ES2868077T3 - Diagnóstico mediante células tumorales circulantes para biomarcadores predictivos de la resistencia a las terapias selectivas del receptor de andrógenos (RA) - Google Patents

Abstract

Un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), en donde el análisis directo significa la detección de CTCs en el contexto de todas las células nucleadas del entorno presentes en la muestra, en contraposición a después del enriquecimiento de la muestra en CTCs antes de la detección; y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende una subpoblación de dichas CTCs que es positiva para citoqueratina (CK+), positiva para RA (RA+), y comprende nucleolos (nucleolos+), y en donde dichas CTCs se caracterizan adicionalmente por la tinción positiva del extremo N-terminal del RA y la pérdida del extremo C-terminal del RA.

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico mediante células tumorales circulantes para biomarcadores predictivos de la resistencia a las terapias selectivas del receptor de andrógenos (RA)

La invención se refiere en general al campo del diagnóstico del cáncer y, de manera más específica, a métodos para predecir la resistencia a las terapias selectivas del RA en un paciente con cáncer de próstata.

Antecedentes

El cáncer de próstata (CP) sigue siendo el cáncer no cutáneo más habitual en los EE.UU. Solo en 2014, la incidencia prevista de cáncer de próstata es de 233.000 casos, con muertes en 29.480 hombres, lo que hace que la terapia del cáncer de próstata metastásico realmente sea una necesidad médica incumplida. Siegel et al., 2014. CA Cancer J Clin. 2014;64(1):9-29. Los estudios epidemiológicos de Europa muestran datos comparables, con una incidencia estimada de 416.700 casos nuevos en 2012, lo que representa un 22,8% de los diagnósticos de cáncer en hombres. En total, se esperan 92.200 muertes por cáncer de próstata, lo que hace que sea uno de los tres cánceres por los que los hombres tienen una mayor probabilidad de morir, con una tasa de mortalidad del 9,5%

Con el advenimiento del crecimiento exponencial de nuevos agentes ensayados y aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (CPRCm) solo en los últimos 5 años, han surgido problemas con respecto a la secuencia o combinación óptimas de estos agentes. Existen varias directrices que ayudan a dirigir a los médicos hacia el mejor enfoque para la secuencia, y la mayoría evaluaría la presencia o ausencia de síntomas, el estado funcional, así como la masa de la enfermedad, para ayudar a determinar la mejor secuencia para estos agentes. Mohler et al., 2014, J Natl Compr Canc Netw. 2013;11 (12):1471 -1479; Cookson et al., 2013, J Urol. 2013;190(2):429-438. En la actualidad, los tratamientos aprobados consisten en agentes citotóxicos de la clase de los taxanos, tales como Taxotere® (docetaxel) y Jevtana® (cabazitaxel), y fármacos de terapias hormonales anti-andrógenos, tales como Zytiga® (abiraterona, que bloquea la producción de andrógenos) o Xtandi® (enzalutamida, un inhibidor del receptor de andrógenos (RA)).

El desafío para los médicos es decidir la mejor secuencia para la administración de estas terapias para proporcionar el mayor beneficio a los pacientes. Sin embargo, el fracaso de la terapia sigue siendo un desafío significativo, dadas las respuestas heterogéneas a las terapias en los pacientes y a la vista de la resistencia cruzada de cada agente. Mezynski et al., Ann Oncol. 2012;23(11):2943-2947; Noonan et al., Ann Oncol. 2013;24(7):1802-1807; Pezaro et al., Eur Urol. 2014, 66(3): 459-465. Además, los pacientes pueden perder la ventana terapéutica para obtener un beneficio sustancial de cada fármaco que se ha demostrado que proporciona un aumento de la supervivencia global. Por lo tanto, sigue siendo una meta importante conseguir mejores métodos de identificación de las poblaciones objetivo que tienen la mayor probabilidad de beneficiarse de las terapias selectivas.

Las células tumorales circulantes (CTCs) representan un avance significativo en el diagnóstico del cáncer, aún más atractivo por su medición no invasiva. Cristofanilli et al., N Engl J Med 351:781 -91, (2004). Las CTCs liberadas de un tumor primario o de sus sitios metastásicos albergan una información importante sobre la biología del tumor. La cuantificación y la caracterización de las CTCs, en forma de una biopsia líquida, ayuda a los médicos a seleccionar el curso de la terapia y a vigilar y monitorizar cómo evoluciona el cáncer de un paciente. Las CTCs se pueden considerar, por lo tanto, no solamente un sustituto de los biomarcadores para una enfermedad metastásica, sino también una herramienta clave prometedora para rastrear los cambios en el tumor, la respuesta al tratamiento, la recidiva del cáncer o la respuesta del paciente de una manera no invasiva. Históricamente, los niveles extremadamente bajos de CTCs en el torrente sanguíneo, combinados con su fenotipo desconocido, ha impedido significativamente su detección y ha limitado su utilidad clínica. En la actualidad se está desarrollando una diversidad de tecnologías para la detección, el aislamiento y la caracterización de las CTCs para utilizar su información.

Bambury et al. describe que los pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastásico con una resistencia de novo a la terapia selectiva de andrógenos tienen una mayor frecuencia inicial de CTCs (CTCs tradicionales, CTCs negativas para citoqueratina y CTCs que expresan receptores de andrógenos) que los pacientes que responden al tratamiento. Bambury et al., 2014. Annals of Oncology 25 (Suplemento 4): iv58-iv84.

Existe la necesidad de desarrollar métodos precisos y no invasivos para determinar la secuencia óptima para administrar la terapia selectiva del RA y la quimioterapia basada en taxanos para maximizar el beneficio en pacientes individuales. La presente invención aborda esta necesidad proporcionando distintivos de biomarcadores que predicen la resistencia a las terapias selectivas de RA y la quimioterapia basándose en una detección robusta de CTCs y una plataforma de caracterización que posibilita la caracterización fenotípica de las CTCs. También se proporcionan ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona métodos relacionados con las CTCs para identificar de manera prospectiva la resistencia a las terapias selectivas de RA y la quimioterapia en un paciente con cáncer de próstata.

La descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CTCs CK+, RA+, nucleolos+ en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En las realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende la presencia de CTCs positivas para el extremo N-terminal del RA y la pérdida del extremo C-terminal del RA. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En las realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende una heterogeneidad incrementada de las CTCs en comparación con una población de referencia. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia en el paciente con cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia basada en taxanos en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia basada en taxanos en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CK+, RA-, nucleolos+, tamaño pequeño en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La invención proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende

(a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), en donde el análisis directo significa la detección de CTCs en el contexto de todas las células nucleadas del entorno presentes en la muestra, en contraposición a después del enriquecimiento de la muestra en CTCs antes de la detección; y

(b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata,

en donde el distintivo de biomarcadores comprende una subpoblación de dichas CTCs que es positiva para citoqueratina (CK+), positiva para RA (RA+), y comprende nucleolos (nucleolos+),

y en donde dichas CTCs se caracterizan adicionalmente por la tinción positiva del extremo N-terminal del RA y la pérdida del extremo C-terminal del RA.

En ciertos aspectos de la invención, la tinción inmunofluorescente de las células nucleadas comprende pancitoqueratina (CK), el cúmulo de diferenciación (CD) 45, diamidino-2-fenilindol (DAPI) y RA. En aspectos adicionales, la tinción inmunofluorescente de RA comprende la tinción nuclear de RA de los extremos N-terminal y C-terminal.

En ciertos aspectos de la invención, la predicción de la resistencia a la terapia selectiva del RA proporciona información para una decisión de tratamiento posterior. En las realizaciones particulares, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (CPRCm).

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un gráfico que representa patrones de cambios de PSA tras las terapias dirigidas a la señalización del RA.

Las Figuras 2A y 2B muestran los métodos usados al llevar a cabo las realizaciones ejemplificadas en la presente memoria y la demografía de los pacientes del grupo de estudio. La Figura 2A muestra un esquema de una recogida de CTCs representativa y el proceso de detección: (1) células nucleadas de la muestra de sangre colocadas sobre portaobjetos; (2) portaobjetos almacenados en un biorrepositorio a -80 °C; (3) portaobjetos teñidos con CK, CD45, DAPI y RA; (4) portaobjetos sometidos a un barrido; (5) análisis mediante algoritmos de patología digitales multiparamétricos; (6) confirmación informática y mediante un lector humano de las CTCs y cuantificación de la expresión de los biomarcadores; (7) para FISH, se registran las coordenadas y se retira el cubreobjetos; (8) se realiza el ensayo FISH; (9) los GBs regionales se puntúan para determinar los valores normales; y (10) las CTCs se relocalizan y se puntúan. La Figura 1B muestra información sobre la población del estudio. Se muestran las características demográficas y clínicas de los pacientes en el momento de la inclusión en el estudio en los paneles izquierdo y derecho. Se incluyeron treinta pacientes (pts) de CPRCm progresivo en el estudio.

La Figura 3 muestra la frecuencia según Epic frente a CellSearch®, con las CTCs de EPIC/mL extrapoladas a CTCs/7,5 mL frente a las CTCs según CellSearch/7,5 mL. Las muestras de sangre coincidentes se procesaron utilizando las plataformas de CTCs de CellSearch® y Epic Sciences. La enumeración de CellSearch® se limitó a 200 CTCs. Las CTCs de Epic se midieron a partir de 1 mL y se extrapolaron a 7,5 mL de sangre.

