CN102449484B

CN102449484B - 分离蛋白-1作为癌症标志物

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Publication number: CN102449484B
Application number: CN201080023712.5A
Authority: CN
Inventors: N.维尔德; M-L.哈格曼; J.卡尔; J.里德林格; M.勒斯勒; M.塔克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2009-05-29
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: HK1170566A1; ES2532644T3; EP2435830A1; JP2012528303A; CN102449484A; US20120028835A1; US9518990B2; JP5731488B2; EP2435830B1; WO2010136163A8; CA2760366A1; WO2010136163A1

Abstract

本发明涉及辅助评估癌症的方法。本发明公开了分离蛋白-1（=SCRN1）作为不同癌症类型的通用标志物的用途。此外，本发明特别涉及从来源于个体的液体样品中评估癌症的方法，通过在所述样品中测量SCRN1。SCRN1的测量可以用于例如癌症的早期检测，或经历手术的患者的监测。

Description

分离蛋白-1作为癌症标志物

本发明涉及辅助评估癌症的方法。本发明公开了分离蛋白-1（=SCRN1）作为不同癌症类型的通用标志物的用途。此外，本发明特别涉及从来源于个体的液体样品中评估癌症的方法，通过在所述样品中测量SCRN1。SCRN1的测量可以用于例如癌症的早期检测或经历手术的患者的监测（surveillance）。

尽管在检测和治疗中取得了进展，癌症仍然是一个主要的公共健康挑战。癌细胞的特征在于癌-相关的标志物蛋白的生成。癌-相关的蛋白存在于携带癌细胞的个体的组织和体液中。它们的水平在致癌进展的早期通常较低，并在疾病进展过程中增加，且仅在少数情况下，在疾病进展期间观察到所述蛋白表现出降低的水平。这些蛋白的灵敏检测是有利的和有前途的癌症诊断方案，尤其是在癌症的早期诊断中。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。

实体瘤的最重要的治疗方案是：

a) 手术切除肿瘤，

b) 化疗，

c) 放疗，

d) 用生物制品治疗，如抗-肿瘤抗体或抗-血管生成抗体，和

e) 上述方法的组合。

肿瘤的手术切除被广泛地接受为早期实体瘤的第一线治疗方法。但是，大多数癌症只有在它们变得有征候时（即当患者已经处于疾病进展的相当晚期时）才被检测出。

癌症的分期是疾病关于程度、进展和严重性的分类。其将癌症患者分组，从而可以对预后和选择治疗作出概括。

CRC的不同病期过去是根据Dukes的A至D期进行分类。现在，TNM系统是最广泛使用的癌症解剖学程度的分类。该系统代表国际接受的统一分期系统。它有三个基本变量：T（原发肿瘤的程度），N（局部淋巴结状态）以及M（存在或不存在远处转移）。TNM标准由UICC（国际防癌联盟，International Union Against Cancer）(Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (编): TNM Classification of Malignant Tumours, 第6版, （2002）)公布。在确定TNM状态以后，将患者归入用在I至IV范围内的罗马数字表示的病期，其中IV是最晚期的病期。TNM分期和UICC病期彼此对应，如在摘自上面的Sobin和Wittekind (编)的下表中所示的。

表 1 ： TNM 分期和 UICC 病期的相互关系

UICC病期	T分期	N分期	M分期
				病期0	Tis	N0	M0
病期I	T1, T2	N0	M0
				病期IIA	T3	N0	M0
病期IIB	T4	N0	M0
				病期IIIA	T1, T2	N1	M0
病期IIIB	T3, T4	N1	M0
				病期IIIC	任意T	N2	M0
病期IV	任意T	任意N	M1

特别重要的是，诸如CRC等癌症的早期诊断转变为好很多的预后。在CRC中，结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期诊断出的那些患者具有最好的预后。在已经存在远处转移时诊断出的患者仅有10%的五年生存率，与此相比，如果处理得当，在早至T_is、N0、M0或T1-3、N0、M0病期诊断出的患者，在诊断后具有超过90%的五年生存机会。

目前的检测方法（包括成像方法，诸如X-射线或核共振成像）在理论上可能至少部分地适用作一般的筛选工具。但是，它们的成本非常昂贵，保健系统不能承担得起用于普查大量受试者（尤其是对于没有任何肿瘤症状的受试者）的一般的和广泛的用途。

因而，本发明的一个目的是，提供一种简单的且节省成本的肿瘤评估方法，例如用于鉴别疑似具有癌症的个体。为此目的，在体液（例如血液或血清或血浆）中可检测到的一般肿瘤标志物或这样的标志物集合是合乎需要的。

许多血清肿瘤标志物已经处于临床应用中。例如细胞角蛋白19的可溶性的30kD片段(CYFRA21-1)、癌胚发生抗原(CEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标志物。但是，它们都不能满足筛选工具所要求的灵敏度和特异性标准 (Thomas, L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany (2000))。

为了具有临床效用，作为单独标志物的新的诊断标志物应当至少与本领域已知的其它标志物一样好，或更好。或者，如果分别单独使用或与一个或更多个其它标志物联合使用，新的标志物应当引起诊断灵敏度和/或特异性的改进。通过在下面详细介绍的受试者操作特征（receiver-operating characteristics），对检查的诊断灵敏度和/或特异性进行最佳评价。

全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标志物的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和控制的方法。因此，存在改进癌症、尤其是LC的体外评估的急迫的临床需求。由于早期诊断出的患者的存活机会大大高于在疾病进展后的期得到诊断的患者，所以改进癌症（例如 LC）的早期诊断尤其重要。

最近已对生化标志物在肺癌中的临床效用进行了综述(Duffy, M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262)。

CYFRA 21-1目前被视作肺癌的当前已知的肿瘤标志物中的最佳者。尽管不是器官-特异性的，它主要存在于肺组织中。据称CYFRA 21-1对于肺癌的灵敏度是46-61%，具有95%的特异性（相对于其它良性肺病）。增加的CYFRA 21-1的血清水平也与明确的良性肝病、肾功能不全和侵入性膀胱癌有关。CYFRA 21-1检查被推荐用于手术后治疗监测。

CEA属于胎儿癌性抗原群体，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官-特异性的，主要用于监测结直肠癌。除了恶性肿瘤以外，几种良性疾病（诸如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫病）也与升高的CEA血清水平有关。在相对于良性肺病的95%特异性，据报道它对肺癌的灵敏度是29-44%。CEA的主要用途是监测结肠癌，尤其是当该疾病已经转移时。但是，多种癌症会产生升高水平的CEA，包括乳腺癌。CEA的一个优选用途是肺癌的治疗监测。

NSE是SCLC的肿瘤标志物。发现提高的NSE血清水平通常与神经外胚层和神经内分泌肿瘤相关。在患有良性肺病和脑病，例如脑膜炎或其他炎症性脑病，和头部外伤的患者中也发现提高的血清水平。尽管据报道在95%特异性上对SCLC的灵敏度是60-87%，检测的NSE的对NSCLC的性能很差(7-25%)。NSE被建议用于SCLC的治疗监测。

在糖脂上的CA 19-9 (碳水化合物抗原 19-9，一种唾液酸化的 Lewis (a) 抗原)是胃肠癌的一种肿瘤标志物。它存在于胎儿胃、肠、和胰腺上皮中。低浓度也见于肝、肺和胰腺的成年组织中。在肿瘤体积和CA 19-9分析值之间不存在关联。因此，CA 19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。由于该粘蛋白仅由肝排泄，在有些情况下，即使轻微的胆汁淤积也可以导致明显升高的CA 19-9血清水平。该标志物主要用于辅助监测具有经证实的胰腺癌的那些患者的疾病状态(灵敏度70-87%)。3-7%的群体具有Lewis a-阴性的/b-阴性的血型构型，且不能表达具有反应性的决定簇 CA 19-9的粘蛋白。当解释发现时，这必须予以考虑。

在高百分比的上皮来源非粘液性卵巢瘤中发现CA 125并可在血清中检测到。卵巢癌占妇科肿瘤的约20%。尽管最高的CA 125值发生在患卵巢癌的患者中，在子宫内膜、乳腺、胃肠道恶性肿瘤和各种其他恶性肿瘤中也观察到明显升高的值。有时在各种良性妇科疾病例如卵巢囊肿、卵巢组织转化、子宫内膜异位、子宫肌瘤或子宫颈炎中发现提高的值。此标志物的轻微升高还可发生在怀孕早期和各种良性疾病中（例如急性和慢性胰腺炎、良性胃肠疾病、肾功能不全、自身免疫疾病等等）。显著升高的水平已在良性肝疾病例如肝硬化和肝炎中发现。极端升高可发生在由恶性和两性疾病引起的任意种类的腹水中。尽管CA 125是相对非特异性的标志物，它是目前最重要的肿瘤标志物，用于监视具有严重卵巢恶性肿瘤的患者的治疗和进展。在82-93%特异性下，据报道灵敏度为69-79%。

