CN102326081B - s-ErbB-3作为癌症标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及辅助评估癌症的方法。本发明公开了s-ErbB-3作为不同癌症类型的通用标志物的应用。s-ErbB-3的测量可以用于例如癌症的早期检测或诊断，或经历手术的患者的监测。
Description
本发明涉及辅助评估癌症的方法。本发明公开了s-ErbB-3作为不同癌症类型的通用标志物的应用。s-ErbB-3的测量可以用于例如癌症的早期检测或诊断或经历手术的患者的监测(surveillance)。
尽管在检测和治疗中取得了进展，癌症仍然是一个主要的公共健康挑战。癌细胞的特征在于癌-相关的标志物蛋白的生成。癌-相关的蛋白存在于携带癌细胞的个体的组织和体液中。它们的水平在致癌进展的早期通常较低，并在疾病进展过程中增加，且仅在少数情况下，在疾病进展期间观察到所述蛋白表现出降低的水平。这些蛋白的灵敏检测是有利的和有前途的癌症诊断方案，尤其是在癌症的早期诊断中。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。
实体瘤的最重要的治疗方案是：
a)手术切除肿瘤，
b)化疗，
c)放疗，
d)用生物制品治疗，如抗-肿瘤抗体或抗-血管生成抗体，和
e)上述方法的组合。
肿瘤的手术切除被广泛地接受为早期实体瘤的第一线治疗方法。但是，大多数癌症只有在它们变得有征候时(即当患者已经处于疾病进展的相当晚期时)才被检测出。
癌症的分期是疾病关于程度、进展和严重性的分类。其将癌症患者分组，从而可以对预后和选择治疗作出概括。
BC或CRC的不同病期过去是根据Dukes的A至D期进行分类。现在，TNM系统是最广泛使用的癌症解剖学程度的分类。该系统代表国际接受的统一分期系统。它有三个基本变量：T(原发肿瘤的程度)，N(局部淋巴结状态)以及M(存在或不存在远处转移)。TNM标准由UICC(国际防癌联盟，International Union Against Cancer)(Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(编)：TNM Classification of MalignantTumours，第6版，2002)公布。在确定TNM状态以后，将患者归入用在I至IV范围内的罗马数字表示的病期，其中IV是最晚期的病期。TNM分期和UICC病期彼此对应，如在摘自上面的Sobin L.H.和Wittekind(编)的下表中所示的。
TNM分期和UICC病期的相互关系
| UICC病期 | T分期 | N分期 | M分期 |
| 病期0 | Tis | N0 | M0 |
| 病期I | T1，T2 | N0 | M0 |
| 病期IIA | T3 | N0 | M0 |
| 病期IIB | T4 | N0 | M0 |
| 病期IIIA | T1，T2 | N1 | M0 |
| 病期IIIB | T3，T4 | N1 | M0 |
| 病期IIIC | 任意T | N2 | M0 |
| 病期IV | 任意T | 任意N | M1 |
特别重要的是，诸如BC或CRC等癌症的早期诊断转变为好很多的预后。在CRC中，结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期诊断出的那些患者具有最好的预后。在已经存在远处转移时诊断出的患者仅有10％的五年生存率，与此相比，如果处理得当，在早至Tis、N0、M0或T1-3、N0、M0病期诊断出的患者，在诊断后具有超过90％的五年生存机会。
目前的检测方法(包括成像方法，诸如X-射线或核共振成像)在理论上可能至少部分地适用作一般的筛选工具。但是，它们的成本非常昂贵，保健系统不能承担得起用于普查大量受试者(尤其是对于没有任何肿瘤症状的受试者)的一般的和广泛的应用。
因而，本发明的一个目的是，提供一种简单的且节省成本的肿瘤评估方法，例如用于鉴别疑似具有癌症的个体。为此目的，在体液(例如血液或血清或血浆)中可检测到的一般肿瘤标志物或这样的标志物集合是合乎需要的。
许多血清肿瘤标志物已经处于临床应用中。例如细胞角蛋白19的可溶性的30kD片段(CYFRA21-1)、癌胚发生抗原(CEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标志物。但是，它们都不能满足筛选工具所要求的灵敏度和特异性标准(Thomas，L.，Labor und Diagnose，TH Books Verlagsgesellschaft，Frankfurt/Main，Germany(2000))。
为了具有临床效用，作为单独标志物的新的诊断标志物应当至少与本领域已知的其它标志物一样好，或更好。或者，如果分别单独使用或与一个或更多个其它标志物联合使用，新的标志物应当引起诊断灵敏度和/或特异性的改进。通过在下面详细介绍的受试者操作特征(receiver-operating characteristics)，对检查的诊断灵敏度和/或特异性进行最佳评价。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标志物的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和控制的方法。因此，存在改进癌症、尤其是BC的体外评估的急迫的临床需求。由于早期诊断出的患者的存活机会大大高于在疾病进展后的期得到诊断的患者，所以改进癌症(例如BC)的早期诊断尤其重要。
鉴于BC是一种公共健康问题，必须开发出BC的更有效的筛选和预防措施。
目前可用的最早期乳腺癌检测方法包括，使用临床乳房检查或乳房X射线照相术。但是，在肿瘤是可触知的或可以通过乳房X射线照片检测出之前，通常必须存在显著的肿瘤大小。乳房组织的密度和年龄是筛选乳房X射线照相术的准确度的重要指标。灵敏度范围是63％(在具有非常致密的乳房的妇女中)至87％(在具有几乎完全脂肪性的乳房的妇女中)。灵敏度随着年龄从69％(在约40岁的妇女中)增加至83％(在80岁和以上的妇女中)(Carney，P.A.等人，Ann.Intern.Med.138(2003)168-175)。仅20-25％的乳房X射线照相地检测出的异常经过活组织检查证实是恶性的。癌前和癌性病变的显影代表着早期检测的最佳方案，但是乳房X射线照相术是一项昂贵的检查，其需要极大的小心和专家经验来实现并解释结果(WHO，Screening for Breast Cancer，2002年5月10日；Esserman，L.等人，J.Natl.Cancer Inst.94(2002)369-375)。
在近些年，已经报道了海量的所谓的乳房特异性基因或甚至所谓的BC特异性基因。大多数的相应研究论文或专利申请都是基于通过分别分析癌组织和不同组织或邻近正常组织的RNA表达谱所获得的数据。这样的方法可概括为差异mRNA展示技术。
作为可由mRNA展示技术获得数据的实例，应提及和讨论WO00/60076。该申请描述并要求保护超过200种分离的多核苷酸以及同样多的对应的多肽，以及它们在BC的检测中的应用。但是，通过对应蛋白的水平不能监测mRNA水平的差异是常识。稀有mRNA编码的蛋白的存在量可能非常大，而高丰度mRNA编码的蛋白可能仍然难以检测到或根本无法发现(Chen，G.等人，Molecular and CellularProteomics 1(2002)304-313)。mRNA水平和蛋白水平之间缺乏关联是源于以下的原因，如mRNA稳定性、翻译效率、蛋白稳定性等。
还有一些最近的方法研究不同组织之间或健康组织和患病组织之间的蛋白谱差异，以鉴别可用于诊断BC的侯选标志物分子。Wulfkuhle，J.D.等人，Cancer Research 62(2002)6740-6749已经鉴别了57种蛋白，这些蛋白在BC组织和邻近的正常组织之间有差别地表达。没有报道得自个体的液体样品的数据。
WO 02/23200报告了约12种通过表面增强激光解吸和离子化(SELDI)发现的乳腺癌-相关的斑点。与得自健康对照的血清相比，在得自BC患者的血清中更常观察到这些斑点。但是，不知道这种斑点中包含的分子的身份(例如其序列)。
多年来，乳头抽吸液(NAF)已经被用作鉴别乳腺癌-特异性的标志物的潜在非侵入性方法。Kuerer等人通过2D凝胶电泳对比了来自具有单侧浸润性乳腺癌的妇女的两侧配对乳头抽吸液(Kuerer，H.M.等人，Cancer 95(2002)2276-2282)。在遭受乳腺癌的乳房的NAF中检测到30至202个不同的蛋白斑点，在健康乳房的配对的NAF中未检出。通过凝胶图像分析，检测这些斑点。但是蛋白斑点的身份未知。
尽管BC领域中的侯选蛋白标志物列表是庞大的且不断增长，但迄今为止这些分子的临床/诊断效用还未知。为了在临床上有效用，作为单个标志物的新诊断标志物物至少应当和本领域已知的最好单个标志物一样好。或者，如果分别单独使用或与一种或更多种其它标志物联用，新标志物应当使诊断灵敏度和/或特异性有进步。检查的诊断灵敏度和/或特异性最好通过下文详述的其受试者操作特征来评估。