La Figura 4 muestra imágenes de inmunofluorescencia de subpoblaciones de CTCs detectadas en la plataforma Epic.

La Figura 5 muestra la heterogeneidad de la expresión de RA de las CTCs observadas y las subpoblaciones de CTCs.

La Figura 6 muestra la caracterización de CTCs y la heterogeneidad de la localización del RA. Todas las células incluyen CTCs tradicionales, CTCs apoptóticas, CTCs CK- y CTCs pequeñas.

La Figura 7 muestra la heterogeneidad de CTCs observada en muestras de pacientes tras diversas líneas de terapia. Para determinar la heterogeneidad, cada célula se incluye en 1 de 70 categorías. Las muestras con más tipos distintos de cero, y por lo tanto más barras distintas de cero en el gráfico, se consideran más heterogéneas que las muestras con unas pocas poblaciones distintas de cero. El panel inferior muestra las terapias a las que se había sometido el paciente del que se obtuvo la muestra en el momento en el que se tomó la muestra.

Descripción detallada

La presente descripción se basa, en parte, en la identificación de un distintivo de biomarcadores de CTCs que posibilita la predicción prospectiva de la resistencia a las terapias selectivas de RA en un paciente afectado de CPRCm. La presente descripción se basa adicionalmente, en parte, en la identificación de un distintivo de biomarcadores de CTCs que posibilita la predicción prospectiva de la resistencia a la quimioterapia en un paciente afectado de CPRCm. La secuencia óptima para administrar la terapia selectiva del RA y la quimioterapia basada en taxanos para maximizar el beneficio en pacientes individuales es una necesidad médica incumplida.

La presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CTCs CK+, RA+, nucleolos+ en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En las realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende la presencia de CTCs positivas para el extremo N-terminal del RA y CTCs con pérdida del extremo C-terminal del RA. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En las realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende la presencia de CTCs positivas para el extremo N-terminal del RA. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

En las realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende una heterogeneidad incrementada de las CTCs en comparación con una población de referencia. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia en el paciente con cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CK+, RA-, nucleolos+, tamaño pequeño en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia basada en taxanos en un paciente con cáncer que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia basada en taxanos en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CK+, RA-, nucleolos+, tamaño pequeño en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, la quimioterapia basada en taxanos comprende docetaxel o cabazitaxel. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia a la quimioterapia basada en taxanos en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la quimioterapia con taxano-taxano en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CK+, RA-, nucleolos+, tamaño pequeño en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la quimioterapia basada en taxanos comprende docetaxel o cabazitaxel. En ciertas realizaciones, la resistencia es una resistencia de novo.

La presente descripción también proporciona un método para predecir la resistencia de novo a la quimioterapia basada en taxanos en un paciente con cáncer de próstata que comprende (a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), y (b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia de novo a la quimioterapia con taxano-taxano en el paciente con cáncer de próstata, en donde el distintivo de biomarcadores comprende CK+, RA-, nucleolos+, tamaño pequeño en una subpoblación de dichas CTCs. En ciertas realizaciones, la quimioterapia basada en taxanos comprende docetaxel o cabazitaxel.

La invención proporciona un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende

(a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), en donde el análisis directo significa la detección de CTCs en el contexto de todas las células nucleadas del entorno presentes en la muestra, en contraposición a después del enriquecimiento de la muestra en CTCs antes de la detección; y

(b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata,

en donde el distintivo de biomarcadores comprende una subpoblación de dichas CTCs que es positiva para citoqueratina (CK+), positiva para RA (RA+), y comprende nucleolos (nucleolos+),

y en donde dichas CTCs se caracterizan adicionalmente por la tinción positiva del extremo N-terminal del RA y la pérdida del extremo C-terminal del RA.

En ciertos aspectos de la invención, la tinción inmunofluorescente de las células nucleadas comprende pancitoqueratina (CK), el cúmulo de diferenciación (CD) 45, diamidino-2-fenilindol (DAPI) y RA. En aspectos adicionales, la tinción inmunofluorescente de RA comprende la tinción nuclear de RA de los extremos N-terminal y C-terminal.

En ciertos aspectos de la invención, la predicción de la resistencia a la quimioterapia o la terapia selectiva del RA proporciona información para una decisión de tratamiento posterior. En las realizaciones particulares, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (CPRCm).

Los andrógenos en forma de testosterona o la más potente dihidrotestosterona (DHT) han sido impulsores bien definidos de la progresión del cáncer de próstata y la diferenciación de la glándula prostática. Como tal, la columna vertebral del tratamiento para los cánceres de próstata avanzados se estableció hace décadas, cuando la castración en forma de orquiectomía quirúrgica consiguió una regresión significativa de los tumores de próstata. Desde entonces, se ha empleado la sustitución por la castración química, principalmente debido a las preferencias de los pacientes. La Terapia de Privación de Andrógenos (TPA), por lo tanto, se ha convertido en el tratamiento sistémico estándar para el cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico. Aunque la TPA casi siempre es eficaz en la mayoría de pacientes, inevitablemente se da la progresión de la enfermedad hasta la resistencia a la castración. En la actualidad se reconoce que el receptor de andrógenos (RA) se sigue sobreexpresando a pesar de castrar aparentemente los niveles de testosterona, debido a que los receptores alternativos pueden activar el RA, u otros genes objetivo pueden ayudar a perpetuar el fenotipo resistente a la castración, y por lo tanto la expresión "resistencia a la castración" se ha adoptado de manera generalizada en la bibliografía.

El eje del receptor de andrógenos es un objetivo validado para el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración. Se ha postulado que varias perturbaciones en esta ruta conducen a un crecimiento independiente de andrógenos, que incluyen la mutación y la amplificación del receptor de andrógenos, así como la producción autocrina de testosterona. Dos fármacos selectivos de esta ruta en el cáncer de próstata resistente a la castración, acetato de abiraterona (Zytiga®) y enzalutamida (Xtandi®), están aprobados para el uso en pacientes que ya han recibido quimioterapia. Desde un punto de vista mecanístico, la abiraterona ejerce la actividad antitumoral mediante la inhibición de la ruta de la 17,20-liasa, crucial para la síntesis de testosterona. La enzalutamida se une al receptor de andrógenos e impide su translocación al núcleo. La abiraterona también está aprobada para pacientes en el ámbito de la prequimioterapia, basándose en los resultados de ensayos clínicos recientes.

Con las nuevas terapias sistémicas disponibles, la secuencia de tratamiento óptima de estos fármacos en el CPRCm se ha hecho cada vez más importante. La quimioterapia está indicada con frecuencia en el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración, y los agentes basados en taxanos, tales como docetaxel, son a menudo la primera elección. La abiraterona (Zytiga), un fármaco anti-andrógenos, solamente se aprobó inicialmente para el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración tras la quimioterapia. Sin embargo, debido a los resultados satisfactorios del tratamiento, muchos médicos prescriben en la actualidad abiraterona pronto durante el curso del tratamiento. La combinación de abiraterona con enzalutamida parece segura, y la eficacia de esta combinación sobre la enzalutamida sola se está evaluando en la actualidad para detectar una ventaja de supervivencia para el enfoque de combinación como tratamiento inicial, en comparación con el uso secuencial estándar esperado de estos agentes.

Los estudios recientes han sugerido que debido a que la quimioterapia basada en taxanos y la abiraterona son eficaces parcialmente debido a mecanismos similares, el tratamiento anterior con abiraterona puede contribuir a la resistencia a los taxanos y a una eficacia disminuida de la quimioterapia, lo que sugiere una resistencia cruzada clínica. Los presentes métodos posibilitan la determinación de la secuencia óptima para el tratamiento con agentes hormonales (abiraterona y enzalutamida) y la quimioterapia citotóxica (docetaxel y cabazitaxel).

Se debe indicar que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una", "uno" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un biomarcador" incluye una mezcla de dos o más biomarcadores, y similares.

El término "alrededor de", especialmente en referencia a una cantidad concreta, pretende incluir desviaciones de más o menos un cinco por ciento.

Tal como se usan en esta solicitud, lo que incluye las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "un/una", y "el/la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contenido lo dicte claramente de otra manera, y se usan de manera intercambiable con "al menos un/una" y "uno/una o más".

Tal como se usan en la presente memoria, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene", y cualquier variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, de forma que un proceso, método, producto por proceso, o composición de materia que comprende, incluye, o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solamente esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes para tal proceso, método, producto por proceso, o composición de materia.

Un "biomarcador" es cualquier molécula, propiedad, característica o aspecto que se puede medir y correlacionar con la probabilidad de un cáncer de próstata, en particular, CPRCm. El término incluye además cualquier propiedad, característica, rasgo o aspecto de una CTC que se puede medir y correlacionar con respecto a la predicción de la resistencia a una terapia del cáncer de próstata, por ejemplo, la terapia selectiva del RA o la quimioterapia basada en taxanos. Para un biomarcador de CTCs, tal característica medible puede incluir, por ejemplo, la presencia, ausencia, o concentración del biomarcador, o un subtipo del mismo, en la muestra biológica, una expresión proteica alterada, un fenotipo inmunofluorescente y/o morfológico, tal como, por ejemplo, pancitoqueratina (CK), cúmulo de diferenciación (CD) 45, diamidino-2-fenilindol (DAPI) y RA, la tinción nuclear de RA de los extremos N-terminal y C-terminal, un detalle nuclear, el contorno nuclear, la presencia o ausencia de nucleolos, la calidad del citoplasma, la cantidad de citoplasma, la intensidad de los patrones de tinción inmunofluorescente en comparación con los sujetos de control adecuados, y/o la presencia o el grado de heterogeneidad de los fenotipos observados para un biomarcador de CTCs.

