CN102472754B

CN102472754B - 作为癌症的标记物的瓣状内切核酸酶-1

Info

Publication number: CN102472754B
Application number: CN201080031539.3A
Authority: CN
Inventors: N.维尔德; M.L.哈格曼; J.卡尔; J.里德林格; M.勒斯勒; M.塔克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: HK1171084A1; JP5681183B2; CN102472754A; US20160169895A1; CA2767406A1; EP2454596A1; JP2012533071A; WO2011006642A1; ES2493070T3; US20150072355A1; EP2454596B1; US20120157335A1

Abstract

本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了瓣状内切核酸酶-1蛋白(=FEN1)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。此外，其特别涉及从源自个体的液体样品中通过测量所述样品中的FEN1评估癌症的方法。FEN1的测量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。

Description

作为癌症的标记物的瓣状内切核酸酶-1

描述

本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了瓣状内切核酸酶-1蛋白(Flap endonuclease-1 protein, = FEN1)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。此外，其特别涉及从源自个体的液体样品中通过测量所述样品中的FEN1评估癌症的方法。FEN1的测量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。

癌症仍然是主要的公共卫生挑战，尽管在检测和治疗上已取得进步。癌细胞以癌症相关标记蛋白的产生为特征。在携带癌细胞的个体的组织和体液中都发现了癌症相关蛋白。它们的水平在致癌性进展的早期通常很低，在疾病的进展过程中增加，并且只在极少的情况下观察到蛋白在疾病进展过程中显示降低的水平。此类蛋白的灵敏检测是用于诊断癌症（特别地在癌症的早期诊断中）的有利的和有前景的方法。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。

用于实体瘤的最重要的治疗方法是：

a)肿瘤的手术切除，

b)化学疗法,

c)放射疗法，

d)使用生物学如抗肿瘤抗体或抗血管生成抗体的疗法和

e)上述方法的组合。

肿瘤的手术切除已被广泛接受为早期实体瘤的一线疗法。然而，大多数癌症只有当它们显示症状，即当患者已处于疾病进展的相当晚期时才被检测到。

癌症的分期是根据程度、进展和严重度对疾病的分类。其将癌症患者分类，这样可对治疗的预后和选择进行归纳。

按照Dukes的分期A至D将CRC的不同分期用于分类。今天，TNM系统是最为广泛使用的癌症的解剖学范围的分类。其代表了国际上接受的统一的分期系统。存在3个基本变量：T(原发性肿瘤的范围)、N(区域淋巴结的状态)和M(远端转移的存在或不存在)。TNM标准由UICC (国际防癌联盟（International Union Against Cancer）), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, 第6版，2002)公布。一旦TNM状态被确定，患者则被分类至由范围从I至IV（IV是最晚期疾病的分期）的罗马数字表示的疾病分期。TNM分期和UICC疾病分期彼此相应，如取自Sobin L.H.和Wittekind (eds.)（同上）的下表中所示的。

表 1 ：TNM分期与UICC疾病分期的相互关系

UICC 疾病分期	T 分期	N 分期	M 分期
				0期	Tis	N0	M0
I期	T1, T2	N0	M0
				IIA期	T3	N0	M0
IIB期	T4	N0	M0
				IIIA期	T1, T2	N1	M0
IIIB期	T3, T4	N1	M0
				IIIC期	任何T	N2	M0
IV期	任何T	任何N	M1

尤其重要的是癌症例如CRC的早期诊断转变为好得多的预后。在CRC中，结直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即来自腺瘤。因此，最佳预后使患者在腺癌期被诊断。早在T_is、N0、M0或T1-3; N0; M0期被诊断的患者，如果经适当治疗，与对于当远端转移已存在时诊断的患者只有10%的5年存活率相比较，在诊断后具有90%以上的机会存活5年。

目前的检测方法（包括成像方法，例如X射线或核共振）在理论上可能至少部分适合用作一般筛查工具。然而，它们极其昂贵，因而对于卫生保健系统来说不能承担其在大量受试者（特别对于无任何肿瘤症状的受试者）的普查中普遍和广泛的使用。

因此，本发明的目的是提供简单且成本效率的肿瘤评估方法，例如以鉴定怀疑患有癌症的个体。为此目的，可在体液例如血液或血清或血浆中检测到的一般肿瘤标记物或一组此类标记物将是令人期待的。

许多血清肿瘤标记物已用于临床应用。例如cytoceratin 19的可溶性30 kDa 片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原（carcinoembryogenic antigen）(CEA)、神经元特异烯醇化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个满足筛查工具所需的灵敏度和特异性标准(Thomas, L., Labor和Diagnose TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany(2000))。