目前，在BC领域，仅有基于癌抗原15-3(CA 15-3，一种肿瘤相关粘蛋白)和癌胚抗原(CEA，一种肿瘤相关糖蛋白)的检测的诊断性血检可用于帮助诊断。在具有晚期乳腺癌的患者中，CA 15-3通常增加。在具有早期乳腺癌的患者中，CA 15-3水平很少升高(Duffy，M.J.，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.38(2001)225-262)。卵巢、肺和前列腺的癌症也可以升高CA 15-3水平。升高的CA 15-3水平可能与非癌病症(诸如良性乳房或卵巢疾病、子宫内膜异位症、盆腔炎性疾病和肝炎)有关。妊娠和哺乳也可以造成CA 15-3水平升高(National CancerInstitute，Cancer Facts，Fact Sheet 5.18(1998)1-5)。CEA的主要用途是监测结直肠癌，尤其是当该疾病已经转移时。但是，多种癌症会产生升高水平的CEA，包括乳腺癌。
由于缺乏器官和肿瘤特异性，CA 15-3的测量和CEA的测量都未被推荐用于筛选BC。在BC患者的随访护理中，这些肿瘤标志物是有用的诊断工具(Untch，M.等人，J.Lab.Med.25(2001)343-352)。
CYFRA 21-1目前被视作肺癌的当前已知的肿瘤标志物中的最佳者。尽管不是器官-特异性的，它主要存在于肺组织中。据称CYFRA21-1对于肺癌的灵敏度是46-61％，具有95％的特异性(相对于其它良性肺病)。增加的CYFRA 21-1的血清水平也与明确的良性肝病、肾功能不全和侵入性膀胱癌有关。CYFRA 21-1检查被推荐用于手术后治疗监测。
CEA属于胎儿癌性抗原群体，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官-特异性的，主要用于监测结直肠癌。除了恶性肿瘤以外，几种良性疾病(诸如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫病)也与升高的CEA血清水平有关。在相对于良性肺病的95％特异性，据报道它对肺癌的灵敏度是29-44％。CEA的主要用途是监测结直肠癌，尤其是当该疾病已经转移时。但是，多种癌症会产生升高水平的CEA，包括乳腺癌。CEA的一个优选用途是肺癌的治疗监测。
在BC领域中，CA 15-3(癌抗原15-3，一种肿瘤相关粘蛋白)可用于辅助诊断。在具有晚期乳腺癌的患者中，CA 15-3通常增加。在具有早期乳腺癌的妇女中，CA 15-3水平很少升高(Duffy，M.J.，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.38(2001)225-262)。卵巢、肺和前列腺的癌症也可以升高CA 15-3水平。升高的CA 15-3水平可能与非癌病症(诸如良性乳房或卵巢疾病、子宫内膜异位症、盆腔炎性疾病和肝炎)有关。妊娠和哺乳也可以造成CA 15-3水平升高(National Cancer Institute，Cancer Facts，Fact Sheet 5.18(1998)1-5)。
在糖脂上的CA 19-9(碳水化合物抗原19-9，一种唾液酸化的Lewis(a)抗原)是胃肠癌的一种肿瘤标志物。它存在于胎儿胃、肠、和胰腺上皮中。低浓度也见于肝、肺和胰腺的成年组织中。在肿瘤体积和CA 19-9分析值之间不存在关联。因此，CA 19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。由于该粘蛋白仅由肝排泄，在有些情况下，即使轻微的胆汁淤积也可以导致明显升高的CA 19-9血清水平。该标志物主要用于辅助监测具有经证实的胰腺癌的那些患者的疾病状态(灵敏度70-87％)。3-7％的群体具有Lewis a-阴性的/b-阴性的血型构型，且不能表达具有反应性的决定簇CA 19-9的粘蛋白。当解释发现时，这必须予以考虑。
ErbB-2(HER-2)代表“人表皮生长因子受体2”，人c-erbB-2基因的过表达在功能上与在乳腺癌的更高侵入性有关。它是ErbB蛋白家族(更常见地称作表皮生长因子受体家族)的一个成员(Peles，E.等人，Cell 69(1992)205-216)。ErbB-2(HER-2)还已经被命名为CD340(分化簇340)或p185。因为它在乳腺癌的发病机制中的作用和作为治疗靶标，ErbB-2(HER-2)受到注意。它是一种细胞膜表面-结合的受体酪氨酸激酶，且通常参与导致细胞生长和分化的信号转导途径。认为ErbB-2是一种孤独受体，EGF家族的配体都不能活化它。但是，在配体结合后，ErbB受体二聚化，且ErbB-2是ErbB家族的其它成员的优选二聚化配偶体。人c-erbB-2基因是位于人染色体17的长臂处的原癌基因(17q11.2-q12)。
从本发明的意义上而言，BC的早期诊断表示在癌前状态(DCIS)或在根本没有转移(非近端也非远端)的肿瘤阶段的诊断，即，存在Tis、N0、M0或T1-4、N0、M0。Tis表示原位癌。在一个优选的实施方案中，ErbB-3的检测被用于诊断非转移期的BC，即，该诊断是在Tis、N0、M0或T1-3、N0、M0(＝Tis-3、N0、M0)病期做出。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对允许可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期BC肿瘤标志物的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和控制的诊断试验。因此，存在改进从血液诊断BC的急迫的临床需求。由于早期诊断出的患者的存活机会大大高于在疾病进展后的期得到诊断的患者，所以改进BC的早期诊断尤其重要。
本发明的目的是，研究是否可以鉴别出可用于评估癌症疾病的生化标志物。具体地，本发明的发明人研究了是否可以在组织样品或体液中鉴别出可用于评估不同癌症类型(诸如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌)的生化标志物。
令人惊奇地，已经发现，使用s-ErbB-3作为生物标志物，可以至少部分地克服现有技术中目前已知的标志物的一些问题，所述s-ErbB-3包含：(i)人“c-erbB-3癌基因”蛋白的脱落的胞外域，和(ii)由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的(a)s-ErbB-3的浓度，(b)任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
另外，本发明涉及s-ErbB-3在癌症评估中的应用。
另外，本发明涉及针对s-ErbB-3蛋白的抗体在癌症评估中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
另外，本发明公开了包含s-ErbB-3和任选的一种或更多种其它癌症标志物的标志物集合在癌症评估中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
另外，本发明涉及一种试剂盒，其用于实现在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的(a)s-ErbB-3的浓度，(b)任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征，所述试剂盒包含特异性地测量s-ErbB-3所需的试剂和任选的特异性地测量一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。
具体实施方式
在一个优选的实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中s-ErbB-3的浓度，并使用该测量结果、特别是测定的浓度来评估癌症。
令人惊奇地，已经发现，实验样品中增加的s-ErbB-3浓度与癌症的发生有关。经证实，s-ErbB-3是不对单一癌症类型特异性的标志物，而是不同癌症类型的标志物，即一般的肿瘤标志物。由于s-ErbB-3表现得对肿瘤发生过程是非常特异性的，新颖的肿瘤标志物s-ErbB-3在不同种类的肿瘤类型的临床效用中具有巨大潜力。
另外，本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。例如，分别在特定癌症类型(如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌)中，已经在样品中发现了与正常对照相比增加的s-ErbB-3浓度。
根据本发明的一个优选实施方案，测量样品中的s-ErbB-3的浓度，以便在体外评估特定癌症类型，诸如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌。
根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的s-ErbB-3的浓度，以便体外评估癌症，诸如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌。
根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的s-ErbB-3的浓度，以便体外评估癌症，诸如乳腺癌和/或结直肠癌。
根据本发明的另一个优选实施方案，测量样品中的s-ErbB-3的浓度，以便体外评估乳腺癌。
本发明的一个实施方案代表人群普查，以区分可能没有癌症的个体和可能归类为“疑似”病例的个体。然后对后一组个体进行其它诊断程序，例如通过成像方法或其它合适的方法。
