CN102414565A

CN102414565A - 作为癌症的标记物的DPPIV/Seprase的用途

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Publication number: CN102414565A
Application number: CN2010800198578A
Authority: CN
Inventors: M.斯维亚特克-德朗格; J.卡尔; W.罗林格
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2009-05-04
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2030-04-26
Also published as: CN102414565B; JP2012526267A; JP5312684B2; CA2760735A1; WO2010127782A1; CA2760735C; ES2533428T3; EP2427772B1; EP2427772A1; HK1169168A1

Abstract

本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了“可溶性DPPIV/Seprase蛋白质复合体”(=DPPIV/Seprase)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。DPPIV/Seprase的测量可以例如用于癌症的早期检测或诊断或用于经历手术的患者的监测。

Description

作为癌症的标记物的DPPIV/Seprase的用途

描述

癌症仍然是主要的公共卫生挑战，尽管在检测和治疗上已取得进步。癌细胞以癌症相关标记蛋白的产生为特征。在携带癌细胞的个体的组织和体液中都发现了癌症相关蛋白。它们的水平在致癌性进展的早期通常很低，在疾病的进展过程中增加，并且只在极少的情况下观察到蛋白在疾病进展过程中显示降低的水平。此类蛋白的灵敏检测是用于诊断癌症（特别地在癌症的早期诊断中）的有利的和有前景的方法。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。

用于实体瘤的最重要的治疗方法是：

a)肿瘤的手术切除，

b)化学疗法,

c)放射疗法，

d)使用生物学如抗肿瘤抗体或抗血管生成抗体的疗法和

e)上述方法的组合。

肿瘤的手术切除已被广泛接受为早期实体瘤的一线疗法。然而，大多数癌症只有当它们显示症状，即当患者已处于疾病进展的相当晚期时才被检测到。

癌症的分期是根据程度、进展和严重度对疾病的分类。其将癌症患者分类，这样可对治疗的预后和选择进行归纳。

按照Dukes的分期A至D将BC或CRC的不同分期用于分类。今天，TNM系统是最为广泛使用的癌症的解剖学范围的分类。其代表了国际上接受的统一的分期系统。存在3个基本变量：T(原发性肿瘤的范围)、N(区域淋巴结的状态)和M(远端转移的存在或不存在)。TNM标准由UICC (国际防癌联盟（International Union Against Cancer）), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, 第6版，2002)公布。一旦TNM状态被确定，患者则被分类至由范围从I至IV（IV是最晚期疾病的分期）的罗马数字表示的疾病分期。TNM分期和UICC疾病分期彼此相应，如取自Sobin L.H.和Wittekind (eds.)（同上）的下表中所示的。

TNM 分期与 UICC 疾病分期的相互关系

UICC 疾病分期	T 分期	N 分期	M 分期
				0期	Tis	N0	M0
I期	T1, T2	N0	M0
				IIA期	T3	N0	M0
IIB期	T4	N0	M0
				IIIA期	T1, T2	N1	M0
IIIB期	T3, T4	N1	M0
				IIIC期	任何T	N2	M0
IV期	任何T	任何N	M1

尤其重要的是癌症例如BC或CRC的早期诊断转变为好得多的预后。在CRC中，结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即来自腺瘤。因此，最佳预后使患者在腺癌期被诊断。早在T_is、N0、M0或T1-3; N0; M0期被诊断的患者，如果经适当治疗，与对于当远端转移已存在时诊断的患者只有10%的5年存活率相比较，在诊断后具有90%以上的机会存活5年。

目前的检测方法（包括成像方法，例如X射线或核共振）在理论上可能至少部分适合用作一般筛查工具。然而，它们极其昂贵，因而对于卫生保健系统来说不能承担其在大量受试者（特别对于无任何肿瘤症状的受试者）的普查中普遍和广泛的使用。

因此，本发明的目的是提供简单且成本效率的肿瘤评估方法，例如以鉴定怀疑患有癌症的个体。为此目的，可在体液例如血液或血清或血浆中检测到的一般肿瘤标记物或一组此类标记物将是令人期待的。

许多血清肿瘤标记物已用于临床应用。例如cytoceratin 19的可溶性30 kDa 片段(Cyfra 21-1)、癌胚抗原（carcinoembryogenic antigen）(CEA)、神经元特异烯醇化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个满足筛查工具所需的灵敏度和特异性标准(Thomas, L., Labor和Diagnose TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany(2000))。

为了具有临床效果（clinical utility），作为单个标记物的新型诊断标记物应当可与本领域内已知的其他标记物相当，或更好。或者，如果分别地将新型标记物单独使用或与一个或更多个其他标记物组合使用，其应当导致诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好通过其受试者工作特性（将在下面进行详细地描述）评估检测的诊断灵敏度和/或特异性。

全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。可有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标记物的鉴定可导致可大大促进该疾病的诊断和管理的方法。因此，存在提高癌症，特别地LC或CRC的体外评估的紧迫临床需要。提高癌症例如LC或CRC的早期诊断尤其重要，因为对于早期诊断的患者，存活的机会与在疾病的晚期（progressed stage）诊断的患者相比要高得多。

最近已对肺癌中生物化学标记物的临床功用进行了综述。(Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262)。

Cyfra 21-1目前被认为是当前已知的肺癌肿瘤标记物中最好的标记物。即使这样，也未在肺组织中显著地发现其器官特异性。Cyfra 21-1对于肺癌的灵敏度在95%的针对其他良性肺病的特异性下被描述为在46至61%之间。增加的Cyfra 21-1血清水平还与明显的良性肝疾病、肾功能不全和浸润性膀胱癌相关。Cyfra 21-1检测被推荐用于术后治疗监测。

CEA属于胎儿癌性抗原类群，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的并且主要用于结直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有几种良性疾病例如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫疾病与增加的CEA血清水平相关。在对于良性肺疾病95%的特异性下，其对于肺癌的灵敏度据报导为29-44%。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。

FERR（铁蛋白）是含有约20%铁的蛋白质并在肠、肝和脾中发现。其是铁在身体中储存的主要形式之一。据报导体内的铁储存增加结肠直肠肿瘤的风险。在Scholefield, J.H. 等人 (Dis. Colon Rectum 41 (1998) 1029-1032)的使用来自148位患者（50位患者具有确诊的结直肠癌，49位患者没有结肠疾病，和具有结肠腺癌的患者）的样品的研究中测定了血清铁蛋白。在3组的任意组之间在血清铁蛋白水平上没有显著差异。

OPN（骨桥蛋白）是特异性针对骨的细胞结合唾液蛋白(Kiefer, M.C. 等人, Nucl. Acids Res. 17 (1989) 3306)。骨桥蛋白(Oldberg, A. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 8819-8823; Oldberg, A. 等人, J. Biol. Chem. 263 (1988) 19433-19436)又称转化相关分泌磷蛋白(Senger, D.R. 等人, Anticancer Res. 9 (1989) 1291-1299)，或早期T淋巴细胞活化因子-1(Patarca, R. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 2736-2739)，其是由骨(Oldberg 等人, J. Biol. Chem. 263 (1986) 19433-19436)，活化的T淋巴细胞(Patarca, R. 等人, J. Exp. Med. 170 (1989) 145-161; Patarca, R. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 2736-2739)，巨噬细胞(Singh, R.P. 等人, J. Exp. Med. 171 (1990) 1931-1942)，血管系统的平滑肌细胞(Giachelli, C. 等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177 (1991) 867-873)，以及癌和肉瘤(Senger, D.R. 等人, Anticancer Res. 9 (1989) 1291-1299)表达的分泌的糖基化磷蛋白。

Seprase，最初被鉴定为170 kDa的膜结合明胶酶，是在高度侵略性的黑色素瘤LOX细胞的侵略性伪足上表达(Aoyama, A.和Chen, W.T., PNAS 87 (1990) 8296-8300; Mueller, S.C. 等人, J. Biol. Chem. 274 (1999) 24947-24952; Monsky, W.L. 等人, Cancer Res. 54 (1994) 5702-5710)。活性酶是2个亚基的同源二聚体(Pineiro-Sanchez, M.L. 等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park, J.E. 等人, J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。从编码97 kDa亚基的cDNA推断的氨基酸序列的分析(Goldstein, L.A. 等人, Biochem. Biophys. Act. 1361 (1997) 11-19)揭示其与成纤维细胞激活蛋白α (FAPα)基本相同 (Scanlan, M.J. 等人, PNAS 91 (1994) 5657-5661)，其在上皮癌和愈合中的创伤的反应性基质成纤维细胞上表达(Garin-Chesa, P. 等人, PNAS 87 (1990) 7235-7239)。

NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶；Swiss-PROT: P40261）具有29.6 kDa的表观分子量和5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其他嘧啶的N-甲基化。此活性对许多药物和异生物质化合物的生物转化很重要。据报导此蛋白质在肝中显著地表达并定位在细胞质中。NNMT已从人肝的cDNA中被克隆并含有792个核苷酸的开放阅读框，所述阅读框编码具有29.6 kDa的计算分子量的264个氨基酸的蛋白质(Aksoy, S. 等人, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840)。在文献中有关酶在人癌症中的潜在作用所知甚少。在一篇论文中报导将提高的肝NNMT酶活性作为小鼠中癌症恶病质的标记物(Okamura, A. 等人, Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656)。在最近的一个报导中，证明了在放射敏感的细胞系中NNMT基因应答放射的下调(Kassem, H.S. 等人, Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460)。最近发现(WO 2004/057336)NNMT在CRC的评估中引人关注。

关于标记物特征和针对提高的肺癌的诊断，公布了使用基于模糊逻辑学的分类算法来组合Cyfra 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)（其为一般炎症标记物）的血清水平的方法(Schneider, J. 等人, Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者报导了在95%的特异性下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如Cyfra 21-1作为单个肿瘤标记物的灵敏度据报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中报导的显著更高。Duffy, M.J., in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262报导了46%至61%的灵敏度。由Schneider等人获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体包括许多晚期分期。第二且更至关重要地，在用于模糊逻辑限定词的确定的训练集的样品上检查算法的性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”并且不用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。NSE是SCLC的肿瘤标记物。通常，发现增加的NSE血清水平与神经外胚层和神经内分泌肿瘤相关。在患有良性肺病和脑病例如脑膜炎或其它脑部炎性疾病以及对头部进行创伤性损伤的患者中，也发现增加的血清水平。尽管在95%特异性下，SCLC的灵敏度被报道为60-87%，但是NSE测试NSCLC的性能比较差（灵敏度为7-25%）。NSE被推荐为SCLC的治疗监测。

PSE3基因最初在1990年被分离并且对应的蛋白质被称为Ki。患有系统性红斑狼疮（SLE）的患者产生针对若干核抗原的自身抗体，Ki是这些核抗原中的一种。Nikaido 等人 (Nikaido, T. 等人, Clin. Exp. Immunol. 79 (1990) 209-214)分离了对应的cDNA，通过使用牛cDNA作为探针和筛选SLE患者的cDNA文库。后来发现重组的Ki激活蛋白酶体，并将此蛋白质鉴定为PSE3(Realini, C. 等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 25483-25492; Tanahashi, N. 等人, Genes to Cells 2 (1997) 195-211)。Tanahashi, N. 等人（见上）也描述了针对P28λ，即针对PSE3的抗体。Miyagi, T. 等人 (Journal of Gastroenterology and Hepatology 18 (2003) 32-40)报导在人结肠癌细胞中蛋白酶体亚基和人白细胞I类抗原的表达受损。PSE3在甲状腺癌中，特别是在其加速生长的细胞中异常地高表达，如通过免疫组织化学染色和蛋白质印迹估计的(Okamura, T. 等人, J. Clin. Endocrin. Metab. 88 (2003) 1374-1383)。

S100A12又称CAAF1；CAGC；羊水中的钙结合蛋白；钙粒蛋白相关蛋白；CGRP；羊水中的钙结合蛋白1；钙粒蛋白C；ENRAGE（新鉴定的细胞外RAGE结合蛋白）；中性粒细胞S100蛋白；S100钙结合蛋白A12。此基因编码的蛋白质是含有2个EF-手钙结合基序的S100蛋白质家族的成员。S100蛋白定位在细胞质中和或范围广泛的细胞的细胞核中，并涉及若干细胞过程例如细胞周期进程和分化的调节。S100基因包括至少13个成簇位于染色体滤器1q21上的成员。推测此蛋白质涉及特异性钙依赖的信号转导途径并且其对细胞骨架成分的调节作用可能调节多种中性粒细胞活性。

CYBP（S100A6）是属于S100蛋白家族的钙结合蛋白（在Zimmer, D. B. 等人, Brain Res. Bull. 37 (1995) 417-429和Heizmann, C. W. 等人, Biometals 11 (1998) 383-397中综述）。发现其基因是基于其细胞周期依赖性表达(Calabretta, B. 等人, J. Biol. Chem. 261 (1986) 12628-12632)。在细胞周期的G0至S期的转换期间此基因的表达处于其最高水平，但此表达在急性骨髓性白血病中不受调节(Calabretta, B. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986) 1495-1498)。此蛋白最早从埃利希腹水瘤(EAT)1细胞中被纯化和表征(Kuznicki, J. 等人, Biochem. J. 247 (1987) 663-667,和Kuznicki, J. 等人, Biochem. J. 263 (1989) 951-956)。后来发现钙周期蛋白在成纤维细胞和上皮细胞中，在具有高增殖活性的细胞中和经历分化的细胞中以高水平表达(Leonard, D.G. 等人, Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 3156-3167; Guo, X. J. 等人, Cell Growth Differ. 1 (1990) 333-338; Tonini, G. P. 等人, Cancer Res. 51 (1991) 1733-1737; Kuznicki, J. 等人, Exp. Cell Res. 200 (1992) 425-430)。

ASC，“含有半胱天冬酶相关募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白”，又称“甲基化诱导沉默因子1的靶”(TMS1) (Swiss-PROT: Q9ULZ3)。半胱天冬酶相关募集结构域（CARD）介导衔接蛋白例如APAF1（凋亡蛋白酶活化因子1）和参与凋亡的半胱天冬酶前体（例如CASP 9）之间的相互作用。ASC是含有CARD的衔接蛋白家族的成员。

NSE：以多种二聚体同种型存在的糖解酶烯醇酶，其包含3个免疫学上不同的亚基，称为α、β和γ。烯醇酶亚型αγ和γγ，其被称为神经元特异性烯醇酶（NSE）或γ-烯醇酶主要在神经元和神经内分泌细胞以及来源于上述细胞的肿瘤中可以高浓度被检测到(Lamerz R., NSE (Neuronen-spezifische Enolase), γ-Enolase, In: Thomas L (编) Clinical Laboratory Diagnosis, TH-Books, Frankfurt, 英文第一版 1998: 979-981, 5. deutsche Auflage 1998:1000-1003)。NSE被描述为在监视小细胞支气管癌中的首选标记物(Lamerz R., NSE (Neuronen-spezifische Enolase), γ-Enolase, In: Thomas L (编) Clinical Laboratory Diagnosis, TH-Books, Frankfurt, 英文第一版 1998: 979-981, 5. deutsche Auflage 1998:1000-1003)。在60-81%的小细胞支气管癌的情况中发现升高的NSE浓度。

CA 19-9(碳水化合物抗原19-9)，糖脂上的唾液酸化Lewis (a)抗原是胃肠癌的肿瘤标记物。其存在于胎儿胃、肠和胰腺上皮细胞。在成年人肝、肺和胰腺组织中也可发现低浓度的CA 19-9。在肿瘤块和CA 19-9测定值中没有相关性，因此CA 19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。因为黏蛋白仅通过肝分泌，有时即使轻微的胆汁郁积可导致明显升高的CA 19-9血清水平。在那些具有确认的胰腺癌患者中，标记物主要用于辅助检测疾病状态（灵敏度70-87%）。3-7%的人群具有Lewis a-阴性/b-阴性血型构成，不能够表达具有反应性的决定物CA19-9的黏蛋白。在对发现进行解释时必须考虑这一点。