PSA（“前列腺相关抗原”）是在血液检测中使用的常规检测肿瘤标志物。PSA似乎具有高组织特异性；在正常的前列腺上皮和分泌物中发现此糖蛋白，而在其他组织中没有发现。PSA对前列腺癌的存在高度灵敏。PSA提高与阶段和肿瘤体积相关。其可预测复发和对治疗的反应。最后，此抗原在患者中具有预后价值，在手术前极高的值预示可能复发。

NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶；Swiss-PROT: P40261）具有29.6 kDa的表观分子量和5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其他嘧啶的N-甲基化。此活性对许多药物和异生物质化合物的生物转化很重要。据报导此蛋白质在肝中显著地表达并定位在细胞质中。NNMT已从人肝的cDNA中被克隆并含有792个核苷酸的开放阅读框，所述阅读框编码具有29.6 kDa的计算分子量的264个氨基酸的蛋白质(Aksoy, S. 等人, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840)。在文献中有关酶在人癌症中的潜在作用所知甚少。在一篇论文中报导将提高的肝NNMT酶活性作为小鼠中癌症恶病质的标志物(Okamura, A. 等人, Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656)。在最近的一个报导中，证明了在放射敏感的细胞系中NNMT基因应答放射的下调(Kassem, H.S. 等人, Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460)。最近发现(WO 2004/057336)NNMT在CRC的评估中引人关注。

proGRP是肿瘤标志物，在检测和监视SCLC中有用。在具有非恶性肺/肋膜疾病例如特发性肺纤维化或结节病的患者中叶发现提高的血清水平。尽管proGRP在SCLC领域（在95%的特异性下）的灵敏度据报导为47-86%，在NSCLC领域的proGRP检测表现很差，因为据报导灵敏度为10%以下。

SCC最初在子宫颈的鳞状上皮细胞CA中被鉴定。SCC对LC的灵敏度一般很低（18-27%）。因此，认为SCC检测不适于筛选。然而，由于对鳞状上皮细胞CA的较高灵敏度，SCC的优选用途是治疗监测，尽管CYFRA 21-1一般表现的更好。

p53（TP53，细胞肿瘤抗原p53，肿瘤抑制因子p53或磷蛋白p53）是诱导细胞生长停滞或凋亡的转录因子(Appella, E. 等人, Pathol. Biol. 48 (2000) 227-245)。p53担当许多肿瘤类型中的肿瘤抑制因子并且在其基因中的失活突变是在人中促进癌症发展的最常见基因事件(在Olivier, M.and Petitjean, A., Cancer Gene Ther. 16 (2009) 1-12; Petitjean, A. 等人, Oncogene 26 (2007) 2157-2165中综述)。在40-50%的结直肠癌中观察到p53突变，且其与癌的侵略性相关(Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。在p53基因中的突变不仅导致蛋白质功能的破坏，而且导致肿瘤相关抗原（TAA）的表达和自身免疫应答的起始和特异性抗-p53自身抗体在癌症患者的血清中的产生(Zhang, J.Y. 等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143; Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。在人血清中检测抗-p53自身抗体是用于诊断和控制癌症的新兴工具。取决于癌症类型，血清中抗-p53自身抗体的频率范围从17.8% (CRC)至16.1 % (LC)和7.8% (乳腺癌) (Tan, E.M., Immunological Reviews 222 (2008) 328-340; Zhang, J.Y. 等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143)。

Seprase，又称成纤维细胞活化蛋白(=FAP)，是170 kDa的具有明胶酶和二肽基肽酶活性的糖蛋白，其由两个相同的单体Seprase单元组成(Pineiro-Sanchez, M.L. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park, J.E. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-3651）。人膜结合Seprase蛋白单体包含760个氨基酸。预测人Seprase在成纤维细胞细胞质内具有4个N末端残基，接着是21个残基的跨膜结构域，然后是734个残基的细胞外C末端催化结构域(Goldstein，L.A. 等人, Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19; Scanlan，M.J. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5657-5661)。人Seprase蛋白的较短形式是本领域技术人员所知的，其为可溶性Seprase或循环的抗纤溶酶切割酶（antiplasmin-cleaving enzyme）（=APCE）(Lee，K.N.等人, Blood 103 (2004) 3783-3788; Lee 等人, Blood 107 (2006) 1397-1404)，其包含Swissprot数据库登录号Q12884的第26-760位氨基酸。可溶性Seprase的二聚体是由2个相同的单体可溶性Seprase蛋白单元组成的160 kDa的糖蛋白。Piñeiro-Sánchez 等人 (同上)发现提高的Seprase的表达与人黑色素瘤和癌细胞的侵袭性表型相关。Henry，L.R. 等人, Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水平的间质Seprase的人结肠肿瘤患者更可能具有侵袭性疾病进展以及转移或复发的潜在发展。

人二肽基肽酶IV（=DPPIV）又称CD26，其是110 kDa的细胞表面分子。人DPPIV蛋白的氨基酸序列包含766个氨基酸。其含有固有的二肽基肽酶IV活性，所述活性选择性地从在第三个氨基酸位置具有脯氨酸或丙氨酸的肽中去除N-端的二肽。其与多种细胞外分子相互作用并也涉及细胞内信号转导级联。人DPPIV的多功能活性依赖于细胞类型和细胞内或细胞外的条件，上述因素影响其作为蛋白水解酶、细胞表面受体、共刺激相互作用蛋白和信号转导介质的功能。人DPPIV具有从第1至6位氨基酸的短细胞质结构域，从第7至28位氨基酸的跨膜区，和从第29至766位氨基酸的具有固有二肽基肽酶IV（DPPIV）活性的细胞外结构域。人可溶性二肽基肽酶IV（=可溶性DPPIV）包含Swissprot数据库登录号P27487的第29至766位氨基酸。可溶性DPPIV的二聚体是由2个相同的单体可溶性DPPIV单元组成的170 kDa的糖蛋白。

可溶性DPPIV/Seprase复合体（=DPPIV/Seprase）指由可溶性DPPIV同源二聚体（170 kDa）和可溶性Seprase同源二聚体（160 kDa）形成的具有330 kDa分子量的可溶性复合体。在特定条件下此复合体可形成具有660 kDa分子量的双重复合体。

关于标志物特征和针对提高的肺癌的诊断，公布了使用基于模糊逻辑学的分类算法来组合CYFRA 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)（其为一般炎症标志物）的血清水平的方法(Schneider, J., 等人, Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者报导了在95%的特异性下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单个肿瘤标志物的灵敏度据报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中报导的显著更高。Duffy, M.J., in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262报导了46%至61%的灵敏度。由Schneider等人获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体包括许多晚期分期。第二且更至关重要地，在用于模糊逻辑限定词的确定的训练集的样品上检查算法的性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”并且不用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。

本发明的目的是，研究是否可以鉴别出可用于评估癌症疾病的生化标志物。具体地，本发明的发明人研究了是否可以在体液中鉴别出可用于评估不同癌症类型（诸如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌）的生化标志物。在本发明的特别优选的方面，研究了用于评估肺癌（LC）的生化标志物的鉴定。

令人惊奇地，已经发现，使用分离蛋白-1(= SCRN1)可以至少部分地克服现有技术中目前已知的标志物的一些问题。

令人惊奇地，已经发现，在检测样品中增加的SCRN1浓度与癌症的发生相关。能够显示，SCRN1不是特异性针对单个类型的癌症的标志物，而是针对不同类型的癌症的标志物，即一般的肿瘤标志物。由于SCRN1似乎对肿瘤发生过程相当特异，新的肿瘤标志物SCRN1在不同种类的肿瘤类型的临床效用中具有巨大潜力。

令人惊奇地，在本发明中已经发现，在样品和/或体液中测定SCRN1的浓度允许评估癌症，例如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌。更令人惊奇地，已经发现，与普通对照相比，在样品和/或体液中提高的SCRN1或其片段的浓度指示癌症发生的风险。

本发明涉及在体外评估癌症的方法，其包括通过免疫学检测方法在样品中测量SCRN1的浓度，和使用测量结果，特别是测定的浓度，评估癌症。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量液体样品中的a) 分离蛋白-1（=SCRN1）和/或其片段的浓度，b) 任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的SCRN1浓度是癌症的指征。

另外，本发明涉及SCRN1在癌症评估中的用途。

另外，本发明涉及针对SCRN1的抗体在癌症评估中的用途，其中增加的SCRN1浓度是癌症的指征。

另外，本发明公开了包含SCRN1和任选的一种或更多种其它癌症标志物的标志物集合在癌症评估中的用途，其中增加的SCRN1浓度是癌症的指征。

另外，本发明涉及一种试剂盒，其用于实现在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的(a) SCRN1和/或其片段的浓度，(b) 任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的SCRN1浓度是癌症的指征，所述试剂盒包含特异性地测量SCRN1所需的试剂和任选的特异性地测量一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。

令人惊奇地，已经发现，在检测样品中增加的SCRN1和/或其片段的浓度与癌症的发生相关。能够显示，SCRN1不是特异性针对单个类型的癌症的标志物，而是针对不同类型的癌症的标志物，即一般的肿瘤标志物。由于SCRN1似乎对肿瘤发生过程相当特异，新的肿瘤标志物SCRN1在不同种类的肿瘤类型的临床效用中具有巨大潜力。

