca而有2mM EDTA存在下，以凝胶酶谱法分析这种蛋白酶复合物。Seprase和DPPIV的免疫分离物(Ip)均显示170-kDa凝胶酶(seprase)活性。图12D.Seprase-DPPIV复合物的DPPIV脯氨酸特异性蛋白酶活性。用荧光Ala-Pro-AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)底物覆盖试验，发现seprase和DPPIV的免疫分离物(Ip)均显示相同的肽酶活性。对于av，a2，a6或β3整联蛋白或对照免疫分离物，均未观察到有活性。
图13A-E.创伤活化的W138成纤维细胞在胶原凝胶中的迁移和胶原间接作用。图13A.单细胞层损伤后1小时(a，b，c)和18小时(d，e，f)W138的形态(细胞存活时拍照)。图片a和d：W138在创伤边缘以及无细胞覆盖的玻璃表面的相差，显示梭形细胞在18小时时(d)在胶原纤维上迁移。图片b和e：与图片a和d同一视野内的荧光胶原凝胶。1小时后(b)，可见单层的TRITC-标记胶原，在18小时(e)，创伤边缘的荧光胶原被活化的迁移细胞局部清除。图片c和f：左侧与中间的图片的显微镜拼接图像。条带＝10μm.图13B.抑制性mAb E19(抗DPPIV)对细胞迁移有的剂量依赖性抑制作用，但对照mAb C37(抗细胞表面糖蛋白gp-90)却没有这样的作用。对于每种抗体，进行了三次24小时单层细胞创伤模型实验。通过测量细胞从原始的创伤边缘前进的面积，对细胞迁移进行定量，表示为均数+/-SD。图13C.抗体抑制细胞迁移作用的逆转。所有的抗体，mAb E19(抗DPPIV)和mAb C37(抗gp-90)，用量为5μg/ml。3天后，除去3种抗体，抗体抑制作用即逆转。图13D.创伤激活细胞局部清除荧光胶原作用的直方图。胶原降解量通过测定迁移细胞清除的荧光胶原面积表示。mAb E19(抗DPPIV)抑制了迁移细胞清除胶原的作用，而对照mAb C37(抗-gp-90)则无此抑制作用。所有的抗体均使用5μg/ml的剂量。对于每种抗体，均进行了三次实验，记录均数+/-标准差。图13E.稀疏培养的迁移细胞对胶原的降低。胶原降解通过测定迁移W138细胞从胶原凝胶中由释放的荧光胶原肽量获得。用细菌胶原酶作为荧光肽释放的阳性对照。所有的抗体均使用5μg/ml的剂量。对于每种抗体，均进行了三次实验，记录均数+/-标准差。
图14A-B.W138细胞在胶原基底层上的的粘附和扩散，主要由β1整联蛋白而非DPPIV介导。图14A.mAb C27(抗β1整联蛋白)抑制WI38细胞在胶原底层上的扩散，mAb E19(抗DPPIV)或mAb C37(抗-gp-90)没有这种抑制作用。图14B.mAb C27(抗pi整联蛋白)抑制WI38细胞在胶原基底层上粘附，mAb E19(抗DPPIV)或mAb C37(抗-gp-90)没有这种抑制作用。
此处的每个数值都是三次独立测量的均值+/-标准差。重复实验得出类似的结果。
图15.Seprase与DPPIV位于迁移到胶原凝胶中的WI38细胞的侵入伪足上。迁移到I型胶原凝胶内的W138细胞中，侵入伪足(空心箭头指示处)的相差成像(a)。直接以抗DPPIV的TRITC-mAb E19标记的侵入伪足(空心箭头指示处)内的DPPIV的免疫荧光图像(b)。直接以抗seprase的FITC-mAb D28标记的侵入伪足(空心箭头指示处)内的seprase的免疫荧光图像(c)。图片b和c的拼接图像显示：Seprase与DPPIV位于迁移到胶原凝胶中的WI38细胞的侵入伪足上。(空心箭头指示处)(d)。标尺＝10μm。
图16.Seprase和DPPIV在人恶性乳腺癌结缔组织中的分布，对石蜡包埋后的肿瘤组织进行连续切片免疫组化分析。在与侵袭性乳腺癌紧邻的结缔组织中成纤维样细胞内存在有seprase和DPPIV，但在远处的正常组织中并未发现这两种酶(未显示)。箭头所示为成纤维细胞seprase或DPPIV的阳性棕色染色。癌细胞团也呈seprase阳性(在中间及底部图片中的大细胞聚集团)和DPPIV阳性(顶部图片中的大细胞聚集团)。乳腺癌和毗邻正常组织的石蜡切片被制成同一张切片，以抗seprase的mAb D8染色(中间及底部的图片)或抗DPPIV的mAb E26染色(顶部的图片)。标尺＝100μm。
图17.seprase与DPPIV在愈合中的人齿龈伤口粘膜细胞中的分布。愈合中的粘膜伤口，在第3天(a，b，c，d，g)以及第7天(e，f及h)时的冰冻切片，以苏木精-伊红染色(a与e)，用抗seprase的TRITC-mAb D28(b-d，以及f)处理，或抗DPPIV的mAb E19处理，然后用TRITC抗大鼠第二抗体(g与h)染色。在第3天的伤口(a-d，以及g)，结缔组织(CT)内含有seprase(b，c，以及d)及DPPIV(g)抗体强染色的细胞。共聚焦显微镜成像显示，在结缔组织中(图片d)，seprase位于以线状伪足形式或成纤维细胞样细胞的胞体形式的侵入伪足上(箭头)。在第7天的伤口(e，f以及h)，伤口的肉芽组织(GT)中发现有seprase染色(f)，而未发现DPPIV染色(h)。点状线表示肉芽组织与结缔组织的边界。字母E表示伤口的上皮细胞；CT，为结缔组织；FC，为纤维蛋白凝块；GT，为肉芽组织。标尺＝200μm。
图18.seprase与DPPIV同位于人恶性乳腺导管癌的侵袭性前沿的内皮细胞，成纤维细胞以及癌细胞上。将甲醛固定，石蜡包埋的人恶性乳腺导管癌样本，制成连续切片，seprase被mAb D8染成棕色(左侧三张图片)，毗邻切片上DPPIV被mAb E26染色(右侧三张)，观察二者分布。
最上面的两张图片显示的是距肿瘤所在部位约2cm的正常乳腺组织。在其上皮细胞(黑色空心箭头)，纤维细胞(黑色箭头)和内皮细胞(黑色空心箭头尖)内观察到其seprase和DPPIV染色为阴性。
中间的两张图片显示的是分化较差(高分级)的癌细胞，在癌细胞(橙色空心箭头)，成纤维细胞(橙色箭色)和部分内皮细胞(橙色空心箭头尖)中可见明显的seprase或DPPIV棕色，而在部分大血管的细胞中未见被染色(黑色空心箭头)。上面和中间图片中的箭头表示比例尺为100μm。
最下面的两张图片显示的是低倍镜下分化较差(高分级)的癌细胞，在癌细胞(橙色空心箭头)，成纤维细胞(橙色箭色)和部分内皮细胞(橙色空心箭头尖)中可见明显的seprase或DPPIV棕色。seprase及DPPIV特别在侵袭前沿处的癌细胞中有表达，如该视野中的大部分癌细胞所示；但在肿瘤中心，如该视野中所示，却未发现有seprase及DPPIV的表达。最下面的图片中的箭头表示比例尺为800μm。
图19.MDA-MB-436细胞的蛋白酶表达与胶原降解能力之间的关系。A，差异表达seprase与DPPIV的MDA-MB-436细胞释放荧光胶原肽。胶原降解的测定通过母细胞(Parent)，转染载体(pAII)的细胞，转染seprase cDNA(pA15)的细胞和转染DPPIV核糖酶的细胞(pZ8)所释放的荧光胶原肽完成。对于每种细胞进行了三次实验，记录均数+/-标准差。星号”*”表示p＜0.05，pA15 seprase sense以及pZ8 DPPIV核糖酶转染子与母细胞和pAI1载体转染细胞相比较。B，seprase和DPPIV在上述的MDA-MB-436细胞中的差异表达。以RIPA缓冲液浸提细胞，用mAb D8(抗-seprase)mAb F4(抗-DPPIV)进行免疫印迹法分析。
5.本发明的详细描述
本发明涉及制备细胞粘附基质的新方法，这种基质可用于从癌症患者的样品中分离和检测具有侵袭性及转移性的活性癌细胞亚群。具体地说，所述方法利用胶原性基质系统来分离并检测癌细胞。在以下的各节中，本发明进一步描述了一种体外检测肿瘤转移性的高灵敏度方法。这种方法的一个重要特点是适用于血液、骨髓、腹水、体液以及肿瘤组织中的癌细胞，以及任何一种已确立的癌细胞系。
本发明提供了一种捕获癌细胞的“细胞粘附基质”，可以从全血、白细胞层、外周血干细胞制品或骨髓中有效地大量清除活性癌细胞。本发明的细胞分离方法可用于癌症诊断，癌症早期检测，药物及手术治疗反应的监测，及对肿瘤发展的预后。本发明的细胞分离方法还可用于癌症的预防及治疗，包括作为血液过滤器用来捕获癌细胞，或用于基因及细胞遗传分析，或用于发现新药靶标，以及开发癌疫苗等。
本发明的体外试验系统还提供一种筛选方法，可用于鉴定抗转移药物。此类药物可用于癌症患者体内一致癌细胞的转移性扩散。另外，该方法还可用于筛选具有抗转移作用的核酸分子。例如，可筛选能抑制转移的反义分子和核糖酶分子。本发明的另一用途是用于检测seprase或DPPIV活性，以判断癌细胞的转移性。
5.1本发明的基质
本发明提供了一种新型的天然细胞粘附基质系统，可用于分离和检测癌症患者样品中的癌细胞。本发明的天然细胞粘附基质与血源性细胞粘附成分具有特异性结合亲和力，包括但不限于纤维连接蛋白，层粘连蛋白以及玻连蛋白。本发明的基础是：转移性癌症患者循环中的癌细胞会粘附于组织碎片，形成较大的细胞团，这提示天然的结构支架与血源性粘附分子之间具有较高的亲和力，因此可促进转移性癌细胞的粘附。另外，已发现天然纤维，包括I型/III型胶原，纤维蛋白，纯棉，以及组织培养塑料的机械刮擦表面易吸附血源性粘附成分从而促进癌细胞的粘附。
本发明的细胞粘附基质包括胶原纤维，纤维蛋白凝胶，纯棉或塑料纤维，可用作为细胞基底层来检测和分离人体内的活细胞，这些细胞包括但不限于癌细胞，内皮细胞以及组织细胞。各种各样市售的胶原性材料可用于制备这种胶原基质，包括但不限于人胎盘I型胶原，购自Calbiochem-Novabiochem Co.(La Jolla，CA)；以及大鼠尾I型胶原，购自Collaborative Biomedical Products(Becton andDickinson Labware，Bedford，MA)。也可以用任何一种得自胶原表达重组宿主细胞(包括细菌、酵母菌或哺乳动物的细胞)的重组胶原。