在高百分比的上皮来源非粘液性卵巢瘤中发现CA 125并可在血清中检测到。卵巢癌占妇科肿瘤的约20%。尽管最高的CA 125值发生在患卵巢癌的患者中，在子宫内膜、乳腺、胃肠道恶性肿瘤和各种其他恶性肿瘤中也观察到明显升高的值。有时在各种良性妇科疾病例如卵巢囊肿、卵巢组织转化、子宫内膜异位、子宫肌瘤或子宫颈炎中发现提高的值。此标记物的轻微升高还可发生在怀孕早期和各种良性疾病中（例如急性和慢性胰腺炎、良性胃肠疾病、肾功能不全、自身免疫疾病等等）。显著升高的水平已在良性肝疾病例如肝硬化和肝炎中发现。极端升高可发生在由恶性和两性疾病引起的任意种类的腹水中。尽管CA 125是相对非特异性的标记物，它是目前最重要的肿瘤标记物，用于监视具有严重卵巢恶性肿瘤的患者的治疗和进展。在82-93%特异性下，据报道灵敏度为69-79%。

p53（TP53，细胞肿瘤抗原p53，肿瘤抑制因子p53或磷蛋白p53）是诱导细胞生长停滞或凋亡的转录因子(Appella, E. 等人, Pathol. Biol. 48 (2000) 227-245)。P53担当许多肿瘤类型中的肿瘤抑制因子并且在其基因中的失活突变是在人中促进癌症发展的最常见基因事件(在Olivier, M.and Petitjean, A., Cancer Gene Ther. 16 (2009) 1-12; Petitjean, A. 等人, Oncogene 26 (2007) 2157-2165中综述)。在40-50%的结直肠癌中观察到p53突变，且其与癌的侵略性相关(Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。在p53基因中的突变不仅导致蛋白质功能的破坏，而且导致肿瘤相关抗原（TAA）的表达和自身免疫应答的起始和特异性抗-p53自身抗体在癌症患者的血清中的产生(Zhang, J.Y. 等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143; Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。在人血清中检测抗-p53自身抗体是用于诊断和控制癌症的新兴工具。取决于癌症类型，血清中抗-p53自身抗体的频率范围从17.8% (CRC)至16.1 % (LC)和7.8% (乳腺癌) (Tan, E.M., Immunological Reviews 222 (2008) 328-340; Zhang, J.Y. 等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143)。

本发明的目的是研究是否可鉴定可用于评估癌症疾病的生物化学标记物。特别地，本发明的发明者研究是否可在体液中鉴定用于评估不同癌症类型例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌的生物化学标记物。在本发明的非常优选方面，研究了用于肺癌（LC）或结直肠癌（CRC）的评估的生物化学标记物的鉴定。

令人惊讶地，已发现DPPIV/Seprase的使用可至少部分地克服现有技术中目前已知的标记物的一些问题。

发明概述

本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量液体样品中a）可溶性二肽基肽酶IV/seprase蛋白质复合体（=DPPIV/Seprase），b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示癌症。

本发明还涉及DPPIV/Seprase在癌症的评估中的用途。

本发明还涉及针对可溶性DPPIV或可溶性Seprase的抗体组合在癌症的评估中的用途，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示癌症。

本发明还公开了包含DPPIV/Seprase和任选地一种或多种其他癌症标记物的标记物组在癌症的评估中的用途，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示癌症。

本发明还涉及用于进行在体外评估癌症的方法的试剂盒，所述方法包括测量样品中（a）DPPIV/Seprase，（b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和（c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示癌症，所述试剂盒包含特异性测量DPPIV/Seprase所需的试剂，和任选地特异性测量一种或多种其他癌症标记物所需的试剂。

发明详述

在优选的实施方案中本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括测量样品中DPPIV/Seprase的浓度和在癌症的评估中使用测量结果，特别是测定的浓度。

在另一个优选的实施方案中本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括测量液体样品中（a）DPPIV/Seprase，（b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和（c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示癌症。

令人惊讶地，发现受试样品中减少的DPPIV/Seprase浓度与癌症的发生相关。发现DPPIV/Seprase是对于单一类型的癌症无特异性但为不同类型癌症的标记物（即，一般肿瘤标记物）的标记物。因为DPPIV/Seprase对致瘤过程表现出相当的特异性，因此新型肿瘤标记物DPPIV/Seprase对于不同种类的肿瘤类型具有非常潜在的临床效果。

令人惊讶地，在本发明中发现在样品和/或体液中测定DPPIV/Seprase的浓度允许评估癌症，例如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、食道癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌。更令人惊讶地，发现相比正常对照，在样品和/或体液中减少的DPPIV/Seprase或其片段的浓度预示癌症的风险或发生。

本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括通过免疫学检测方法测量样品中的DPPIV/Seprase浓度并在癌症的评估中使用测量结果，特别是测定的浓度。

本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。已例如分别在特定的癌症类型如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、食道癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌中发现，与正常对照相比较，样品中DPPIV/Seprase的浓度减少。

根据本发明的优选实施方案，为了体外评估特定癌症类型例如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、食道癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌，测量样品中DPPIV/Seprase的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌、结肠癌、头颈癌和胰腺癌，测量样品中DPPIV/Seprase的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌（LC）或结直肠癌（CRC），测量样品中DPPIV/Seprase的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如LC，测量样品中DPPIV/Seprase的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如CRC，测量样品中DPPIV/Seprase的浓度。

本发明的一个实施方案涉及区分可能不患癌症的个体与可能被分类为“疑似”病例的个体的人群的普查。然后可以例如利用成像方法或其他合适的方法使后一个个体群体经历进一步的诊断过程。

本发明的另外的实施方案涉及适合于诊断一般性癌症的肿瘤标记物组或适合于诊断特定肿瘤类型例如肺癌或结肠癌的肿瘤标记物组的改进。

本发明还涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中DPPIV/Seprase和特异于癌症的一个或更多个其他标记物的浓度，以及在癌症的评估中使用测量结果，特别地测定的浓度。与DPPIV/Seprase组合使用的优选标记物在一个方面是为一般性肿瘤标记物(即不特异于单个肿瘤类型的标记物)的标记物或，在另一方面，是为特定肿瘤的标记物（为特异于单个肿瘤类型的标记物）的标记物。例如用于癌症例如肺癌或结肠癌的评估的优选标记物是Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。此类标记物可各自单个地使用或以任何组合与DPPIV/Seprase一起使用。

本发明也涉及用于利用生物化学标记物评估癌症例如肺癌或结肠癌的方法，其包括测量样品中DPPIV/Seprase以及一个或更多个其他癌症标记物，例如肺癌或结肠癌的一个或更多个其他标记物的浓度，以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症评估中。优选，一个或更多个其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。

本发明还涉及包括至少DPPIV/Seprase和选自CYBP、NNMT、PSE3、ASC、OPN、Seprase、S100A12、NSE、CEA和Cyfra 21-1的一种或多种其他标记物的标记物组在评估LC和更特别地NSCLC中的用途。

本发明还涉及包括至少DPPIV/Seprase和选自FERR、OPN、抗-p53 自身抗体、Seprase、CEA和Cyfra 21-1的标记物组用于评估结肠癌，以及更特别地CRC中的用途。

本发明还涉及DPPIV/Seprase在评估癌症中的用途，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示着癌症。

本发明还涉及DPPIV/Seprase在评估几种特定类型的癌症，特别地肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌中的用途。

本发明还涉及DPPIV/Seprase在评估几种特定类型的癌症，特别地肺癌、结肠癌、头颈癌或胰腺癌中的用途。

本发明还涉及针对可溶性DPPIV，可溶性Seprase或DPPIV/Seprase的特异性结合剂的组合在评估癌症中的用途，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示着癌症。

优选地以夹心型免疫测定形式（=夹心免疫测定）检测DPPIV/Seprase。

本发明还涉及夹心免疫测定形式，其具有分别结合作为DPPIV/Seprase一部分的可溶性DPPIV的第一特异性结合剂和结合作为DPPIV/Seprase一部分的可溶性Seprase的第二特异性结合剂。

本发明还涉及夹心免疫测定形式，其具有结合可溶性DPPIV/Seprase蛋白复合物但不分别结合可溶性DPPIV或可溶性Seprase的特异性结合剂。

本发明还涉及具有结合剂的夹心免疫测定形式，其特征在于分别使用第一特异性结合剂或第二特异性结合剂作为捕获结合剂和使用所述第二特异性结合剂或所述第一特异性结合剂作为检测结合剂。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性测量DPPIV/Seprase和一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异地测量DPPIV/Seprase和一个或更多个癌症标记物（例如上述肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌的标记物）所需的试剂，其中其他标记物可各自单个地使用或以其任何组合使用。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性地测量DPPIV/Seprase和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125的其他标记物所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以特异性测量DPPIV/Seprase和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125的其他标记物和任选地用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以在评估LC和更特别地NSCLC中特异性测量DPPIV/Seprase和一种或多种选自CYBP、NNMT、PSE3、ASC、OPN、Seprase、S100A12、NSE、CEA和Cyfra 21-1的其他标记物。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以在评估结肠癌和更特别地CRC中特异性测量DPPIV/Seprase和一种或多种选自FERR、OPN、抗-p53 自身抗体、Seprase、CEA和Cyfra 21-1的其他标记物。