发明详述

在一个优选的实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中SCRN1和/或其片段的浓度，并使用该测量结果、特别是测定的浓度来评估癌症。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的(a) SCRN1和/或其片段的浓度，(b) 任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的SCRN1浓度是癌症的指征。

本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。例如，分别在特定癌症类型（如分别在肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌）中，已经在样品中发现了与正常对照相比增加的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便在体外评估癌症。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估特定的癌症类型，诸如肺癌（LC）、卵巢癌（OC）、子宫内膜癌（EC）、黑色素瘤（MM）、乳腺癌（BC）、头颈癌（H/NC）、膀胱癌（BLC）、胰腺癌（PAC）、结肠癌（CRC）、子宫颈癌（CC）、肾癌（KC）或前列腺癌（PC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如肺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌或乳腺癌。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如肺癌（LC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如卵巢癌（OC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如子宫内膜癌（EC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如黑色素瘤（MM）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如乳腺癌（BC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如头颈癌（H/NC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如膀胱癌（BLC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如胰腺癌（PAC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如结直肠癌（CRC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如子宫颈癌（CC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如肾癌（KC）。

根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，以便体外评估癌症，诸如前列腺癌（PC）。

本发明的一个实施方案代表人群普查，以区分可能没有癌症的个体和可能归类为“疑似”病例的个体。然后对后一组个体进行其它诊断程序，例如通过成像方法或其它合适的方法。

本发明的另一个实施方案代表肿瘤标志物集合的改进，所述肿瘤标志物集合适用于诊断一般的癌症，或所述肿瘤标志物集合适用于诊断特定肿瘤类型，例如肺癌。

本发明还涉及通过生化标志物在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段和一种或更多种其它的癌症特异性的标志物的浓度，并使用测得的测量结果、尤其是浓度来评估癌症。与SCRN1联合使用的优选标志物是：一方面，作为一般肿瘤标志物(即不是对单一肿瘤类型特异性的标志物)的标志物，或另一方面，作为特异性肿瘤标志物(对单一肿瘤类型特异性的标志物)的标志物。优选的标志物，例如用于评估诸如肺癌或结肠癌等癌症，是Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和可溶性DPPIV/Seprase复合物(= DPPIV/Seprase)。这些标志物可以各自单独使用，或以任意组合与SCRN1一起使用。

本发明还涉及通过生化标志物在体外评估癌症（诸如肺癌或结肠癌）的方法，所述方法包括，测量样品中的DPPIV/Seprase和一种或更多种其它的癌症标志物（例如一种或更多种其它的肺癌或结肠癌标志物）的浓度，并使用测得的测量结果、尤其是浓度来评估癌症。优选地，所述一种或更多种其它的标志物选自：Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

本发明还涉及标志物集合在癌症（例如LC）评估中的用途，所述标志物集合至少包含SCRN1和至少一种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他的肿瘤标志物。

优选地，本发明涉及通过生化标志物在体外评估癌症（诸如肺癌或结肠癌）的方法，所述方法包括，测量样品中的SCRN1和/或其片段和一种或更多种其它的癌症标志物（例如一种或更多种其它的肺癌或结肠癌标志物）的浓度，并使用测得的测量结果、尤其是浓度来评估癌症。优选地，所述一种或更多种其它的标志物选自：Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

本发明还涉及SCRN1蛋白和/或其片段在评估癌症中的用途，其中增加的SCRN1和/或其片段的浓度指示癌症。

本发明还涉及SCRN1蛋白和/或其片段在体外评估癌症中的用途，其中样品是血清或血浆。

本发明还涉及SCRN1在评估若干特定癌症类型，特别是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌中的用途。

本发明还涉及SCRN1在评估若干特定癌症类型，特别是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌或结肠癌中的用途。

本发明还涉及SCRN1在评估若干特定癌症类型，特别是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌或头颈癌中的用途。

本发明也涉及针对SCRN1蛋白和/或其片段的抗体在评估癌症中的用途，其中增加的SCRN1和/或其片段的浓度指示癌症。

优选地，以夹心免疫测定的形式（=夹心免疫测定）检测SCRN1。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含特异性地测量SCRN1蛋白和/或其片段和一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含特异性地测量SCRN1蛋白和/或其片段和任选的上述的一种或更多种癌症标志物（例如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌的标志物，如上所述）所需的试剂，其中所述其它标志物可以各自单独使用，或以它们的任意组合使用。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量SCRN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的生物芯片阵列，以特异性地测量SCRN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物，和任选的用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的生物芯片阵列，以特异性地测量SCRN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物，用于评估癌症。

本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的生物芯片阵列，以特异性地测量SCRN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物，和任选的用于进行测量的辅助试剂，用于评估癌症。

术语“测量”优选地包括样品中SCRN1蛋白和/或其片段的定量、半定量或定量测量。在一个优选的实施方案中，测量是半定量测量，即测定SCRN1的浓度是在截止值以上或以下。如技术人员会理解的，在有- (存在)或无- (不存在)试验中，通常将试验灵敏度设定得与截止值匹配。例如通过检查一组健康个体，可以确定截止值。优选地，将截止设定为产生90%的特异性，也优选地，将截止设定为产生95%的特异性，或也优选地，将截止设定为产生98%的特异性。超过截止值的值可以是例如癌症存在的指征。具体地，超过截止值的值可以是例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆道癌存在的指征。在另一个优选的实施方案中，SCRN1的测量是定量测量。在其它实施方案中，将SCRN1的浓度与潜在的诊断问题（如例如疾病的病期、疾病进展或对治疗的应答）相关联。

在另一个优选的实施方案中，将截止设定为产生90%的灵敏度，也优选地，将截止设定为产生95%的灵敏度，或也优选地，将截止设定为产生98%的灵敏度。

低于截止值的值可以是例如癌症存在的指征。具体地，低于截止值的值可以是例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆道癌存在的指征。

在另一个优选的实施方案中，SCRN1的测量是定量测量。在其它实施方案中，将SCRN1的浓度与潜在的诊断问题（如例如疾病的病期、疾病进展或对治疗的应答）相关联。

分离蛋白-1（=SCRN1），Swiss-PROT ID: Q12765，是具有46.4 kDa分子量的414个氨基酸的细胞质蛋白，由SEQ ID NO:1中给出的序列表征（图14）。1996年Nagase, T.等人从骨髓来源的cDNA克隆的分析中预测了SCRN1的编码序列 (Nagase, T. et al., DNA Res. 3 (1996) 17-24)。最近，将相应的基因定位在染色体7上并阐明了基因结构(Hillier, L.N. et al., Nature 424 (2003) 157-164)。虽然现在良好表征了其基因，SCRN1的生物学作用和功能仅部分地被理解。SCRN1调控肥大细胞的分泌并提高细胞对钙刺激的敏感性(Way, G. et al., Mol. Biol. Cell 13 (2002) 3344-3354)。通过蛋白质组学方法也在血小板中检测到SCRN1，但蛋白功能未知(O’Neill, E.E. et al., Proteomics 2 (2002) 288-305)。在最近的出版物中，将RNA表达水平与胃癌相联系(Yamashita, S. et al., Cancer Sci. 97 (2006) 64-71), Suda, T. et al., Cancer Sci. 97 (2006) 411-419)。也在Barrett食道（一种癌变前的病症）中发现提高的表达，其中通过激光捕获显微解剖分离细胞，和然后使用Affymetrix微阵列分析生成的cDNA(Sabo, E. et al., Clin. Cancer. Res. 14 (2008) 6440-6448)。然而，这些研究无一提出在蛋白质水平上验证。迄今为止，在文献中没有描述在体液中检测SCRN1蛋白作为癌症的诊断标志物。

如本文所使用的，下面术语的每一个具有与在本部分中的它相关的含义。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个（种）或超过一个（种）（即至少一个（种））冠词的语法上的对象。作为实例，“一种标志物”指一种标志物或超过一种标志物。术语“至少”用于表示任选地可能存在一种或更多种其它对象。作为实例，至少包括(标志物) SCRN1和CYFRA 21-1的标志物集合可以任选地包括一种或更多种其它的标志物。

表述“一种或更多种”表示 1-50、优选1-20，也优选 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。

术语“芯片”、“生物芯片”、“聚合物芯片”或“蛋白质芯片”可互换使用并指排列在共有基质上的大量探针、标志物或生物化学标志物的集合，所述基质可为硅片、尼龙条、塑料条或玻璃片的一部分。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”是有意创造的物质例如分子、标志物、缺口、微型线圈、检测器和/或传感器的集合，所述物质连接或组装在基质或固体表面，例如玻璃、塑料、硅片或其他形成阵列的材料上。阵列可用于测量大量的水平，例如几十、几千或几百万同时的反应或组合。阵列也可含有少量物质，例如一，几个或一打。阵列中的物质可为彼此相同的或不同的。阵列可假定多种形式，例如可溶性分子的文库，固定化的分子的文库，固定化的抗体的文库，结合树脂珠的化合物的文库，硅片或其他固体支持物。取决于阵列上衬垫的大小，文库可为宏阵列或微阵列。宏阵列通常包含约300微米或更大的衬垫大小并可通过凝胶和印迹扫描仪容易地显像。微阵列通常包含小于300微米的衬垫大小。