Además de los biomarcadores de CTCs, los biomarcadores pueden incluir además indicios de riesgo que incluyen, por ejemplo la edad, los antecedentes familiares, la raza y la dieta. Varios factores están asociados a un riesgo incrementado de cáncer de próstata. La genética, la edad creciente, y factores ambientales y geográficos desempeñan un papel importante. Pero los factores alimentarios, tales como un consumo elevado de grasas - ácidos grasos, ácido alfa-linolénico hallado en la carne roja, etc., la deficiencia de oligoelementos como selenio y los niveles bajos de vitamina D y E también se han implicado con un riesgo incrementado de desarrollo de cáncer de próstata en ciertos individuos.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "distintivo de biomarcadores" se refiere a una combinación que comprende dos o más biomarcadores. El número de biomarcadores útiles para un distintivo de biomarcadores se basa en el valor de la resistencia y la especificidad para la combinación particular de valores de biomarcadores.

El término "paciente", tal como se usa en la presente memoria, se refiere preferiblemente a un ser humano, pero también incluye otros mamíferos. Se observa que, tal como se usan en la presente memoria, los términos "organismo", "individuo", "sujeto", o "paciente" se usan como sinónimos y de manera intercambiable.

La expresión "terapia selectiva del receptor de andrógenos" o "terapia selectiva del RA", en el contexto de los métodos descritos en la presente memoria, incluye cualquier terapia que inhibe directamente o indirectamente la ruta de señalización de RA, lo que incluye, por ejemplo, por medio de la inactivación de la producción de andrógenos, la inactivación de la unión de los andrógenos al RA o la inactivación del RA directamente. Cualquier terapia que altere el eje de señalización de RA e inhiba la ruta de señalización se incluye por tanto en la expresión terapia selectiva del RA. Un ejemplo de inhibición directa, enzalutamida, también conocida como MDV3100, es uno de los antagonistas de RA estudiados con más frecuencia. La enzalutamida selecciona como objetivo varias etapas de la ruta de señalización de RA. Debido a su afinidad de unión incrementada hacia el RA, es capaz de bloquear la unión de los andrógenos al receptor, lo que impide la translocación nuclear del RA, la unión al ADN, y la incorporación de co-activadores del complejo ligando-receptor. Una de las características más notables de la enzalutamida es que es capaz de unirse e inhibir no solamente el RA de tipo natural, sino también el mutante, lo que implica las mutaciones puntuales del RA que habitualmente se dan tras la progresión del CP que provocan la resistencia tras la castración. Otro agente emergente en el tratamiento del CPRC es el acetato de abiraterona. Mientras la enzalutamida selecciona como objetivo el RA directamente, la abiraterona actúa inhibiendo indirectamente la ruta de señalización del RA. La abiraterona inhibe CYP17, una enzima de la familia del citocromo P450. Esta inhibición es significativa, ya que CYP17 desempeña un papel crucial en la síntesis de testosterona. Por lo tanto, la inhibición provoca la inhibición de la síntesis de testosterona, limitando la cantidad de andrógenos circulantes en el cuerpo, y por tanto limitando también la acción del RA. Aunque la castración es capaz de disminuir la síntesis de testosterona y DHT, no elimina todas las fuentes posibles de andrógenos en el cuerpo, tales como los andrógenos intratumorales o suprarrenales. Como entenderán los expertos en la técnica, cualquier mecanismo de inhibición de andrógenos es una vía potencial para la terapia selectiva del RA.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "resistencia", en el contexto de la terapia selectiva del RA o la quimioterapia, que incluye los taxanos, significa que el sujeto no muestra una respuesta a la terapia basada en una capacidad subyacente de las células tumorales de escapar del efecto del agente terapéutico. La resistencia incluye la resistencia de novo y la resistencia adquirida. Los pacientes con cáncer que exhiben una resistencia de novo no responden a la quimioterapia desde el inicio. Sin embargo, en la resistencia adquirida, las células cancerosas responden inicialmente a un fármaco quimioterápico, pero finalmente adquieren resistencia hacia él. Las células también podrían mostrar una resistencia cruzada hacia otros fármacos sin relación estructural ni mecanística, un fenómeno conocido habitualmente como multirresistencia a fármacos (MRF). Debido a la adquisición de MRF, los regímenes de tratamiento que combinan múltiples agentes con diferentes objetivos dejan de ser eficaces.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "heterogeneidad de CTCs" se refiere a la diversidad de CTCs en una muestra. La heterogeneidad se puede determinar clasificando las CTCs en tipos específicos, y contando el número de cada tipo que se observa en la muestra. La existencia de más tipos de CTCs significa que se ha hallado una población más diversa de CTCs. Por ejemplo, para los pacientes X e Y de la Tabla 1, con los siguientes números de subtipos de CTCs, el Paciente X tiene una heterogeneidad mayor que el Paciente Y, incluso aunque tengan el mismo número de células. Como se describe en la presente memoria, la presencia de un grado mayor de heterogeneidad entre CTCs o un incremento de la heterogeneidad en comparación con un nivel de referencia puede ser indicativa de la resistencia a la terapia selectiva del RA.

Tabla 1. Heterogeneidad de CTCs

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "célula tumoral circulante" o "CTC" pretende incluir cualquier célula poco frecuente que está presente en una muestra biológica y que está relacionada con el cáncer de próstata. Las CTCs, que pueden estar presentes en forma de CTCs individuales tradicionales o no tradicionales o en agrupamientos de CTCs, con frecuencia son células epiteliales desprendidas de tumores sólidos halladas a concentraciones muy bajas en la circulación de los pacientes. En el término "CTCs" se incluyen las "CTCs tradicionales", que se definen adicionalmente como una CTC individual que es positiva para citoqueratina, negativa para CD45, contiene un núcleo positivo para DAPI, y es morfológicamente diferente de los glóbulos blancos del entorno. El término "CTC" también incluye las "CTCs no tradicionales", que se refieren a una CTC que difiere de una CTC tradicional en al menos una característica. Las CTCs no tradicionales incluyen agrupamientos de CTCs, CTCs negativas para CK que son positivas al menos para un biomarcador adicional que permite la clasificación como CTC, CTCs pequeñas, CTCs nucleolos+ y CTCs con un patrón punteado de CK. La expresión "CTC pequeña" se refiere a una CTC que es de igual o menor tamaño que el tamaño medio de los GBs de la muestra. La expresión "agrupamiento de CTCs" también se incluye en la definición de "CTCs", y significa además dos o más CTCs con membranas celulares en contacto.

En ciertas realizaciones, la frecuencia de CTCs con truncamientos en el extremo C-terminal del RA es un biomarcador útil para la práctica de los métodos de la invención. Tal como se describe en la presente memoria, la disminución en la tinción nuclear del extremo C-terminal de RA en comparación con la tinción nuclear del extremo N-terminal de RA puede ser parte de un distintivo de biomarcadores predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA. Además, una disminución de la tinción nuclear del extremo C-terminal de RA en comparación con la tinción nuclear del extremo N-terminal de RA puede ser parte de un distintivo de biomarcadores predictivo de la resistencia a inhibidores de CYP17 tales como orteronel, galeterona y VT-464, activadores de PP2A, y fármacos selectivos del extremo N-terminal del RA, tales como EPI-001, EPI-002 y EPI-506.

En su sentido más amplio, una muestra biológica puede ser cualquier muestra que contenga CTCs. Una muestra puede comprender un líquido corporal, tal como sangre; la fracción soluble de una preparación celular, o una alícuota de medios en los que se han cultivado células; un cromosoma, un orgánulo, o membrana aislada o extraída de una célula; ADN genómico, ARN, o cADN en disolución o unido a un sustrato; una célula; un tejido; una impresión tisular; una huella dactilar; células; piel, y similares. Una muestra biológica obtenida de un sujeto puede ser cualquier muestra que contenga células, e incluye cualquier material en el que se pueden detectar CTCs. Una muestra puede ser, por ejemplo, sangre completa, plasma, saliva u otro líquido o tejido corporal que contenga células.

En las realizaciones particulares, la muestra biológica es una muestra de sangre. Como se describe en la presente memoria, una muestra puede ser sangre completa, más preferiblemente sangre periférica o una fracción celular de la sangre periférica. Como apreciarán los expertos en la técnica, una muestra de sangre puede incluir cualquier fracción o componente de la sangre, sin limitación, células T, monocitos, neutrófilos, eritrocitos, plaquetas y microvesículas, tales como exosomas y vesículas similares a exosomas. En el contexto de esta descripción, las células sanguíneas incluidas en una muestra de sangre incluyen cualquier célula nucleada, y no se limitan a los componentes de la sangre completa. Como tales, las células sanguíneas incluyen, por ejemplo, tanto glóbulos blancos (GBs) como células poco frecuentes, que incluyen las CTCs.