术语“测量”优选包括样品中DPPIV/Seprase的半定量或定量测量。在优选实施方案中，测量是半定量测量，即，确定DPPIV/Seprase的浓度是高于还是低于截止值（cut-off value）。如本领域技术人员将理解的，在是-（存在）或否-（不存在）测定中，通常将测定灵敏度设置至匹配截止值。可以例如根据健康个体组的检测来确定截止值。优选地，将截止值设置至导致90%的特异性，还优选地将截止值设置至导致95%的特异性，或还优选地将截止值设置至导致98%的特异性。存在或低于截止值的值可以例如预示癌症的存在。特别地，存在或低于截止值的值可以例如预示着肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的存在。在另外的优选实施方案中，DPPIV/Seprase的测量是定量测量。在另外的实施方案中DPPIV/Seprase的浓度与潜在的诊断问题如例如疾病的阶段、疾病的进程或对治疗的应答相关。

在某些其他的优选实施方案中，例如在治疗的监控或随访中，将截止值设置至导致90%的灵敏度，还优选地将截止值设置至导致95%的灵敏度，或还优选地将截止值设置至导致98%的灵敏度。

高于截止值的值可例如预示不存在癌症。特别地高于截止值的值可例如预示不存在乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌。

在另外的优选实施方案中，DPPIV/Seprase的测量是定量测量。在另外的实施方案中可溶性DPPIV/Seprase蛋白质复合体的浓度与潜在的诊断问题如例如疾病的阶段、疾病的进程或对治疗的应答相关。

人膜结合 Seprase，也称为成纤维细胞活化蛋白(=FAP))是170 kDa的具有明胶酶和二肽基肽酶活性的糖蛋白，其由两个相同的单体Seprase单元组成(Pineiro-Sanchez 等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park 等人, J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。人Seprase蛋白单体包含在SEQ ID NO:1中显示的760个氨基酸（Swissprot数据库登录号Q12884）。

人Seprase蛋白的较短形式是本领域技术人员所知的，其为可溶性Seprase或循环的抗纤溶酶切割酶（antiplasmin-cleaving enzyme）（=APCE）(Lee，K.N.等人, Blood 103 (2004) 3783-3788; Lee 等人, Blood 107 (2006) 1397-1404)。人可溶性 Seprase的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4并包含Swissprot数据库登录号Q12884的第26-760位氨基酸。预测人Seprase在成纤维细胞细胞质内具有最先的4个N末端残基，接着是21个残基的跨膜结构域，然后是734个残基的细胞外C末端催化结构域(Goldstein，L.A. 等人, Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19; Scanlan，M.J. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5657-5661)。可溶性Seprase的二聚体是由2个相同的单体可溶性Seprase蛋白单元组成的160 kDa的糖蛋白。已显示可溶性Seprase可在N末端被进一步加工为70kDa或50kDa的片段(Chen, D. 等人, Cancer Res. 66 (2006) 9977-9985)。

Piñeiro-Sánchez 等人 (同上)发现增加的Seprase的表达与人黑色素瘤和癌细胞的侵袭性表型相关。Henry，L.R. 等人, Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水平间质（stromal）Seprase的人结肠肿瘤患者更可能具有侵袭性疾病进展以及转移或复发的潜在发展。

人二肽基肽酶IV（=DPPIV）又称CD26，其是110 kDa的细胞表面分子。人DPPIV蛋白的氨基酸序列包含766个氨基酸并显示于SEQ ID NO: 2 (Swissprot数据库登录号P27487)中。其含有固有的二肽基肽酶IV活性，所述活性选择性地从在第三个氨基酸位置具有脯氨酸或丙氨酸的肽中去除N-端的二肽。其与多种细胞外分子相互作用并也涉及细胞内信号转导级联。人DPPIV的多功能活性依赖于细胞类型和细胞内或细胞外的条件，上述因素影响其作为蛋白水解酶、细胞表面受体、共刺激相互作用蛋白和信号转导介质的功能。人DPPIV具有从第1至6位氨基酸的短细胞质结构域，从第7至28位氨基酸的跨膜区，和从第29至766位氨基酸的具有固有二肽基肽酶IV（DPPIV）活性的细胞外结构域。

人可溶性二肽基肽酶IV（=可溶性 DPPIV）的氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 3，并包含Swissprot数据库登录号P27487的第29至766位氨基酸。可溶性DPPIV的二聚体是由2个相同的单体可溶性DPPIV单元组成的170 kDa糖蛋白。

膜结合的人 DPPIV/Seprase 蛋白质复合体是由220 kDa的DPPIV同源二聚体和170 kDa的Seprase同源二聚体组成的并具有410 kDa的分子量。在特定条件下此复合物可形成具有820 kDa分子量的双复合体。Ghersi, G. 等人, J. Biol. Chem. 277 (2002) 29231-29241; Ghersi, G. 等人, Adv. Exp. Med. Biol. 524 (2003) 87-94和Ghersi, G. 等人, Cancer Res. 66 (2006) 4652-4661报导了在人内皮细胞中的这种膜结合的DPPIV/Seprase蛋白质复合体。

根据本发明，术语“可溶性DPPIV/Seprase蛋白质复合体”（=DPPIV/Seprase）指由可溶性DPPIV同源二聚体（170 kDa）和可溶性Seprase同源二聚体（160 kDa）形成的具有330 kDa分子量的可溶性复合体。在特定条件下此复合体可形成具有660 kDa分子量的双复合体。

因此，本领域的上述文献中没有一个表明体液中减少的DPPIV/Seprase浓度预示着癌症。

对本领域技术人员显而易见地，本发明不应被解释为局限于由SEQ ID NO:3的可溶性DPPIV和SEQ ID NO:4的可溶性Seprase形成的复合体。DPPIV/Seprase也可包含DPPIV或Seprase的生理或人工片段，DPPIV或Seprase的二级修饰以及DPPIV或Seprase的等位基因变体。因此，本发明也包含与Seprase或与其片段、修饰和变体结合的DPPIV以及DPPIV的片段、修饰和变体。

在合适的样品中检测DPPIV/Seprase。优选的样品是体液，例如血液、血浆、血清、痰、上皮细胞衬液（=ELF；在疑为LC的情况下优选）、支气管肺泡灌洗液（=BAL；在疑为LC的情况下优选）等等。优选地，样品来源于人受试者，例如肿瘤患者或具有肿瘤风险的人或疑为具有肿瘤的人。也优选在血清或血浆样品中检测DPPIV/Seprase。

所有这些检测技术也可以基于微阵列、蛋白质阵列、抗体微阵列、组织微阵列、电子生物芯片或蛋白质芯片的技术形式应用(见Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, Natick, Mass., 2000)。

如本文中所使用的，每一个下列术语在该部分中具有与其相关的意义。

冠词“一”在本文中用于指一个或多于一个（即，至少一个）的冠词的语法宾语。例如，“一个标记物”意指一个标记物或多余一个标记物。术语“至少”用于表示任选地一个或更多个另外的物体可存在。例如，包括至少（标记物）DPPIV/Seprase和Cyfra 21-1的标记物组可任选地包括一个或更多个其他标记物。

表述“一个或更多个”表示1至50，优选1至20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。

术语“生物芯片”、“聚合物芯片”或“蛋白质芯片”可互换使用并指排列在共有基质上的大量探针、标记物或生物化学标记物的集合，所述基质可为硅片、尼龙条、塑料条或玻璃片的一部分。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”是有意创造的物质例如分子、标记物、缺口、微型线圈、检测器和/或传感器的集合，所述物质连接或装配在基质或固体表面，例如玻璃、塑料、硅片或其他形成阵列的材料上。阵列可用于测量较大数量的水平，例如几十、几千或几百万同时的反应或组合。阵列也可含有较少数量的物质，例如一，几个或一打。阵列中的物质可为彼此相同的或不同的。阵列可假定多种形式，例如可溶性分子的文库，固定化的分子的文库，固定化的抗体的文库，结合树脂珠的化合物的文库，硅片或其他固体支持物。取决于阵列上衬垫的大小，阵列可为宏阵列或微阵列。宏阵列通常包含约300微米或更大的衬垫大小并可通过凝胶和印迹扫描仪容易地显像。微阵列通常包含小于300微米的衬垫大小。

“固体支持物”是不可溶的功能化的聚合材料，其上可连接或共价结合（经常通过接头）文库成员或试剂以固定文库成员或试剂或使文库成员或试剂易于从过量的试剂、可溶性反应副产物或溶剂中分离（通过过滤、离心、洗涤等等）。