本发明的另一个实施方案代表肿瘤标志物集合的改进，所述肿瘤标志物集合适用于诊断一般的癌症，或所述肿瘤标志物集合适用于诊断特定肿瘤类型，例如乳腺癌。
本发明还涉及通过生化标志物在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的s-ErbB-3和一种或更多种其它的癌症特异性的标志物的浓度，并使用测得的测量结果、尤其是浓度来评估癌症。与s-ErbB-3联合使用的优选标志物是：一方面，作为一般肿瘤标志物(即不是对单一肿瘤类型特异性的标志物)的标志物，或另一方面，作为特异性肿瘤标志物(对单一肿瘤类型特异性的标志物)的标志物。优选的标志物，例如用于评估诸如乳腺癌或结直肠癌等癌症，是CYFRA21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2(HER-2)。这些标志物可以各自单独使用，或以任意组合与s-ErbB-3一起使用。
如果根据本发明的方法评估癌症，各种癌症的一种或更多种其它的标志物优选地选自：CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及标志物集合在例如癌症(例如乳腺癌、卵巢癌和/或结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含标志物s-ErbB-3和至少一种其它的肿瘤标志物。
本发明还涉及针对s-ErbB-3的抗体在癌症评估中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
另外，本发明涉及抗体在癌症评估中的应用，所述抗体针对由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型，其中增加的由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型的浓度是癌症的指征。
另外，本发明涉及抗体在癌症评估中的应用，所述抗体针对人“c-erbB-3癌基因”蛋白的脱落的胞外域，其中增加的人“c-erbB-3癌基因”蛋白的脱落的胞外域的浓度是癌症的指征。
优选地，本发明涉及通过生化标志物在体外评估癌症(诸如肺癌或结直肠癌)的方法，所述方法包括，测量样品中的s-ErbB-3和一种或更多种其它的癌症标志物(例如一种或更多种其它的乳腺癌或结直肠癌标志物)的浓度，并使用测得的测量结果、尤其是浓度来评估癌症。优选地，所述一种或更多种其它的标志物选自：CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及标志物集合在癌症(尤其是乳腺癌或结直肠癌、更尤其是结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含s-ErbB-3和CYFRA 21-1。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及标志物集合在癌症(尤其是乳腺癌或结直肠癌、更尤其是结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含s-ErbB-3和CEA。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及标志物集合在癌症(尤其是乳腺癌或结直肠癌、更尤其是结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含s-ErbB-3和CA 15-3。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及标志物集合在癌症(尤其是乳腺癌或结直肠癌、更尤其是结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含s-ErbB-3和CA 19-9。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及标志物集合在癌症(尤其是乳腺癌或结直肠癌、更尤其是结直肠癌)评估中的应用，所述标志物集合至少包含s-ErbB-3和ErbB-2。
本发明还涉及s-ErbB-3蛋白在癌症评估中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
本发明还涉及s-ErbB-3在评估几种特定癌症类型(尤其是乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌)中的应用。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含特异性地测量s-ErbB-3和一种或更多种其它的癌症标志物所需的试剂。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含特异性地测量s-ErbB-3和任选的上述的一种或更多种癌症标志物(例如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌的标志物)所需的试剂，其中所述其它标志物可以各自单独使用，或以它们的任意组合使用。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量s-ErbB-3和CYFRA 21-1所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量s-ErbB-3和CEA所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量s-ErbB-3和CA 15-3所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量s-ErbB-3和CA 19-9所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于实现根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包含分别特异性地测量s-ErbB-3和ErbB-2所需的试剂，和任选的用于进行测量的辅助试剂。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括，测量样品中的(a)s-ErbB-3的浓度，(b)任选的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的s-ErbB-3浓度是癌症的指征。
术语“测量”优选地包括样品中s-ErbB-3的定量、半定量或定量测量。在一个优选的实施方案中，测量是半定量测量，即测定s-ErbB-3的浓度是在截止值以上或以下。如技术人员会理解的，在有-(存在)或无-(不存在)试验中，通常将试验灵敏度设定得与截止值匹配。例如通过检查一组健康个体，可以确定截止值。优选地，将截止设定为产生90％的特异性，也优选地，将截止设定为产生95％的特异性，或也优选地，将截止设定为产生98％的特异性。超过截止值的值可以是例如癌症存在的指征。具体地，超过截止值的值可以是例如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌存在的指征。在另一个优选的实施方案中，s-ErbB-3的测量是定量测量。在其它实施方案中，将s-ErbB-3的浓度与潜在的诊断问题(如例如疾病的病期、疾病进展或对治疗的应答)相关联。
在某些其它优选的实施方案中，例如在监测治疗或随访中，将截止设定为产生90％的灵敏度，也优选地，将截止设定为产生95％的灵敏度，或也优选地，将截止设定为产生98％的灵敏度。
低于截止值的值可以是例如癌症存在的指征。具体地，低于截止值的值可以是例如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌存在的指征。
在另一个优选的实施方案中，s-ErbB-3的测量是定量测量。在其它实施方案中，将s-ErbB-3的浓度与潜在的诊断问题(如例如疾病的病期、疾病进展或对治疗的应答)相关联。
ErbB-3以及ErbB1、ErbB2和ErbB4属于表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族。
在结合神经调节蛋白(它们也称作分化因子或heuregulin)以后，通过与ErbB1、ErbB2或ErbB4的异源二聚化，ErbB-3被活化(Riese，D.J.等人，Mol.Cell Biol.15(1995)5770-5776)。通过结合ErbB-3或ErbB4，神经调节蛋白诱导上皮细胞、神经胶质细胞和肌细胞的增殖或分化(Lee，H.等人，Oncogene 16(1998)3243-3252；Lee，H.等人，Cancer Res.61(2001)4467-4473；Citri，A.等人，Exp.Cell Res.284(2003)54-65)。
人ErbB-3蛋白(也称作p180ErbB-3或“人表皮生长因子受体3”)由人c-erbB-3癌基因编码。在源自人“c-erbB-3癌基因”的全长mRNA中编码的所述p180ErbB-3糖蛋白(180kDa)由胞外域(配体结合域，ECD)、跨膜域和与酪氨酸激酶具有同源性的胞质域组成(Kraus，M.H.等人，PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman，G.D.等人，PNAS 87(1990)4905-4909)。