“固体支持物”是不可溶的功能化的聚合材料，其上可连接或共价结合（经常通过接头）文库成员或试剂以固定文库成员或试剂或使文库成员或试剂易于从过量的试剂、可溶性反应副产物或溶剂中分离（通过过滤、离心、洗涤等等）。

本文使用的术语“标志物”或“生化标志物” 指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害（例如，在炎症过程中），且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。标志物多肽的变体由相同的基因编码，但可能在其等电点（=PI）或分子量（=MW）或以上二者上有差异，例如作为可选的mRNA或mRNA前体加工的结果。变体的氨基酸序列与对应的标志物序列具有95%或更高的同一性。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。

在适当样品中检测SCRN1蛋白，尤其是SCRN1蛋白和/或其片段的可溶形式。优选的样品是组织样品、组织裂解物或体液，诸如血液、血浆、血清、尿、支气管肺泡灌洗液(=BAL；优选地，在疑似LC的情况下)或上皮细胞衬液(= ELF；优选地，在疑似LC的情况下)。优选地，所述样品源自人受试者，例如肿瘤患者或处于肿瘤危险中的人或疑似具有肿瘤的人。也优选地，在血清或血浆样品中检测SCRN1。

在根据本发明的一个优选的实施方案中，测定SCRN1蛋白和/或其片段的浓度。在一个实施方案中，使用特异性的结合剂，特异性地测量样品中的标志物SCRN1。

特异性的结合剂是，例如，SCRN1受体、结合SCRN1的凝集素或与SCRN1反应的抗体。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少10⁷ l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有10⁸ l/mol、或更优选10⁹ l/mol的亲和力。

技术人员将理解，使用术语“特异性的”表示，样品中存在的其它生物分子不与SCRN1的特异性的结合剂发生显著的结合。优选地，与除靶分子之外的生物分子结合的水平产生这样的结合亲和力，其最多分别是与靶分子亲和力的仅10%或更少、仅5%或更少、仅2%或更少、或仅1%或更少。优选的特异性的结合剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。

特异性的结合剂优选是与SCRN1反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体结合域的遗传构建体。

可以使用保留了特异性的结合剂的上述标准的任何抗体片段。使用现有技术水平方法产生抗体，例如在Tijssen（Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 全书，尤其第43-78页）中所说明的。另外，熟练的技术人员充分认识到可以用于抗体的特异性分离的以免疫吸附剂为基础的方法。使用这些方法，可以加强多克隆抗体的质量并因此加强其在免疫测定中的性能（Tijssen，P.，见上，第108-115页）。

为达到在本发明中公开的成绩，可以使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种（例如绵羊或山羊）的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于具有恒定特征的单克隆抗体可以以任何需要量产生，所以它们代表了临床常规测定开发中的理想工具。在根据本发明的方法中，SCRN1的单克隆抗体的产生和使用分别代表其它优选的实施方案。

免疫测定是本领域技术人员所熟知的。实施这些测定的方法以及实际应用和程序总结在相关教科书中。相关教科书的实例是Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278, Burdon, R.H.和v. Knippenberg, P.H. (编.), Elsevier, Amsterdam (1990)，和“Methods in Enzymology”(S.P. Colowick, N.O. Caplan编, Academic Press)的涉及免疫学检测方法的多卷，特别是第70, 73, 74, 84, 92和121卷。

技术人员现在将理解，SCRN1已经被鉴定为用于评估癌症（优选肺癌）的标志物，可以使用不同的免疫诊断方法以达到能够与本发明成绩相比的结果。例如，可以使用可选的策略以产生抗体。除了别的以外，这些策略包含使用合成肽，所述肽代表用于免疫的SCRN1表位。或者，可以使用DNA免疫接种，也称为DNA疫苗接种。

为了测量，在适于形成结合剂SCRN1复合物的条件下，将从个体获得的样品与SCRN1特异性的结合剂一起温育。由于技术人员不进行任何创造性努力就可以轻易地确定这类适宜的温育条件，所以这样的条件无需说明。测量结合剂SCRN1复合物的量，并将其用于评估癌症，优选肺癌。技术人员将理解，测量特异性的结合剂SCRN1复合物的量的许多方法都在有关教科书中得到详细说明（参阅，例如Tijssen P.，见上，或Diamandis, E.P.和Christopoulos, T.K. (编) Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))。

优选地，以夹心型测定形式检测SCRN1。在这类测定中，使用第一种特异性的结合剂将SCRN1捕获于一侧，且在另一侧使用第二种特异性的结合剂，该试剂被标记成可以直接或间接检测出。在夹心型测定形式中使用的特异性的结合剂可以是特异性地针对SCRN1的抗体。

从本发明的意义上而言，“癌症的标志物”是这样的任意标志物，其如果与标志物SCRN1相组合，会在一般癌症的评估中或在某些癌症类型的评估中（例如在LC、PRO、BLC、OC、BC或CRC的评估中）增加有关的信息。如果通过将所述标志物包括在已经包含标志物SCRN1的标志物组合中，用于评估癌症的在给定特异性下的灵敏度或在给定灵敏度下的特异性分别可以提高，则所述信息被认为是有关的或具有附加价值。在癌症评估的优选实施方案中，在p = .05、.02、.01或更低的显著性水平，灵敏度或特异性的提高分别是统计上显著的。优选地，所述一种或更多种其它的肿瘤标志物选自：Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

本文使用的术语“样品”表示为体外评估目的得到的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包括任何体液。优选的样品是组织样品、组织裂解物或体液，例如全血、血清、血浆、尿、支气管肺泡灌洗液(=BAL；优选地，在疑似LC的情况下)或上皮细胞衬液(= ELF；优选地，在疑似LC的情况下)，其中血清或血浆是最优选的。

本文使用的术语“组织样品”和/或“组织切片”表示在手术、治疗切除术或包含为了体外评估目的取出细胞或组织的活组织检查(例如切开活组织检查、切除活组织检查、中心(core)活组织检查或针吸活组织检查)过程中从患者取出的生物样品。当进行根据本发明的分析时，直接使用组织样品材料，或用作“组织裂解物”。本文使用的“组织样品”也称作薄组织切片，其通常通过使用切片机来制作。在涉及生物样品的任意公开的方法实施方案中，这样的生物样品可以(但不一定)固定在显微镜载玻片上，是组织切片 (诸如福尔马林固定的和石蜡包埋的组织切片)，和/或是肿瘤组织(例如，肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌或胶质母细胞瘤)。

本文使用的“组织裂解物”、“细胞裂解物”、“裂解物”、“裂解的样品”、“组织提取物”或“细胞提取物”表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术人员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。

术语“评估癌症”和具体地“评估肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌”用于表示，根据本发明的方法(单独地或与其它标志物或变量一起，例如，UICC所述的标准 (参见上文))可以例如辅助医师确认或证实癌症（尤其是LC或CRC）是否存在，或在预后、复发检测(手术后患者的随访)和/或治疗（尤其是化疗）的监测中辅助医师。

如技术人员会理解的，任意这样的评估可以在体外进行。此后抛弃患者样品。患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，且患者样品材料不再转移回患者体内。通常，所述样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。

除非另外指出，根据常规用法，使用技术术语。在细胞和分子生物学中的普通术语的定义可以参见：Lewin, B., Genes V, Oxford University Press出版 (1994), ISBN 0-19-854287 9); Kendrew, J. 等人 (编), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 出版 (1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版(1995), ISBN 1-56081-5698。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过生化标志物体外评估癌症（例如LC）的方法，所述方法包括，测量样品中的SCRN1浓度，和使用测定的浓度评估癌症（例如LC）。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及通过生化标志物体外评估LC的方法，所述方法包括，测量样品中的SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，和使用测定的浓度评估LC。

本发明的发明人已经令人惊讶地能够检测源自癌症(尤其是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌)患者的样品中的相当大百分比的标志物SCRN1的增加的浓度。甚至更令人惊讶地，他们已经能够证实，在从个体得到的这种样品中的增加的SCRN1浓度可以用于评估癌症，尤其是上述的癌症疾病。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型（例如LC）的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病（例如LC），没有生化标志物的诊断是100%特异性且同时100%灵敏度。相反地，可使用生化标志物（例如，Cyfra 21-1、CEA、NSE或本文证实的SCRN1）来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

可以单独地测定生化标志物，或者，在本发明的一个优选实施方案中，可以使用基于芯片或珠的阵列技术，同时测量它们。然后，例如使用每种标志物的单独截止值，独立地解释生物标志物的浓度，或者可以组合它们进行解释。

在另一个优选的实施方案中，在包含下述步骤的方法中，进行根据本发明的癌症的评估：a）测量样品中SCRN1蛋白和/或其片段的浓度，b）测量样品中一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和c）使用测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度评估癌症。

在癌症的评估中，标志物SCRN1在一个或更多个下述方面是有利的：筛选；诊断辅助；预后；治疗（诸如化疗、放疗和免疫治疗）的监测。

筛选:

筛选被定义为检查的全身应用，以鉴别个体（例如处于危险中的个体）中的疾病指征，例如，癌症的存在。优选地，筛选群体由已知处于比平均值更高的癌症风险的个体组成。例如，肺癌的筛选群体由已知处于比平均值更高的肺癌风险的个体，例如吸烟者、曾吸烟者和暴露在铀、石英或石棉下的工人组成。

在优选的实施方案中，组织样品、组织裂解物或任何体液（诸如全血、血浆、血清、尿、支气管肺泡灌洗液(=BAL；优选地，在疑似LC的情况下)或上皮细胞衬液(= ELF；优选地，在疑似LC的情况下)）被用于癌症（例如肺癌）的筛选中。

对于许多疾病，循环中的单一生化标志物不能满足筛选目的所要求的灵敏度和特异性标准。对于癌症、尤其是对于肺癌，这似乎也是正确的。必须预见到，在癌症筛选中必须使用包含多种标志物的标志物集合。在本发明中确立的数据表明，标志物SCRN1将形成适用于筛选目的的标志物集合的必备部分。本发明因此涉及SCRN1作为癌症标志物集合（即包含SCRN1和一种或更多种用于癌症筛选目的的其它标志物的标志物集合）的一种标志物的用途。具体地，本发明涉及SCRN1作为一般癌症标志物集合的一种标志物的用途。这样的标志物集合包含标志物SCRN1和一种或更多种其它的标志物，例如一般癌症标志物和/或用于上述癌症类型的标志物。

标志物的组合显著改进了分子测定的价值。首先，使用标志物集合显著改进了测定的灵敏度。其次，复杂的统计模型允许对多种标志物测定的ROC曲线分析，且结果证实，与最佳的单个标志物相比显著提高了诊断精确度。

SCRN1也可能构成某些特定癌症类型（例如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌）的标志物集合。

要使用包含SCRN1的标志物集合评估的其它优选的癌症类型是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌或结肠癌。

要使用包含SCRN1的标志物集合评估的其它优选的癌症类型是肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌或头颈癌。

要使用包含SCRN1的标志物集合评估的其他优选的癌症类型是肺癌(LC)或结肠癌（CRC）。

要使用包含SCRN1的标志物集合评估的一种优选的癌症类型是肺癌(LC)。

本发明的数据进一步指示，标志物的某些组合在癌症的筛选是有利的。

例如，参考筛选癌症的优选实施方案, 本发明还涉及下述标志物集合的用途：包含SCRN1和至少一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的标志物的标志物集合。

诊断辅助:

标志物可以辅助在一个特定器官中的良性和恶性疾病的差别化诊断，帮助区分肿瘤的不同组织学类型，或在手术之前建立基线标志物值。

现在，在肺癌的检测中使用的重要方法是放射学和/或计算机体层摄影术(CT)扫描。通过这些方法，可以观察小结节，即疑似组织的小区域。但是，许多这样的结节（使用CT时，超过90%）代表良性组织变化，且仅小量结节代表癌性组织。标志物SCRN1的用途可以辅助良性和恶性疾病的区分。

在一个优选的实施方案中，在免疫组织学方法中使用标志物SCRN1，以便建立或确认癌症的不同组织学类型。

由于SCRN1作为单一标志物可能优于其它标志物，例如在LC的情况下，优于其它标志物（如CEA或NSE），必须预见到，SCRN1可以用作诊断辅助，特别是通过在手术之前建立基线值。本发明因而也涉及SCRN1用于在癌症手术之前建立基线值的用途。

预后:

预后指标可以定义为癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理或生化特征，所述特征以某种可能性预测疾病的结果。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免侵入性疾病的治疗不足和无痛疾病的治疗过度。Molina, R. 等人, Tumor Biol. 24 (2003) 209-218 评价了CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后值。在他们的研究中，标志物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清水平似乎指示更短的存活。

由于单独的SCRN1明显有助于区分癌症患者（例如LC患者）和健康对照，所以必须预见到，它将辅助评估患有癌症（优选LC）的患者的预后。手术前的SCRN1水平最可能与一种或更多种其它的癌症标志物和/或TNM分期系统相组合。在一个优选的实施方案中，SCRN1被用于具有LC的患者的预后。

化学疗法的监测：

Merle, P. 等人, Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315已经评价了用诱导化疗治疗的具有局部晚期NSCLC的患者的CYFRA 21-1血清水平变动。他们的结论是，CYFRA 21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC 患者中的肿瘤应答和存活的有用的预后工具。另外，报告已经描述了CEA在监测LC患者的治疗中的用途(Fukasawa, T. 等人, Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867)。其中的大多数是回顾性的、非随机化的，且包含少数患者。正如在使用CYFRA 21-1的研究的情况下一样，CEA研究表明：a）CEA水平降低同时接受化疗的患者通常具有比CEA水平不降低的那些患者更好的结果，和（b）对于几乎所有的患者，CEA水平的升高与疾病进展有关。

预见到，在化疗的监测方面，SCRN1将是至少分别与CYFRA 21-1或CEA一样好的标志物。本发明因此也涉及SCRN1用于监测癌症患者和优选的处于治疗中的肺癌(LC)患者的用途。

在治疗的监测中，在一个优选的实施方案中，组合SCRN1和至少一种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的标志物的的测量结果，并用于评估肺癌（LC）。

随访:

大部分经历手术切除术的LC患者的目的是完全去除癌性组织、更迟发生复发或转移性疾病(Wagner, H. Jr., Chest 117 (2000) S110-S118; Buccheri, G. 等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。这些复发的大多数发生在手术后的前2-3年内。由于如果太晚地检测出的话复发性/转移性疾病总是致命的，所以大量的研究已经集中在早期癌症复发上，以及因而潜在地可治疗的病期。

结果，许多癌症患者（例如LC患者）经历手术后的监护计划，这经常包括使用CEA的常规监测。在手术切除术以后1年CEA的系列监测已经证实，会检测出手术后早期的复发性/转移性疾病，灵敏度为大约29%，特异性为大约97%，甚至在没有可疑症状或体征的情况下 (Buccheri, G. 等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。因而，手术后LC患者的随访是适当生化标志物的最重要的用途领域之一。由于SCRN1在研究的LC患者中的高灵敏度，所以单独的或与一种或更多种其它标志物相联合的SCRN1可能极大地有助于LC患者的随访，尤其是手术后BC患者的随访。包含SCRN1和一种或更多种其它的LC标志物的标志物集合在LC患者的随访中的用途，代表本发明的另一个优选的实施方案。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及SCRN1在癌症的诊断领域中的用途。优选地，SCRN1分别被用于评估肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及与一种或更多种其它的癌症标志物分子相联合的作为癌症（例如一般癌症或特定癌症类型，诸如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌或前列腺癌）的标志物分子的SCRN1的用途。其它的标志物分子可以是癌-型非特异性的一般标志物分子和/或癌-型特异性的标志物分子，例如肺癌的标志物分子。SCRN1和至少一种其它的标志物被用于在从个体得到的液体样品中评估癌症（例如肺癌）。SCRN1的测量可以组合的优选的选择的其它癌症标志物是Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。具体地，SCRN1的测量可以组合的优选的选择的其它LC标志物是CYFRA 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、proGRP和/或NSE。进一步优选地，在癌症（例如LC）的评估中使用的标志物集合包含SCRN1和至少一种选自CYFRA 21-1和CEA的其它标志物分子。

如熟练的技术人员会明白的，存在许多使用两种或更多种标志物的测量的方式，以改善在研究中的诊断问题。在一个非常简单的、但是仍然经常有效的方案中，如果样品对至少一种研究的标志物是阳性的，则假定是阳性结果。这可以是例如当诊断感染性疾病（如AIDS）时的情况。

但是，经常地，评价标志物的组合。优选地，数学地组合标志物集合中的标志物（例如SCRN1和CYFRA 21-1）的测量值，并将组合的值与潜在的诊断问题相关联。通过任何适当的现有技术水平数学方法，可以组合标志物值。众所周知的将标志物组合与疾病相关联的数学方法使用下述方法，如判别式分析（DA）（即线性的-、二次的-、规则化的-DA）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻分类法）、PLS（偏最小二乘法）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林（Random Forest）方法、Boosting/Bagging方法）、广义线性模型（即逻辑回归）、基于主组分的方法（即SIMCA）、广义累加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练的技术人员会无问题地选择适当的方法来评价本发明的标志物组合。优选地，用于将本发明的标志物组合与例如是否存在LC相关联的方法选自DA（即线性的-、二次的-、规则化的判别式分析）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻分类法）、PLS（偏最小二乘法）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting方法）或广义线性模型（即逻辑回归）。关于这些统计学方法的细节，参见下面的文献：Ruczinski, I. 等人, J. of Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T. 等人, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L. 等人, Classification and regression trees, California: Wadsworth (1984); Breiman, L., Random Forests, Machine Learning 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); 和Duda, R.O. 等人, Pattern Classification, Wiley Interscience, 第2版(2001)。