本文中使用的术语“标记物”或“生物化学标记物”是指被用作靶以分析患者的受试样品的分子。此类分子靶的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标记物的蛋白质或多肽预期包括所述蛋白质的天然发生的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别地免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员应认识到由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可在例如炎症期间被破坏，并且可被降解或被切割成这样的片段。某些标记物以无活性的形式合成，所述形式随后可通过蛋白质水解激活。如本领域技术人员应理解的，蛋白质或其片段还可作为复合物的一部分存在。这样的复合物在本发明的意义上也可用作标记物。标记物多肽的变体由相同基因编码，但作为可选的mRNA、前-mRNA加工或蛋白质加工的结果，可在它们的等电点(=PI)或分子量 (=MW)或两者上不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列达到95%或更多的相同。此外，或可选地，标记物多肽或其变体可具有翻译后修饰。优选的翻译后修饰是糖基化、酰基化和/或磷酸化。

特异性结合剂是例如DPPIV/Seprase的受体、结合DPPIV/Seprase的凝集素或与DPPIV/Seprase反应的抗体。特异性结合剂对于其相应的靶分子具有至少10⁷ l/mol的亲和力。特异性结合剂对于其靶分子优选地具有10⁸ l/mol或也优选10⁹ l/mol的亲和力。

一对特异性结合剂优选地包含与可溶性DPPIV反应的第一种抗体和与可溶性Seprase反应的第二种抗体从而使抗体对能够与DPPIV/Seprase形成复合物。

此外，特异性结合剂优选地是与DPPIV/Seprase特异性反应但不与可溶性DPPIV或可溶性seprase单独反应的抗体。

本发明也包含针对未结合的可溶性DPPIV的特异性结合剂，其中特异性结合剂优选地是与可溶性DPPIV的一个表位反应的抗体，当可溶性DPPIV与可溶性Seprase结合时所述表位被掩盖。本发明也包含针对未结合的可溶性Seprase的特异性结合剂，其中特异性结合剂优选地是与可溶性Seprase的一个表位反应的抗体，当可溶性Seprase与可溶性DPPIV结合时所述表位被掩盖。

术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及指包含抗体的结合结构域的基因构建体。

可使用保持特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。通过现有技术方法，例如，如在Tijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 全书, 特别地第43至78页）中描述的方法，产生抗体。此外，本领域技术人员十分了解基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen, P., 同上, 第108至115页)。

为了达到本发明中公开的成就，可使用在兔子中产生的多克隆抗体。然而，也很显然，还可使用来自不同物种例如绵羊或山羊的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆抗体可以以任何需要的量和恒定的性质产生，它们代表了用于临床常规测定的开发的理想的工具。在根据本发明的方法中抗DPPIV/Seprase的单克隆抗体的产生和应用分别代表了其他优选实施方案。

免疫测定是本领域技术人员所熟知的。实施这些测定的方法以及实际应用和步骤总结在相关教科书中。相关教科书的实例是Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278, Burdon, R.H.和v. Knippenberg, P.H. (编.), Elsevier, Amsterdam (1990)，和“Methods in Enzymology”(S.P. Colowick, N.O. Caplan编, Academic Press)的涉及免疫学检测方法的多卷，特别是第70, 73, 74, 84, 92和121卷。

根据本发明，测定了DPPIV/Seprase的浓度。在一个实施方案中，通过使用特异性结合剂从样品中特异性测量标记物DPPIV/Seprase。

正如本领域技术人员现在应认识到DPPIV/Seprase已被鉴定为用于评估癌症优选肺癌或结肠癌的标记物。不同的免疫诊断方法可用于获得可与本发明的成就相当的结果。例如，可使用产生抗体的可选策略。这样的可选策略包括使用合成肽（代表DPPIV、Seprase或DPPIV/Seprase的表位以进行免疫）等等。可选地，可使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫。

为了进行测量，将获自个体的样品在适合于结合剂-DPPIV/Seprase复合物形成的条件下与DPPIV/Seprase的特异性结合剂一起温育。这样的条件不必详细说明的，因为本领域技术人员无需任何创造性努力就可容易地鉴定这样的合适的温育条件。在癌症优选肺癌的评估中测量和使用结合剂-DPPIV/Seprase的量。本领域技术人员应理解，存在许多测量特异性结合剂-DPPIV/Seprase的量的方法，其全都详细地描述于相关教科书(参见，例如，Tijssen, P., 同上, 或Diamandis, E.P., 和Christopoulos, T.K. (编), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。

优选，在夹心类型测定形式（=夹心免疫测定）中检测DPPIV/Seprase。在这样的夹心免疫测定中，将连接在固体支持物上的第一特异性结合剂用于将DPPIV/Seprase捕获在一侧，并且将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合剂用于另一侧。用于夹心类型测定形式的特异性结合剂可以是分别特异性针对DPPIV和Seprase的抗体的组合。

也优选这样的夹心免疫测定，其具有针对可溶性DPPIV的捕获抗体和针对可溶性Seprase的检测抗体，和反之亦然。

也优选这样的夹心免疫测定，其具有结合DPPIV/Seprase复合物但不结合可溶性DPPIV或可溶性Seprase的抗体。

在一些诊断设置中也可使用仅识别可溶性DPPIV或可溶性Seprase的非复合物形式的抗体。

在本发明的意义上“癌症的标记物”和特别地“肺癌的标记物”以及“结肠癌的标记物”是如果与标记物DPPIV/Seprase组合可在癌症的评估中,例如在一般性癌症的评估中或在某些癌症类型的评估中（例如在LC或CRC的评估中）增加相关信息的任何标记物。如果可通过将所述标记物包括入已包含标记物DPPIV/Seprase的标记物组合来分别提高对于癌症评估的灵敏度（在给定的特异性下）或特异性（在给定的灵敏度下），则信息被认为是相关或为相加值（additive value）。在癌症评估的优选实施方案中，灵敏度或特异性的提高分别地在p = .05、.02、.01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选，一个或更多个其他肿瘤标记物选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。

本文中使用的术语“样品”是指获得用于体外评估目的的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液。优选的检测样品包括血液、血清、血浆、痰、ELF和BAL。优选的样品是全血、血清、血浆、ELF，血浆或血清是最优选的。

术语“评估癌症”和特别地“评估肺癌”或“评估结肠癌”用于表示根据本发明的方法将（单独地或与其他标记物或变量，例如由UICC所示的标准(参见上文)一起）例如帮助医师确定或确认癌症特别地LC或CRC的不存在或存在或帮助医师预后、检测复发（术后患者的随访）和/或监测治疗特别地化学治疗。

如本领域技术人员将理解的，任何此类评估是在体外进行的。之后弃去患者样品。患者样品只用于本发明的体外诊断方法，并且不将患者样品的材料转移回患者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。

除非另外指出，根据常规用法使用技术术语。在细胞和分子生物学中的常用术语的定义可在Lewin, B., Genes, V., Oxford University Press出版(1994), ISBN 0-19-854287 9; Kendrew, J. 等人 (编), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版(1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A. (编), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版(1995), ISBN 1-56081-569 8中找到。

在优选实施方案中，本发明涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症例如LC或CRC的方法，其包括测量样品中DPPIV/Seprase的浓度和将测定的浓度用于癌症例如LC或CRC的评估。

本发明的发明者已令人惊讶地能够在显著百分比的来源于患有癌症特别是患有肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌的患者的样品中检测到减少的标记物DPPIV/Seprase的浓度。甚至更令人惊讶地，他们已能够证明获自个体的此类样品中减少的DPPIV/Seprase的浓度可用于癌症特别是上述癌症疾病的评估。

进行诊断的理想的情形是其中单个事件或过程可在例如感染性疾病中引起各自疾病的情形。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学未完全弄清楚时，对于许多癌症类型例如对于LC的情况就是如此。如本领域技术人员将理解的，不存在对于给定的多因素疾病例如LC的诊断既具有100%的特异性同时又具有100%的灵敏度的生物化学标记物。相反,生物化学标记物例如Cyfra 21-1、CEA、NSE，或如本文中所显示的DPPIV/Seprase可用于以某种可能性或预测值例如存在、不存在或严重度来评估疾病。因此在常规临床诊断中，通常在潜在的疾病的诊断、治疗和管理中一起考虑通常不同的临床症状和生物学标记物。

可以独立地测定生物化学标记物或在本发明的优选实施方案中使用基于生物芯片或珠粒的阵列技术同时测量它们。然后例如使用各标记物的个体截止值独立地解释生物标记物的浓度，或将它们组合以进行解释。