为了具有临床效果（clinical utility），作为单个标记物的新型诊断标记物应当可与本领域内已知的其他标记物相当，或更好。或者，如果分别地将新型标记物单独使用或与一个或更多个其他标记物组合使用，其应当导致诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好通过其受试者工作特性（将在下面进行详细地描述）评估检测的诊断灵敏度和/或特异性。

全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。可有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标记物的鉴定可导致可大大促进该疾病的诊断和管理的方法。因此，存在提高癌症的体外评估的紧迫临床需要。提高癌症的早期诊断尤其重要，因为对于早期诊断的患者，存活的机会与在疾病的晚期（progressed stage）诊断的患者相比要高得多。

最近已对肺癌中生物化学标记物的临床功用进行了综述。(Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262)。

关于标记物特征和针对提高的肺癌的诊断，公布了使用基于模糊逻辑学的分类算法来组合CYFRA 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)（其为一般炎症标记物）的血清水平的方法(Schneider, J.等人, Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者报导了在95%的特异性下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单个肿瘤标记物的灵敏度据报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中报导的显著更高。Duffy, M.J., in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262报导了46%至61%的灵敏度。由Schneider等人获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体包括许多晚期分期。第二且更至关重要地，在用于模糊逻辑限定词的确定的训练集的样品上检查算法的性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”并且不用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。

本发明的目的是研究是否可鉴定可用于评估癌症疾病的生物化学标记物。特别地，本发明的发明者研究是否可在体液中鉴定用于评估癌症的一般生物化学标记物。在本发明中，特别是研究了用于评估子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌或非小细胞肺癌的生物化学标记物的鉴定。

令人惊讶地，已发现瓣状内切核酸酶-1蛋白(= FEN1)的使用可至少部分地克服现有技术中目前已知的标记物的一些问题。

令人惊讶地，发现受试样品中增加的FEN1浓度与癌症的发生相关。发现FEN1是对于单一类型的癌症无特异性但为不同类型癌症的标记物（即，一般肿瘤标记物）。因为FEN1对致瘤过程表现出相当的特异性，因此新型肿瘤标记物FEN1对于不同种类的肿瘤类型具有非常潜在的临床效果。

令人惊讶地，在本发明中发现在样品和/或体液中测定FEN1的浓度允许评估癌症，例如子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌或非小细胞肺癌。更令人惊讶地，发现相比正常对照，在样品和/或体液中增加的FEN1或其片段的浓度预示癌症的风险或发生。

本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括通过免疫学检测方法测量样品中的FEN1浓度并在癌症的评估中使用测量结果，特别是测定的浓度。

发明概述

本发明在一个实施方案中涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量液体样品中a）瓣状内切核酸酶-1蛋白（=FEN1）和/或其片段，b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中增加的FEN1浓度预示癌症。

本发明还涉及FEN1在癌症的评估中的用途。

本发明还涉及针对FEN1的抗体组合在癌症的评估中的用途，其中增加的FEN1浓度预示癌症。

本发明还公开了包含FEN1和任选地一种或多种其他癌症标记物的标记物组在癌症的评估中的用途，其中增加的FEN1浓度预示癌症。

本发明还涉及用于进行在体外评估癌症的方法的试剂盒，所述方法包括测量样品中（a）FEN1和/或其片段，（b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和（c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中增加的FEN1浓度预示癌症，所述试剂盒包含特异性测量FEN1所需的试剂，和任选地特异性测量一种或多种其他癌症标记物所需的试剂。

令人惊讶地，发现受试样品中增加的FEN1和/或其片段的浓度与癌症的发生相关。发现FEN1是对于单一类型的癌症无特异性但为不同类型癌症的标记物（即，一般肿瘤标记物）。因为FEN1对致瘤过程表现出相当的特异性，因此新型肿瘤标记物FEN1对于不同种类的肿瘤类型具有非常潜在的临床效果。

发明详述

在优选的实施方案中本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括测量样品中FEN1和/或其片段的浓度和在癌症的评估中使用测量结果，特别是测定的浓度。

在另一个优选的实施方案中本发明涉及在体外评估癌症的方法，所述方法包括测量液体样品中（a）FEN1和/或其片段，（b）任选地一种或多种其他癌症标记物的浓度，和（c）在癌症的评估中使用步骤（a）和任选地步骤（b）的测量结果，其中增加的FEN1浓度预示癌症。