Las muestras de esta descripción pueden contener una diversidad de poblaciones celulares y subpoblaciones celulares que son distinguibles mediante métodos muy conocidos en la técnica (p.ej., FACS, inmunohistoquímica). Por ejemplo, una muestra de sangre puede contener poblaciones de células no nucleadas, tales como eritrocitos (p.ej., 4­ 5 millones/gl) o plaquetas (150.000-400.000 células/gl), y poblaciones de células nucleadas, tales como GBs (p.ej., 4.500 - 10.000 células/gl), CECs o CTCs (células tumorales circulantes; p.ej., 2-800 células/gl). Los GBs pueden contener subpoblaciones celulares, p.ej., de neutrófilos (2.500-8.000 células/gl), linfocitos (1.000-4.000 células/gl), monocitos (100-700 células/gl), eosinófilos (50-500 células/gl), basófilos (25 - 100 células/gl y similares. Las muestras de esta descripción son muestras sin enriquecer, es decir, no están enriquecidas en ninguna población o subpoblación específicas de células nucleadas. Por ejemplo, las muestras de sangre sin enriquecer no están enriquecidas en CTCs, GB, células B, células T, células NK, monocitos, o similares.

En ciertos aspectos, la muestra es una muestra de sangre obtenida de un sujeto sano o un sujeto que se considera que tiene un riesgo elevado de cáncer de próstata o metástasis de un cáncer de próstata existente, basándose en criterios clínicamente establecidos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, la edad, la raza, y los antecedentes familiares. En ciertas realizaciones, la muestra de sangre es de un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer de próstata y/o CPRCm basándose en una biopsia tisular o líquida y/o en criterios quirúrgicos o clínicos. En ciertas realizaciones, la muestra de sangre se obtiene de un sujeto que muestra una manifestación clínica de cáncer de próstata y/o CPRCm muy conocida en la técnica, o que presenta cualquiera de los factores de riesgo conocidos para el cáncer de próstata y/o CPRCm. En las realizaciones particulares, el paciente padece CPRCm.

Tal como se usa en la presente memoria en el contexto de la identificación de CTCs en una muestra, la expresión "análisis directo" significa que las CTCs se detectan en el contexto de todas las células nucleadas del entorno presentes en la muestra, en contraposición a después del enriquecimiento de la muestra en CTCs antes de la detección. En ciertas realizaciones, los métodos comprenden la microscopía, que proporciona un campo de visión que incluye tanto CTCs como al menos 200 glóbulos blancos (GBs) del entorno.

Un aspecto fundamental de la presente descripción es la solidez sin precedentes de los métodos descritos con respecto a la detección de CTCs. La detección de eventos infrecuentes descrita en la presente memoria con respecto a las CTCs se basa en un análisis directo, es decir, sin enriquecimiento, de una población que incluye la identificación de eventos poco frecuentes en el contexto de eventos que no son infrecuentes en el entorno. La identificación de los eventos infrecuentes según los métodos descritos identifica intrínsecamente los eventos del entorno como eventos no infrecuentes. Teniendo en cuenta los eventos no infrecuentes del entorno y determinando las medias para los eventos no infrecuentes, por ejemplo, el tamaño celular medio de los eventos no infrecuentes, se posibilita la calibración del método de detección eliminando el ruido. El resultado es una solidez de los métodos descritos que no se puede conseguir con los métodos que no se basan en el análisis directo, sino que comparan poblaciones enriquecidas con comparaciones contextuales intrínsecamente distorsionadas de eventos infrecuentes. La solidez de los métodos de análisis directos descritos en la presente memoria posibilita la caracterización de CTCs, lo que incluye los subtipos de CTCs descritos en la presente memoria, que tiene en cuenta la identificación de los fenotipos y la heterogeneidad que no se puede conseguir con otros métodos de detección de CTCs y que posibilita el análisis de biomarcadores en el contexto de los métodos reivindicados.

En ciertas realizaciones, los métodos de predicción de la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata puede incluir además los factores de riesgo de pacientes individuales y los datos de imagenología, que incluyen cualquier modalidad de imagenología conocida y usada en la técnica, por ejemplo y sin limitación, tomografía computerizada de rayos X (TC), ecografía, tomografía de emisión de positrones (TEP), tomografía de impedancia eléctrica y resonancia magnética (IRM). Se entiende que un experto en la técnica puede seleccionar una modalidad de imagenología basándose en una diversidad de criterios conocidos en la técnica. Como se describe en la presente memoria, los métodos de la invención pueden incluir uno o más fragmentos de datos de imagenología. En los métodos descritos en la presente memoria, se pueden seleccionar uno o más factores de riesgo individuales del grupo que consiste en la edad, la raza, y los antecedentes familiares. Se entiende que un experto en la técnica puede seleccionar factores de riesgo individuales adicionales basándose en una diversidad de criterios conocidos en la técnica. Como se describe en la presente memoria, los métodos de la invención pueden incluir uno o más factores de riesgo individuales. Por lo tanto, los biomarcadores pueden incluir datos de imagenología, factores de riesgo individuales y datos de CTCs. Como se describe en la presente memoria, los biomarcadores también pueden incluir, pero sin limitación, moléculas biológicas que comprenden nucleótidos, ácidos nucleicos, nucleósidos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos, esteroides, metabolitos, péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, hormonas, anticuerpos, regiones de interés que sirven como sustitutos para macromoléculas biológicas y combinaciones de los mismos (p.ej., glicoproteínas, ribonucleoproteínas, lipoproteínas), así como porciones o fragmentos de una molécula biológica.

Las CTCs se pueden identificar mediante cualquier método adecuado que incluye, por ejemplo, mediante características morfológicas y características inmunofluorescentes. Como entenderán los expertos en la técnica, los biomarcadores pueden incluir una molécula biológica, o un fragmento de una molécula biológica, cuyo cambio y/o detección se puede correlacionar, individualmente o combinado con otras características medibles, con el cáncer de próstata y/o el CPRCm. Las CTCs, que pueden estar presentes en una célula individual o en agrupamientos de CTCs, con frecuencia son células epiteliales desprendidas de tumores sólidos, y están presentes a concentraciones muy bajas en la circulación de los sujetos. Por lo tanto, la detección de las CTCs en una muestra de sangre se puede denominar detección de evento infrecuente. Las CTCs tienen una abundancia de menos de 1:1.000 en una población de células sanguíneas, p.ej., una abundancia de menos de 1:5.000, 1:10.000, 1:30.000, 1:50:000, 1:100.000, 1:300.000, 1:500.000, o 1:1.000.000. En ciertas realizaciones, la CTC tiene una abundancia de 1:50:000 a 1:100.000 en la población celular.

Las muestras de esta descripción se pueden obtener mediante cualquier medio, que incluye, p.ej., por medio de una biopsia de tejido sólido o una biopsia líquida (véase, p.ej., Marrinucci D. etal., 2012, Phys. Biol.9016003). Brevemente, en las realizaciones particulares, el proceso puede incluir la lisis y la eliminación de los eritrocitos en una muestra de sangre de 7,5 mL, el depósito de las células nucleadas restantes en un portaobjetos de microscopio especializado, cada uno de los cuales da cabida al equivalente de aproximadamente 0,5 mL de sangre completa. Se puede extraer una muestra de sangre de cualquier fuente que se sepa que incluye células de la sangre o componentes de la misma, tales como sangre venosa, arterial, periférica, tisular, de cordón, y similares. Las muestras se pueden procesar mediante el uso de métodos clínicos muy conocidos y rutinarios (p.ej., procedimientos para extraer y procesar sangre completa). En ciertas realizaciones, se extrae una muestra de sangre en tubos de recogida de sangre (BCT) con anti­ coagulante, que puede contener EDTA o Streck Cell-Free DNA™. En otras realizaciones, se extrae una muestra de sangre en tubos CellSave® (Veridex). Además, se puede almacenar una muestra de sangre durante hasta 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, o 60 horas antes del procesamiento posterior.

En ciertas realizaciones, los métodos de esta descripción comprenden una etapa inicial de obtención de un recuento de glóbulos blancos (GB) para la muestra de sangre. En ciertas realizaciones, el recuento de GB se puede obtener usando un dispositivo HemoCue® WBC (Hemocue, Ángelholm, Suecia). En ciertas realizaciones, el recuento de GB se usa para determinar la cantidad de sangre necesaria para colocar en una placa un volumen de carga coherente de células nucleadas por portaobjetos, y para calcular el equivalente de CTCs por volumen de sangre.

En ciertas realizaciones, los métodos de esta descripción comprenden una etapa inicial para lisar los eritrocitos de la muestra de sangre. En ciertas realizaciones, los eritrocitos se lisan, p.ej., añadiendo una disolución de cloruro amónico a la muestra de sangre. En ciertas realizaciones, una muestra de sangre se somete a centrifugación tras la lisis de los eritrocitos, y las células nucleadas se resuspenden, p.ej., en una disolución de PBS.