在另外的优选实施方案中，在方法中进行根据本发明的癌症的评估，所述方法包括测量样品中a)DPPIV/Seprase，和b)一个或更多个其他癌症标记物的浓度，以及c)将测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于癌症的评估。

在癌症的评估中，标记物DPPIV/Seprase在一个或更多个下列方面中是有利的：筛查；诊断帮助；预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。

筛查:

筛查定义为就疾病的指标，例如癌症的存在鉴定个体例如处于风险中的个体的检测的系统性应用。优选筛查群体由已知处于比平均水平更高的癌症风险中的个体组成。例如，肺癌的筛查群体由已知处于比肺癌的平均风险更高的风险中的个体（如吸烟者、曾吸烟者（ex-smoker）和暴露于铀、石英和石棉的工人）组成。

在优选实施方案中，体液例如全血、血浆、血清、痰、上皮细胞衬液（=ELF；在疑为LC的情况下优选）或支气管肺泡灌洗液（=BAL；在疑为LC的情况下优选）在癌症例如肺癌或结直肠癌的筛查中用作样品。

对于许多疾病，循环中没有单个生物化学标记物可以总是满足筛查目的所需的灵敏度和特异性标准。这对于癌症，特别地肺癌似乎也是如此。势必期望必须将包括多个标记物的标记物组用于癌症的筛查。本发明中确定的数据表明标记物DPPIV/Seprase将形成适合用于筛查目的的标记物组的构成整体所必需的（integral）部分。本发明因而涉及DPPIV/Seprase作为癌症标记物组（即包括DPPIV/Seprase和一个或更多个另外的用于癌症筛查目的的标记物的标记物组）的一个标记物的用途。特别地，本发明涉及DPPIV/Seprase作为一般性癌症标记物组中的一个标记物的用途。这样的标记物组包括标记物DPPIV/Seprase和一个或更多另外的标记物，例如一般性癌症标记物和/或用于上述类型的癌症的标记物。

DPPIV/Seprase还可能贡献于用于某些特定类型癌症例如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌的标记物组。

使用包括DPPIV/Seprase的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌、头颈癌或胰腺癌。

使用包括DPPIV/Seprase的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌（LC）或结肠癌（CRC）。

使用包括DPPIV/Seprase的标记物组评估的优选类型的癌症是CRC。

使用包括DPPIV/Seprase的标记物组评估的优选类型的癌症是LC。

本数据还表明标记物的某些组合在癌症的筛查中是有利的。

例如，参考筛查癌症的实施方案，本发明还涉及包括DPPIV/Seprase和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125的其他肿瘤标记物的标记物组的用途。

例如，参考筛查CRC的实施方案，本发明还涉及包括DPPIV/Seprase和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CA19-9和CA125的其他肿瘤标记物的标记物组的用途。

例如，参考筛查LC的实施方案，本发明还涉及包括DPPIV/Seprase和一种或多种选自CYBP、NNMT、PSE3、ASC、OPN、Seprase、S100A12、NSE、Cyfra 21-1、CEA、CA19-9和CA125的其他肿瘤标记物的标记物组的用途。

诊断辅助物:

标记物可以有助于特定器官中良性对恶性疾病的鉴别诊断，帮助区分不同的组织学类型的肿瘤或在手术前建立基线标记物值。

在优选的实施方案中在免疫组化方法中使用标记物DPPIV/Seprase以确定或者证实癌症的不同组织学类型。

因为作为单个标记物的DPPIV/Seprase可能优于其他标记物，例如在LC的情况下优于其他标记物，如CEA或NSE，因此势必期望将DPPIV/Seprase用作诊断辅助物（特别地通过在手术前确定基线值）。本发明因此还涉及DPPIV/Seprase用于在癌症的手术之前确定基线值的用途。

预后:

预后指标可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理学或生物化学特性。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免对侵袭性疾病的处理不足和对怠惰性疾病（indolent disease）的治疗过度。Molina, R. 等人, Tumor Biol. 24 (2003) 209-218评估了CEA、CA 125、Cyfra 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后价值（prognostic value）。在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清似乎表示更短的存活时间。

由于DPPIV/Seprase单独地显著促进癌症患者例如LC或CRC患者与健康对照的区分，因此必需期望其将有助于评估患有癌症优选患有LC或CRC的患者的预后。术前DPPIV/Seprase的水平最可能与一个或更多个其他癌症标记物和/或TNM分期系统组合。在优选实施方案中，DPPIV/Seprase用于患有LC或CRC的患者的预后。

治疗的监测:

Merle, P. 等人, Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315已评估了用诱导化疗法治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中Cyfra 21-1血清水平的变化。他们得出Cyfra 21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预后工具。此外，报告已描述了CEA在监测患有LC的患者的治疗中的用途(Fukasawa, T. 等人, Gan to Kagku Ryoho 13 (1986) 1862-1867)。大多数此类研究是基于回忆的、非随机化的并且包括少数患者。如在使用Cyfra 21-1的研究的情况下，CEA研究表明：a)CEA水平降低同时接受化学治疗的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的结果以及(b)对于所有患者，CEA水平的增加与疾病的进展相关。

预期DPPIV/Seprase将是分别与Cyfra 21-1或CEA至少一样好的用于化学治疗的监测的标记物。本发明因此还涉及DPPIV/Seprase在监测处于治疗中的癌症患者，优选LC或CRC患者中的用途。

在一个优选实施方案中的治疗监测中，可将对于DPPIV/Seprase的测量与对于至少一种选自CYBP、NNMT、PSE3、ASC、OPN、Seprase、S100A12、NSE、CEA、Cyfra 21-1、CA19-9和CA125的标记物的测量组合,然后将其用于LC的评估。

在一个优选实施方案中的治疗监测中，可将对于DPPIV/Seprase的测量与对于至少一种选自CEA、Cyfra 21-1、Feritin、OPN、抗p53自身抗体、NNMT、PSE3、S100A12、CA 19-9和CA 125的标记物的测量组合,然后将其用于CRC的评估。

随访:

大部分经历目的在于完全清除癌性组织的手术切除的LC患者日后发生复发性或转移性疾病(Wagner, H. Jr., Chest 117 (2000) 110S-118S; Buccheri, G., 等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此类复发在术后最初的2至3年内发生。因为如果检测得太迟，复发性/转移性疾病常常是致命的，因此相当多的研究集中在处于早期以及因此潜在地可治疗的时期的癌症复发上。

因此，许多癌症患者例如LC患者经历了频繁包括使用CEA的定期监测的术后监测方案。已显示手术切除术后一年使用CEA的系列监测甚至在疑似症状或体征不存在的情况下，在大约97%的特异性下以大约29%的灵敏度检测到早期术后复发/转移性疾病(Buccheri, G., 等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。因此，术后患有LC的患者的随访是合适的生物化学标记物的用途的最重要的领域之一。由于DPPIV/Seprase在被调查的LC患者中的高灵敏度，DPPIV/Seprase（单独地或与一个或更多个其他标记物组合）可能极大地帮助LC患者的随访，尤其在术后LC患者的随访。包括DPPIV/Seprase和一个或更多个LC的标记物的标记物组在LC患者的随访中的用途代表了本发明的另外的优选实施方案。

本发明在优选实施方案中涉及DPPIV/Seprase在癌症的诊断领域中的用途。优选，DPPIV/Seprase 分别用于肺癌（LC）、结肠癌（CRC）、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的评估。

在还另外的优选实施方案中，本发明涉及DPPIV/Seprase作为癌症例如一般性癌症或特定类型的癌症（例如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌）的标记分子与一个或更多个另外的癌症标记分子组合的用途。另外的标记分子可以是癌症类型非特异性一般性标记分子和/或癌症类型特异性标记分子，例如LC或CRC的标记分子。DPPIV/Seprase和至少一个另外的标记物用于在获自个体的液体样品中癌症例如LC或CRC的评估。优选选择的可将其与DPPIV/Seprase的测量组合的其他癌症标记物是Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。特别地，优选选择的可将DPPIV/Seprase的测量与其组合的其他LC或CRC标记物是Cyfra 21-1, CEA和/或NSE。用于评估癌症例如LC的还另外优选的标记物组包括DPPIV/Seprase和至少一个选自Cyfra 21-1和CEA的其他标记分子。

如本领域技术人员将理解的，存在许多使用两个或更多个标记物的测量以改进调查中的诊断问题的方法。在相当简单但通常有效的方法中，如果样品对于至少一种被调查的标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以例如是当诊断感染性疾病如AIDS时的情况。