本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。已例如分别在特定的癌症类型如子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌或非小细胞肺癌中发现，与正常对照相比较，样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度增加。

根据本发明的优选实施方案，为了体外评估癌症，测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估特定的癌症类型例如子宫内膜癌（EC）、恶性黑色素瘤（MM）、子宫颈癌（CC）、头颈癌（H/NC）、卵巢癌（OC）、结肠癌（CRC）、膀胱癌（BLC）、胰腺癌（PAC）、乳腺癌（BC）、小细胞肺癌（SCLC）、前列腺癌（PC）、肾癌（KC）或非小细胞肺癌（NSCLC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如子宫内膜癌（EC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如恶性黑色素瘤（MM），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如子宫颈癌（CC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如头颈癌（H/NC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如卵巢癌（OC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如结肠癌（CRC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如膀胱癌（BLC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如胰腺癌（PAC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如乳腺癌（BC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如小细胞肺癌（SCLC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如前列腺癌（PC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肾癌（KC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如非小细胞肺癌（NSCLC），测量样品中FEN1蛋白和/或其片段的浓度。

本发明的一个实施方案涉及区分可能不患癌症的个体与可能被分类为“疑似”病例的个体的人群的普查。然后可以例如利用成像方法或其他合适的方法使后一个个体群体经历进一步的诊断过程。

本发明的另外的实施方案涉及适合于诊断一般性癌症的肿瘤标记物组或适合于诊断特定肿瘤类型的肿瘤标记物组的改进。

CYFRA 21-1目前被认为是当前已知的肺癌肿瘤标记物中最好的标记物。即使这样，也未在肺组织中显著地发现其器官特异性。CYFRA 21-1对于肺癌的灵敏度在95%的针对其他良性肺病的特异性下被描述为在46至61%之间。增加的CYFRA 21-1血清水平还与明显的良性肝疾病、肾功能不全和浸润性膀胱癌相关。CYFRA 21-1检测被推荐用于术后治疗监测。

CEA属于胎儿癌性抗原类群，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的并且主要用于结直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有几种良性疾病例如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫疾病与增加的CEA血清水平相关。在对于良性肺疾病95%的特异性下，其对于肺癌的灵敏度据报导为29-44%。CEA主要用于结肠癌的监测，特别是当疾病已经转移时。不过，多种癌症包括乳腺癌都可以产生水平升高的CEA。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。

NSE是SCLC的肿瘤标记物。通常，发现增加的NSE血清水平与神经外胚层和神经内分泌肿瘤相关。在患有良性肺病和脑病例如脑膜炎或其它脑部炎性疾病以及对头部进行创伤性损伤的患者中，也发现增加的血清水平。尽管在95%特异性下，SCLC的灵敏度被报道为60-87%，但是NSE测试NSCLC的性能比较差（灵敏度为7-25%）。NSE被推荐为SCLC的治疗监测。

CA 19-9(碳水化合物抗原19-9)，糖脂上的唾液酸化Lewis (a)抗原是胃肠癌的肿瘤标记物。其存在于胎儿胃、肠和胰腺上皮细胞。在成年人肝、肺和胰腺组织中也可发现低浓度的CA 19-9。在肿瘤块和CA 19-9测定值中没有相关性，因此CA 19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。因为黏蛋白仅通过肝分泌，有时即使轻微的胆汁郁积可导致明显升高的CA 19-9血清水平。在那些具有确认的胰腺癌患者中，标记物主要用于辅助检测疾病状态（灵敏度70-87%）。3-7%的人群具有Lewis a-阴性/b-阴性血型构成，不能够表达具有反应性的决定物CA19-9的黏蛋白。在对发现进行解释时必须考虑这一点。

在高百分比的上皮来源非粘液性卵巢瘤中发现CA 125并可在血清中检测到。卵巢癌占妇科肿瘤的约20%。尽管最高的CA 125值发生在患卵巢癌的患者中，在子宫内膜、乳腺、胃肠道恶性肿瘤和各种其他恶性肿瘤中也观察到明显升高的值。有时在各种良性妇科疾病例如卵巢囊肿、卵巢组织转化、子宫内膜异位、子宫肌瘤或子宫颈炎中发现提高的值。此标记物的轻微升高还可发生在怀孕早期和各种良性疾病中（例如急性和慢性胰腺炎、良性胃肠疾病、肾功能不全、自身免疫疾病等等）。显著升高的水平已在良性肝疾病例如肝硬化和肝炎中发现。极端升高可发生在由恶性和良性疾病引起的任意种类的腹水中。尽管CA 125是相对非特异性的标记物，它是目前最重要的肿瘤标记物，用于监视具有严重卵巢恶性肿瘤的患者的治疗和进展。在82-93%特异性下，据报道灵敏度为69-79%。