I型胶原易于被组装或重新组装成任何形式，也可以通过聚合及解聚过程包被于血管表面。例如，已知I型胶原单体在浓度达到0.3mg/ml以上时会在天然pH值及温度(25-37℃)下在含生理盐水的介质中发生聚合，并在pH2-4，低温(2-10℃)以及低盐介质中解聚(Klasson，S.C.，et al.1986，Coll.Relat.Res.6：397)。这种细胞粘附基质可以沿微毛细血管壁形成，在细胞分离柱、组织培养板或微小网孔中形成，用来捕获生物液体中的癌细胞。
本发明的基质，其构架可由天然纤维组成，包括但不限于胶原，纤维蛋白以及纯棉。这些基质构架的共同特性是，其表面对血源性粘附分子有亲和力，血源性粘附分子包括但不限于纤连蛋白，玻连蛋白以及层粘连蛋白。基质的构架被以全血、血浆或血清中的细胞粘附分子包被时，可以提供一个粘附表面供高密度的细胞群中的癌细胞及组织细胞粘附。这些细胞群可能来自血液，淋巴液，骨髓以及肿瘤组织，可能包括多种不同的细胞类型。
在此描述一种制备胶原性基质的方法。通过减少血浆中的抗凝血剂含量在管表面制备了一种由纤维蛋白纤维组成的基质构架。先以Dulbecco改进的Eagle＇s液(DMEM)将动物或人血浆稀释到10-20％，然后加入细胞分离管或分离孔中。将分离管或孔在CO2孵育箱中37°孵育30分钟，使纤维蛋白纤维在分离管表面聚合。将纯棉纤维简单地悬浮于含10-20％牛血清的DMEM中，接种于细胞培养孔内，让有细胞粘附分子包被。相似的，将玻璃及塑料纤维也悬浮在含10-20％牛血清的DMEM中，以细胞粘附分子包被。以Eppendorf移液管尖端刮擦细胞培养板以制备基质构架。应该注意的是，在将全血或白细胞层加于基质构架上时，无需预先以细胞粘附分子对基质构架进行包被。
然而，需用抗凝剂处理全血或白细胞层，以防止在细胞分离过程中出现凝结。特别注意，需预先以等体积的含0.5mM EDTA的介质或以含肝素50单位/ml的10％抗凝剂右旋糖柠檬酸盐(ACD；Baxter Healthcare Corporation，IL)对血液或白细胞层进行稀释。
为了便于对结合在胶原基质上的癌细胞进行检测，为了测定这些细胞的转移性，可以用各种不同的试剂对基质进行标记，这些试剂包括但不限于荧光染料，生物素，染色剂，以及放射活性探针。例如，胶原纤维可通过直接偶联染色剂来标记，这样可以保护胶原内的聚合位点免于被标记。胶原纤维(可以用这种方法进行标记，也可以不进行标记)很容易解聚成可溶性的胶原单体，然而可在管道表面装配成任何形状。宜用于标记胶原的染料包括Bodipy-rhodamine或荧光素染料(Molecular Probes公司，为猝灭荧光染料)。如图1A、1B所示，当两个染料分子在胶原上紧靠在一起时，Bodipy-rhodamine的荧光信号(黄色)减弱，但当胶原降解或被酶裂解成两个分开的染料分子时，荧光信号(红色)增强。标记基质的方法是本领域熟知的。同样地，将细胞毒性化合物与这种胶原纤维结合，可提供一种新的载体，将药物送达特定的癌细胞。例如，将一种与细胞毒素结合的胶原微球注入癌症患者体内，可以特异性地杀伤癌细胞。
基质构架的表面再用血源性的粘附分子包被。多种市售的含血源性粘附分子的溶液均可用于包被上述基质，这包括但不限于小牛血清，胎牛血清(Collaborative Research，Inc.，Bedford，MA)；人血清(Sigma)以及人血浆纤维连接蛋白，层粘连蛋白以及玻连蛋白(Collaborative Research，Inc.，Bedford，MA)。可以应用10-20％的小牛血清，胎牛血清，或人血清(或血浆)，或0.01-0.5mg/ml的人血浆纤维连接蛋白，层粘连蛋白以及玻连蛋白包被这种基质构架的表面。
本发明可较好地达到预期目的，即提供一种细胞分离系统，提供预防及干预转移瘤形成的方法。具体地说，本发明提供了一种分离癌症患者的癌细胞的方法，包括：(1)将癌症患者的癌细胞样品接种在细胞粘附基质上；(2)癌细胞样品孵育足够长的时间，以使癌细胞粘附于基质上，然后除去非粘附细胞；(3)体外扩增基质上结合的癌细胞。
本发明的细胞分离方法可用于体内及体外来源的各种癌细胞群，所述来源包括但不限于体液，如循环血液、尿液、骨髓、脑脊液及胸膜液，腹水，唾液；离体的肿瘤组织样本；以及培养的癌细胞。关于各种癌细胞群的示例，包括但不限于以下癌细胞：前列腺，乳腺，结肠，脑，肺，头颈部，卵巢，膀胱，肾及睾丸，黑色素瘤，淋巴瘤，肝，胰腺以及其它胃肠道癌。具体地说，各种癌的癌细胞群包括，肺癌细胞，肺腺瘤细胞，结肠腺癌细胞，肾癌细胞，直肠腺癌细胞，回盲部腺癌细胞，胃腺癌、胰腺癌、肝细胞瘤细胞，肝细胞癌细胞，前列腺腺癌细胞、膀胱癌细胞，乳腺癌、卵巢畸胎瘤、恶性黑色素瘤细胞，子宫颈、喉及口腔源性的鳞状细胞癌；恶性胶质瘤细胞，子宫内膜腺癌，星状细胞瘤，伯基特淋巴瘤细胞，以及非何杰金淋巴瘤细胞。
可用各种方法检测结合在基质上的癌细胞，这些方法包括利用癌细胞的功能性、免疫表型、以及细胞形态学特征进行检测。另外，可根据细胞摄取经标记的胶原性基质来检测结合在基质上的细胞。
5.2本发明在肿瘤治疗及预防中的应用
本发明所提供的细胞分离方法的用途包括例如：清除血液或骨髓中的恶性癌细胞，以及富集造血祖代细胞作为骨髓移植的供体细胞。细胞分离方法之后，可可用与肿瘤抗原表位(如上皮细胞的标记物)反应的抗体，或与内皮细胞反应的抗体如抗-CD31或抗-CD34分别富集癌细胞或内皮细胞群。
在一种实施方式中，可以通过本发明的细胞分离方法，从全血中富集不同肿瘤的癌细胞，经体外扩增后，与树突状细胞反应，可利用所述的方法研制成一种有效的抗肿瘤疫苗(Brugger et al.，1999，Annals of the New York Academy ofScience 872：363-371)。
在本发明的另一项实施方式中，从一例癌症患者体内分离出循环性癌细胞，然后在体外接受一系列化疗药物处理，以确定各治疗方案的疗效。随后可给予患者有效剂量的药物或联合用药(设计药物)。
在本发明的另一项实施方式中，结合了细胞毒素的胶原微球被注入一例转移瘤患者的体内，以选择性杀伤癌细胞。体内癌细胞特异性的粘附并内吞毒性胶原，可提供一种新型的抗癌治疗方法。
本发明还提供了纤维化合物，包括但不限于血源性粘附分子包被的胶原、纤维蛋白、棉及塑料纤维，可作为细胞粘附基质用于治疗转移瘤患者的血液过滤器。所述细胞粘附基质的用途包括将患者血液灌注通过这种细胞粘附基质。在血液灌注方案中，抽出患者的血液，与细胞粘附基质接触。在通过细胞粘附基质的过程中，患者血液内的癌细胞将优先粘附在细胞基质上，于是从患者循环中清除。
要制备这种细胞粘附基质，可在一管道内进行胶原或上文所述某种材料的成形，这包括但不限于柱子，组织培养板，微毛细管，或微网孔，用来捕获生物液体中的癌细胞。
供患者血液通过的管道，有一个入口和一个出口。在本发明的实施方式之一中，细胞粘附基质在容器管道(包括血液输入管路，可联用一传统蠕动泵)内成型。管道还包括输出管路。输入、输出管路与适当的动静脉瘘管相连接，例如，可将这种动静脉瘘管植入患者的前臂。另外，血液成分分采后的外周血回输也可与上述的细胞粘附基质癌细胞分离术联合应用。血液成分分采法可以将白细胞计数回收到1×109/L以上。可以应用Cobe Spectra细胞分离装置(Lakewood，Colo.)，以80ml/min的速率进行血液成分分采或白细胞分采，进行200分钟(总体积16L)。本发明细胞粘附基质的应用提供了一种从患者血循环中清除那些具有较高转移性的癌细胞的方法。
5.3测定癌细胞转移性的试验
本发明目的之一是提供一种方法，用于鉴定转移性较高的癌症患者。
本发明提供了一种方法，利用本发明以胶原为基础的细胞粘附基质系统，通过检测受试者癌细胞侵袭能力，即粘附、降解及摄入胶原基质的能力来评价癌转移性。检查并判断癌细胞的血管生成倾向，细胞活度及增殖能力，为肿瘤预后提供新的方法。
本发明所述细胞分离及试验方法可用于各种诊断目的。这些用途包括早期检测，药物及手术治疗反应的监测，以及肿瘤发展的预后所需的形态学、分子、生化或免疫试验方法。例如，可制备循环性癌细胞的RNA，进行实时的聚合酶链反应(PCR)，DNA微阵列分析和基因表达的系列分析(SAGE)以及鉴定作为癌症诊断标志或控制肿瘤转移的药物的靶标的差异表达的基因。另外，可应用蛋白组学(proteomics)分析得出分离所得的癌细胞的蛋白图谱，用来发现新的转移标记和药物靶标。分离得到的癌细胞可用上皮细胞特异性抗原，seprase及DPPIV抗原或内皮细胞标记进行染色，定量测定，确定存在的癌细胞数目，以评价癌症的转移性。作为肿瘤的常规病理学评价，可以对分离得到的癌细胞进行形态学评估。将分离所得的癌细胞在无菌条件下进行培养，进行细胞遗传学分析，以检测是否存在染色体异常或突变。可用DNA微阵列，PCR以及FISH使分离所得的癌细胞与分子探针反应，从而更灵敏地检测突变。这些方法避免了在此之前须采用的损伤更重、更为昂贵的手术操作。
本发明可较好地达到预期目的，即为评价癌症患者的预后提供一种方法，为鉴定那些易于发生肿瘤转移的患者提供一种方法。
具体地说，本发明包括了一种利用本发明的细胞粘附基质确定自患者分离所得癌细胞转移性的功能性试验方法。
具体地说，本发明涉及一种测定癌症患者癌细胞转移性的方法，该方法包括：(1)将癌症患者的癌细胞样本接种在细胞粘附基质上；(2)将癌细胞样本孵育足够长的时育以使癌细胞粘附、迁移穿越基质或摄取基质；(3)检测癌细胞对基质材料的粘附、迁移穿越或摄取，发生所述粘附、迁移或摄取是癌细胞具有转移性的标志。
本发明的试验方法涉及一种人造基质，癌细胞可以接种在这种人造基质上。可以接种在这种基质上的细胞包括但不限于血细胞，癌细胞系和哺乳动物肿瘤细胞，后者包括癌症患者的细胞，如肿瘤组织活检标本等。
将癌细胞被接种于基质上后，可将该基质孵育足够长的时间以使细胞粘附、摄取或侵入基质中。
接种时间将根据所接种的癌细胞转移性的不同而不同。
接种后，可用各种不同的方法检测癌细胞对基质的粘附和/或摄取。
例如，可用试剂对胶原性基质进行标记，所述实际例如荧光染料，生物素，染料以及放射活性探针等。癌细胞摄入这种标记后的基质造成细胞被标记。可用各种已知方法检测表达了所标记的标志物的癌细胞，这些方法包括但不限于荧光显微镜检，荧光激活细胞分选(FACS)或液闪计数器测定放射活性。用这些标记可对细胞粘附及摄入基质材料的程度进行定量，以确定细胞的转移性。