En ciertas realizaciones, las células nucleadas de una muestra, tal como una muestra de sangre, se depositan en forma de una monocapa en un soporte plano. El soporte plano puede ser de cualquier material, p.ej. cualquier material claro fluorescente, cualquier material que conduzca a la adhesión celular, cualquier material que conduzca a la eliminación sencilla de los restos celulares, cualquier material que tenga un grosor de < 100 gm. En ciertas realizaciones, el material es una película. En ciertas realizaciones el material es un portaobjetos de vidrio. En ciertas realizaciones, el método incluye una etapa inicial para depositar las células nucleadas de la muestra de sangre en forma de una monocapa en un portaobjetos de vidrio. El portaobjetos de vidrio se puede revestir para permitir una retención máxima de las células vivas (véase, p.ej., Marrinucci D. et al., 2012, Phys. Biol. 9 016003). En ciertas realizaciones, se depositan alrededor de 0,5 millones, 1 millón, 1,5 millones, 2 millones, 2,5 millones, 3 millones, 3,5 millones, 4 millones, 4,5 millones, o 5 millones de células nucleadas sobre el portaobjetos de vidrio. En ciertas realizaciones, los métodos de esta descripción comprenden depositar alrededor de 3 millones de células sobre un portaobjetos de vidrio. En las realizaciones adicionales, los métodos de esta descripción comprenden depositar entre alrededor de 2 millones y alrededor de 3 millones de células sobre el portaobjetos de vidrio. En ciertas realizaciones, el portaobjetos de vidrio y las muestras celulares inmovilizadas están disponibles para el procesamiento o la experimentación posterior después de haber completado los métodos de esta descripción.

En ciertas realizaciones, los métodos de esta descripción comprenden una etapa inicial de identificación de las células nucleadas en la muestra de sangre sin enriquecer. En ciertas realizaciones, las células nucleadas se identifican con una tinción fluorescente. En ciertas realizaciones, la tinción fluorescente comprende una tinción específica de ácidos nucleicos. En ciertas realizaciones, la tinción fluorescente es diamidino-2-fenilindol (DAPI). En ciertas realizaciones, la tinción inmunofluorescente de las células nucleadas comprende pancitoqueratina (CK), cúmulo de diferenciación (CD) 45 y DAPI. En ciertas realizaciones descritas adicionalmente en la presente memoria, las CTCs comprenden una tinción inmunofluorescente diferente de las células nucleadas del entorno. En ciertas realizaciones, la tinción inmunofluorescente diferente de las CTCs comprende DAPI (+), CK (+) y CD 45 (-). En ciertas realizaciones, la identificación de las CTCs comprende adicionalmente comparar la intensidad de la tinción fluorescente de pancitoqueratina con las células nucleadas circundantes. En ciertas realizaciones, la identificación de las CTCs incluye la microscopía de barrido de fluorescencia para detectar la tinción inmunofluorescente de las células nucleadas en una muestra de sangre. (Marrinucci D. et al., 2012, Phys. Biol. 9016003).

En las realizaciones particulares, todas las células nucleadas se retienen y se tiñen mediante inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales que seleccionan como objetivo la citoqueratina (CK), un filamento intermedio hallado exclusivamente en las células epiteliales, un anticuerpo específico panleucocitario que selecciona como objetivo el antígeno leucocitario común CD45, y una tinción nuclear, DAPI. Se pueden tomar imágenes de las células sanguíneas nucleadas en múltiples canales fluorescentes para producir imágenes digitales de alta calidad y resolución que conservan los sutiles detalles citológicos del contorno nuclear y la distribución citoplasmática. Aunque los GBs del entorno se pueden identificar con el anticuerpo específico panleucocitario que selecciona como objetivo CD45, las CTCs se pueden identificar como DAPI (+), CK (+) y CD 45 (-). En los métodos descritos en la presente memoria, las CTCs comprenden una tinción inmunofluorescente diferente de las células nucleadas del entorno.

En las realizaciones adicionales, las CTCs incluyen las CTCs tradicionales, también conocidas como CTCs de alta definición (HD-CTCs). Las CTCs tradicionales son positivas para CK, negativas para CD45, contienen un núcleo intacto positivo para DAPI sin cambios apoptóticos identificables ni un aspecto alterado, y son morfológicamente diferentes de los glóbulos blancos (GBs) del entorno. Las intensidades de DAPI (+), CK (+) y CD45 (-) se pueden clasificar como características medibles durante la enumeración de HD-CTCs como se describió previamente (Figura 1). Nieva etal., Phys Biol 9:016004 (2012). El análisis directo, sin enriquecimiento, empleado por los métodos descritos en la presente memoria da como resultado una alta sensibilidad y especificidad, mientras añade una citomorfología de alta definición para posibilitar una caracterización morfológica detallada de una población de CTCs, que se sabe que es heterogénea.

Aunque las CTCs se pueden identificar como células que son DAPI (+), CK (+) y CD 45 (-), los métodos de la descripción se pueden poner en práctica con cualquier otro biomarcador, tal como RA(+) y nucleolos (+), que un experto en la técnica selecciona para caracterizar las CTCs y/o identificar las CTCs y los agrupamientos de CTCs. Un experto en la técnica conoce cómo seleccionar una característica morfológica, una molécula biológica, o un fragmento de una molécula biológica, cuyo cambio y/o detección se pueden correlacionar con una CTC. Los biomarcadores moleculares incluyen, pero sin limitación, moléculas biológicas que comprenden nucleótidos, ácidos nucleicos, nucleósidos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos, esteroides, metabolitos, péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, hormonas, anticuerpos, regiones de interés que sirven como sustitutos para macromoléculas biológicas y combinaciones de los mismos (p.ej., glicoproteínas, ribonucleoproteínas, lipoproteínas). El término también incluye las porciones o los fragmentos de una molécula biológica, por ejemplo, un fragmento peptídico de una proteína o polipéptido.

Una persona experta en la técnica apreciará que se pueden usar varios métodos para identificar las CTCs, que incluyen las aproximaciones basadas en microscopía, que incluye la microscopía de barrido de fluorescencia (véase, p.ej., Marrinucci D. et al., 2012, Phys. Biol. 9016003), las aproximaciones mediante espectrometría de masas, tales como MS/MS, LC-MS/MS, monitorización de reacciones múltiples (MRM) o SRM y monitorización de iones de productos (PIM), y también incluyen los métodos basados en anticuerpos, tales como inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, inmunoensayos tales como transferencias de Western, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación, radioinmunoensayo, transferencia puntual, y FACS. Los expertos en la técnica conocen en general las técnicas y protocolos de inmunoensayos (Price y Newman, Principles and Practice of Immunoassay, 2a Edición, Grove's Dictionaries, 1997; y Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000). Se puede usar una diversidad de técnicas de inmunoensayos, que incluyen los inmunoensayos competitivos y no competitivos (Self et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996), véase también John R. Crowther, The ELISA Guidebook, 1a ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282 y An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, de Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198).

Una persona experta en la técnica apreciará además que se puede detectar la presencia o ausencia de biomarcadores mediante el uso de cualquier clase de reactivos de unión específicos de los marcadores conocidos en la técnica, que incluyen, p.ej., anticuerpos, aptámeros, proteínas de fusión, tales como proteínas de fusión que incluyen componentes de receptores proteicos o ligandos proteicos, o moléculas de unión pequeñas específicas de los biomarcadores. En ciertas realizaciones, se determina la presencia o ausencia de CK o CD45 mediante un anticuerpo.

Los anticuerpos de esta descripción se unen de manera específica a un biomarcador. El anticuerpo se puede preparar mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Véase, p.ej., Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed. 1986). El anticuerpo puede ser cualquier inmunoglobulina o su derivado, producido de manera natural o completamente o parcialmente sintética. También se incluyen en el término todos los derivados del mismo que mantienen una capacidad de unión específica. El anticuerpo tiene un dominio de unión que es homólogo o en gran medida homólogo a un dominio de unión de una inmunoglobulina, y se puede obtener de fuentes naturales, o se puede producir de manera parcialmente o completamente sintética. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple. Las personas de experiencia habitual en la técnica apreciarán que el anticuerpo se puede proporcionar en cualquiera de una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, en forma humanizada, parcialmente humanizada, quimérica, humanizada quimérica, etc. El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo que incluye, pero sin limitación, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diacuerpo, y Fd. El anticuerpo se puede producir mediante cualquier medio. Por ejemplo, el anticuerpo se puede producir enzimáticamente o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto, y/o se puede producir de manera recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia del anticuerpo parcial. El anticuerpo puede comprender un fragmento de anticuerpo de cadena simple. De manera alternativa o adicional, el anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que están unidas entre sí, por ejemplo, mediante uniones disulfuro, y cualquier fragmento funcional obtenido a partir de tales moléculas, en donde tales fragmentos conservan las propiedades de unión específica de la molécula de anticuerpo original. Debido a su menor tamaño como componentes funcionales de la molécula completa, los fragmentos de anticuerpo pueden ofrecer ventajas respecto de los anticuerpos intactos para el uso en ciertas técnicas inmunoquímicas y aplicaciones experimentales.