PSA（“前列腺相关抗原”）是在血液检测中使用的常规检测肿瘤标志物。PSA似乎具有高组织特异性；在正常的前列腺上皮和分泌物中发现此糖蛋白，而在其他组织中没有发现。PSA对前列腺癌的存在高度灵敏。PSA提高与阶段和肿瘤体积相关。其可预测复发和对治疗的反应。最后，此抗原在患者中具有预后价值，在手术前极高的值预示可能复发。

NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶；Swiss-PROT: P40261）具有29.6 kDa的表观分子量和5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其他嘧啶的N-甲基化。此活性对许多药物和异生物质化合物的生物转化很重要。据报导此蛋白质在肝中显著地表达并定位在细胞质中。NNMT已从人肝的cDNA中被克隆并含有792个核苷酸的开放阅读框，所述阅读框编码具有29.6 kDa的计算分子量的264个氨基酸的蛋白质(Aksoy, S.等人, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840)。在文献中有关酶在人癌症中的潜在作用所知甚少。在一篇论文中报导将提高的肝NNMT酶活性作为小鼠中癌症恶病质的标记物(Okamura, A.等人, Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656)。在最近的一个报导中，证明了在放射敏感的细胞系中NNMT基因应答放射的下调(Kassem, H.S.等人, Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460)。最近发现(WO 2004/057336)NNMT在CRC的评估中引人关注。

ProGRP是肿瘤标志物，在检测和监视SCLC中有用。在具有非恶性肺/肋膜疾病例如特发性肺纤维化或结节病的患者中也发现提高的血清水平。尽管proGRP在SCLC领域（在95%的特异性下）的灵敏度据报导为47-86%，在NSCLC领域的proGRP检测表现很差，因为据报导灵敏度为10%以下。

SCC最初在子宫颈的鳞状上皮细胞CA中被鉴定。SCC对LC的灵敏度一般很低（18-27%）。因此，认为SCC检测不适于筛选。然而，由于对鳞状上皮细胞CA的较高灵敏度，SCC的优选用途是治疗监测，尽管CYFRA 21-1一般表现的更好。

p53（TP53，细胞肿瘤抗原p53，肿瘤抑制因子p53或磷蛋白p53）是诱导细胞生长停滞或凋亡的转录因子(Appella, E.等人, Pathol. Biol. 48 (2000) 227-245)。P53担当许多肿瘤类型中的肿瘤抑制因子并且在其基因中的失活突变是在人中促进癌症发展的最常见基因事件(在Olivier, M.and Petitjean, A., Cancer Gene Ther. 16 (2009) 1-12; Petitjean, A.等人, Oncogene 26 (2007) 2157-2165中综述)。在40-50%的结直肠癌中观察到p53突变，且其与癌的侵略性相关(Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。在p53基因中的突变不仅导致蛋白质功能的破坏，而且导致肿瘤相关抗原（TAA）的表达和自身免疫应答的起始和特异性抗-p53自身抗体在癌症患者的血清中的产生(Zhang, J.Y.等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143; Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788)。

在人血清中检测抗-p53自身抗体是用于诊断和控制癌症的新兴工具。取决于癌症类型，血清中抗-p53自身抗体的频率范围从17.8% (CRC)至16.1 % (LC)和7.8% (乳腺癌) (Tan, E.M., Immunological Reviews 222 (2008) 328-340; Zhang, J.Y.等人, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143)。

Seprase，也称为成纤维细胞活化蛋白(=FAP)，是170 kDa的具有明胶酶和二肽基肽酶活性的糖蛋白，其由两个相同的单体Seprase单元组成(Pineiro-Sanchez等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park等人, J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。人膜结合Seprase蛋白单体包含760个氨基酸。预测人Seprase在成纤维细胞细胞质内具有最先的4个N末端残基，接着是21个残基的跨膜结构域，然后是734个残基的细胞外C末端催化结构域(Goldstein，L.A.等人, Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19; Scanlan，M.J.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5657-5661)。人Seprase蛋白的较短形式是本领域技术人员所知的，其为可溶性 Seprase或循环的抗纤溶酶切割酶（antiplasmin-cleaving enzyme）（=APCE）(Lee，K.N.等人, Blood 103 (2004) 3783-3788; Lee等人, Blood 107 (2006) 1397-1404)，其包含Swissprot数据库登录号Q12884的第26-760位氨基酸。可溶性Seprase的二聚体是由2个相同的单体可溶性Seprase蛋白单元组成的160 kDa的糖蛋白。Piñeiro-Sánchez等人 (同上)发现增加的Seprase的表达与人黑色素瘤和癌细胞的侵袭性表型相关。Henry，L.R.等人, Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水平间质（stromal）Seprase的人结肠肿瘤患者更可能具有侵袭性疾病进展以及转移或复发的潜在发展。