此外，对用本发明基质分离所得的癌细胞可用各种已知方法测定其转移性。例如，可以将癌细胞样品与标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL+)进行孵育，接种在胶原凝胶板上，使形成毛细血管网，或以内皮细胞标记物的抗体进行染色，这些标记包括但不限于CD31+，FIkI+，以及因子VIII(F8+)，充分反应一段时间后，测定癌细胞获得的内皮表型。另外，可用一种凋亡试验试剂盒(Molecular Probes，Inc.)，检测癌细胞发生凋亡的倾向。癌细胞簇可与抗白细胞标记抗体反应，这些标记物包括但不限于CD45，CD19，CD8和CD4，充分反应一段时间后，可对癌细胞的活性，与免疫细胞(白细胞，T-细胞与杀伤细胞)的相关性，以及对细胞或补体介导的细胞溶解过程的耐受性等进行定量检测。将癌细胞在含有10-20％人血浆的组织培养液中增殖1-5周，可测定分离的癌细胞在培养基中形成群落的能力。
本发明的试验系统还可被用于监测抗癌药物在治疗过程的疗效。例如，可在治疗前后测定癌细胞的转移性。比较整个治疗过程中癌细胞的数量和转移性，由此可测定药物的疗效。有效的抗癌药是指那些能够使可检测到的癌细胞对胶原性基质的粘附、降解或摄取水平降低的药物，或使可检测到的癌细胞的活性降低的药物，以及使可检测到的癌细胞形成群落的能力降低的药物。
5.4鉴定抗转移药物的体外筛选方法
本发明还提供了药物筛选方法，用于鉴定能够抑制癌细胞自原发肿瘤部位扩散形成转移灶的药物。根据本发明，可对药物抑制癌细胞转移的能力进行筛选。用本发明试验方法鉴定药物的抗转移作用时，将待测药物与癌细胞一起接种胶原基质上。将待测药物存在下癌细胞对胶原基质的粘附、摄取和/或降解作用与溶剂对照存在下癌细胞对胶原基质的粘附、摄取和/或降解作用进行比较。如果药物能够抑制癌细胞对胶原基质的粘附、摄取和/或降解，则可认定其具有抗转移作用。
具体来说，本发明包括了一种鉴定药物是否能抑制癌细胞转移的方法，该方法包括(1)将癌细胞样品与待测药物或溶剂对照一起接种在细胞粘附基质上，(2)孵育足够长的时间以使癌细胞粘附、降解和/或摄取基质；(3)检测癌细胞对基质的粘附、降解和/或摄取，与溶剂对照存在下的癌细胞比较，如果在待测药物存在下癌细胞对胶原基质的粘附、摄取和/或降解作用降低了，则提示这种化合物具有抑制肿瘤转移的作用。
可用本发明可以进行筛选的药物包括但不限于无机化合物，肽，抗体及其片段，以及其它有机化合物(拟肽类)，这些药物能够抑制癌细胞从原发肿瘤部位扩散为转移灶。这些药物包括但不限于肽类，如可溶性肽类，包括但不限于随机肽文库的成员；(例如，参见Lam，K.S.et al.，1991，Nature 354：82-84；Houghten.R.et al.，1991，Nature 354：84-86)，以及由D-和/或L-构型的氨基酸、磷肽(包括但不限于磷肽文库随机或部分降解的成员；例如，参见Songyang，Z.et.al.，1993，Cell 72：767-778)组成的组合化学衍生的分子文库。
用本发明方法鉴定的药物可用于了解癌细胞是否能够成功地迁移和侵袭，并有助于抑制癌症患者体内转移灶的形成。
为测定筛选鉴定所得化合物的效果，可在动物模型系统中检测转移灶的形成。可将此类动物模型作为试验基础来鉴定对癌转移有效的药物、医疗产品、疗法及干预措施。
本发明的试验方法还可用于筛选能够抑制癌细胞转移性的核酸序列。此类核酸序列包括含有蛋白编码序列或反义序列的分子。可以在检测之前，将这些核酸分子通过以下方法通过例如电穿孔法，质粒转染法，磷酸盐介导的转染或病毒感染等方法转移到癌细胞内。
根据本发明，可用一种试验系统筛选可调节丝氨酸膜内在蛋白酶(包括DPPIV和seprase)的活性从而调节癌细胞转移性的药物。据此，可用内源性表达DPPIV和seprase的细胞筛选此类药物。或者，某些细胞系，如293细胞，COS细胞，CHO细胞，成纤维细胞等经遗传工程改造而表达DPPIV和seprase，因而可用于筛选此类药物。较好的是，对宿主细胞进行遗传工程改造，使其表达DPPIV和seprase，这种宿主细胞可用作为此项试验的终点；例如，检测它在化学，物理，生物或表型等方面的改变。
在应用此类细胞系统时，表达DPPIV和seprase的细胞与待测化合物或与溶剂对照接触。接触后，对细胞进行检测，测定DPPIV和seprase蛋白酶的表达和/或活性。例如，在接触后，对细胞溶解产物进行检测，测定明胶分解活性(seprase)，或含有毗邻于脯氨氨的磷酸化残基的底物，如H-Gly-Pro-p-硝基苯胺或氨甲基香豆素(DPPIV与seprase)以及Z-Gly-Pro-p-硝基苯胺或氨甲基香豆素(seprase)(Kaspari et al.，1996)。待测化合物使DPPIV和/或seprase蛋白酶活性水平降低到以溶剂对照液处理的细胞中所观察到的活性水平以下，表明该待测化合物抑制了DDPIV及seprase相关性蛋白酶的活性。
此外，所述试验方法还可用于鉴定那些可拮抗DPPIV与seprase相互作用从而抑制这种蛋白酶复合物活性的药物。在鉴定此类药物时，在有或没有待测化合物的条件下，对DPPIV和seprase蛋白进行孵育，然后检测复合物形成的量。复合物形成下降，表明待测药物能够拮抗DPPIV与seprase之间的相互作用。
本发明的内容之一是在无细胞试验中重组表达、标记及利用可溶性DPPIV与seprase，以鉴定可抑制DPPIV与seprase相互作用的化合物。在此类试验中，DPPIV或seprase均可通过已知方法粘附于固体基质如试管或微滴定孔上。然后对鉴定待测药物抑制DPPIV或seprase在固体基质上相互作用的能力。
5.5成分与用途
本发明涉及一种新的癌细胞捕获系统，可对癌症患者血和/或组织中的侵袭性癌细胞进行迅速有效地检测和选择。本发明涉及用作细胞粘附基质的纤维性组合物，包括血源粘附分子包被的胶原、纤维蛋白、棉纤维以及塑料纤维等。本发明还涉及了用此类包被有纤维检测癌症患者体内转移性细胞，以及用此类包被纤维过滤转移性癌症患者的血液。可用于癌症患者的细胞粘附基质包括在前文5.1.-5.2中所提及的物质。
本发明还提供了用本发明的细胞粘附基质分离所得的细胞成分。此类细胞成分包括一小部分的具有转移性的癌细胞亚群，以及血液中可以引起肿瘤晚期相关性器官功能不全的癌细胞集落。所富集的癌细胞群可用于例如研究新的药物靶标，探讨有关的遗传缺陷，检测这些细胞的转移能力，以及探讨最有效的治疗方案。所富集的细胞还可用于与树突状细胞融合，以开发肿瘤疫苗。
本发明提供了通过给予调节癌细胞转移活性的药物来治疗增殖性疾病如肿瘤的方法。可给予癌症患者的化合物包括用前文5.3.中所述方法鉴定出来的那些药物。
本发明实施方式之一鉴定出了组织侵袭性表型所需要的关键性蛋白酶。例如，已发现组织细胞迁移与侵袭需要丝氨酸膜内在蛋白酶如seprase和DPPIV的活化。因此，可用此类蛋白酶的抑制剂抑制癌细胞的转移活性。此类抑制剂包括seprase或DPPIV的免疫特异性的抗体(图13A-E)。或者，向癌细胞转染表达seprase或DPPIV的反义RNA或核糖酶的载体，用来降低癌细胞的转移能力(图19)。
另外，也可用蛋白酶抑制剂来抑制癌细胞从原发肿瘤扩散形成转移灶。如第7部分实施例2所示，DPPIV抑制剂，即抗DPPIV抗体，可抑制癌细胞迁移。癌细胞向体内其它部位转移的癌症可用能够抑制癌细胞迁移和组织侵袭的药物进行治疗。此类癌症包括诸如乳腺癌和前列腺癌等。
鉴定出的用于预防肿瘤转移的化合物在用于人体之前可在适当的动物模型系统中进行试验，这类动物模型包括但不限于犬、大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、家兔等。对于体内试验，在用于人类之前，可采用任何一种已经较成熟的动物模型。
在具体实施例中，癌症患者的癌细胞被证实其转移性有所增高后，可给予抑制癌转移的化合物。有所增高的转移性很容易被检测出来：收集血样(或患者的活检组织)，用本发明的细胞分离及检测系统检测分离的细胞的转移性。
本发明提供了通过给予有效量的能抑制癌细胞的转移性的化合物来治疗癌症的方法。接受者宜为动物，哺乳动物较好，最好是人类。
本发明还提供了可与细胞粘附基质结合或与本发明中分离的细胞成分结合药物组合物。这些药物组合物包括可调节癌细胞迁移及侵袭的治疗有效量的组合物以及药学上可接受的载体。在具体实施例中，所谓“药学上可接受的”一词是指获得联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典中列出的，或其它被广为认可的药典列出的，适用于动物，特别是人体。“载体”一词是指与组合物一起给予的稀释剂、辅佐剂、赋形剂或溶剂。这类药学载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、蔬菜或合成的油，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。所述药物组合物经由静脉给予时，水是优选的载体。生理盐水溶液，右旋糖水溶液和甘油溶液等也可作为液态载体，特别是对注射用溶液而言。
6.实施例：分离血管生成和转移相关性循环性癌细胞
以下所述表明，用新的细胞粘附基质进行细胞的分离与检定可将活性癌细胞从转移性癌症患者的外周血中分离出来。这些细胞获得了血管生成和转移所必需的分子决定簇。
于来自原发肿瘤的细胞相比，这些活性循环性癌细胞代表了癌细胞群中一个能够进行转移的小亚群。
6.1材料和方法
6.1.1采集血液标本
活体采集的血液或细胞应在采集后相对较短的时间内进行细胞分离，否则这些细胞可能失去活性。为了获得癌细胞的最佳分离，宜将采集的血液、腹水或组织标本保存于4℃，不超过24小，最好在4小时之内。
在盛有抗凝剂肝素锂的真空管(Becton Dickinson，顶端绿色，每管装7毫升)中，每次采集大约10-20毫升的血液。患者的年龄，性别，诊断日期，治疗干预，临床状况以及活组织检查报告都可以从患者的记录图表中追溯。实验方案通过了研究机构审察委员会的批准。