Se puede usar un marcador detectable en los métodos descritos en la presente memoria para la detección directa o indirecta de los biomarcadores al identificar las CTCs en los métodos de la invención. Se puede usar una amplia diversidad de marcadores detectables, y la elección del marcador depende de la sensibilidad necesaria, la facilidad de la conjugación con el anticuerpo, los requisitos de estabilidad, y la instrumentación disponible y las estipulaciones de eliminación. Los expertos en la técnica están familiarizados con la selección de un marcador detectable adecuado basándose en la detección analítica de los biomarcadores de los métodos de la invención. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero sin limitación, colorantes fluorescentes (p.ej. fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodimina (TRITC), Cy3, Cy5, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 488), marcadores fluorescentes (p.ej. proteína fluorescente verde (GFP), ficoeritrina, etc.), enzimas (p.ej., luciferasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, etc.), nanopartículas, biotina, digoxigenina, metales, y similares.

Para el análisis basado en espectrometría de masas, el marcaje diferencial con reactivos isotópicos, p.ej., marcadores de afinidad codificados por isótopo (ICAT) o la variación más reciente que usa reactivos de marcaje isobárico, iTRAQ (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), seguido de cromatografía líquida (LC) multidimensional y el análisis mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) pueden proporcionar una metodología adicional para poner en práctica los métodos de esta descripción.

Se puede usar un ensayo de quimioluminiscencia que usa un anticuerpo quimioluminiscente para la detección sensible y sin radiactividad de proteínas. También puede ser adecuado un anticuerpo marcado con un fluorocromo. Los ejemplos de fluorocromos incluyen, sin limitación, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo Texas, y lisamina. Los marcadores indirectos incluyen diversas enzimas muy conocidas en la técnica, tales como peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa, ureasa, y similares. Los sistemas de detección que usan sustratos adecuados para la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa son muy conocidos en la técnica.

Se puede analizar una señal del marcador directo o indirecto, por ejemplo, mediante el uso de un microscopio, tal como un microscopio de fluorescencia o un microscopio de barrido de fluorescencia. De manera alternativa, se puede usar un espectrofotómetro para detectar el color de un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar la radiación, tal como un contador gamma para la detección de 125I; o un fluorímetro para detectar la fluorescencia en presencia de una luz de una cierta longitud de onda. Si se desea, los ensayos usados para poner en práctica los métodos de esta descripción se pueden automatizar o llevar a cabo de manera robótica, y se puede detectar simultáneamente la señal de múltiples muestras.

En ciertas realizaciones, los biomarcadores son marcadores inmunofluorescentes. En ciertas realizaciones, los marcadores inmunofluorescentes comprenden un marcador específico de las células epiteliales. En ciertas realizaciones, los marcadores inmunofluorescentes comprenden un marcador específico de glóbulos blancos (GBs). En ciertas realizaciones, uno o más de los marcadores inmunofluorescentes comprenden CD 45 y CK.

En ciertas realizaciones, la presencia o ausencia de los marcadores inmunofluorescentes en las células nucleadas, tales como CTCs o GBs, da como resultado diferentes patrones de tinción inmunofluorescente. Los patrones de tinción inmunofluorescente para CTCs y GBs pueden diferir en base a qué marcadores de células epiteliales o de GB se detectan en las células respectivas. En ciertas realizaciones, la determinación de la presencia o ausencia de uno o más marcadores inmunofluorescentes comprende comparar la diferente tinción inmunofluorescente de las CTCs con la diferente tinción inmunofluorescente de los GBs mediante el uso, por ejemplo, de la tinción inmunofluorescente de CD45, que identifica claramente los GBs. Existen otros marcadores detectables o combinaciones de marcadores detectables que se unen a las diversas subpoblaciones de GBs. Estos se pueden usar en diversas combinaciones, lo que incluye en combinación o como alternativa a la tinción inmunofluorescente de CD45.

En ciertas realizaciones, las CTCs comprenden diferentes características morfológicas en comparación con las células nucleadas del entorno. En ciertas realizaciones, las características morfológicas comprenden el tamaño del núcleo, la forma del núcleo, el tamaño de la célula, la forma de la célula, y/o la proporción nuclear/citoplasmática. En ciertas realizaciones, el método comprende además analizar las células nucleadas por el detalle nuclear, el contorno nuclear, la presencia o ausencia de nucleolos, la calidad del citoplasma, la cantidad de citoplasma, y la intensidad de los patrones de la tinción inmunofluorescente. Una persona de experiencia habitual en la técnica entiende que las características morfológicas de esta descripción pueden incluir cualquier rasgo, propiedad, característica, o aspecto de una célula que se puede determinar y correlacionar con la detección de una CTC.

Las CTCs se pueden caracterizar con cualquier método microscópico conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, el método se lleva a cabo mediante microscopía de barrido de fluorescencia. En ciertas realizaciones, el método microscópico proporciona imágenes de alta resolución de las CTCs y los GBs de su entorno (véase, p.ej., Marrinucci D. etal., 2012, Phys. Biol. 9016003)). En ciertas realizaciones, un portaobjetos revestido con una monocapa de células nucleadas de una muestra, tal como una muestra de sangre sin enriquecer, se somete a un barrido mediante un microscopio de barrido de fluorescencia, y se registran las intensidades de fluorescencia de los marcadores inmunofluorescentes y las tinciones nucleares para permitir la determinación de la presencia o ausencia de cada marcador inmunofluorescente y la determinación de la morfología de las células nucleadas. En ciertas realizaciones, la recogida y el análisis de los datos de microscopía se llevan a cabo de una manera automatizada.

En ciertas realizaciones, la identificación de las CTCs por medio del análisis directo incluye la detección de uno o más biomarcadores, por ejemplo, CK y CD 45. Un biomarcador se considera "presente" en una célula si es detectable por encima del ruido de fondo del método de detección respectivo usado (p.ej. 2 veces, 3 veces, 5 veces, o 10 veces mayor que el fondo; p.ej., 2o o 3o sobre el fondo). En ciertas realizaciones, un biomarcador se considera "ausente" si no es detectable por encima del ruido de fondo del método de detección usado (p.ej., <1,5 veces o <2,0 veces mayor que la señal de fondo; p.ej., <1,5o o <2,0o sobre el fondo).

En ciertas realizaciones, la presencia o ausencia de marcadores inmunofluorescentes en las células nucleadas se determina seleccionando los tiempos de exposición durante el proceso de barrido de fluorescencia, de forma que todos los marcadores inmunofluorescentes alcanzan un nivel preseleccionado de fluorescencia en los GBs del campo de visión. En estas condiciones, los marcadores inmunofluorescentes específicos de CTCs, incluso aunque estén ausentes en los GBs, son visibles en los GBs como señales de fondo con alturas fijadas. Además, los marcadores inmunofluorescentes específicos de GBs que están ausentes en las CTCs son visibles en las CTCs como señales de fondo con alturas fijadas. Una célula se considera positiva para un marcador inmunofluorescente (es decir, el marcador se considera presente) si su señal fluorescente para el marcador respectivo es significativamente mayor que la señal de fondo fijada (p.ej., 2 veces, 3 veces, 5 veces, o 10 veces mayor que el fondo; p.ej., 2o o 3o sobre el fondo). Por ejemplo, una célula nucleada se considera positiva para CD 45 (CD 45+) si su señal fluorescente para CD 45 es significativamente mayor que la señal de fondo. Una célula se considera negativa para un marcador inmunofluorescente (es decir, el marcador se considera ausente) si la señal de fluorescencia de la célula para el marcador respectivo no es significativamente mayor que la señal de fondo (p.ej., <1,5 veces o <2,0 veces mayor que la señal de fondo; p.ej., <1,5o o <2,0o sobre el fondo).

En general, cada campo microscópico contiene tanto CTCs como GBs. En ciertas realizaciones, el campo microscópico muestra al menos 1,5, 10, 20, 50, o 100 CTCs. En ciertas realizaciones, el campo microscópico muestra al menos 10, 25, 50, 100, 250, 500, o 1.000 veces más GBs que CTCs. En ciertas realizaciones, el campo microscópico comprende una o más CTCs o agrupamientos de CTCs rodeados por al menos 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1.000 o más GBs.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria, la identificación de CTCs por medio de un análisis directo comprende la enumeración de las CTCs que están presentes en la muestra de sangre. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria incluyen la detección de al menos 1,0 CTC/mL de sangre, 1,5 CTCs/mL de sangre, 2,0 CTCs/mL de sangre, 2,5 CTCs/mL de sangre, 3,0 CTCs/mL de sangre, 3,5 CTCs/mL de sangre, 4,0 CTCs/mL de sangre, 4,5 CTCs/mL de sangre, 5,0 CTCs/mL de sangre, 5,5 CTCs/mL de sangre, 6,0 CTCs/mL de sangre, 6,5 CTCs/mL de sangre, 7,0 CTCs/mL de sangre, 7,5 CTCs/mL de sangre, 8,0 CTCs/mL de sangre, 8,5 CTCs/mL de sangre, 9,0 CTCs/mL de sangre, 9,5 CTCs/mL de sangre, 10 CTCs/mL de sangre, o más.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria, la identificación de las CTCs comprende la detección de diferentes subtipos de CTCs, que incluyen las CTCs no tradicionales. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria incluyen la detección de al menos 0,1 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,2 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,3 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,4 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,5 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,6 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,7 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,8 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 0,9 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 1 agrupamiento de CTCs/mL de sangre, 2 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 3 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 4 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 5 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 6 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 7 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 8 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 9 agrupamientos de CTCs/mL de sangre, 10 agrupamientos/mL o más. En una realización particular, los métodos descritos en la presente memoria incluyen la detección de al menos 1 agrupamiento de CTCs/mL de sangre.