术语“s-ErbB-3”涉及(i)人“c-erbB-3癌基因”蛋白的脱落的胞外域和(ii)由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型。
Lee，H.等人，Oncogene 16(1998)3243-3252已经报道了从卵巢癌衍生的细胞系分离出的4个新的替代性的c-erbB-3癌基因转录物(mRNA)。使用RNA印迹分析(其中观察了组织和细胞特异性的定位)，检查了这些替代同种型的表达(细节参见下文)(Katoh，M.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.192(1993)1189-1197)。
在SEQ ID NO：1(野生型)中，显示了人p180ErbB-3蛋白的脱落的胞外域。由现在已知的源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型显示在SEQ ID NO：2(p45ErbB-3、同种型R2)、SEQ ID NO：3(p85ErbB-3、同种型R31)、SEQ ID NO：4(p85ErbB-3、同种型R35)和SEQ ID NO：5(同种型R1/变体S)中。
稳定转染的成纤维细胞证实，4个截短形式是可溶的分泌型蛋白。在原代卵巢细胞系的培养基中，90kDa ErbB-3蛋白同种型可使用针对ErbB-3的配体结合域的抗体检测到(90kDa ErbB-3蛋白同种型是上面显示的85kDa ErbB-3蛋白同种型的更高糖基化形式)。其它研究提示，分泌的p85ErbB-3蛋白同种型会抑制神经调节蛋白与ErbB-3受体的结合，其结果是，内源配体被中和。总之，该观察提示，p85ErbB-3蛋白同种型是HRG-刺激的信号转导的天然存在的负调节物。最近，在来自具有前列腺癌的男性的骨髓上清液样品中，已经鉴别出了分泌的p45ErbB-3蛋白同种型。另外，人组织样本的免疫组织化学分析证实，分泌的p45ErbB-3蛋白同种型在骨的转移前列腺癌细胞中高度表达(Chen，N.等人，Cancer Res.67(2007)6544-6548)。
如本领域技术人员显而易见的，本发明不应当解释为限于SEQ IDNO：1所示的ErbB-3蛋白的全长脱落的胞外域或SEQ ID NO：2-5所示的源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型。s-ErbB-3的生理或人工片段、s-ErbB-3的二级修饰以及s-ErbB-3的等位基因变体也包括在本发明内。多肽的变体由相同基因编码，但是它们的等电点(＝PI)或分子量(＝MW)或二者可以不同，例如，作为替代性的mRNA或前-mRNA处理的结果。变体的氨基酸序列与对应的标志物序列具有95％或更高的同一性。人工片段优选地包括合成地或通过重组技术生产的肽，其至少包含一个诊断目标表位，所述表位由源自SEQ ID NO：1-5所公开的序列的至少6、7、8、9或10个连续氨基酸组成。这样的片段可以有利地用于制备抗体或作为免疫测定中的标准品。更优选地，所述人工片段包含至少2个适用于建立夹心免疫测定的目标表位。
R&D Systems提供了ErbB-3ELISA试验，用于测量细胞培养上清液中的天然和重组人表皮生长因子受体3。
Genentech Inc.公开了这样的抗体，其结合ErbB-3蛋白，并减少表达ErbB2和ErbB-3的细胞中HRG-诱导的ErbB2-ErbB-3蛋白复合物的形成。此外，这样的抗体，其增加神经生长因子对ErbB-3蛋白的结合亲和力，且特征是减少表达ErbB2和ErbB-3的细胞中HRG-诱导的ErbB2活化。
如本文所使用的，下面术语的每一个具有与在本部分中的它相关的含义。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种))冠词的语法上的对象。作为实例，“一种标志物”指一种标志物或超过一种标志物。术语“至少”用于表示任选地可能存在一种或更多种其它对象。作为实例，至少包括(标志物)s-ErbB-3和CYFRA 21-1的标志物集合可以任选地包括一种或更多种其它的标志物。
表述“一种或更多种”表示1-50、优选1-20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
在适当样品中检测s-ErbB-3蛋白，尤其是(i)人“c-erbB-3癌基因”蛋白的脱落的胞外域和(ii)由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的分泌性蛋白同种型。优选的样品是组织样品或体液，诸如血液、血浆、血清、粪便(优选地，在疑似CRC的情况下)、乳头抽吸液(＝NAF；优选地在疑似BC的情况下)等，优选地，所述样品源自人受试者，例如肿瘤患者或处于肿瘤危险中的人或疑似具有肿瘤的人。也优选地，在血清或血浆样品中检测s-ErbB-3。
在根据本发明的一个优选的实施方案中，测定s-ErbB-3的浓度。在一个实施方案中，使用特异性的结合剂，特异性地测量样品中的标志物s-ErbB-3。
特异性的结合剂是，例如，s-ErbB-3受体、结合s-ErbB-3的凝集素或s-ErbB-3的抗体。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有108l/mol、或更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语“特异性的”表示，样品中存在的其它生物分子不与s-ErbB-3的特异性的结合剂发生显著的结合。优选地，与除靶分子之外的生物分子结合的水平产生这样的结合亲和力，其最多分别是与靶分子亲和力的仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少、或仅1％或更少。优选的特异性的结合剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。
特异性的结合剂优选是与s-ErbB-3反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体结合域的遗传构建体。
可以使用保留了特异性的结合剂的上述标准的任何抗体片段。使用现有技术水平方法产生抗体，例如在Tijssen(Tijssen，P.，Practiceand theory of enzyme immunoassays，11，Elsevier Science PublishersB.V.，Amsterdam，全书，尤其第43-78页)中所说明的。另外，熟练的技术人员充分认识到可以用于抗体的特异性分离的以免疫吸附剂为基础的方法。使用这些方法，可以加强多克隆抗体的质量并因此加强其在免疫测定中的性能(Tijssen，P.，见上，第108-115页)。
为达到在本发明中公开的成绩，可以使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种(例如绵羊或山羊)的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于具有恒定特征的单克隆抗体可以以任何需要量产生，所以它们代表了临床常规测定开发中的理想工具。在根据本发明的方法中，s-ErbB-3的单克隆抗体的产生和使用分别代表其它优选的实施方案。
技术人员现在将理解，s-ErbB-3已经被鉴定为用于评估癌症(优选乳腺癌或结直肠癌)的标志物，可以使用不同的免疫诊断方法以达到能够与本发明成绩相比的结果。例如，可以使用可选的策略以产生抗体。除了别的以外，这些策略包含使用合成肽，所述肽代表用于免疫的s-ErbB-3表位。或者，可以使用DNA免疫接种，也称为DNA疫苗接种。
为了测量，在适于形成结合剂s-ErbB-3复合物的条件下，将从个体获得的样品与s-ErbB-3特异性的结合剂一起温育。由于技术人员不进行任何创造性努力就可以轻易地确定这类适宜的温育条件，所以这样的条件无需说明。测量结合剂s-ErbB-3复合物的量，并将其用于评估癌症，优选肺癌。技术人员将理解，测量特异性的结合剂s-ErbB-3复合物的量的许多方法都在有关教科书中得到详细说明(参阅，例如Tijssen P.，见上，或Diamandis，E.P.和Christopoulos，T.K.(编)Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。
优选地，以夹心型测定形式检测s-ErbB-3。在这类测定中，使用第一种特异性的结合剂将s-ErbB-3捕获于一侧，且在另一侧使用第二种特异性的结合剂，该试剂被标记成可以直接或间接检测出。在夹心型测定形式中使用的特异性的结合剂可以是特异性地针对s-ErbB-3的抗体。使用不同的捕获抗体和标记的抗体(即识别s-ErbB-3蛋白上的不同表位的抗体)，可以进行检测。
从本发明的意义上而言，“癌症的标志物”和具体地“选自BC、CRC和OC的癌症的标志物”是这样的任意标志物，其如果与标志物s-ErbB-3相组合，会在一般癌症的评估中或在某些癌症类型的评估中(例如在BC的评估中)增加有关的信息。如果通过将所述标志物包括在已经包含标志物s-ErbB-3的标志物组合中，用于评估癌症的在给定特异性下的灵敏度或在给定灵敏度下的特异性分别可以提高，则所述信息被认为是有关的或具有附加价值。在癌症评估的优选实施方案中，在p＝.05、.02、.01或更低的显著性水平，灵敏度或特异性的提高分别是统计上显著的。优选地，所述一种或更多种其它的肿瘤标志物选自：CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2。