6.1.2分离血液或肿瘤组织中的癌细胞
制备胶原聚合溶液，然后将其调整到预测浓度，使每毫升Dulbecco＇s modifiedEagle＇s(DMEM)培养液含1-2毫克胶原，在胶凝于试管底部之前，迅速置于冰块上(图1A)。具体地说，在4℃将I型胶原溶液(大鼠尾I型胶原，4.0mg/ml，合作生物制品，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)与等体积的DMEM混合。
在4℃下，将混合物薄薄的一层覆盖到96-孔微量滴定板或6孔培养板各孔的底部。为了形成胶原纤维凝胶，37℃下培养30分钟，让胶原层聚合。
6.1.3分离血液、腹水或肿瘤组织中的癌细胞
为了分离细胞群中的癌细胞，首先要在细胞培养基上覆盖胶原基质，细胞培养基的组成为：1∶1的Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液和RPMI1640，并添加有10％的牛血清，15％的Nu-血清，2毫摩的L-谷氨酰胺，0.1毫摩的非必需氨基酸，1毫摩的丙酮酸钠，1单位/毫升的青霉素，以及10μg/ml链霉素。然而，也可以直接从全血中分离癌细胞，而不必包被血中的其他粘附分子。
在4℃，从标本中分离血浆和细胞。
离心血液标本，得到血浆，用含2％牛血清和0.5毫摩尔EDTA的PBS稀释细胞传动到最初的溶液体积，接着用Ficoll-Paque(Pharmacia)分级收集单核细胞。根据对细胞粘附基质的差异粘附，进一步筛选单核细胞中的活性和侵袭性癌细胞。简言之，将单核细胞悬浮于完全培养基中(与血液体积相同)。接种一部分单核细胞，即，在96孔微量滴定板中每孔0.1毫升，或在6孔组织培养板(NUNC)中每孔1到10毫升，两板均包被有胶原胶质，培养15分到1小时。接着，轻轻地用培养液冲洗培养物，去除未粘附的细胞。为进行免疫细胞化学和功能测定，在操作开始前，将微滴定板中的细胞培养12-24小时。为进行细胞分离研究，用胰蛋白酶/EDTA溶液(GIBCO)处理5分钟，或者，简单地用磷酸盐缓冲液(PBS)剧烈冲洗，使粘附到基质上的细胞悬浮。接着，将洗液中的细胞转移到一个6孔组织培养板上，置于CO2培养箱中，在37C下培养12小时到24天。
需注意的是，如果患者白细胞计数很高，即患者患淋巴癌或白血病，应用完全培养液稀释单核细胞至6孔组织培养板中每孔中有1-2百万个细胞。癌细胞的回收取决于基质上的细胞浓度(见下)。用台盼蓝排除法或凋亡试验来评估细胞活性。
另外，也可使全血通过包被有一层细胞粘附基质(如I型胶原或纯棉过滤器)的细胞培养珠，而直接除去全血中的活行和侵袭性癌细胞。具体地说，用充填了纯棉或胶原包裹珠的一根30毫升消过毒的移液管，每10毫升的血液用0.1毫升胶原包被珠。血液应用等体积的含0.5毫摩尔的EDTA培养液预先稀释或用含50单位/ml肝素的10％柠檬酸盐右旋糖抗凝剂(ACD，Bakter Healthcare Corporation，IL)预先稀释。
用含10％人血浆或血清的培养液预先洗柱。
流速为每分钟0.1到0.7毫升，捕获的细胞同上述底层法所得的细胞具有共同特征。
6.1.4标记胶原基质和测量细胞侵袭表型
在使用生物素、荧光素或罗丹明标记之前，将胶原聚合，这样聚合部位不会受干扰。将标记了的胶原纤维溶于酸化水中(pH2.0)，但在实验室条件下又会很容易聚合成以前的胶原纤维。具体地说，将10毫升I型胶原溶液(大鼠尾I型胶原，4.0mg/ml，合作生物制品，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)与10毫升DMEM混合，4℃加到10厘米的组织培养皿中，37℃下孵育30分钟，以促进胶原纤维聚合(胶凝)。
用30毫升pH9.3(Sigma)的双份硼酸缓冲液冲洗凝胶30分钟，然后在25℃与30毫升含有3毫克硫-NSH-生物素(Pierce)，盐酸异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明，异硫氰酸盐(TRITC)(Research Organics Inc，Cleveland，OH)或者含有1毫克Bodipy-罗丹明或荧光素染料(分子探索Inc.，)的硼酸缓冲液，在震荡器上进行孵育。用PBS洗涤3次以终止交连，接着用50毫升PBS洗涤2天，再用50毫升蒸馏水洗涤两天。用酸化水(0.02当量醋酸)溶解标记了的胶原纤维，至最终浓度1毫克/毫升。接着，将标记了的胶原单体与等量未标记的胶原溶液混合，并用2倍体积的DMEM稀释，再将其覆盖在管表面以形成很薄的一层，最后，在37℃下孵育30分钟以形成凝胶。
用标记了的胶原基质包被16孔微量滴定板载玻璃片(在96-孔微量滴定板格里；Lab-Tek，Rochester，NY)，或包被6孔组织培养皿(NUNC)。将一部分单核细胞，即96孔微量滴定板中每孔0.1毫升，或6孔组织培养皿(NUNC)中每孔1.6毫升，接种在该底层上，并培养15分钟到1小时，以捕获粘附细胞。在洗去未粘附细胞后，使细胞在标记了的基质上生长12到24小时，然后用Nikon Eclipse E300倒置光学显微镜以及SONY DC5000猫眼成像系统，或用分子仪器fMax荧光素微板阅读器和如图1A，1B.所述的SOFTmaxPRO 1.2F for Windows软件电脑分析测定细胞的侵袭性。在16孔培养箱中制备如上所述的Bodipy-荧光胶原底层，使细胞培养和显微镜成像分析达到最佳状态，以便分析和确定基质分离的细胞的特性(图1A)。优化96-孔微量滴定板的底物制备。最佳参数包括可实行的标本吞吐量，以及精确定量的分辨率。
6.1.5其他的细胞功能测定
按照操作手册(L-3485，分子探索，OR，美国)。用乙酰低密度脂蛋白(acLDL)Bodipy FL偶合物对内皮细胞活性进行功能测定。为了分辨基质上同时分离的血细胞是凋亡还是坏死，固定之前应用Vybrant凋亡试验试剂盒#5Hoechst/prodidium iodide(V-13244，分子探索，OR，美国)对细胞进行染色。
6.1.6细胞系和培养
从American Type Culture Collection(Rockville，MD)获得人乳腺癌细胞系MDA-MB-436和Hs578T，从挪威奥斯陆Norwegian Radium医院癌症研究所的，Oystein Fodstad教授获得人无黑素性黑素瘤细胞系LOX。将细胞置于1∶1的Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液和RPMI1640的混合液中进行培养，并添加10％牛血清，15％Nu-血清，2毫摩L-谷氨酰胺，0.1毫摩非必需氨基酸，1毫摩丙酮酸钠，1单位/毫升青霉素和10皮克/毫升链霉素。用这些细胞来评价免疫细胞化学检测试剂和判断功能试验的灵敏度。
6.1.7免疫细胞化学的溶液标本的制备
用标记了的胶原基质包被16孔培养室载玻片，并在37℃于CO2培养箱中在相同底层上培养12-24小时，使癌症患者血液的单核细胞被胶原基质捕获。为了计数血液中转化的上皮细胞，并与白细胞和外周血液组织细胞进行比较，将单核细胞固定，进行免疫细胞化学分析。用于该研究的第一单抗包括如下小鼠单克隆壳体，它能识别人上皮特异抗原(ESA；clone W-1D9，NeoMarkers，CA，USA；SIGMA，MS，USA)，Muc-1上皮膜糖蛋白(Muc-1；clone E29，NeoMarkers，CA，USA)，细胞角蛋白4，5，6，8，10，13，和18(PCK；clone C-11，SIGMA，MS，USA)；CD31/PECAM-1内皮细胞标志(CD31；Clone JC/70A，NeoMarkers，CA，USA)，Flk-1，血管内皮生长因子受体(Flk-1，Clone sc-6251，Santa Cruz，USA)，VE-cadherin内皮标志(VE-cad；Clone sc 9989，Santa Cruz，USA)，CD34外周血液干细胞标志物(CD34；clone 581，Pharmingen，USA)，CD45白细胞共同抗原(CD45；clone T29/33，DAKO，Denmark)，CD8；抑制性T细胞标志(CD8；clone c8/144B，NeoMarkers，CA，USA)，CD43 T细胞标志(CD43；clone 84-3C1，NeoMarkers，CA，USA)，前列腺特异性酸性磷酸酶(PSAP；clone PASE/4LJ，NeoMarkers，CA，USA)，前列腺特异性抗原(PSA；cloneER-PR8，NeoMarkers，CA，USA)，c-erbB-2/Her-2/neu肿瘤蛋白(erB-2；clone e2-4001+3B5，NeoMarkers，CA，USA)，c-erbB-2(Clone TAB250，Zymed，CA，USA)，CA19-9/sialyl Lewis GI肿瘤标志(CA19-9；clone 121 SLE，NeoMarkers，CA，USA)，p53肿瘤抑制蛋白(p53；clone DO-7+BP53-12，NeoMarkers，CA，USA)。此外，除了上述的抗其他细胞标志的第一抗体外，还采用荧光素偶联的抗Muc-1上皮细胞标志(DAKO，Denmark)的抗体和抗因子VIII内皮标志(F8；Atlantic)的羊抗体荧光素偶联物，分别进行癌瘤和内皮细胞的双重染色。而且，也使用本实验室产生的大鼠单克隆抗体D28(抗seprase)，E19，E26(抗DPPIV)和C27(抗β1整合素)。
抗体染色包括，在用2％BSA封闭非特异性结合位点30分钟后，加入第一抗体和/或荧光素-F8或荧光素-Muc-1到载玻片上。然后，室温下培养标本20分钟，以PBS洗涤两次，每次5分钟，然后第二抗体兔抗小鼠免疫球蛋白20分钟。再洗涤两次，然后将标本和碱性磷酸酶-抗-碱性磷酸酶(APAAP)小鼠免疫球蛋白复合物一起孵育15分钟。最后，加入酶底物[NewFuchsin(Dako)]，生成红色沉淀。用Nikon Eclipse E300倒置光学显微镜和SONY DC5000猫眼成像系统记录数据，并将数据储存在电脑服务器上，以供以后参考。