然而，频繁地，评估标记物的组合。优选，将测量的标记物组的标记物例如DPPIV/Seprase和Cyfra 21-1的值算术组合，并且使组合的值与基本诊断问题发生关联。可通过任何合适的现有技术数学方法来组合标记物值。用于使标记物组合与疾病发生关联的熟知的数学方法使用方法如判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化-DA)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器（k-Nearest-Neighbor Classifiers）)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法（Random Forest Method）、Boosting/套袋法（Bagging Methods）)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主要成分的方法（Principal Components based Method）(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的方法（Fuzzy Logic based Method）、神经网络和基于遗传算法的方法。本领域技术人员在选择合适的方法评估本发明的标记物组合中将没有问题。优选，用于使本发明的标记物组合例如与LC的不存在或存在发生关联的方法选自DA(即线性-、二次-、正则化判别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法（Tree-Based Method）(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于此类统计方法的详细内容见于下列参考文献：Ruczinski, I.等人, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T.等人, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L.等人，Classification and regression trees, California: Wadsworth(1984); Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series 28 (2003); 和Duda, R.O.等人, Pattern Classification, Wiley Interscience, 第2版(2001)。

本发明的优选实施方案是使用生物学标记物的基本组合的最优化多变量截止值以及区分状态A与状态B（例如区分患病的与健康的）。在该类型的分析中,标记物不再是独立的而是形成标记物组。

诊断方法的精确性通过其受试者工作特性(ROC；特别地参见Zweig, M.H., 和Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)得到最佳描述。ROC图是由在整个观察到的数据范围内连续改变决策阈值产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。

实验室检测的临床性能取决于其诊断精确性或正确地将受试者分类至临床相关亚组的能力。诊断精确性测量检测的正确区分被调查的受试者的两个不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。

在各情况下，ROC曲线通过在完全的决策阈值范围内将灵敏度对1-特异性作图来描述两个分布之间的重叠。灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检测结果的数目)/(真阳性检测结果的数目 + 假阴性检测结果的数目)] 在y轴上。这也称为在疾病或病状存在的情况下的阳性。其只根据受影响的亚组来计算。假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目 + 假阳性结果的数目)] 在x轴上。其是特异性的指数并且完全根据未受影响的亚组来计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检测结果完全分别地计算真阳性分数和假阳性分数，因此ROC曲线不依赖于样品中疾病的流行性（prevalence）。ROC曲线上的各点代表相应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分（两个结果的分布中无重叠）的检测具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0或100%(完美的灵敏度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(对于两组为相同的结果分布)的检测的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部分曲线落在这两个极端值之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，这可通过将“阳性”标准从“大于”转变成“小于”或反之亦然来容易地矫正)。定性地，曲线越接近左上方的角，检测的总体精确性越高。

定量实验室检测的诊断精确性的一个优选方法是利用单个数字表示其性能。这样的总体参数例如称为“总误差（total error）”或可选地“曲线下的面积=AUC”。最普遍的全局测量是ROC曲线下的面积。按常规，该面积总是大于0.5(如果不是，可颠倒决策规则来使其大于0.5)。值在1.0(两组的检测值完全分离)至0.5(两组检测值之间无显著分布差异)之间变化。面积不仅取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90%特异性下的灵敏度，而且还取决于整个曲线。这是ROC曲线接近完美曲线(面积 = 1.0)的程度的定量描述性表述。

将DPPIV/Seprase和其他标记物如Cyfra 21-1或CEA，或和其他尚未发现的癌症标记物的测量组合，DPPIV/Seprase分别导致和将导致在癌症评估中的进一步改进。

在另外的优选实施方案中，本发明涉及通过分别测量样品中至少DPPIV/Seprase和一种或多种其他选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125的肿瘤标记物的浓度，以及使测定的浓度与癌症例如LC或CRC的存在或不存在发生关联来提高癌症例如LC或CRC相对于健康对照的诊断精确性的方法，当与基于任何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌症，例如LC或CRC相对于健康对照。

在优选的实施方案中本发明涉及通过分别测量样品中至少DPPIV/Seprase和Cyfra 21-1，和任选地CEA和/或NSE的浓度，以及使测定的浓度与癌症例如LC或CRC的存在或不存在发生关联来提高癌症例如LC或CRC相对于健康对照的诊断精确性的方法，当与基于任何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌症，例如LC或CRC相对于健康对照。

提供下列实施例、序列表和图来帮助理解本发明，其真实范围示于所附权利要求中。应当理解，可在所示的方法中进行变动而不背离本发明的精神。

附图说明

图1显示结直肠癌（CRC）患者和健康对照患者中血清DPPIV/Seprase浓度值的分布。

图2显示CRC患者和健康对照的组群的DPPIV/Seprase检测的ROC曲线。

图3显示在LC、头颈癌和胰腺癌患者和健康对照的组群中DPPIV/Seprase值的分布。

图4显示LC患者和健康对照的组群的DPPIV/Seprase检测的ROC曲线。

图5显示头颈癌患者和健康对照的组群的DPPIV/Seprase检测的ROC曲线。

图6显示胰腺癌患者和健康对照的组群的DPPIV/Seprase检测的ROC曲线。

序列描述

SEQ ID NO：1显示人Seprase蛋白质（同种型1）的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号Q12884。

SEQ ID NO：2显示人DPPIV蛋白质的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号P27487。

SEQ ID NO：3显示可溶性人DPPIV蛋白质的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号P27487的第29至766位。

SEQ ID NO：4显示可溶性人Seprase蛋白质的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号Q12884的第26至760位。

实施例 1

大鼠单克隆抗DPPIV和抗seprase抗体(分别为克隆E26和D28)购自Vitatex Inc. (Stony Brook, NY, USA)。Ghersi, G. 等人 (J. Biol. Chem. 277 (2002) 29231-29241)和Pineiro-Sanchez, M.-L. 等人 (J. Biol. Chem. 12 (1997) 7595-7601)曾经描述了这些抗体。

单克隆大鼠IgG的生物素化

使单克隆大鼠IgG(克隆E26)在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中达到10 mg/ml。每 ml IgG溶液加入50 µl 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6 mg/ml于DMSO中)。在室温下进行30分钟后，将样品在Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上进行层析。收集含有生物素化的IgG的级分。

单克隆大鼠IgG的地高辛化（Digoxygenylation）

使单克隆大鼠IgG(克隆D28)在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, 30 mM NaCl, pH 7.5中达到10 mg/ml。每 ml IgG溶液加入50 µl地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (3.8 mg/ml 于DMSO中)。在室温下进行30分钟，将样品在Superdex® 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上进行层析。收集含有地高辛化的IgG的级分。

实施例 2

用于人血清和血浆样品中DPPIV/Seprase的测量的ELISA

为了检测人血清或血浆中的DPPIV/Seprase，发展了夹心ELISA。为了捕获和检测抗原，将等分试样的抗DPPIV单克隆抗体E26和抗Seprase单克隆抗体D28(参见实施例 1)分别缀合生物素和地高辛。

在链霉抗生物素包被的微滴定板的单个孔中将样品(20 µl)与100 µl各自含有0.12 µg/ml的E26-生物素和D28-地高辛抗体的抗体试剂于温育缓冲液(40 mM磷酸盐、200 mM酒石酸钠、10 mM EDTA、0.05%苯酚、0.1%聚乙二醇40000、0.1% Tween 20、0.2% BSA、0.1%牛IgG、0.02% 5-溴-5-硝基-1,3-二

烷并且调整至pH 7.4，补充200 µg/ml 聚合单克隆小鼠IgG Fab片段以消除人抗大鼠抗体应答（HARA）；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 11096478-001)中混合。

在温育1小时后，用清洗缓冲液(10 mM Tris、150 mM NaCl、 0.05% Tween 20)清洗板3次。

在下一步骤中，用30 mU/ml的通用缀合缓冲液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 11684825)中的抗地高辛-HRP缀合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 1633716)温育孔，进行60 分钟，然后如之前一样进行清洗。

然后用100 µl TMB底物溶液（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 12034425）温育孔进行30分钟。加入2N 硫酸(50 µl)终止显色并且将蓝色转变成黄色。用ELISA读数器在450 nm测量OD。

所有温育在室温下进行。用温育缓冲液预稀释人血清或血浆的样品至5%。为了进行校准，将人血清用作标准。用温育缓冲液将其稀释至2/4/8/16/32%的终浓度以分别产生具有2/4/8/16/32单位/ml的任意给定的值的标准。

通过非线性最小平方曲线拟合（Wiemer-Rodbard）计算校正曲线方程，将其用于将孔的吸光度读数转换成相应的浓度值。将结果乘以预稀释因子以获得各样品本身的浓度。