En ciertas realizaciones, los métodos que predicen la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) comprende el análisis genómico de las CTCs, por ejemplo, mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH). En ciertas realizaciones, los métodos que predicen la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) comprenden la detección del reordenamiento del gen relacionado con el factor específico de transformación de eritroblastos (ETS) (ERG). En ciertas realizaciones, los métodos que predicen la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) comprenden la detección de la pérdida del gen del homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN).

Las técnicas de biología molecular habituales conocidas en la técnica y no descritas de manera específica se siguen en líneas generales como en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989), y como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) y como en Perbal, A Practica! Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988), y como en Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nueva York y en Birren et al. (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998). La reacción de cadena de la polimerasa (PCR) se puede llevar a cabo en general como en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se puede usar cualquier método capaz de determinar un perfil del número de copias de ADN de una muestra particular para realizar el perfil molecular según la descripción, con tal de que la resolución sea suficiente para identificar los biomarcadores. El técnico experto conoce y es capaz de usar varias plataformas diferentes para estudiar los cambios en el número de copias de un genoma completo a una resolución suficiente para identificar el número de copias del o de los biomarcadores de la descripción.

Los ensayos de hibridación in situ son muy conocidos y se describen en general en Angerer et al., Methods Enzymol.

152:649-660 (1987). En un ensayo de hibridación in situ, las células, p.ej. de una biopsia, se fijan a un soporte sólido, en general un portaobjetos de vidrio. Si se va a sondear el ADN, las células se desnaturalizan con calor o un álcali. Después las células se ponen en contacto con una disolución de hibridación a una temperatura moderada para permitir la hibridación de sondas específicas que están marcadas. Las sondas están marcadas preferiblemente con radioisótopos o marcadores fluorescentes. La FISH (hibridación in situ fluorescente) usa sondas fluorescentes que se unen solamente a las partes de una secuencia con las que muestran un grado elevado de similitud de secuencia.

La FISH es una técnica citogenética usada para detectar y localizar secuencias polinucleotídicas específicas en las células. Por ejemplo, se puede usar FISH para detectar secuencias de ADN en los cromosomas. También se puede usar FISH para detectar y localizar ARNs específicos, p.ej. mARNs, en muestras de tejido. En la FISH, se usan sondas fluorescentes que se unen a secuencias nucleotídicas específicas hacia las que muestran un grado elevado de similitud de secuencia. Se puede usar la microscopía de fluorescencia para determinar si se unen las sondas fluorescentes, y dónde se unen. Además de detectar secuencias nucleotídicas específicas, p.ej. translocaciones, fusiones, roturas, duplicaciones y otras anormalidades cromosómicas, la FISH puede ayudar a definir los patrones espaciotemporales del número de copias de un gen específico y/o de la expresión génica en células y tejidos.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata incluyen el uso de un modelo predictivo. En las realizaciones adicionales, los métodos descritos para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata incluyen comparar una característica medible con una característica de referencia. Como pueden apreciar los expertos en la técnica, tal comparación puede ser una comparación directa con la característica de referencia o una comparación indirecta, donde se ha incorporado la característica de referencia en el modelo predictivo. En las realizaciones adicionales, el análisis de una característica medible para identificar de manera prospectiva la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata incluye uno o más de un modelo de análisis discriminante lineal, un algoritmo de clasificación de máquinas vectoriales de soporte, un modelo de eliminación de características recursivas, un análisis de predicción de un modelo de micromatrices, un modelo de regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo FlexTree, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, un algoritmo de aprendizaje automatizado, un método de regresión penalizada, o una combinación de los mismos. En las realizaciones particulares, el análisis comprende la regresión logística. En las realizaciones adicionales, los métodos para predecir la resistencia a la terapia selectiva el receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata se expresa en forma de un índice de riesgo.

Un proceso de clasificación analítica puede usar cualquiera de una diversidad de métodos analíticos estadísticos para manipular los datos cuantitativos y proporcionar la clasificación de la muestra. Los ejemplos de los métodos útiles incluyen el análisis discriminante lineal, la eliminación de características recursivas, un análisis de predicción de micromatrices, una regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo FlexTree, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, algoritmos de aprendizaje automatizado y otros métodos conocidos para los expertos en la técnica.

La clasificación se puede hacer según métodos de modelización predictivos que establecen un umbral para determinar la probabilidad de que una muestra pertenezca a una clase concreta. La probabilidad es preferiblemente de al menos un 50%, o al menos un 60%, o al menos un 70%, o al menos un 80%, o al menos un 90%, o más. Las clasificaciones también se pueden hacer determinando si una comparación entre un conjunto de datos obtenido y un conjunto de datos de referencia proporciona una diferencia estadísticamente significativa. En ese caso, la muestra de la que se obtuvo el conjunto de datos se clasifica como no perteneciente a la clase del conjunto de datos de referencia. A la inversa, si en tal comparación no hay una diferencia estadísticamente significativa respecto del conjunto de datos de referencia, la muestra de la que se obtuvo el conjunto de datos se clasifica como perteneciente a la clase del conjunto de datos de referencia.

La capacidad predictiva de un modelo se puede evaluar según su capacidad de proporcionar una métrica de calidad, p.ej. AUROC (área bajo la curva ROC) o exactitud, de un valor particular, o intervalo de valores. Las medidas del área bajo la curva son útiles para comparar la exactitud de un clasificador a lo largo de todo el intervalo de datos. Los clasificadores con una mayor AUC tienen una capacidad mayor de clasificar correctamente incógnitas entre dos grupos de interés. El análisis de ROC se puede usar para seleccionar el umbral óptimo bajo una diversidad de circunstancias clínicas, equilibrando el balance inherente que existe entre especificidad y sensibilidad. En ciertas realizaciones, un umbral de calidad deseado es un modelo predictivo que clasificará una muestra con una exactitud de al menos alrededor de 0,7, al menos alrededor de 0,75, al menos alrededor de 0,8, al menos alrededor de 0,85, al menos alrededor de 0,9, al menos alrededor de 0,95, o más. Como medida alternativa, un umbral de calidad deseado puede referirse a un modelo predictivo que clasificará una muestra con un AUC de al menos alrededor de 0,7, al menos alrededor de 0,75, al menos alrededor de 0,8, al menos alrededor de 0,85, al menos alrededor de 0,9, o más.

Como se conoce en la técnica, la sensibilidad y especificidad relativas de un modelo predictivo se puede ajustar para favorecer la métrica de especificidad o la métrica de sensibilidad, donde las dos métricas tienen una relación inversa. Los límites en un modelo como se describió anteriormente se pueden ajustar para proporcionar un nivel de sensibilidad o especificidad seleccionado, dependiendo de las necesidades particulares del ensayo que se está llevando a cabo. Una o ambas de la sensibilidad y la especificidad pueden ser de al menos alrededor de 0,7, al menos alrededor de 0,75, al menos alrededor de 0,8, al menos alrededor de 0,85, al menos alrededor de 0,9, o más.

Los datos en bruto se pueden analizar inicialmente midiendo los valores para cada característica o biomarcador medible, normalmente por triplicado o en múltiples triplicados. Los datos se pueden manipular, por ejemplo, los datos en bruto se pueden transformar mediante el uso de curvas patrón, y se puede usar la media de las medidas por triplicado para calcular la media y la desviación estándar para cada paciente. Estos valores se pueden transformar antes de usarlos en los modelos, p.ej. transformarlos logarítmicamente, transformarlos mediante el método de Box-Cox (Box y Cox, Royal Stat. Soc., Series B, 26:211-246(1964). Los datos se introducen después en un modelo predictivo, que clasificará la muestra según el estado. La información resultante se puede comunicar a un paciente o profesional sanitario.

En ciertas realizaciones, el método descrito en la presente memoria para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata tiene una especificidad de >60%, >70%, >80%, >90% o más. En las realizaciones adicionales, los métodos para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) o la quimioterapia en un tumor de un paciente con cáncer de próstata tiene una especificidad >90% a un umbral de clasificación de 7,5 CTCs/mL de sangre.

Como entenderán los expertos en la técnica, un proceso de clasificación analítica puede usar cualquiera de una diversidad de métodos analíticos estadísticos para manipular los datos cuantitativos y proporcionar la clasificación de la muestra. Los ejemplos de los métodos útiles incluyen, sin limitación, el análisis discriminante lineal, la eliminación de características recursivas, un análisis de predicción de micromatrices, una regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo FlexTree, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, y algoritmos de aprendizaje automatizado.

La enumeración de un listado de elementos en cualquier definición de una variable en la presente memoria incluye las definiciones de esa variable como cualquier elemento individual o combinación (o subcombinación) de elementos enumerados. La enumeración de una realización en la presente memoria incluye esa realización en forma de cualquier realización individual o en combinación con cualesquiera otras realizaciones o porciones de las mismas.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, no de limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1 (no forma parte de la invención). Caracterización de CTCs y subpoblaciones de CTCs en el CPRCm progresivo

48 muestras de 21 pacientes de CPRCm progresivo único tratados con terapias selectivas del receptor de andrógenos (Tto. del RA), 9 (43%) con Abiraterona más Prednisona (AA+P) y 12 (57%) con Enzalutamida (E). Las muestras se recogieron y se enviaron a Epic Sciences, donde se tiñeron las células y se identificaron las CTCs mediante barridos de fluorescencia y análisis algorítmico. Se identificaron las CTCs, definidas como clásicas (CK+ CD45- con núcleos DAPI intactos y diferentes), apoptóticas (CK+, CD45-, núcleos no intactos) y CK- (CK-, CD45-, intactos y diferentes). Las CTCs se informaron por mL de sangre y se examinaron con respecto a RA, PTENy ERG. Los datos de las CTCs se analizaron en el contexto del PSA, CTCs con Veridex (informadas por 7,5 mL de sangre), y los antecedentes clínicos.