本文使用的术语“样品”表示为体外评估目的得到的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包括任何体液。优选的样品是全血、血清、血浆、乳头抽吸液(＝NAF；优选地，在疑似BC的情况下)、粪便(优选地，在疑似CRC的情况下)、组织裂解物或组织样品，其中血浆或血清是最优选的。
本文使用的术语“组织样品”和/或“组织切片”表示在手术、治疗切除术或包含为了体外评估目的取出细胞或组织的活组织检查(例如切开活组织检查、切除活组织检查、中心(core)活组织检查或针吸活组织检查)过程中从患者取出的生物样品。当进行根据本发明的分析时，直接使用组织样品材料，或用作“组织裂解物”。本文使用的“组织样品”也称作薄组织切片，其通常通过使用切片机来制作。在涉及生物样品的任意公开的方法实施方案中，这样的生物样品可以(但不一定)固定在显微镜载玻片上，是组织切片(诸如福尔马林固定的和石蜡包埋的组织切片)，和/或是肿瘤组织(例如，肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌或胶质母细胞瘤)。
本文使用的“组织裂解物”、“细胞裂解物”、“裂解物”、“裂解的样品”、“组织提取物”或“细胞提取物”表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术人员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。
术语“评估癌症”和具体地“评估选自BC、OC和CRC的癌症”用于表示，根据本发明的方法(单独地或与其它标志物或变量一起，例如，UICC所述的标准(参见上文))可以例如辅助医师确认或证实癌症(尤其是BC)是否存在，或在预后、复发检测(手术后患者的随访)和/或治疗(尤其是化疗)的监测中辅助医师。
如技术人员会理解的，任意这样的评估可以在体外进行。此后抛弃患者样品。患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，且患者样品材料不再转移回患者体内。优选地，所述样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。
除非另外指出，根据常规用法，使用技术术语。在细胞和分子生物学中的普通术语的定义可以参见：Lewin，B.，Genes V，OxfordUniversity Press出版(1994)，ISBN 0-19-854287 9)；Kendrew，J.等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版(1994)，ISBN 0-632-02182-9；和Meyers，R.A.(ed.)，MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，Inc.出版(1995)，ISBN 1-56081-5698。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过生化标志物体外评估癌症(例如BC)的方法，所述方法包括，测量样品中的s-ErbB-3浓度，和使用测定的浓度评估癌症(例如BC)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及通过生化标志物体外评估BC的方法，所述方法包括，测量样品中的s-ErbB-3浓度，和使用测定的浓度评估BC。
本发明的发明人已经令人惊讶地能够检测源自癌症(尤其是乳腺癌(BC)、结直肠癌(CRC)或卵巢癌(OC))患者的样品中的相当大百分比的标志物s-ErbB-3的增加的浓度。甚至更令人惊讶地，他们已经能够证实，在从个体得到的这种样品中的增加的s-ErbB-3浓度可以用于评估癌症，尤其是上述的癌症疾病。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型(例如BC、CRC或OC)的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病(例如BC)，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同时100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，CYFRA21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9、ErbB-2或本文证实的s-ErbB-3)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
可以单独地测定生化标志物，或者，在本发明的一个优选实施方案中，可以使用基于芯片或珠的阵列技术，同时测量它们。然后，例如使用每种标志物的单独截止值，独立地解释生物标志物的浓度，或者可以组合它们进行解释。
在另一个优选的实施方案中，在包含下述步骤的方法中，进行根据本发明的癌症的评估：a)测量样品中s-ErbB-3的浓度，b)测量样品中一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和c)使用测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度评估癌症。
在癌症的评估中，标志物s-ErbB-3在一个或更多个下述方面是有利的：筛选；诊断辅助；预后；治疗(诸如化疗、放疗和免疫治疗)的监测。
筛选：
筛选被定义为检查的全身应用，以鉴别个体(例如处于危险中的个体)中的疾病指征，例如，癌症的存在。优选地，筛选群体由已知处于比平均值更高的癌症风险的个体组成。例如，乳腺癌的筛选群体由已知处于比平均值更高的癌症风险的个体组成。
在优选的实施方案中，组织样品或任何体液(诸如全血、血浆、血清、粪便(优选地，在疑似CRC的情况下)或乳头抽吸液(＝NAF；优选地，在疑似BC的情况下))被用于癌症(例如乳腺癌)的筛选中。
在另一个优选的实施方案中，血浆、血清或NAF(优选地，在疑似BC的情况下)被用作乳腺癌筛选的样品。
在另一个优选的实施方案中，血浆、血清或粪便(优选地，在疑似CRC的情况下)被用作结直肠癌筛选的样品。
在另一个优选的实施方案中，血浆或血清被用作卵巢癌筛选的样品。
对于许多疾病，循环中的单一生化标志物不能满足筛选目的所要求的灵敏度和特异性标准。对于癌症、尤其是对于乳腺癌，这似乎也是正确的。必须预见到，在癌症筛选中必须使用包含多种标志物的标志物集合。在本发明中确立的数据表明，标志物s-ErbB-3有利地形成适用于筛选目的的标志物集合的必备部分。本发明因此涉及s-ErbB-3作为癌症标志物集合(即包含s-ErbB-3和一种或更多种用于癌症筛选目的的其它标志物的标志物集合)的一种标志物的用途。具体地，本发明涉及s-ErbB-3作为一般癌症标志物集合的一种标志物的用途。这样的标志物集合包含标志物s-ErbB-3和一种或更多种其它的标志物，例如一般癌症标志物和/或用于上述癌症类型的标志物。
s-ErbB-3也可能构成某些特定癌症类型(例如乳腺癌、结直肠癌和/或卵巢癌)的标志物集合。
要使用包含s-ErbB-3的标志物集合评估的其它优选的癌症类型是乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌。
要使用包含s-ErbB-3的标志物集合评估的其它优选的癌症类型是乳腺癌或结直肠癌。
要使用包含s-ErbB-3的标志物集合评估的一种优选的癌症类型是乳腺癌(BC)。
要使用包含s-ErbB-3的标志物集合评估的另一种优选的癌症类型是结直肠癌(CRC)。
本发明的数据进一步指示，标志物的某些组合在癌症的筛选是有利的。例如，参考筛选BC、OC或CRC的优选实施方案，本发明还涉及下述标志物集合的应用：包含s-ErbB-3和CYFRA 21-1的标志物集合，或包含s-ErbB-3和CEA的标志物集合，或包含s-ErbB-3和CA15-3的标志物集合，或包含s-ErbB-3和CA 19-9的标志物集合，或包含s-ErbB-3和ErbB-2的标志物集合，或包含s-ErbB-3和2种或更多种选自CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2的标志物的标志物集合。
诊断辅助：
标志物可以辅助在一个特定器官中的良性和恶性疾病的差别化诊断，帮助区分肿瘤的不同组织学类型，或在手术之前建立基线标志物值。
现在，在乳腺癌的检测中使用的重要方法是放射学和/或计算机体层摄影术(CT)扫描。通过这些方法，可以观察小结节，即疑似组织的小区域。但是，许多这样的结节(使用CT时，超过90％)代表良性组织变化，且仅小量结节代表癌性组织。标志物s-ErbB-3的应用可以辅助良性和恶性疾病的区分。
在一个优选的实施方案中，在免疫组织学方法中使用标志物s-ErbB-3，以便建立或确认BC、OC和/或CRC(优选BC)的不同组织学类型。