6.1.8用于流式细胞计数分析的标本的制备
通过包被6孔组织板上的胶原基质捕获了血液中的转化上皮细胞，未来计数，按照制造商的操作说明，用流式细胞计数仪分析基质底层释放的单核细胞。该程序类似于免疫细胞化学程序，固定前用Vybrant凋亡检测试剂盒#5Hoechst/prodidium iodide(V-13244，Molecular Probes，OR，USA)染色，判断细胞凋亡还是坏死。简言之，用含有荧光素(FITC)偶联的抗细胞角蛋白4，5，6，8，10，13，18(PCK；Sigma)的小鼠单克隆抗体或抗Muc-1(DAKO)荧光壳体，藻红蛋白(PE)偶联的抗-CD31内皮标志(CD31；Becton-Dickinson)，以及peridinin叶绿素蛋白(PerCP)-标记的抗-CD45(CD31；Becton-Dickinson)的溶液染色单核细胞15分钟。在孵育和洗涤后，将集得的细胞重悬于0.5毫升中，在FACScan或FACSVantage流式细胞计数仪(Becton Dickinson)上对标本进行分析。
6.2结论
6.2.1使用细胞粘附基质分离癌细胞：血源性细胞粘附分子的作用
表I显示当人血浆中的纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白以及人和牛血清存在时，从一名头颈癌患者分离的LOX人恶性黑素瘤细胞和癌细胞能粘附于各种不同的天然纤维表面。在包被了不同量的纯化血浆蛋白质(0.1～1μg每孔)或者是10％血清的96孔板(Nunc公司，Naperville，IL)上分析人癌细胞的粘附，操作如前所述(Nomizu等，1995)。通过计算一个微量滴定孔1.27mm2面积内保持粘附区域中的细胞数量来确定天然纤维的细胞粘附性。在人或者牛血清或纤连蛋白+层粘连蛋白+玻连蛋白存在时，LOX黑素瘤细胞在纯化后胶原、纤维蛋白和棉纤维以及划线的塑料表面上粘附力比在平坦的塑料表面上更强，并有更多的保持粘附细胞。(表1)类似地，与在平坦的塑料表面上相比，头颈癌细胞在划线塑料表面上以及净化胶原、纤维蛋白和棉纤维上的粘附更强，并且保持粘附的细胞更多(表2)。这些结果提示，细胞粘附基质表面通过其对血源行粘附分子的结合亲合力发挥了其对癌细胞的粘附作用。
表1.LOX黑素瘤细胞对不同细胞粘附基质表面的粘附主要是通过基质与血源性细胞粘附分子的相结合而介导的。
人血清  牛血清  FN+LM+VN  阴性对照
I型胶原 92±5  91±6  86±5  8±5
纤维蛋白 68±7  72±8  67±6  6±6
纯化的棉花 79±5  83±9  72±6  7±6
划线的塑料 57±8  49±9  35±8  4±3
平坦的塑料 7±3  5±4  34±2  2±1
4×103/孔的细胞(计算一个1.27mm2面积的微量滴定孔上保持粘附区域内细胞数)接种在96孔-板(Nunc公司，Naperville，IL)中的各种基质表面上，该96孔-板用10％人类血清(Sigma)，10％牛血清(协作调查公司，贝德福德，MA)或10μg/ml人血浆纤连蛋白+层粘连蛋白+玻连蛋白(FN+LM+VN；Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)包被。没有被蛋白质覆盖的孔用作阴性对照。根据下面描述的程序，在微量滴定孔的底部形成I型胶原纤维。
纤维蛋白纤维是通过在微量滴定孔中以Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液中配制的20％人血浆凝结而成。将纯化的棉纤维悬浮于Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液中，接种到微量滴定孔中培养。“划线的塑料表面”表示微量滴定孔的表面用一个Eppendorf移液管尖端刮擦过。每个数值代表三次独立试验的平均值±标准差。
表2.头颈癌细胞对不同细胞粘附基质表面的粘附，主要是通过基质与血源性细胞粘附分子的结合而介导的。
人血清  牛血清  FN+LM+VN  阴性对照
I型胶原 42±4  41±4  37±5  2±2
纤维蛋白 37±3  33±5  27±3  3±2
纯化后的棉 38±5  34±4  29±2  2±1
划线的塑料 27±2  28±3  22±2  2±1
平坦的塑料 5±2  3±2  2±1  2±1
2×103/孔的细胞(计算一个1.27mm2面积的微量滴定孔上保持粘附区域内细胞数)接种在96孔-板(Nunc公司，Naperville，IL)中各种的基质表面上，该96孔-板用10％人类血清(Sigma)，10％牛血清(协作调查公司，贝德福德，MA)或10μg/ml人血浆纤连蛋白+层粘连蛋白+玻连蛋白(FN+LM+VN；Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)包被。没有被蛋白质覆盖的孔则被用作阴性对照。根据下面描述的程序，在微量滴定孔的底部形成I型胶原纤维。
纤维蛋白纤维是通过在微量滴定孔中以Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液配制的20％人血浆凝结而成。纯化后的棉纤维也悬浮于Dulbecco＇s modified Eagle＇s培养液中悬浮，并接种得到微量滴定孔中培养。“划线的塑料表面”表示微量滴定孔的表面用Eppendorf移液管尖端刮擦过。每个数值代表三次独立试验的平均值±标准偏差(S.D.)。
6.2.2细胞分离方法的敏感度
用人侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-436和Hs578T(美国型培养收藏中心，Rockville，MD)来测定细胞分离方法的敏感度，并用来评估免疫组织化学检测试剂(参照下述内容)。将这些乳腺癌细胞用荧光染料标记，用来测定分离过程的敏感度。图3A-G显示正常血液标本和膀胱癌血液标本的分析，在这些血液标本中加入了不同量的用PKH26红色荧光细胞Linker(∑)标记的Hs578T乳腺癌细胞。如图所示，癌细胞可与其他血细胞区分出来。乳腺癌细胞的回收在以下频率范围上是一致的，即介于1和500个，Hs578T细胞接种到正常献血者的1-ml血液中(含1千万-2千万个单核细胞/ml)中时，细胞的回收率在75和100％之间。但是，当Hs578T乳腺癌细胞接种到膀胱癌献血者的血液(少于1千万个单核细胞/ml)中时，Hs578T细胞的回收率则介于95和100％之间，这提示，细胞密度是细胞粘附基质的一个抑制因素。此外，将19个红色荧光标记的Hs578T细胞接种到膀胱癌献血者的1-ml血液中时，用抗-细胞角蛋白抗体CI1阳性染色鉴定了分离的Hs578T细胞和膀胱癌细胞图3E-3F)。在1ml血液中检测到了16个荧光标记的Hs578T细胞和468个膀胱癌细胞。这些结果提示，基质捕获方法的敏感度水平为每毫升血液1个活性癌细胞，而回收率可达到85％。
6.2.3利用细胞粘附基质进行的癌细胞分离
为了检测血液中的癌细胞，将一薄层罗丹明-胶原溶液包被16孔载玻片(Lab-Tek，罗切斯特，NY)或者96孔培养皿(NUNC)，随意与含有血源性粘附分子的牛血清一起培养，成为“基质”的一个优选实施例。将1.6ml全血白血病层中的单核细胞(每份0.1ml)接种到16-孔载玻片的每一个孔中37℃培养10分钟到18小时，根据细胞对胶原基质的差异粘附选出癌细胞。
图4A-D显示用以I型胶原为基础的细胞粘附基质对循环性癌细胞团块与组织碎片进行的分离。这种不同大小的细胞集落常见于晚期转移性癌症患者的血液中，这些疾病包括头颈鳞状细胞癌(图4A-C)和前列腺癌(Figure 4D)。据估计，在第III-IV期癌症患者的血液中有大量的癌细胞集落，其数量为每立方厘米血液几百个到两万个。
然而，在正常献血者和早期癌症患者的血液中没有发现这样的细胞集落。而且，纤维蛋白纤维(图4E)，塑料刮片(图4F-G)，纯化的棉纤维(图4H-I)，和I型胶原纤维(图5A-H)捕获的循环性癌细胞能在培养基中生长并表现出上皮细胞的形态。这些材料的表面吸附了血源性细胞粘附分子，这些分子随后促进了癌细胞的粘附和扩散(见上面表II)。通过包被的胶原基质与抗纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白的单克隆抗体一起孵育，进一步证明了细胞粘附分子的作用。这种处理降低了基质捕获细胞的能力。
图5A-H显示当血源性粘附分子存在时，循环性细胞和它们下面的以I型胶原为基础的细胞粘附基质的形态学特点。这些癌细胞在接触后的10分钟到60分钟之内优先地粘附于胶原性基质。然后，降解并摄取基质，在平的底层产生空洞，随后迁移到塑料表面并生长(图5A-D；6A-D)。此类癌细胞在大多数正常献血者(图7A)、良性肿瘤患者(图7B)，或者正在接受化疗的癌症患者(图7C-D)的血液中不存在。新鲜分离的循环性癌细胞在形状上比较小，但比基质上同时分离的大部分单核细胞大(图6A)。这些推定的癌细胞生长迅速，在形态上变得更大，4天培养就具备了上皮形状(图5A-D；6A-D)。但是，同时分离的白细胞较小，培养基中数量减少(图5A-D)。另外，用细胞粘附基质从头颈鳞状细胞癌(SCCHN)活检组织中(图5E-F)分离的极少数癌细胞表现出侵袭性表型或循环性癌细胞的生长特点，这说明循环性癌细胞代表了转移性癌细胞群体中的一个独特亚群。在这种SCCHN组织中，它们是能侵入胶原凝胶并在培养基中繁殖的成纤维细胞(图5E-F)。需要指出的是，细胞分离系统捕获的是那些保持有活力的细胞，例如，那些保持着粘附力的细胞，而不是那些在循环中或是在实验操作过程中已被破坏的细胞。