Con Epic, los 21 pacientes tuvieron CTCs detectables (mediana de 23 células/ml, intervalo 2 a 249), mientras con Veridex, 14 (67%) pacientes tuvieron > 5 CTCs/7,5 ml (mediana de 5 células/7,5 ml, intervalo 0 a >200).

Tabla 2. Expresión de RA inicial (CTCs con Epic)

0/7 (0%) con RA alto respondieron a Abiraterona más Prednisona (AA+P) o Enzalutamida (E), 8/14 (53%) con RA bajo tuvieron una disminución del PSA y una enfermedad radiográfica estable (seguimiento mediano de 12 semanas). Se observaron variaciones en la expresión proteica de RA y la heterogeneidad de la localización en todos los pacientes en grados variables. 6/21 (29%) pacientes mostraron una proporción CK-CTCs/CTCs >50% (mediana de 9 células/ml, intervalo 5-38). El reordenamiento ERG y la pérdida de PTEN se correlacionaron.

El análisis de CTCs de Epic proporciona mayores tasas de detección, a la vez que posibilita los análisis de células individuales en busca de biomarcadores predictivos de la resistencia a las terapias dirigidas al RA. Fue notable la heterogeneidad acusada de la detección de RA, ERG, y PTEN de las CTCs individuales. Hay estudios en curso para explorar adicionalmente las asociaciones con los resultados.

Ejemplo 2 (no forma parte de la invención). Caracterización de CTCs y subpoblaciones de CTCs en el CPRCm progresivo

32 muestras de 30 pacientes de CPRCm progresivo único tratados con terapias selectivas del receptor de andrógenos (Tto. del RA); 14/30 (46,7%) con Abiraterona más Prednisona (AA+P) y 16/30 (53,3%) con Enzalutamida (E). Las muestras se recogieron y se enviaron a Epic Sciences, donde se tiñeron las células y se identificaron las CTCs mediante barridos de fluorescencia y análisis algorítmico (Figura 3). Se identificaron las CTCs, definidas como tradicionales (CK+CD45- con núcleos DAPI intactos y morfológicamente diferentes), apoptóticas (CK+CD45-, núcleos no intactos) y CK- (CK-CD45-, intactas y morfológicamente diferentes) (Figura 4). Las CTCs informadas por mL de sangre se examinaron con respecto a la expresión de RA mediante inmunofluorescencia (IF), y la pérdida de PTEN y los reordenamientos ERG mediante FISH. Los datos de las CTCs se analizaron en el contexto del PSA, el recuento de CTCs con CellSearch® (informado por 7,5 mL de sangre), y los antecedentes clínicos.

Mediante el uso de la plataforma de CTCs de Epic Sciences, 26/30 (86,7%) pacientes tuvieron > 5 CTCs tradicionales/7,5 mL de sangre (mediana de 56 células/mL, intervalo 8 a >200), mientras con CellSearch®, 15/30 (50,0%) pacientes tuvieron > 5 CTCs/7,5 mL (mediana de 62 células/7,5 mL, intervalo 6 a >200) (Figura 3). Como se muestra en la Tabla 3, la expresión media de RA >3,82 o >5 CTCs CK-/mL predijo la resistencia de novo frente a la resistencia adquirida (Sensibilidad = 63%, Especificidad = 83%, p = 0,0235). Ningún paciente que respondió al tratamiento tuvo RA>3,82 ni >5 CTCs CK-/mL. El reordenamiento ERG y la pérdida de PTEN también se enriquecieron en la población resistente de novo. Ni la CTC de CellSearch® ni el PSA fueron predictivos de la resistencia de novo.

Tabla 3. Modelo para la predicción de la resistencia de novo

El análisis de CTCs de Epic proporciona mayores tasas de detección, a la vez que posibilita los análisis de células individuales en busca de biomarcadores predictivos de la sensibilidad a las terapias dirigidas al RA. Fue notable la heterogeneidad acusada de la detección de RA, ERG, y PTEN de las CTCs individuales. La expresión media de RA alta en todas las subpoblaciones de CTCs y la frecuencia alta de CTCs CK- están asociadas a la resistencia de novo.

Ejemplo 3. Biomarcadores Predictivos de la Sensibilidad a la Señalización del Receptor de Andrógenos (SRA) y la Quimioterapia Basada en Taxanos en Células Tumorales Circulantes (CTCs) de Pacientes con Cáncer de Próstata Resistente a la Castración Metastásicos (CPRCm)

91 muestras de sangre de pacientes recogidas de 79 pacientes para el análisis de CTCs con la plataforma de Epic Sciences antes del tratamiento (27 pre-A, 28 pre-E, 28 pre-D, 8 pre-C). El análisis de Epic identificó las CTCs tradicionales (CK+, CD45-, núcleos intactos, morf. diferente), CTCs CK- (CK-, CD45, núcleos intactos, morfología diferente), CTCs pequeñas (CK+, CD45-, núcleos intactos, pequeño tamaño celular), y agrupamientos de CTCs. Si se llevó a cabo la tinción para la exp. de N de RA, C de RA, los algoritmos digitales de patología analizaron la morfología de las CTCs. El clasificador A se desarrolló para asociar los fenotipos clínicos al resultado hacia un agente específico.

Los distintivos de biomarcadores A y E incluyeron: Exp. de N/C de RA y presencia de CTCs CK+, RA+, Nucleolos+. Los distintivos de biomarcadores de D y C incluyeron: la presencia de CTCs CK+, pequeñas, RA-, Nucleolos+. Los algoritmos multivariantes para A y E y D y C se asociaron estadísticamente con la resistencia de novo. La línea de la terapia no fue un predictor univariante de la respuesta.

Tabla 4. Distintivos de CTCs Iniciales

La caracterización de las CTCs identificó los biomarcadores predictivos de la sensibilidad al Tto. SRA y la quimioterapia con taxanos en los pacientes de CPRCm. El distintivo de A y E propuesto difiere del C y D, lo que proporciona la oportunidad de guiar mejor la selección del tratamiento y mejorar los resultados de los pacientes mediante el uso de una biopsia de sangre en tiempo real y no invasiva. Se han planificado ensayos prospectivos para validar los resultados.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir la resistencia a la terapia selectiva del receptor de andrógenos (RA) en un paciente con cáncer de próstata que comprende

(a) llevar a cabo un análisis directo que comprende la tinción inmunofluorescente y la caracterización morfológica de las células nucleadas en una muestra de sangre obtenida del paciente para identificar las células tumorales circulantes (CTCs), en donde el análisis directo significa la detección de CTCs en el contexto de todas las células nucleadas del entorno presentes en la muestra, en contraposición a después del enriquecimiento de la muestra en CTCs antes de la detección; y

(b) basándose en dicho análisis directo, determinar adicionalmente la presencia de un distintivo de biomarcadores que es predictivo de la resistencia a la terapia selectiva del RA en el paciente con cáncer de próstata,

en donde el distintivo de biomarcadores comprende una subpoblación de dichas CTCs que es positiva para citoqueratina (CK+), positiva para RA (RA+), y comprende nucleolos (nucleolos+), y en donde dichas CTCs se caracterizan adicionalmente por la tinción positiva del extremo N-terminal del RA y la pérdida del extremo C-terminal del RA.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la tinción inmunofluorescente de las células nucleadas comprende pancitoqueratina, el cúmulo de diferenciación 45 (CD45), diamidino-2-fenilindol (DAPI) y RA.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la tinción inmunofluorescente de RA comprende la tinción nuclear de RA de los extremos N-terminal o C-terminal.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la tinción nuclear del extremo C-terminal de RA está disminuida en comparación con la tinción nuclear del extremo N-terminal de RA.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dichas CTCs comprenden las CTCs tradicionales, agrupamientos de CTCs, CTCs negativas para CK (CK-), y CTCs pequeñas,

en donde las CTCs tradicionales se caracterizan por DAPI+CK+CD45- y son morfológicamente diferentes de los glóbulos blancos (GBs) del entorno, y

en donde las CTCs pequeñas se caracterizan por DAPI+CK+CD45- y son del mismo o menor tamaño que el tamaño medio de los GBs de la muestra.

6. El método de la reivindicación 1, en donde dicha predicción proporciona información para una decisión de tratamiento posterior.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende una etapa inicial de depositar las células nucleadas en forma de una monocapa sobre un portaobjetos.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (CPRCm).

9. El método de la reivindicación 1, en donde la identificación de CTCs comprende la microscopía de barrido de fluorescencia.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la microscopía de barrido de fluorescencia proporciona un campo de visión que comprende tanto CTCs como al menos 200 glóbulos blancos (GBs) del entorno.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el análisis directo comprende estudiar al menos 4 millones de las células nucleadas.