实施例3

CRC研究群体

在第一研究中，已使用来源于48位良好表征的患有结直肠癌(表1中给出的UICC分类)的患者的样品。

表 1

根据UICC的分期	样品的数目
		UICC I	6
UICC II	14
		UICC III	13
UICC IV	6
		无分期	9
CRC样品的总数	48

与获自50个明显健康的无任何已知恶性疾病（=对照组群）的个体的对照样品相比较，评估表1的样品。

实施例4

DPPIV/Seprase复合物区分癌症患者与健康对照

DPPIV/Seprase的血清浓度在CRC患者与健康对照之间显著不同（图1和2）。

CRC患者组群的平均浓度显著比对照组群的低：在患者中51.6 U/ml 相对于对照中85.8 U/ml。对于对各对照组群产生95%特异性的截止值，结直肠癌的灵敏度为75%。

灵敏度对于癌症的所有分期都相似（表2）。因此，在血清/血浆中的DPPIV/seprase浓度可用作疾病的早期指示剂。

表 2

CRC研究: 灵敏度取决于UICC分类

根据UICC的分期	样品的数目	阳性数目	阳性%
				UICC I	6	5	83
UICC II	14	12	86
				UICC III	13	8	61.5
UICC IV	6	5	83
				无分期	9	5	55
CRC样品的总数	48

实施例 5

LC研究群体

完全不依赖于第一研究的第二研究集中于肺癌（准确地说是非小细胞肺癌：NSCLC)、头颈癌和胰腺癌。在NSCLC中，调查了患有其2种主要类型，腺癌和鳞状细胞癌的患者。表3描述了肺癌组群的类型和分期分布。

表 3

LC样品的类型和分期

本研究中的对照组群经特别地定义包括来自表4中描述的吸烟者和不吸烟者的样品。对每个个体进行肺量测定法（spirometry）肺功能检测(Miller, M.R. 等人, Eur. Respir. J. 26 (2005) 319–338) 。只有供体的结果在正常范围内时，才将样品包括在对照组群中。使用相同的对照组群用于评估DPPIV/Seprase检测对头颈癌和胰腺癌的灵敏度。

表 4

对照组群的组成

个体	样品的数目
		吸烟者	30
曾抽烟者	5
		不抽烟者	25
不确定的	7

实施例6

DPPIV/Seprase区分LC患者与健康对照

DPPIV/Seprase的血清浓度在LC患者与健康对照之间显著不同（图3）。癌症患者组群的平均浓度显著比对照组群的低：在患者中35 U/ml 相对于对照中75 U/ml。对于对各对照组群产生95%特异性的截止值，肺癌的灵敏度为77%。

灵敏度对于肺癌的所有分期都相似，但对于鳞状细胞癌的灵敏度比对腺癌的高（表5）。

表 5

LC研究: 灵敏度取决于类型和分期

LC的分期和类型	样品的数目	阳性数目	阳性%
				UICC I和II	24	18	75
UICC III和IV	33	26	79
				腺癌	29	21	72
鳞状细胞癌	28	23	82
				全部LC样品	57	44	77

实施例7

头颈癌研究群体

在研究中已使用来源于29位良好表征的患有头颈癌(表6中给出的UICC分类)的患者的样品。通过与从67个不具有任何恶性疾病的明显健康个体（=对照组群）中得到的对照样品的比较评估了上述样品。使用相同的对照组群用于评估DPPIV/Seprase检测对LC和胰腺癌的灵敏度。

表 6 ：

头颈癌样品的类型和分期

根据UICC的分期	样品的数目
		UICC I	2
UICC II	2
		UICC III	2
UICC IV	21
		无分期	2
全部头颈癌样品	29

实施例8

DPPIV/Seprase区分头颈癌患者与健康对照

DPPIV/Seprase的血清浓度在头颈癌患者与健康对照之间有差异（图3）。头颈癌患者组群的平均浓度显著比对照组群的低：在患者中44 U/ml 相对于对照中75 U/ml。对于对各对照组群产生95%特异性的截止值，头颈癌的灵敏度为59%。

实施例9

胰腺癌研究群体

在该研究中通过与对照组群的比较已评估了来源于44位良好表征的患有胰腺癌的患者的样品。使用相同的对照组群用于评估DPPIV/Seprase检测对LC和头颈癌的灵敏度。表7描述了胰腺癌组群的类型和分期。

表 7 ：

胰腺癌样品的类型和分期

根据UICC的分期	样品的数目
		UICC I	0
UICC II	24
		UICC III	5
UICC IV	13
		无分期	2
全部胰腺癌样品	44

实施例10

DPPIV/Seprase复合体区分胰腺癌患者与健康对照

DPPIV/Seprase的血清浓度在胰腺癌患者与健康对照之间有显著差异（图3）。胰腺癌患者组群的平均浓度显著比对照组群的低：在患者中41 U/ml 相对于对照中75 U/ml。对于对各对照组群产生95%特异性的截止值，头颈癌的灵敏度为59%。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 作为癌症的标记物的DPPIV/Seprase的用途

<130> 26090 WO

<150> EP09006097

<151> 2009-05-04

<160> 4

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 760

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His

20 25 30

Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Pro Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

325 330 335

Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu

500 505 510

Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu

725 730 735

Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu

740 745 750

Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210> 2

<211> 766

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Lys Thr Pro Trp Lys Val Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Val Thr Ile Ile Thr Val Pro Val Val Leu Leu Asn Lys Gly Thr

20 25 30

Asp Asp Ala Thr Ala Asp Ser Arg Lys Thr Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr

35 40 45

Leu Lys Asn Thr Tyr Arg Leu Lys Leu Tyr Ser Leu Arg Trp Ile Ser

50 55 60

Asp His Glu Tyr Leu Tyr Lys Gln Glu Asn Asn Ile Leu Val Phe Asn

65 70 75 80

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<211> 738

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Claims

1. 用于体外评估癌症的方法，其包括测量液体样品中下列物质的浓度：

a)可溶性二肽基肽酶IV/Seprase蛋白质复合体（=DPPIV/Seprase）,

b)任选地一个或更多个其他癌症标记物，和

c)在癌症的评估中使用步骤(a)和任选地步骤(b)的测量结果，其中减少的DPPIV/Seprase的浓度预示着癌症。

2. 根据权利要求1的方法，其中所述方法是夹心免疫测定。

3. 根据权利要求2的方法，其进一步的特征在于分别使用结合作为DPPIV/Seprase一部分的可溶性二肽基肽酶IV（=DPPIV）的第一特异性结合剂和结合作为DPPIV/Seprase一部分的可溶性Seprase蛋白质（=Seprase）的第二特异性结合剂。

4. 根据权利要求1或2的方法，其进一步的特征在于使用结合DPPIV/Seprase复合体但不分别结合可溶性DPPIV或Seprase的特异性结合剂。

5. 根据权利要求2至4的方法，其进一步的特征在于分别使用第一特异性结合剂或第二特异性结合剂作为捕获结合剂和使用所述第二特异性结合剂或所述第一特异性结合剂作为检测结合剂。

6. 根据权利要求1至5的方法，其进一步的特征在于所述方法用于评估癌症例如肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌。

7. 根据权利要求1至6中任一项的方法，其进一步的特征在于所述步骤（b）的一种或多种其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53 自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。

8. 根据权利要求1至7中任一项的方法，其进一步的特征在于所述样品是一种体液。

9. DPPIV/Seprase在评估癌症中的用途。

10. 在评估选自肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的癌症中根据权利要求9的用途。

11. 包含DPPIV/Seprase和任选地一种或多种其他癌症标记物的标记物组在评估癌症中的用途，其中减少的DPPIV/Seprase浓度预示着癌症。

12. 根据权利要求11的标记物组的用途，其进一步的特征在于任选地一种或多种其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53 自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125。

13. 根据权利要求11和12的任一项的标记物组在评估肺癌、结肠癌、头颈癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌中的用途。

14. 进行根据权利要求1的方法的试剂盒，其包含特异性测量DPPIV/Seprase所需要的试剂，和任选地特异性测量一种或多种其他癌症标记物所需要的试剂。

15. 用于进行根据权利要求1的方法的生物芯片阵列，其用于特异性测量DPPIV/Seprase和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、FERR、OPN、抗-p53自身抗体、Seprase、NNMT、PSE3、S100A12、CYBP、ASC、NSE、CA19-9和CA125的其他标记物，和任选地用于进行测量的辅助试剂。