如同光学显微镜和透射电子显微镜测量(图5E-H)所确定的那样，胶原性基质的厚度估计约为100μm。聚集的胶原能够在10分钟到1个小时内捕获混合细胞群中的癌细胞，混合细胞群指血液或组织活检产生的细胞悬液。基质捕获的细胞在一至两个星期的孵育中可以进一步侵入基质，而在基质表面留下一些非侵袭性细胞，这些细胞不会繁殖(图5E-F)。聚集的胶原纤维是直径为70nm的精细的线，与烃的胶原束具有相似的外观，但是没有胶原-条带模式(图5G-H)。
6.2.4循环性癌细胞的功能性和免疫表型特征
基质捕获的上皮细胞的功能和免疫表型特征与那些新生瘤细胞的特点一致。为了评估这些细胞的侵袭性表型特征，用罗丹明-胶原基质分析从癌症患者血液中分离的细胞，分析这些细胞的粘附、降解和吸收罗丹明-胶原底层的能力。图8A-I显示推定的癌细胞所表现出的广泛的胶原-降解/摄取活性(Col+)；这些细胞也表现出癌细胞的免疫学和形态学特征(参照下述内容)。
为了确定癌细胞的性质，分析了用罗丹明-胶原基质从癌症患者血液中分离的细胞，使用抗上皮细胞特异性抗原(ESA)、上皮细胞膜抗原(Muc-1)和细胞角蛋白4，5，6，8，10，13，和18(PCK)的抗体进行免疫细胞化学分析，推测这些细胞的上皮来源。这些ESA+，Muc-1+或PCK+反应阳性细胞是上皮源性细胞，因而，与它们的转移性相一致。用细胞型特异性单克隆抗体(例如那些抗上皮细胞、癌细胞、内皮细胞、外周血干细胞或者白细胞的抗体)染色基质上的包括富集的癌细胞在内的粘附性细胞。粘附性细胞是上皮细胞标志阳性细胞(图8E，G，J，K)，而且能够摄取胶原片段，Col+(图8B，C，F，I，L)。
循环性癌细胞在大多数正常献血者的血液中(图8L)、良性肿瘤患者或者正在接受化疗的癌症患者的血液中很少见。与其他免疫细胞化学分析相类似，可取癌症患者血液中的单核细胞(从基质中释放出来的)作为荧光-激活的细胞分选(FACS)的对象。
6.2.5循环性癌细胞获得内皮细胞表型
除了侵袭性以外，在循环中的转移性癌症细胞还具有明显的新血管生成能力。利用一个细胞粘附基质从癌症患者的血液中分离出来的循环性癌细胞必然获得内皮细胞的特征。这些头颈鳞状细胞癌(HN，图9A-C；9I-J)，结肠癌(CC，图9D-E)和前列腺癌(PC，图9G-H)的细胞是Col+染色(图9 C，F)，用内皮细胞的表型，包括von Willebrand因子或第VIII因子(F8)(图9B，E)和CD31(图9d)阳性，掺入乙酰化低密度脂蛋白(LDL)显示了内皮细胞的能力(图9H，J)以及上皮细胞表面抗原(图9G中的ESA)。此外，当分离的癌细胞被内化并被低密度脂蛋白荧光素标记，然后接种在厚0.5mm的胶原凝胶上时，它们显示出增强的内皮细胞分化特点，包括形成细胞网络和管状结构(图9K，L)。这些结构主要由低密度脂蛋白标记的癌细胞组成。此外，循环性癌细胞还表现出其它内皮细胞特点，包括表达血管内皮生长因子Flk-1和VE-钙粘连蛋白的受体，并且不丢失以前所表达的上皮细胞标志。这种血管生成能力仅仅限于那些进入循环系统的癌细胞，而不出现于留在肿瘤组织中的细胞。这种血管生成表型的空间限制反映了循环性癌细胞所特有的功能性能力：向外渗透、侵袭定居与血管生成合作，从而导致微小转移灶的形成。
6.2.6循环性癌细胞培养时受到免疫免疫力杀伤和生长
循环性癌细胞与表达白细胞共同抗原CD45和T-细胞标志CD8的白细胞(WBC)可形成集落。细胞粘附基质能够很容易地把表现出良好预后的癌症患者的这种免疫细胞和癌细胞的复合物选出的集落分离出来。尽管循环性癌细胞的总数可能预示着转移的可能性，但是，(图10A-1)与细胞代谢WBC反映的癌细胞的数量或者自身免疫性抗癌抗体介导的补体溶细胞作用(图10J-L)表明宿主具有抗转移免疫力。在这些表现出良好预后的癌症患者中，大多数癌细胞受到白细胞的攻击，培养一天后变成了碎片，只有少数癌细胞集落生长(图10F-1)。此外，抗癌抗体介导的补体溶细胞作用可发生于大部分癌症患者体内。对癌细胞的这种杀伤在这里是通过以10％的自身血浆培养同一癌症患者血液分离的BLC细胞来证明的(图10J-K)，但正常献血者血浆中则不行(图10L)。癌细胞是否发生溶细胞可通过裂解细胞中黑暗相物质的形态来确定(图10J-L)。
重要的是，大约97％的从血液中新鲜分离出的细胞是凋亡细胞，这可用Molecular Probe Inc.的凋亡和细胞溶解测定试剂盒作荧光染色来确定。虽然有些癌细胞可以在培养基中繁殖两个月，但是大多数癌细胞在分离后立刻表现为凋亡或者溶胞，这意味着癌细胞被宿主的免疫力所杀灭。大部分白细胞在一个星期以后从培养基中消失，留下癌细胞的集落或群落(图10F-L)。这样，能抵抗免疫杀伤力的活性和侵袭性癌细胞的数量就成为高度转移性患者最有力的指标。
6.2.7循环性癌细胞的计数
如上所述，分析了使用细胞分离方法而分离的循环性癌细胞的侵袭性、上皮特性、血管生成特性和对宿主免疫力的抗性。结果使用带有索尼DKC5000的3CCD图象处理系统的计算机化Nikon倒置显微镜来记录。用这种细胞分离法和本发明试验方法计数全血或白细胞层中的癌细胞数目提供了最高的敏感度和分辨率。检测了200多名前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌、淋巴瘤、肾和睾丸癌、肝癌或胰腺癌以及其他胃肠道癌症患者的样品。明确为Col+，LDL+，ESA+，Muc-1+，PCK+，F8+，或CD31+的循环性癌细胞在转移性癌症患者全血中为每毫升两千到两万。通过这项研究，估计在可能发生转移的癌症患者的循环系统中有大约8个到8千万个的活性癌细胞。分辨率比以前基于抗体的方法高出100倍以上(Racila，E.，Euhus，D.，Weiss，A.J.，Rao，C.，McConne11，J.，Terstappen，L.W.，和Uhr，J.W.1998，血液中癌细胞的检测和特性分析，1995年美国国家科学院论文汇编，4589-4594)。然而，从这项研究所估计的转移细胞的数量仅仅代表早期调查所报道的循环性癌细胞总数的0.1％.(Glaves et al.，1988，Br.J.癌症57：32-35)。
7.实施例：胶原基质上成纤维细胞迁移规律依赖于新的细胞表面蛋白酶复合物
以下信息表明，迁移性成纤维细胞的侵入性伪足上形成的新的蛋白酶复合物(包含丝氨酸膜内在蛋白酶(SIMP)，包括seprase，二肽基肽酶IV(DPPIV))与胶原基质中的细胞侵袭和迁移相关。
7.1材料和方法
7.1.1细胞培养
人胚肺成纤维细胞系WI38和人乳腺癌细胞系MDA-MB-436由美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得。细胞培养在1∶1混合的DMEM和RPMI1640中，其中还补充了10％小牛血清，5％Nu血清(Collaborative Research Inc.，Bedford，MA)，2mM L-谷氨酰胺，1单位/毫升青霉素，10μg/ml链霉素，0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠。大鼠单克隆抗体E26，E19和F4针对人胎盘DPPIV，大鼠单克隆抗体D8和D28针对人胎盘seprase(Goldstein LA et al.，1997，Biochim.Biophys.Acta.1361：11-19；Pinereiro-Sanchez，ML et al.，1997，J：Biol.Chem.272：7595-7601；correction(1998)J：Biol.Chem.272：13366)，单克隆抗体C27针对人黑色素瘤β1整联蛋白，大鼠单克隆抗体C37针对细胞表面糖蛋白gp-90(Meuller，SC.，et al.，1999，J.Biol.Chem.274：24947-24952)。小鼠抗av整联蛋白和抗β3整联蛋白单克隆抗体由美国典型培养物保藏中心(L230克隆，编号HB8448；AP-3克隆，编号HB242)获得。
7.1.2 SEPRASE-DPPIV复合物的分离
将W138细胞接种于含水的I型胶原膜上(大鼠尾部注射0.2mg/ml的I型胶原，Collaborative Biomedical Products，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)培养至90％铺满培养基。依照说明书用Suffo-NSH-生物素(Pierce，Rockford，IL)进行W138单层细胞的表面生物素化。为收集裂解液，每一细胞培养板用PBS洗3次，并用125 1/cm2的RIPA溶液(pH7.5的50mM Tris缓冲液配制的1.25％的乙基苯基聚乙二醇P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)提取。提取物在25℃以25rpm在旋转振荡器(Bellco Orbital Shaker，Vineland，NJ)上振荡2h。取出细胞层和缓冲液，转移至一50ml锥形管中，在4℃下进一步振荡孵育3h。以10,000xg的速度4℃离心20min以澄清该抽提物，用上清液进行免疫沉淀反应。
为了制备免疫亲和基质，将纯化的大鼠抗膜蛋白单克隆抗体(2.5mg)与1-mlCNBr-琼脂糖凝胶4MB(Pharmacal Biotech Inc.，Piscataway，NJ)交连。用0.25-ml单克隆抗体珠免疫沉淀复合物，此复合物由25-ml细胞提取物4℃振荡培养过夜得到。
用25ml抽提缓冲液洗涤3次后，将载体抗原抗体偶联复合物的微珠重悬于0.1％甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.4)中(缓冲液体积与微珠体积相同)，样品在4℃培养5min。然后，即刻将样品转移至Amicon过滤器中(0.45m 400l容量)，在4℃下以10,000rpm的速度在小离心管中离心10min。加入2M Trizma碱中和微珠过滤物。为了测定分离的蛋白复合物的亚单位组成，通过SDS-PAGE，然后转移至硝酸纤维素膜上，用HPR-链霉亲和素(Sigma，St.Louis，MO)和ECL系统(Amersham，St.Louis，MO)分析和检测表面生物素化复合物的免疫沉淀物。分离的蛋白复合物也可用于免疫印迹分析(使用抗seprase，-DPPI\I，β1和β3整联蛋白单克隆抗体)，明胶酶谱分析(检测seprase明胶酶活性)和DPPIV底物膜覆盖分析(Pinereiro-Sanchez，ML et al.，1997，J.Biol.Chem.272：7595-7601；correction(1998)J.Biol.Chem.272：13366)。为了检测蛋白是否完全从微珠上洗脱下来，可加入Laemmli样品缓冲液(与微珠体积相同)，然后将样品在微波炉中加热(低火加热2个循环，每次30秒，再用中火加热1个循环，30秒)。然后，即刻将样品在4℃下离心。滤出液进行上述试验。