本发明的一个优选的实施方案是，使用生物学标志物的潜在组合的最优化的多变量截止值，并辨别状态A和状态B，例如病态和健康。在这类分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物集合。

诊断方法的精确性最好由其受试者操作特征(ROC)说明（特别见Zweig, M. H.,和Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577）。ROC图是在整个观察数据范围内连续变化决定阈值（decision thresh-hold）而产生的所有灵敏度/特异性对的图。

实验室检验的临床性能依赖于其诊断精确性、或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性衡量了检验将研究的受试者的两种不同状况正确区分的能力。这类状况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。

在每个病例中，ROC图通过在决定阈值的全部范围将灵敏度对1-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数[定义为（真阳性试验结果数）/（真阳性数+假阴性试验结果数）]。它也称为疾病或状况存在的阳性。它从受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性[定义为（假阳性结果数）/（真阴性数+假阳性结果数）]。它是特异性的指标，并完全从未受影响的亚群计算。因为使用来自两个不同亚群的检验结果，完全独立地计算真和假阳性分数，所以ROC图不依赖于样品中疾病的患病率。ROC图上的每点代表对应于特定决定阈值的灵敏度/1-特异性对。具有最佳辨别力的检验（在结果的两个分布中没有重叠）具有经过左上角的ROC图，在左上角，真阳性分数为1.0，或者100%（理想的灵敏度），且假阳性分数为0（理想的特异性）。没有辨别力的检验的理论图（两组结果的同样分布）为从左下角至右上角的45º对角线。大多图介于这两个极端之间。（如果ROC图完全落在45º对角线之下，则容易地通过将“阳性”标准从“高于”反转为“低于”来矫正这种情况，反之亦然。）从定性上，图越接近左上角，检验的总精确度就越高。

定量实验室检验诊断精确度的一种优选的方法是通过单独的数字表达其性能。这样的总参数是例如所谓的“总误差”或者“曲线下面积 = AUC”。最普通的全面测量是ROC图下的面积。按照惯例，该面积总是≥0.5（如果不是，则可以反转决定规则使其≥0.5）。值在1.0（两组检验值的理想分离）和0.5（在两组检验值之间没有明显的分布差异）之间变化。该面积不仅依赖于该图的特定部分，例如最接近对角线的点或在90%特异性的灵敏度，也依赖于全图。这是对ROC图有多么接近理想ROC图（面积=1.0）的定量的说明性表达。

组合测量SCRN1和其它标志物（如CYFRA 21-1或CEA）或有待发现的其它LC标志物，SCRN1分别导致和将导致LC评估的进一步提高。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及提高癌症（例如LC相对于健康对照）的诊断准确度的方法，其通过分别测量样品中至少SCRN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他肿瘤标志物的浓度，并将测定的浓度与是否存在癌症（例如LC）相关联来实现，与基于单独研究的任何单一标志物的分类相比，所述提高导致更多患者被正确地归入遭受癌症（例如LC相对于健康对照）的患者。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及提高癌症（例如LC相对于健康对照）的诊断准确度的方法，其通过分别测量样品中至少SCRN1和Cyfra 21-1，和任选地测量CEA和/或NSE的的浓度，并将测定的浓度与是否存在癌症（例如LC）相关联来实现，与基于单独研究的任何单一标志物的分类相比，所述提高导致更多患者被正确地归入遭受癌症（例如LC相对于健康对照）的患者。

提供下列实施例和附图以帮助对本发明的理解，其真实范围于附加的权利要求中提出。应当理解，可以在不偏离本发明精神的情况下，在提出的方法中进行修饰。

附图说明

图1显示了20个肺癌组织裂解物的蛋白质印迹分析。如在实施例3中描述的分析15 µg总蛋白的癌症（CA）组织裂解物和匹配的对照组织裂解物。M=分子量标志物；T=肿瘤组织裂解物；N=匹配的对照组织裂解物；rec ag=重组产生的分离蛋白-1（=SCRN1）；箭头指示分离蛋白-1（=SCRN1）的位置。

图2显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估365个从LC患者得到的样品的LC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.85）。

图3显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估30个从头/颈癌患者得到的样品的H/NC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.86）。

图4显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估23个从子宫内膜癌患者得到的样品的EC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.84）。

图5显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估42个从卵巢癌患者得到的样品的OC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.83）。

图6显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估16个从黑色素瘤患者得到的样品的MM样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.82）。

图7显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估47个从乳腺癌患者得到的样品的BC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.77）。

图8显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估20个子宫颈癌患者得到的样品的CC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.74）。

图9显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估49个从胰腺癌患者得到的样品的PAC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.70）。

图10显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估50个从结直肠癌患者得到的样品的CRC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.67）。

图11显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估50个从卵巢癌患者得到的样品的BLC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.65）。

图12显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估25个从肾癌患者得到的样品的KC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.60）。

图13显示了与从明显健康的个体得到的50个对照样品相比，用于评估50个从前列腺癌患者得到的样品的PC样品中的SCRN1的受试者操作特征图(ROC-图) （AUC为0.58）。

图14显示了人SCRN1蛋白的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号：Q12765 (SEQ ID NO:1)。

序列的描述

SEQ ID NO: 1显示了根据图14的人SCRN1蛋白的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号: Q12765。

SEQ ID NO: 2显示了合成的肽延伸。

SEQ ID NO: 3显示了合成的正向引物

SEQ ID NO: 4显示了合成的反向引物

实施例 1

将SCRN1鉴别为肺癌的潜在标志物

组织来源：

为了鉴定作为肺癌的潜在诊断标志物的肿瘤特异性蛋白质，使用蛋白质组学方法进行了2种不同组织的分析。

总共分析了20个患有肺癌（LC）的患者的组织样本。在治疗切除术中从每个患者处收集了2种不同组织类型：肿瘤组织（>80%肿瘤）（T）和相邻的健康组织（N）。后者作为匹配的健康对照样品。切除后立即将组织速冻并在处理前贮存于–80℃。通过组织病理学标准诊断肿瘤。

组织制备：

将0.8-1.2 g冷冻组织切成小块，转移至冷的搅拌球磨机的研磨罐中并通过液氮完全冷冻。在球磨机中将组织磨成粉末，溶解于10倍体积（w/v）的裂解缓冲液（40 mM柠檬酸钠, 5 mM MgCl₂, 1% Genapol X-080, 0.02%叠氮化钠, Complete^®无EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1 873 580]）并之后在Wheaton®玻璃均质器中均质（20 x 松配合, 20 x 紧配合）。离心匀浆液（10’，以5,000 x g），将上清转移至另一个小管并再次离心（15’，以20,000 x g）。得到的上清包含可溶性蛋白质并用于进一步的分析。

等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE

用于IEF，3 ml悬浮物与12 ml样品缓冲液（7M脲，2M硫脲，2% CHAPS，0.4% IPG缓冲液 pH4-7，0.5% DTT）混合并孵育1小时。在Amicon^® Ultra-15 装置(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)中浓缩样品并使用Bio-Rad^®蛋白质测定(货号500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany)根据供应商手册的说明测定蛋白质浓度。对对应1.5 mg蛋白质的体积加入样品缓冲液至350 µl的终体积。使用此溶液再水化IPG条（pH 4-7）(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)过夜。使用以下梯度方案进行IEF：1.）1分钟至500 V；2.）2h至3500 V；3.）22h，从恒压3500V开始至82 kVh。IEF之后，在–80℃贮存条或直接用于SDS-PAGE。

在SDS-PAGE以前，将条在平衡缓冲液（6 M脲, 50 mM Tris/HCl, pH 8.8, 30%甘油, 2 % SDS）中孵育，加入DDT用于还原（15分钟，+50 mg DTT/10 ml），和加入IAA用于烷化（15分钟，+ 235 mg碘乙酰胺/10 ml）。将条置于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上并以1 W/凝胶电泳1小时和之后以17 W/凝胶电泳。之后，固定凝胶（50%甲醇，10%醋酸）并用Novex^TMColloidal Blue Staining试剂盒(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 货号LC6025, 45-7101)染色过夜。

SCRN1作为肺癌的潜在标志物的检测：

使用ProteomeWeaver®软件(Definiens AG, Germany, München)通过图像分析分别分析了每个患者。另外，通过捡取机器人切下凝胶上的所有点并通过MALDI-TOF质谱(Ultraflex^TMTof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)鉴定了点中存在的蛋白质。对每个患者，比较来自肿瘤样品的3块胶和来自相邻正常组织的3块胶，并分析对应差异表达的蛋白质的不同点。在16位患者的肿瘤样品中和仅1个对照样品中鉴定出SCRN1。通过此方法，发现蛋白质SCRN1分别在肿瘤组织中特异性表达或强烈地过表达。因此其有资格作为候选标志物用于肺癌的诊断。鉴定了来源于SCRN1的以下胰蛋白酶消化肽。