由于s-ErbB-3作为单一标志物可能优于其它标志物，例如在BC的情况下，优于其它标志物(如CEA或CYFRA 21-1)，必须预见到，s-ErbB-3可以用作诊断辅助，特别是通过在手术之前建立基线值。本发明因而也涉及s-ErbB-3用于在癌症手术之前建立基线值的应用。
预后：
预后指标可以定义为癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理或生化特征，所述特征以某种可能性预测疾病的结果。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免侵入性疾病的治疗不足和无痛疾病的治疗过度。Molina，R.等人，Tumor Biol.24(2003)209-218评价了CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后值。在他们的研究中，标志物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清水平似乎指示更短的存活。
由于单独的s-ErbB-3明显有助于区分癌症患者(例如BC或CRC患者)和健康对照，所以必须预见到，它将辅助评估患有癌症(优选BC或CRC)的患者的预后。手术前的s-ErbB-3水平最可能与一种或更多种其它的癌症标志物和/或TNM分期系统相组合。在一个优选的实施方案中，s-ErbB-3被用于具有BC、CRC或OC的患者的预后。
治疗的监测：
Merle，P.等人，Int.J.of Biological Markers 19(2004)310-315已经评价了用诱导化疗治疗的具有局部晚期NSCLC(＝非小细胞肺癌)的患者的CYFRA 21-1血清水平变动。他们的结论是，CYFRA 21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC患者中的肿瘤应答和存活的有用的预后工具。另外，报告已经描述了CEA在监测LC患者的治疗中的用途(Fukasawa，T.等人，Gan to Kagku Ryoho 13(1986)1862-1867)。其中的大多数是回顾性的、非随机化的，且包含少数患者。正如在使用CYFRA 21-1的研究的情况下一样，CEA研究表明：a)CEA水平降低同时接受化疗的患者通常具有比CEA水平不降低的那些患者更好的结果，和(b)对于几乎所有的患者，CEA水平的升高与疾病进展有关。
预见到，在化疗的监测方面，s-ErbB-3将是至少分别与CYFRA21-1或CEA一样好的标志物。本发明因此也涉及s-ErbB-3用于监测癌症患者和优选的处于化疗中的乳腺癌(BC)或结直肠癌(CRC)患者的用途。在治疗的监测中，在一个优选的实施方案中，组合s-ErbB-3和至少一种选自CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2的标志物的的测量结果，并用于评估BC或CRC。
随访：
大部分经历手术切除术的患者(例如肺癌患者)的目的是完全去除癌性组织、更迟发生复发或转移性疾病(Wagner，H.，Chest 117(2000)110-118；Buccheri，G.等人，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。这些复发的大多数发生在手术后的前2-3年内。由于如果太晚地检测出的话复发性/转移性疾病总是致命的，所以大量的研究已经集中在早期癌症复发上，以及因而潜在地可治疗的病期。
结果，许多癌症患者(例如BC患者)经历手术后的监护计划，这经常包括使用CEA的常规监测。在手术切除术以后1年CEA的系列监测已经证实，会检测出手术后早期的复发性/转移性疾病，灵敏度为大约29％，特异性为大约97％，甚至在没有可疑症状或体征的情况下(Buccheri，G.等人，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。因而，手术后BC患者的随访是适当生化标志物的最重要的应用领域之一。由于s-ErbB-3在研究的BC患者中的高灵敏度，所以单独的或与一种或更多种其它标志物相联合的s-ErbB-3可能极大地有助于BC患者的随访，尤其是手术后BC患者的随访。包含s-ErbB-3和一种或更多种其它的BC标志物的标志物集合在BC患者的随访中的用途，代表本发明的另一个优选的实施方案。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及s-ErbB-3在癌症的诊断领域中的用途。优选地，s-ErbB-3分别被用于评估乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及与一种或更多种其它的癌症标志物分子相联合的作为癌症(例如一般癌症或特定癌症类型，诸如乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌)的标志物分子的s-ErbB-3的用途。其它的标志物分子可以是癌-型非特异性的一般标志物分子和/或癌-型特异性的标志物分子，例如乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌的标志物分子。s-ErbB-3和至少一种其它的标志物被用于在从个体得到的液体样品中评估癌症(例如BC或CRC)。s-ErbB-3的测量可以组合的优选的选择的其它癌症标志物是CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和/或ErbB-2。具体地，s-ErbB-3的测量可以组合的优选的选择的其它BC标志物是CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和/或ErbB-2。进一步优选地，在BC的评估中使用的标志物集合包含s-ErbB-3和至少一种选自CYFRA 21-1和CEA的其它标志物分子。
如熟练的技术人员会明白的，存在许多使用两种或更多种标志物的测量的方式，以改善在研究中的诊断问题。在一个非常简单的、但是仍然经常有效的方案中，如果样品对至少一种研究的标志物是阳性的，则假定是阳性结果。这可以是例如当诊断感染性疾病(如AIDS)时的情况。
但是，经常地，评价标志物的组合。优选地，数学地组合标志物集合中的标志物(例如s-ErbB-3和CYFRA 21-1)的测量值，并将组合的值与潜在的诊断问题相关联。通过任何适当的现有技术水平数学方法，可以组合标志物值。众所周知的将标志物组合与疾病相关联的数学方法使用下述方法，如判别式分析(DA)(即线性的-、二次的-、规则化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林(Random Forest)方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主组分的方法(即SIMCA)、广义累加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练的技术人员会无问题地选择适当的方法来评价本发明的标志物组合。优选地，用于将本发明的标志物组合与例如是否存在LC相关联的方法选自DA(即线性的-、二次的-、规则化的判别式分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于这些统计学方法的细节，参见下面的文献：Ruczinski，I.等人，J.of Computational and GraphicalStatistics 12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the AmericanStatistical Association 84(1989)165-175；Hastie，T.等人，The Elementsof Statistical Learning，Springer Series in Statistics(2001)；Breiman，L.等人，Classification and regression trees，Wadsworth，Inc.，California(1984)；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classificationand Prediction，Oxford Statistical Science Series，28(2003)；和Duda，R.O.等人，Pattern Classification，Wiley Interscience，第2版(2001)。
本发明的一个优选的实施方案是，使用生物学标志物的潜在组合的最优化的多变量截止值，并辨别状态A和状态B，例如病态和健康。在这类分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物集合。
诊断方法的精确性最好由其受试者操作特征(ROC)说明(特别见Zweig，M.H.，和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是在整个观察数据范围内连续变化决定阈值(decision thresh-hold)而产生的所有灵敏度/特异性对的图。