7.1.3胶原纤维的标记
在生物素，荧光素或罗丹明标记之前聚合胶原，可以不致破坏聚合位点。然后将标记的胶原纤维溶解于酸化的水中(pH2.0)，但是在实验条件下可能很容易聚合回复至胶原纤维。具体地说，在4℃下，将10ml I型胶原溶液(大鼠尾部I型胶原，4.66mg/ml，Collaborative Biomedical Products，Becton和DickinsonLabware，Bedford，MA)与10ml DMEM混合。混合物在37℃下孵育30min，以使胶原纤维聚合(凝胶)。用30ml pH值为9.3的交联硼酸盐缓冲液(Sigma)洗涤凝胶30min，然后在振荡器上，在含有3mg Sulfo-NSH-生物素(Pierce)，荧光素异硫氰酸盐I盐酸(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)(Research OrganicsInc，Cleveland，OH)的30ml硼酸盐缓冲液中25℃振荡孵育。用PBS洗涤3次以终止偶联反应，然后用50ml PBS洗涤2天，再用50ml蒸馏水洗涤2天。将标记的胶原纤维溶解于酸化的水中(0.02N乙酸)至终浓度1mg/ml。将标记的胶原单体与等体积的DMEM或p缓冲液(300mM NaCl溶于50mM碳酸氢胺缓冲液中，pH8.4)混合，在37℃下孵育30分钟以使凝胶形成。
7.1.4细胞迁移和荧光胶原降解试验
荧光胶原纤维覆盖的单层创伤培养物可用于检验创伤愈合过程中细胞在胶原凝胶中的迁移。将WI38细胞培养在2孔盖玻片上(Lab-Tek，Rochester，NY)，至细胞铺满。用一移液头尖端刮擦细胞单层，以形成创伤边缘。
然后用DMEM配制的TRITC-胶原替代细胞培养介质(600μg/ml；50μl/孔)，37℃下在CO2培养箱中孵育30min以使培养物形成凝胶。
然后加入含有血清或抑制性单克隆抗体的培养基(300μl/孔)，可使用相差显微镜和荧光显微镜(Nikon倒置显微镜)实时观察培养基对细胞迁移和胶原降解的影响。可通过测量细胞迁移的面积和迁移性细胞清除的荧光胶原面积对细胞迁移和胶原降解作定量检测(可采用NIH成像1.62b4/脂肪分析程序)。
发展了上析试验的微量滴定方法来测量迁移性细胞引起的胶原降解。在96孔组织培养板中(Nunc，Rochester，NY)，先加入50μl/孔TRITC胶原溶液(600μg/ml)，37℃培养箱中培养30min使溶液胶凝。然后将含有2×105细胞和单克隆抗体(50μg/ml)的TRITC胶原溶液每孔50μl加到TRITC胶原凝胶上，37℃时于CO2培养箱中培养30min使培养物胶凝。然后用每孔补充150μl新鲜培养基。所有的培养基都需不含酚红。间或从每孔中取出100μl培养物用荧光微板读数仪测量TRITC-胶原肽的释放，544nm处激发，590nm处发射(MolecularDevices fMax：荧光微板读数仪)。加入亮氨酸以测定培养条件下细胞的代谢活性，其中含有2Ci/ml 3H-亮氨酸的培养基150μl/孔地加入培养物中，再将细胞-胶原层溶解于5ml闪烁液体中，在闪烁计数器中记数(Beckman LS-7500)。获得了组成型表达seprase和DPPIV的乳腺癌细胞系MDA-MB-436稳定转染体。依照说明书用脂质转染胺试剂(Gibco/BRL)，将质粒pAI 1(单独pCR3.1载体)，pA15(载体加全长seprase)和pZ8(DPPIV核酶构建物)转染入MDA-MB-436细胞系。选择培养基包含G418，浓度为300μg/ml。
7.1.5SEPRASE和DPPIV的免疫荧光标记
将WI38细胞在胶原凝胶中培养，使用罗丹明偶联的抗seprase单克隆抗体D28和荧光素偶联的抗DPPIV单克隆抗体E26(Meuller，SC，et al.，1999，J.Biol.Chem.274：24947-24952)，在一步中固定和免疫标记W138细胞。在Zeiss光显微镜III(Carl Zeiss公司)上落射荧光显下给染色的样品拍照，所用物镜为Planapo 25/1.2或63/1.4。
7.1.6人牙龈损伤和侵袭性人乳腺癌
人牙龈活检材料来自于芬兰Turku大学。全层厚度口腔粘膜损伤来自于两位健康志愿者，活检材料收集于损伤后第3，7，14和28天。活检之后，即刻将新鲜组织块包埋于Histoprep中(Fisher Scince，新泽西州)，并于液氮中迅速冷冻。制作冰冻切片(6μm)，-20℃丙酮固定5min，并保存于-70℃。如进行常规组织学检查，将切片用苏木素和伊红染色。如进行免疫组化染色，将切片用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma化学公司，St.Louis，M.O.)的PBS洗涤，潮湿柜中，与罗丹明偶联的抗seprase的单克隆抗体D28于4℃共同孵育16h。然后用PBS/BSA和水洗涤切片，空气干燥，使用氰基丙烯酸盐粘合剂(Krazy Glue，Borden有限公司)封固切片。
使用Zeiss Axioskop 20亮度，荧光和共焦显微镜检查染色情况，使用MC 80Zeiss显微照相机拍照。
用罗丹明偶联的第二抗体进行对照染色，未显示出特异性的染色。如上所述(Kelly T et al.，1998，Mod.Pathol.11：855-863)，进行侵袭性人乳腺癌的免疫组化染色。
7.2结果
显示的数据表明，与LOX人恶性黑色素瘤细胞(Pineiro-Snachez ML，1997，J.Biol.Chem.272：7595-7601)中的seprase类似，在WI38人胚胎成纤维细胞中的绝大多数的seprase和DPPIV在非离子型去污剂中以400kDa以上的复合物形式存在，去污剂例如Triton(辛基苯氧基聚乙氧乙醇)X-100，Triton X-114，含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的RIPA缓冲液，辛基葡糖苷，以及WGA琼脂糖亲和纯化的物质。在交联葡聚糖Sephacryl S-200凝胶过滤层析时洗脱的400kDa以上复合物位于外水体积组分中。分离WGA纯化的物质后，进行Superose 12凝胶过滤液相层析，显示出大约200kDa(片断17)，440kDa(片断14)和670kDa(片断13)(图11A)为主要形式。由于seprase包括一个97kDa的亚单位和DPPIV的110kDa的单体，而且seprase和DPPIV在非离子型去污剂(10)中都是二聚体，凝胶过滤数据显示seprase-DPPIV复合物出现在440-670kDa位置(图11B)。
用单克隆抗体D28(抗seprase)和单克隆抗体E19(抗DPPIV)的免疫沉淀在W138细胞提取物(已表面生物素化)中鉴定到两条主要的强度相似的条带(图12A)。这两条条带，经单克隆抗体D28或E19的交叉免疫沉淀，分别表明为seprase和DPPIV的二聚体。当样品溶解于1％的SDS而未沸时，免疫印迹方法在上述SDS凝胶中鉴定到200kDa处的顶部或较慢的条带为DPPIV，170kDa处下部或较快的条带为seprase(图12B)。在样品溶解于SDS之后，在SDS凝胶中未检测到350-400kDa的异质凝聚物(图12A，12B)，这表明异质凝聚物已分离为两个稳定的二聚体，分别为200kDa的DPPIV和170kDa的seprase。在包括RIPA细胞提取物的三个独立的实验中，用抗seprase和DPPIV的而不是抗ββ1和β3整联蛋白的单克隆抗体检测到seprase和DPPIV的稳定结合(图12A，12B)的抗体来检测。此外，这样的异质复合物可通过免疫法分离的复合物的蛋白水解活性来验证。用分别识别seprase或DPPIV的单克隆抗体D28或E19作亲和纯化从WI38 RIPA提取物中分离得到抗原，分析洗脱物为170kDa(seprase)的明胶酶(图12C)和200kDa(DPPIV)的脯氨酸-特异性二肽氨基肽酶(图12D)。明胶酶谱分析在抗seprase单克隆抗体D28的免疫沉淀物中(图12C，IP：seprase)或抗DPPIV单克隆抗体E19的免疫沉淀物中(图12C，IP：DPPIV)检测到170kDa的明胶酶活性。分离的DPPIV二聚体没有明胶酶活性，用DPPIV抗体在明胶酶谱图中鉴定到170kDa的条带，表明该复合物中有seprase存在。相似地，DPPIV底物覆盖试验检测到在抗seprase单克隆抗体D28(图12D，IP：seprase)或抗DPPIV单克隆抗体E19(图12D，IP：DPPIV)的免疫沉淀物中存在200kDa的脯氨酸-特异性二肽氨基肽酶活性。在av，a2，a6或β3整联蛋白或对照免疫沉淀物中，未观察到170kDa明胶酶或DPPIV活性。这些结果也证实了先前的观察结果，即seprase和DPPIV在SDS缓冲液中为均二聚体，它们对热(＞60℃)和酸敏感，在敏感条件下可分解为它们的单体亚单位。
所以，蛋白酶复合物似乎包含等量的seprase和DPPIV蛋白(图11A，11B，12A，12B)，并且在引发170kDa明胶酶和200kDa DPPIV二肽氨基肽酶活性方面同样有效(图12C，12D)。