表 2：通过MALDI-TOF鉴定的胰蛋白酶消化肽

鉴定的肽	SCRN1中的氨基酸区域 (参考SEQ ID NO: 1)
		DEVQEVVYFSAADHEPESK	33-51
VECTYISIDQVPR	52-64
		EPAAEIEALLGMDLVR	99-114
DEAWVLETIGK	163-173
		YWAAEKVTEGVR	174-185
DKASGVCIDSEFFLTTASGVSVLPQNR	260-286
		ASGVCIDSEFFLTTASGVSVLPQNR	262-286
SSPCIHYFTGTPDPSR	287-302
		SIFKPFIFVDDVK	303-315
FQEKPDR	337-343
		AIIESDQEQGR	356-366

实施例 2

生成针对癌症标志物蛋白SCRN1的抗体

生成了针对肺癌标志物蛋白SCRN1的多克隆抗体，用于进一步使用此抗体通过免疫检测测定（例如蛋白质印迹和ELISA）测量SCRN1的血清和血浆水平或在其他体液中的浓度。

在大肠杆菌中的重组蛋白质表达

为了产生针对SCRN1的抗体，在大肠杆菌中产生重组抗原：因此，从全长cDNA克隆（从德国基因组研究资源中心(German Resource Center for Genome Research) (RZPD, Berlin, Germany)得到）上PCR扩增SCRN1编码区，使用以下引物：

正向引物(SEQ ID NO. 3)：

5’-acgtgaattcattaaagaggagaaattaactATGAGAGGATCGCATCACCAT

CACCATCACATTGAAGGCCGTGCTGCAGCTCCTCCAAGTTACTG-3’

（下划线为EcoRI位点，编码核苷酸为大写字母）。

反向引物(SEQ ID NO. 4)：

5’-acgtaagcttTCATTACTTAAAGAACTTAATCTCCGTG-3’

（下划线为HindIII位点，编码核苷酸为大写字母）。

正向引物（除了EcoRI克隆位点和核糖体结合位点以外）编码了在SCRN1基因的5’端依读框融合的N-端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸(在SEQ ID NO. 2中显示)。将EcoRI/HindIII消化的PCR片段连接进pQE80L载体(Qiagen, Hilden, Germany)。之后，用生成的质粒转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞。在序列分析后，用生成的质粒转化大肠杆菌C600感受态细胞用于处于pQE载体系列的T5启动子控制下的IPTG诱导表达，遵照制造商的说明书。

为了纯化MRGSHHHHHHIEGR-SCRN1融合蛋白，通过离心沉淀1L诱导的过夜细菌培养物，并在裂解缓冲液(20 mM磷酸钠缓冲液, pH 7.4, 500 mM氯化钠(NaCl))中重悬细胞沉淀。在French压碎器中破碎细胞，使用1500 bar的压力。通过离心(25000 g, 15分钟, 4℃)沉淀不可溶的物质，并将上清应用于镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金属亲和柱。在应用抗原后，用几倍柱床体积的洗涤缓冲液(20 mM磷酸缓冲液, pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑)洗涤柱。最后，使用具有20 mM – 500 mM咪唑的线性梯度的洗涤缓冲液洗脱结合的抗原，用紫外检测仪在O.D.₂₈₀处鉴定包含抗原的组分（每个7 ml）。合并包含抗原的组分，对贮存缓冲液(75 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6.5 % (w/v)蔗糖)透析并分别贮存于4℃或-80℃。

生成用于免疫的肽免疫原：

为了产生特异性针对SCRN1的多克隆抗体，鉴定了与其他已知的人蛋白质未显示有显著同源性的肽序列。使用Blast软件在瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）上可获得的人蛋白质数据库上运行SCRN1的氨基酸序列。氨基酸序列398-413没有显示与分离蛋白-2（=SCRN2）或其他人蛋白质的显著同源性并因此被选为引发SCRN1特异性抗体。合成了相应序列并化学缀合至KLH（=钥孔虫戚血蓝素）以得到用于免疫的免疫原。

生成多克隆抗体：

a）免疫

用于免疫，以1：1的比例制备蛋白质溶液（100 µg/ml蛋白质SCRN1）或500 µg/ml连接来自SCRN1氨基酸398-413的肽的KLH和弗氏完全佐剂的新鲜乳剂。用1ml乳剂在第1、7、14和60天免疫每只兔子。抽血并将得到的抗-SCRN1血清用于进一步的实验（如在实施例3和4中描述）。

b）通过用辛酸和硫酸铵相继沉淀从兔血清中纯化IgG（免疫球蛋白G）

用4倍体积的醋酸缓冲液(60 mM, pH 4.0)稀释1倍体积的兔血清。用2M Tris碱调节pH至4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸（25 µl/ml稀释样品）。30分钟后离心(13 000 x g, 30分钟, 4℃)样品，弃沉淀并收集上清。通过加入2M Tris碱将上清的pH调节至7.5并过滤(0.2 µm)。

在剧烈搅拌下通过逐滴加入4M 硫酸铵溶液至2M的终浓度沉淀上清中的免疫球蛋白。通过离心(8000 x g, 15分钟, 4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。

弃上清。在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中溶解沉淀并彻底透析。离心透析液(13 000 x g, 15分钟, 4℃)，并过滤(0.2 µm)。

多克隆兔IgG的生物素化：

在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中将多克隆兔IgG溶为10 mg/ml。对每ml IgG溶液加入50 µl 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6 mg/ml，在DMSO中)。在室温30分钟后，样品在Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上层析。收集包含生物素化IgG的组分。已根据相同的程序生物素化单克隆抗体。

多克隆兔IgG的地高辛化：

在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl, pH 7.5中将多克隆兔IgG溶为10 mg/ml。对每ml IgG溶液加入50 µl 地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, 货号1 333 054)(3.8 mg/ml，在DMSO中)。在室温30分钟后，样品在Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上层析。收集包含地高辛化IgG的组分。已根据相同的程序用地高辛标记单克隆抗体。

实施例 3

使用如实施例2中生成的多克隆抗体，蛋白质印迹检测人肺癌（LC）组织中的SCRN1

如实施例1，“组织制备”中描述的制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解物。

使用Invitrogen, Karlsruhe, Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对检测的每个组织样品，在还原性NuPAGE® (Invitrogen) SDS样品缓冲液中稀释15 µg组织裂解物，并在95℃加热10分钟。在4-12% NuPAGE®凝胶(Tris-甘氨酸)上在MES电泳缓冲液系统中电泳样品。使用Invitrogen XCell II^TM印迹组件(Invitrogen)和NuPAGE^®转移缓冲液系统将凝胶分离的蛋白质混合物印在硝酸纤维素膜上。在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜3次，并用Roti®-Block封闭缓冲液(A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)封闭2小时。以1:10,000在Roti®-Block封闭缓冲液中稀释第一抗体，多克隆兔抗-SCRN1血清（在实施例2中描述了生成），并与膜孵育1小时。在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜6次。用POD缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体（在0.5 xRoti®-Block封闭缓冲液中稀释至10 mU/ml）标记特异性结合的第一兔抗体。孵育1小时后，在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜6次。为了检测结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-Light^PLUS 蛋白质印迹底物(目录号2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)孵育并在放射自显影胶片上曝光。

在从20个不同的LC患者处得到的20个肿瘤组织裂解物的19个中，针对SCRN1的信号强度提高（图1）。因此，通过蛋白质印迹分析清楚地验证了在实施例1中通过MALDI检测的，在肿瘤组织中提高的SCRN1丰度。

实施例 4

ELISA测量人血清和血浆样品或其他体液中的SCRN1

为了检测人血清或血浆中的SCRN1，使用实施例2中的抗体进行夹心ELISA。为了捕获抗原，用生物素缀合针对肽398-413的抗体，而用地高辛缀合针对SCRN1全长序列的抗体。

为了校准测定，增殖LOXIMVI细胞（一种人黑色素瘤细胞系，包括在美国国家癌症研究所的NCI60肿瘤细胞系中），并使用细胞裂解物用于校准。将1：2500稀释的裂解物（蛋白质浓度 = 7.7 mg/ml）强制设定为1 U/ml。

链霉抗生物素包被的96孔微滴定板与100 µl生物素化的抗-SCRN1，aa 398 – 413，多克隆抗体以10 µg/ml在10 mM 磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中孵育60分钟。孵育后，用0.9% NaCl , 0.1% Tween 20洗涤板3次。然后将孔与作为标准抗原的连续稀释的重组蛋白质（见实施例2）或稀释的来自患者的血清/血浆/ELF样品孵育过夜。在SCRN1结合后，用0.9% NaCl , 0.1% Tween 20洗涤板3次。为了特异性检测结合的SCRN1，将孔与100 µl地高辛化的抗-SCRN1多克隆抗体以10 µg/ml在10 mM 磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中孵育60分钟。之后，洗涤板3次以去除未结合的抗体。在下一步中，将孔与50 mU/ml抗地高辛-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1633716)在10 mM 磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中孵育60分钟。之后用相同的缓冲液洗涤板3次。为了检测抗原-抗体复合物，将孔与100 µl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号11685767)孵育，并在30-60分钟后使用ELISA阅读器在405 nm处测量OD。

实施例5

SCRN1作为肺癌（LC）的血清标志物

使用来源于365位良好表征的肺癌患者（146位腺癌，87位鳞状细胞癌，44位小细胞癌，88位其他肺癌）的样品，在表3中给出了UICC分类。

表 3：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	182
UICC III	118
		UICC IV	62
未知分期	3
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表3的LC样品中的SCRN1水平，AUC为0.85（图2）。