实验室检验的临床性能依赖于其诊断精确性、或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性衡量了检验将研究的受试者的两种不同状况正确区分的能力。这类状况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。
在每个病例中，ROC图通过在决定阈值的全部范围将灵敏度对1-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性数+假阴性试验结果数)]。它也称为疾病或状况存在的阳性。它从受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性数+假阳性结果数)]。它是特异性的指标，并完全从未受影响的亚群计算。因为使用来自两个不同亚群的检验结果，完全独立地计算真和假阳性分数，所以ROC图不依赖于样品中疾病的患病率。ROC图上的每点代表对应于特定决定阈值的灵敏度/1-特异性对。具有最佳辨别力的检验(在结果的两个分布中没有重叠)具有经过左上角的ROC图，在左上角，真阳性分数为1.0，或者100％(理想的灵敏度)，且假阳性分数为0(理想的特异性)。没有辨别力的检验的理论图(两组结果的同样分布)为从左下角至右上角的45°对角线。大多图介于这两个极端之间。(如果ROC图完全落在45°对角线之下，则容易地通过将“阳性”标准从“高于”反转为“低于”来矫正这种情况，反之亦然。)从定性上，图越接近左上角，检验的总精确度就越高。
定量实验室检验诊断精确度的一种优选的方法是通过单独的数字表达其性能。这样的总参数是例如所谓的“总误差”或者“曲线下面积＝AUC”。最普通的全面测量是ROC图下的面积。按照惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，则可以反转决定规则使其≥0.5)。值在1.0(两组检验值的理想分离)和0.5(在两组检验值之间没有明显的分布差异)之间变化。该面积不仅依赖于该图的特定部分，例如最接近对角线的点或在90％特异性的灵敏度，也依赖于全图。这是对ROC图有多么接近理想ROC图(面积＝1.0)的定量的说明性表达。
组合测量s-ErbB-3和其它标志物(如CYFRA 21-1或CEA)或有待发现的其它BC标志物，s-ErbB-3分别导致和将导致BC评估的进一步提高。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及提高癌症(例如BC相对于健康对照)的诊断准确度的方法，其通过分别测量样品中至少s-ErbB3和CYFRA 21-1和任选的CEA、CA 15-3、CA 19-9和/或HER-2的浓度，并将测定的浓度与是否存在癌症(例如BC)相关联来实现，与基于单独研究的任何单一标志物的分类相比，所述提高导致更多患者被正确地归入遭受癌症(例如BC相对于健康对照)的患者。
在根据本发明的一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3和CYFRA 21-1的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3和CEA的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3和CA 15-3的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3和CA 19-9的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3和ErbB-2的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3、CYFRA 21-1和CEA的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3、CYFRA 21-1和CA 15-3的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3、CYFRA 21-1和CA 19-9的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
在根据本发明的另一个优选的方法中，至少分别测定生物标志物s-ErbB-3、CYFRA 21-1和ErbB-2的浓度，并将该标志物组合用于评估癌症，例如BC。
提供下列实施例、序列表和附图以帮助对本发明的理解，其真实范围于附加的权利要求中提出。应当理解，可以在不偏离本发明精神的情况下，在提出的方法中进行修饰。
附图说明
图1显示了s-ErbB-3在不同的疾病组中的盒形图(Boxplot)。BC＝乳腺癌；CRC＝结直肠癌；ctrl＝对照组。
图2显示了与从明显健康的个体得到的43个对照样品相比，用于评估39个从BC患者得到的样品的乳腺癌(BC)样品中的s-ErbB-3的受试者操作特征图(ROC-图)(AUC为0.79)。
图3显示了与从明显健康的个体得到的43个对照样品相比，用于评估110个从BC患者得到的样品的结直肠癌(CRC)样品中的s-ErbB-3的受试者操作特征图(ROC-图)(AUC为0.79)。
序列的描述
SEQ ID NO：1显示了在源自人“c-erbB-3癌基因”(野生型)的全长mRNA中编码的脱落的胞外域的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号：P21860。
SEQ ID NO：2显示了由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的氨基酸序列；该同种型在文献中也称作“p45 s-ErbB-3”或“同种型R2”。
SEQ ID NO：3显示了由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的氨基酸序列；该同种型在文献中也称作“p85 s-ErbB-3”或“同种型R31”。
SEQ ID NO：4显示了由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的氨基酸序列；该同种型在文献中也称作“p85 s-ErbB-3”或“同种型R35”。
SEQ ID NO：5显示了由源自人“c-erbB-3癌基因”的mRNA的剪接变体编码的氨基酸序列；该同种型在文献中也称作“同种型R1/变体S”。
SEQ ID NO：6显示了人p180 ErbB-3(HER-3)糖蛋白的近膜(JM)区的氨基酸基序。
SEQ ID NO：7显示了人ErbB-2(HER-2)的近膜(JM)区的氨基酸基序。
SEQ ID NO：8引物1(有义)
SEQ ID NO：9引物2(反义)
SEQ ID NO：10引物3(反义)
SEQ ID NO：11引物4(反义)
实施例1
将s-ErbB-3鉴别为乳腺癌的潜在标志物
已知，HER-2/neu(一种185kDa跨膜蛋白)的胞外域经历金属蛋白酶的蛋白水解性裂解，并脱落进血液中，成为循环抗原。已经证实，血清HER-2在乳腺癌中具有预后和预测信息。跨膜受体HER-2与HER-3一起形成高亲和力调蛋白共受体(Sliwkowski，M.X.等人，J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665)，认为该共受体会引起有效的促有丝分裂的信号和转化信号。
另外，认为在EGF受体家族的近膜(JM)区中的基序是仅含有11个氨基残基的区域，该区域中存在裂解位置。裂解位置的基序由在(P/GX 5-7P/G)之间的具有5-7个氨基酸残基的脯氨酸/甘氨酸残基基序决定。已知脯氨酸和甘氨酸残基会局部地破坏二级结构，且存在于已知的裂解位点中。在人全长p180ErbB-3蛋白(HER-3wt)的蛋白序列中，该基序也存在于近膜区中：
人HER-2(ErbB-2)近膜区(SEQ ID NO：7)
人HER-3(ErbB-3)近膜区(SEQ ID NO：6)
使用ELISA，测量了来自癌症患者和来自明显健康的人(对照组)的血清样品中的s-ErbB-3蛋白水平。通过检查与HER-1、HER-2和HER-4的重组胞外域的抗体特异性，排除了与其它EGF家族成员的交叉反应性。没有观察到交叉反应性。
在SEQ ID NO：1中，显示了在源自人“c-erbB-3癌基因”的全长mRNA中编码的人p180 ErbB-3蛋白的胞外域的氨基酸序列。源自人“c-erbB-3癌基因”的剪接变体mRNA的翻译，产生了在SEQ ID NO：2(p45s-ErbB-3、同种型R2)、SEQ ID NO：3(p85s-ErbB-3、同种型R31)、SEQ ID NO：4(p85s-ErbB-3、同种型R35)和SEQ ID NO：5(同种型R1/变体S)中所示的蛋白。在哺乳动物细胞HEK 293T中表达所有蛋白，并通过蛋白印迹和ELISA进行测试。
实施例2
针对乳腺癌标志物蛋白s-ErbB-3的抗体
针对癌症标志物蛋白s-ErbB-3的单克隆抗体购自R&D Systems(目录号DY348)，用于通过免疫检测试验(例如蛋白印迹法和ELISA)测量s-ErbB-3的血清和血浆和血液水平。
在HEK 293T细胞中的重组蛋白表达
为了制备s-ErbB-3蛋白的校准物质，进行ErbB-3蛋白的野生型(wt)p180ErbB-3和替代转录物(mRNA)的重组表达。在哺乳动物细胞HEK 293T中进行表达。在第一步中，用对描述的人c-erbB-3基因的公开的核苷酸序列的一部分特异性的寡核苷酸引物进行PCR(Lee，H.等人，Oncogene 16(1998)3243-3252)。合成的引物的核苷酸序列选择如下：