为了测定在胶原凝胶中的细胞迁移和可能的胶原降解中seprase-DPPIV复合物的作用，我们将一薄层胶原铺在单层细胞创伤模型上进行形态学检查和铺在稀疏培养物上进行生化研究(图13)。细胞在胶原凝胶中的迁移和细胞对局部胶原的摄取可通过成像分析结合相差及荧光显微术，记数细胞迁移/胶原消失的区域面积来测量(图13A-13D)。将单克隆抗体E19(抗DPPIV)加入创伤闭合模型中，可阻止细胞迁移(图13B，13C)和细胞引起的局部胶原消失(图13D)，然而与类型(IgG)匹配的单克隆抗体却不能引起此种反应(图13B，13C，13D)。随着加入的单克隆抗体E19的增加，抑制作用也加强(图13B)，并且这种抗体抑制效应可以通过去除E19而逆转，所以，这种单克隆抗体是无毒的(图13C)。
而且，活化细胞引起的局部胶原降解，可通过采用荧光分光光度法测定96孔板稀疏培养物中WI38细胞从荧光胶原纤维中释出的荧光肽进行定量测定(图13E)。已知稀疏培养物中的细胞是迁移性的，这是由于较少的“接触性迁移抑制”(Chen，W-T，1979，J.Cell Biol 81：684-691)。在4天内迁移性WI38细胞显示出时间依赖性的胶原降解，并且单克隆抗体E19(抗DPPIV)抑制迁移性细胞的胶原降解，然而对照的单克隆抗体C37(抗gp-90)则不然(图13E)。这些表明了seprase-DPPIV复合物在创伤激活的成纤维细胞引发的胶原凝胶细胞迁移和胶原降解中的作用。
由于显示DPPIV是胶原的一种粘附受体(Bauvois B，1988，Biochem.J.252：723-731；Hanski C，1988，Exp.Cell Res.178：64-72；Loster K.，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.217：341-348)或纤连蛋白的粘附受体(Cheng，HC 1998，J.Biol.Chem.272：24207-24215；Johnson RC et al.，1993，J.Cell Biol 121：1423-1432；Piazza，GA et al.，1989，Biochem.J.262：327-334)，已确认单克隆抗体E19(抗DPPIV)对迁移性细胞引起的胶原凝胶中的细胞迁移和胶原降解具有抑制效应是由于该抗体对于粘附活性的影响。图14表明，在整联蛋白粘附和胶原纤维的平行比较中，尽管单克隆抗体E19(抗DPPIV)抑制了迁移性细胞引起的胶原凝胶中的细胞迁移和胶原降解，但并不影响WI38细胞在胶原底层上的扩散(图14A)和在胶原底层上的粘附(图14B)。然而，单克隆抗体C27(抗β1整联蛋白)可抑制W138细胞在胶原底层上的粘附和扩散，但是单克隆抗体E19(抗DPPIV)或单克隆抗体C37(抗gp-90)则不能(图14A和14B)。这些结果表明，β1整联蛋白也许是W138细胞上负责与seprase-DPPIV复合物的底物结合的主要胶原受体。
为了证明seprase和DPPIV与迁移性细胞的侵入伪足相关，进行了双标记免疫荧光实验(图15)。结果观察到胶原凝胶中迁移的细胞的侵入伪足(a)为抗seprase的TRITC-单克隆抗体D28(b)染色阳性，或抗DPPIV的FITC-单克隆抗体E26(c)染色阳性。叠加的影像也表明，seprase和DPPIV共同定位于在胶原凝胶中迁移的WI38成纤维细胞的侵入伪足中(d)。
为了检验是否能够在体内找到这样的seprase和DPPIV共同定位现象，在系列甲醛固定、石腊包埋的人乳腺癌组织切片上进行免疫组化实验(图16和18)。与侵袭前沿的癌细胞相似，人侵袭性乳腺癌中的结缔组织细胞，与抗seprase单克隆抗体D28或抗DPPIV单克隆抗体E26起强烈反应(图16，箭头所示)。然而，在远处正常组织的结缔组织细胞中检测到这样的seprase和DPPIV的染色(图18)。很可能，在对肿瘤侵袭的反应中，seprase-DPPIV的表达与结缔组织细胞的激活有关；而且，seprase和DPPIV不仅共同定位于侵袭性癌细胞，也共同定位于这些激活的组织细胞。
与培养基的人脐带平滑肌细胞不同(Goldstein LA et al.，1997，Biochim.Biophys.Acta.1361：11-19)，在人胚胎组织包括胎盘和脐带中，seprase和DPPIV都优先地分布于间叶细胞中，但不分化为大血管的肌细胞和内皮细胞。为了确定在体内损伤愈合过程中是否引起基质成纤维细胞中表达seprase和DPPIV，进行了人牙龈粘膜伤口愈合的免疫组化实验(图17)。在创伤后3天，在结缔组织细胞中可观察到seprase和DPPIV的强烈表达(b-d，g)。在毗邻的正常粘膜组织中则未观察到免疫反应。在血纤蛋白凝血区和上皮组织中未观察到特异性的反应。共焦显微镜观察表明，seprase(d)和DPPIV定位于结缔组织细胞的突起，这表明体内存在侵入性伪足。稍后，创伤后7天，在肉芽组织中只有少量细胞与抗seprase抗体(f)发生反应，但不与抗DPPIV抗体(h)反应。一周后，结缔组织细胞中的seprase和DDPIV染色消失，创伤后14天或28天的细胞也不与抗体反应。数据表明，seprase和DDPIV是成纤维细胞，内皮细胞和癌细胞的激活酶，它们可能参与细胞迁移所必需的局部胶原降解过程。
采用细胞转染实验研究了seprase和DDPIV的细胞表面联系。使用了组成性表达seprase-DPPIV复合物的MDA-MB-436乳腺癌细胞。检测了过表达seprase的细胞或DPPIV或seprase产物缺陷型细胞的胶原降解和迁移活动情况(图19)。与亲本或载体转染细胞相比(图19A；亲本，pAII)，在用编码seprase的质粒pA15转染的MDA-MB-436细胞中观察到TRITC-胶原肽释放的增加(图19A，pA15)，在经编码DPPIV特异性核酶的构建物转染的细胞中观察到肽释放的减少(图19A，pZ8)。而且，seprase的过表达似乎与DPPIV的轻微减少有关，用DPPIV核酶转染的细胞未产生可检测到的DPPIV，并大量减少了seprase(图19B)。
现在的发明并不局限于此处所描述的特定的例证范围之内，这些例证只是为了说明发明的各个方面，功能上等同的方法和组成部分在发明的范围之内。事实上，发明的各种修正，以及那些此处表现和描述的内容，都将从前述的内容和相关的图表中给人以启发。这样的修正都将在权利要求的范围之内。本发明对此处引用的各种出版物的全文进行了参考。

Claims (21)

1.一种检测受试者体内是否存在癌细胞的方法，包括：
(1)将取自上述受试者的样品接种于包被有粘附分子的基质上；
(2)将样品孵育足够长的时间以让癌细胞粘附在细胞粘膜基质上；
(3)检测是否有癌细胞与基质结合，
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品为血液样品。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品为组织样品。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述基质包含天然材料，所述天然材料包括胶原，纤维蛋白和棉纤维。
5.一种检测癌症患者的癌细胞是否具有转移性的方法，包括：
(1)将癌症患者的癌细胞接种于包被有粘附分子的基质上；
(2)将癌细胞孵育足够长的时间以让癌细胞粘附，摄取或侵入基质；
(3)检测癌细胞对基质的粘附、摄取或侵入；如检测到癌细胞对基质有粘附、摄取或侵入，则表明癌细胞具有转移性。
6.一种鉴定能抑制癌细胞转移性的药物的方法，包括：
(1)将癌细胞和待测药物或和载体对照与包被有粘附分子的基质接触；
(2)将此基质孵育足够长的时间以让癌细胞粘附和摄取基质；
(3)检测癌细胞对基质的粘附和摄取；如果在待测药物存在的情况下癌细胞对基质粘附及摄取的程度低于仅载体存在的情况下，表明该化合物能抑制转移。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述的基质荧光标记。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述的基质以放射活性同位素标记。
9.抑制癌细胞转移活性的组合物，它是用权利要求6所述方法鉴定的。
10.抑制患者体内癌细胞的转移活性的方法，包括给予seprase抑制剂。
11.抑制患者体内癌细胞的转移活性的方法，包括给予二肽基肽酶IV抑制剂。
12.鉴定能抑制癌细胞转移性的核酸的方法，包括：
(1)将核酸分子引入癌细胞样品；
(2)将所述癌细胞样品接种到包被有粘附分子的基质上；
(3)将此基质与癌细胞孵育足够长的时间以让癌细胞粘附和摄取基质；
(4)检测癌细胞对基质的粘附与摄入情况；如果含有该核酸分子的癌细胞对基质的粘附与摄入程度低于不含该核酸分子的癌细胞，表明该核酸分子能够抑制癌细胞的转移性。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的核酸分子是反义分子。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述的反义分子是seprase的反义核酸。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述的反义分子是一种二肽基肽酶IV的反义核酸。
16.除去癌症患者样品中癌细胞的方法，包括将样品与包被有粘附分子的基质接触足够长的时间以让癌细胞粘附于细胞粘附基质上。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的样品是腹水，淋巴液，肿瘤或尿液组织样品。
18.除去患者血液中的癌细胞的方法，包括将所述血液与包被有粘附分子的基质接触足够长的时间以让癌细胞粘附于基质上。
19.如权利要求18所述的方法，其中将已除去了癌细胞的血液样品重新回输给患者。
20.除去患者骨髓中癌细胞的方法，包括将骨髓与包被有细胞粘附分子的基质接触足够长的时间以让癌细胞粘附于细胞粘附基质上。
21.如权利要求20所述的方法，其中将已除去了癌细胞的骨髓重新回输给患者。
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