实施例 6

SCRN1作为头/颈癌（H/NC）的血清标志物

使用来源于30位良好表征的头/颈癌患者的样品，在表4中给出了UICC分类。

表 4：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	4
UICC III	3
		UICC IV	21
未知分期	2
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表4的H/NC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.86（图3）。

实施例 7

SCRN1作为子宫内膜癌（EC）的血清标志物

使用来源于23位良好表征的子宫内膜癌患者的样品，在表5中给出了UICC分类。

表 5：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	12
UICC III	3
		UICC IV	3
未知分期	5
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表5的EC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.84（图4）。

实施例 8

SCRN1作为卵巢癌（OC）的血清标志物

使用来源于42位良好表征的卵巢癌（OC）患者的样品，在表6中给出了UICC分类。

表 6：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	7
UICC III	14
		UICC IV	9
未知分期	12
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的OC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.83（图5）。

实施例 9

SCRN1作为黑色素瘤（MM）的血清标志物

使用来源于16位良好表征的黑色素瘤患者的样品，在表7中给出了UICC分类。

表 7：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	3
UICC III	1
		UICC IV	0
未知分期	12
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表7的MM样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.82（图6）。

实施例 10

SCRN1作为乳腺癌（BC）的血清标志物

使用来源于47位良好表征的乳腺癌患者的样品，在表8中给出了UICC分类。

表 8：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	26
UICC III	9
		UICC IV	12
明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表8的BC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.77（图7）。

实施例 11

SCRN1作为子宫颈癌（CC）的血清标志物

使用来源于20位良好表征的子宫颈癌患者的样品，在表9中给出了UICC分类。

表 9：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC is/I/II	11
UICC III	7
		UICC IV	2
未知分期	0
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表9的CC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.74（图8）。

实施例 12

SCRN1作为胰腺癌（PAC）的血清标志物

使用来源于49位良好表征的胰腺癌患者的样品，在表10中给出了UICC分类。

表 10：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	26
UICC III	5
		UICC IV	15
未知分期	3
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表10的PAC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.70（图9）。

实施例 13

SCRN1作为结直肠癌（CRC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的结直肠癌患者的样品，在表11中给出了UICC分类。

表 11：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	25
UICC III	13
		UICC IV	6
未知分期	6
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表11的CRC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.67（图10）。

实施例 14

SCRN1作为膀胱癌（BLC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的膀胱癌患者的样品，在表12中给出了UICC分类。

表 12：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC 0/I/II	42
UICC III	1
		UICC IV	3
未知分期	4
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表12的BLC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.65（图11）。

实施例 15

SCRN1作为肾癌（KC）的血清标志物

使用来源于25位良好表征的肾癌患者的样品，在表13中给出了UICC分类。

表 13：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	13
UICC III	4
		UICC IV	3
未知分期	5
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表13的KC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.60（图12）。

实施例 16

SCRN1作为前列腺癌（PC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的结直肠癌患者的样品，在表14中给出了UICC分类。

表 14：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	24
UICC III	4
		UICC IV	6
未知分期	16
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表14的PC样品中的SCRN1水平，得到AUC为0.58（图13）。

实施例 17

在上皮细胞衬液（ELF）中的SCRN1——支气管镜微量取样

支气管镜微量取样（BMS）提供了主要以非侵害性方式在小肺结节附近收集上皮细胞衬液（ELF）的可能性。之后，有可能测量ELF中肿瘤标志物的浓度以鉴定恶性结节。通过在对侧肺中取样ELF得到相应的肿瘤标志物的患者特异性基线浓度。

通过支气管镜将BMS探针(Olympus Medical Systems Corp. Tokyo, Japan, 货号: BC-402C)插入肺，BMS探针由外部的聚乙烯护套和内部的附着在不锈钢引导物上的棉探针组成。内部探针深入结节附近并进行几秒种的BMS。之后，内部探针收回外部护套且2种装置同时收回。切掉棉尖端并直接冷冻在-80℃。用于测定，从棉尖端上洗脱ELF且之后可分析ELF。使用如实施例4中描述的ELISA在ELF中测定SCRN1的浓度。

通过计算机断层摄影术，在来自具有肺部肿瘤的患者的ELF中检测到SCRN1。在表15中使用的缩写是PM（=具有肺部肿瘤的患者）和Cl（=对侧肺）。表中给出了可得到的最终癌症相关诊断。

表 15：检测ELF中的SCRN1

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 分离蛋白-1作为癌症标志物

<130> 26148 WO

<150> EP09161524

<151> 2009-05-29

<160> 4

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 414

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val Ala Phe Pro Pro Arg

1 5 10 15

Ala Lys Asp Gly Leu Val Val Phe Gly Lys Asn Ser Ala Arg Pro Arg

20 25 30

Asp Glu Val Gln Glu Val Val Tyr Phe Ser Ala Ala Asp His Glu Pro

35 40 45

Glu Ser Lys Val Glu Cys Thr Tyr Ile Ser Ile Asp Gln Val Pro Arg

50 55 60

Thr Tyr Ala Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu Trp Gly Ala Glu

65 70 75 80

Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val Cys Ile Ala Asn Glu Ala Ile Asn

85 90 95

Thr Arg Glu Pro Ala Ala Glu Ile Glu Ala Leu Leu Gly Met Asp Leu

100 105 110

Val Arg Leu Gly Leu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Lys Glu Ala Leu Asp

115 120 125

Val Ile Val Ser Leu Leu Glu Glu His Gly Gln Gly Gly Asn Tyr Phe

130 135 140

Glu Asp Ala Asn Ser Cys His Ser Phe Gln Ser Ala Tyr Leu Ile Val

145 150 155 160

Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val Leu Glu Thr Ile Gly Lys Tyr Trp Ala

165 170 175

Ala Glu Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile Cys Ser Gln Leu Ser

180 185 190

Leu Thr Thr Lys Met Asp Ala Glu His Pro Glu Leu Arg Ser Tyr Ala

195 200 205

Gln Ser Gln Gly Trp Trp Thr Gly Glu Gly Glu Phe Asn Phe Ser Glu

210 215 220

Val Phe Ser Pro Val Glu Asp His Leu Asp Cys Gly Ala Gly Lys Asp

225 230 235 240

Ser Leu Glu Lys Gln Glu Glu Ser Ile Thr Val Gln Thr Met Met Asn

245 250 255

Thr Leu Arg Asp Lys Ala Ser Gly Val Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe

260 265 270

Leu Thr Thr Ala Ser Gly Val Ser Val Leu Pro Gln Asn Arg Ser Ser

275 280 285

Pro Cys Ile His Tyr Phe Thr Gly Thr Pro Asp Pro Ser Arg Ser Ile

290 295 300

Phe Lys Pro Phe Ile Phe Val Asp Asp Val Lys Leu Val Pro Lys Thr

305 310 315 320

Gln Ser Pro Cys Phe Gly Asp Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Pro Arg

325 330 335

Phe Gln Glu Lys Pro Asp Arg Arg His Glu Leu Tyr Lys Ala His Glu

340 345 350

Trp Ala Arg Ala Ile Ile Glu Ser Asp Gln Glu Gln Gly Arg Lys Leu

355 360 365

Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Glu Ala Met Glu

370 375 380

Glu Ile Leu Thr Ser Ser Glu Pro Leu Asp Pro Ala Glu Val Gly Asp

385 390 395 400

Leu Phe Tyr Asp Cys Val Asp Thr Glu Ile Lys Phe Phe Lys

405 410

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的肽延伸

<400> 2

Met Arg Gly Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的正向引物

<400> 3

acgtgaattc attaaagagg agaaattaac tatgagagga tcgcatcacc atcaccatca 60

cattgaaggc cgtgctgcag ctcctccaag ttactg 96

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的反向引物

<400> 4

acgtaagctt tcattactta aagaacttaa tctccgtg 38

Claims

1.特异性地测量SCRN1蛋白所需的试剂在制备用于体外在体液样品中评估癌症的试剂盒中的用途，其中增加的SCRN1蛋白的浓度是癌症的指征。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒还包含特异性地测量一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒用于夹心免疫测定。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其进一步特征在于所述试剂盒用于评估选自肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肾癌和前列腺癌的癌症。

5.根据权利要求2所述的用途，其进一步特征在于所述一种或更多种其它的标志物选自：CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其进一步特征在于所述浓度通过免疫学方法测量。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述特异性地测量SCRN1蛋白所需的试剂是针对SCRN1蛋白的抗体。

8.用于实现根据权利要求1所述的用途的试剂盒，其包含特异性地测量SCRN1蛋白所需的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含特异性地测量一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。

10.用于实现根据权利要求1所述的用途的生物芯片阵列，其用以特异性地测量SCRN1和一种或多种选自CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物。

11.用于实现根据权利要求1所述的用途的生物芯片阵列，其用以特异性地测量SCRN1和一种或多种选自CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标志物，和用于进行测量的辅助试剂。