引物1(有义)SEQ ID NO：8
5’-gcaagctagccaccatgagggcgaacgacgctctgc-3’
引物2(反义)SEQ ID NO：9
5’-gcaagcggccgccccacctttgggacatagtcccccacaaggc-3’
引物3(反义)SEQ ID NO：10
5’-gcaagcggccgcttgtatgccacctgaacagttccattgcag-3’
引物4(反义)SEQ ID NO：11
5’-gcaagcggccgcacacccccttcctccttggttccatccctc-3’
将PCR产物克隆进标记的哺乳动物表达载体pCMV-Fc(Clonetech)，并通过Geneart测序。
细胞系：在添加了10％胎牛血清的DMEM中，培养人胚胎肾细胞系293。
s-ErbB-3蛋白的纯化：
从用克隆同种型R2、同种型R35、同种型R31或同种型R1/变体S瞬时转染的细胞的浓缩培养基中分离出所有s-ErbB-3蛋白，并在一步中纯化。使用HiTrap色谱法(使用蛋白A柱(Amersham))，将蛋白在4℃装载上柱过夜。用缓冲液A(10mM磷酸盐，pH 7.4，27mMKCl和137mM NaCl)洗涤结合的物质，并用PreScission蛋白酶在4℃温育过夜，然后使用含有0.1M柠檬酸钠的缓冲液B(pH 3.5)洗脱。使用GSTrap(1ml)柱，去除GST标记的PreScission蛋白酶。对从每个步骤取出的样品进行SDS-PAGE，并通过考马斯亮蓝染色和蛋白印迹(使用识别s-ErbB-3的胞外域的抗-ErbB-3抗体)进行分析。
实施例3
用于测量人血清和血浆样品或其它体液中的s-ErbB-3蛋白的ELISA
为了检测人血清或血浆中的s-ErbB-3蛋白，开发了夹心法ELISA。为了捕获和检测抗原，使用生物素缀合抗-ErbB-3单克隆抗体的等分试样(见实施例2)。
用100μl生物素化的抗-s-ErbB-3多克隆抗体(2μg/ml，在10mM磷酸盐、pH 7.4、27mM KCl和137mM NaCl中)，温育抗生蛋白链菌素包被的96孔微孔滴定板过夜。温育后，用10mM磷酸盐、pH 7.4、27mM KCl和137mM NaCl洗涤平板3次。然后，用10mM磷酸盐、pH 7.4、1％BSA、27mM KCl和137mM NaCl温育孔2h，以阻断非特异性的结合。洗涤3次后，用作为标准抗原的重组蛋白(见实施例2)的系列稀释液，或用稀释的从患者得到的液体样品，温育孔。sErbB-3结合后，使用10mM磷酸盐、pH 7.4、27mM KCl和137mM NaCl洗涤平板3次。为了特异性地检测结合的s-ErbB-3，用100μl抗-s-ErbB-3单克隆抗体(4μg/ml，在10mM磷酸盐、pH 7.4、1％BSA和137mM NaCl中)温育孔60分钟。此后，洗涤平板3次，以去除未结合的抗体。在下一步中，在10mM磷酸盐、pH 7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％吐温20中，用200μg/ml抗-小鼠-POD缀合物温育孔30分钟。随后使用相同缓冲液洗涤平板3次。为了检测抗原-抗体复合物，用100μl ABTS溶液(R&D Systems)温育孔，并在30分钟后，使用ELISA读出器在495nm测量OD。
实施例4
ROC分析，以评估关于诊断准确度的临床效用
通过分析从充分表征的患者群体得到的各个液体样品，评估准确度，所述患者群体分别是：50位已经经历乳房X射线照相术且发现没有BC的患者，50位各自被确诊且分期为BC的侵入性导管和侵入性小叶T1-3、N0、M0的患者，50位诊断出进展的BC的患者(至少具有在至少一个近端淋巴结中的肿瘤浸润，或更严重的转移形式)，50位各自诊断出髓性乳腺癌、粘蛋白性乳腺癌、导管乳腺癌、乳突乳腺癌的患者，和50位诊断出DCIS的患者。
已经在从这些个体中的每一个得到的血清中，定量了通过可商业得到的试验(Roche Diagnostics，CA 15-3-试验(目录号0 304 5838)，用于ElecsysSystems免疫测定分析仪)测量的CA 15-3和如上所述测量的s-ErbB-3蛋白。根据Zweig，M.H.，和Campbell，同上，进行ROC-分析。发现通过曲线下面积测量的用于将在组T1-3、N0、M0内的患者与健康个体区分开的区分能力至少象生物标志物s-ErbB-3一样好(相对于确立的标志物CA 15-3)。
试验s-ErbB-3的测量值：
在来自乳腺癌(BC)患者、结直肠癌(CRC)患者的样品中，和在明显健康的个体的对照组(Ctrl)中，测量人血清中的癌症标志物s-ErbB-3浓度。表1显示了所述组的人血清中的s-ErbB-3水平的绝对测量值的分布，其中显示了平均值和中位值、最小值和最大值，以及所述值的第一和第三四分位数(25％和75％百分位数)。表1的数据以对数形式显示在表2中，并显示为图1的盒形图中的图。
s-ErbB-3作为乳腺癌(BC)的血清标志物：
样品来自39位充分表征的乳腺癌(BC)患者，具有在表3中给出的数据。图2显示了人血清中s-ErbB-3水平的受试者操作特征曲线(ROC)。已经在BC集合(39位患者)和43个从明显健康的个体得到的对照样品(＝对照组)中，测定了标志物，得到0.79的AUC。
s-ErbB-3作为结直肠癌(CRC)的血清标志物：
样品来自110位充分表征的结直肠癌(CRC)患者，具有在表3中给出的数据。图3显示了人血清中s-ErbB-3水平的受试者操作特征曲线(ROC)。已经在CRC集合(110位患者)和43个从明显健康的个体得到的对照样品(＝对照组)中，测定了标志物，得到0.79的AUC。
总结
表1：
BC患者、CRC患者和对照组的人血清中的s-ErbB-3水平的绝对测量值的分布
| Min. | 1st Qu. | 中位值 | 平均值 | 3rd Qu. | Max. | n | |
| BC | 295,4 | 1974 | 3170 | 3748 | 4339 | 13620 | 39 |
| CRC | 753,2 | 1805 | 2249 | 2824 | 3459 | 8015 | 110 |
| Ctrl | 712,4 | 1109 | 1527 | 1680 | 2030 | 5914 | 43 |
BC＝乳腺癌；CRC＝结直肠癌；Ctrl＝对照组；Min.＝值的最小值；
1st Qu.＝第一四分位数(值的25％百分位数)；3rd Qu.＝第三四分位
数(值的75％百分位数)；Max.＝值的最大值；n＝患者数目
表2：
BC患者、CRC患者和对照组的人血清中的s-ErbB-3水平的对数测量值的分布
| Min. | 1st Qu. | 中位值 | 平均值 | 3rd Qu. | Max. | n | |
| BC | 5,688 | 7,588 | 8,061 | 7,957 | 8,375 | 9,519 | 39 |
| CRC | 6,624 | 7,498 | 7,718 | 7,83 | 8,149 | 8,989 | 110 |
| Ctrl | 6,569 | 7,011 | 7,331 | 7,337 | 7,615 | 8,685 | 43 |
BC＝乳腺癌；CRC＝结直肠癌；Ctrl＝对照组；Min.＝值的最小值；
1st Qu.＝第一四分位数(值的25％百分位数)；3rd Qu.＝第三四分位数(值的75％百分位数)；Max.＝值的最大值；n＝患者数目
下面的数据表明，癌症标志物s-ErbB-3也有助于手术后患者的随访。
表3：
s-ErbB-3对于乳腺癌(BC)和结直肠癌(CRC)的诊断灵敏度和特异性
Claims (7)
1.测量血清或血浆样品中的s-ErbB-3的增加的浓度的试剂和任选地测量血清或血浆样品中的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度的试剂在制备用于在体外评估乳腺癌的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，另外特征在于，所述一种或更多种其它的标志物选自： CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，另外特征在于，所述浓度通过免疫学方法来测量。
4.测量血清或血浆样品中的s-ErbB-3的试剂在制备在乳腺癌的体外评估中使用的试剂盒中的应用。
5.针对血清或血浆样品中的s-ErbB-3的抗体在制备在乳腺癌的体外评估中使用的试剂盒中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是乳腺癌的指征。
6.测量血清或血浆样品中的包含s-ErbB-3和任选的一种或更多种其它癌症标志物的标志物集合的试剂在制备在乳腺癌的体外评估中使用的试剂盒中的应用，其中增加的s-ErbB-3浓度是乳腺癌的指征。
7.根据权利要求6的测量标志物集合的试剂的应用，另外特征在于，所述任选的一种或更多种其它标志物选自： CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9和ErbB-2。
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