人二肽基肽酶IV（=DPPIV）又称CD26，其是110 kDa的细胞表面分子。人DPPIV蛋白的氨基酸序列包含766个氨基酸。其含有固有的二肽基肽酶IV活性，所述活性选择性地从在第三个氨基酸位置具有脯氨酸或丙氨酸的肽中去除N-端的二肽。其与多种细胞外分子相互作用并也涉及细胞内信号转导级联。人DPPIV的多功能活性依赖于细胞类型和细胞内或细胞外的条件，上述因素影响其作为蛋白水解酶、细胞表面受体、共刺激相互作用蛋白和信号转导介质的功能。人DPPIV具有从第1至6位氨基酸的短细胞质结构域，从第7至28位氨基酸的跨膜区，和从第29至766位氨基酸的具有固有二肽基肽酶IV（DPPIV）活性的细胞外结构域。人可溶性二肽基肽酶IV（=可溶性 DPPIV）包含Swissprot数据库登录号P27487的第29至766位氨基酸。可溶性DPPIV的二聚体是由2个相同的单体可溶性DPPIV单元组成的170 kDa糖蛋白。

可溶性DPPIV/Seprase蛋白质复合体（=DPPIV/Seprase）指由可溶性DPPIV同源二聚体（170 kDa）和可溶性Seprase同源二聚体（160 kDa）形成的具有330 kDa分子量的可溶性复合体。在特定条件下此复合体可形成具有660 kDa分子量的双复合体。

本发明还涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中FEN1蛋白和/或其片段和特异于癌症的一个或更多个其他标记物的浓度，以及在癌症的评估中使用测量结果，特别地测定的浓度。与FEN1组合使用的优选标记物在一个方面是为一般性肿瘤标记物(即不特异于单个肿瘤类型的标记物)的标记物或，在另一方面，是为特定肿瘤的标记物（为特异于单个肿瘤类型的标记物）的标记物。

例如用于癌症评估的优选标记物是Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和可溶性DPPIV/Seprase 复合物(= DPPIV/Seprase)。此类标记物可各自单个地使用或以任何组合与FEN1一起使用。

本发明也涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中FEN1以及一个或更多个其他癌症标记物的浓度，以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症评估中。优选，一个或更多个其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

本发明还涉及包括至少FEN1标记物和选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的一种或多种其他标记物的标记物组在评估癌症中的用途。

优选地，本发明涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中FEN1蛋白和/或其片段以及一个或更多个其他癌症标记物的浓度，以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症评估中。优选，一个或更多个其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

本发明还涉及FEN1蛋白和/或其片段在评估癌症中的用途，其中增加的FEN1蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。

本发明还涉及FEN1蛋白和/或其片段在体外评估癌症中的用途，其中样品为血清或血浆。

本发明还涉及FEN1在评估几种特定类型的癌症，特别地EC、MM、CC、H/NC、OC、CRC、BLC、PAC、BC、SCLC、PC、KC或NSCLC中的用途。

本发明还涉及FEN1在评估几种特定类型的癌症，特别地EC、MM、CC、H/NC、OC、CRC、BLC、PAC或BC中的用途。

本发明还涉及FEN1在评估几种特定类型的癌症，特别地EC、MM、CC、H/NC、OC或CRC中的用途。

本发明还涉及针对FEN1蛋白和/或其片段的抗体在评估癌症中的用途，其中增加的FEN1和/或其片段的浓度预示着癌症。

优选地以夹心型免疫测定形式（=夹心免疫测定）检测FEN1。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性测量FEN1蛋白和/或其片段和任选地一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异地测量FEN1蛋白和/或其片段和一个或更多个癌症标记物（例如上述EC、MM、CC、H/NC、OC、CRC、BLC、PAC、BC、SCLC、PC、KC或NSCLC的标记物）所需的试剂，其中其他标记物可各自单个地使用或以其任何组合使用。

本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性地测量FEN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标记物所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以特异性测量FEN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标记物和任选地用于进行测量的辅助试剂。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以在癌症评估中特异性测量FEN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标记物。

本发明还提供了生物芯片阵列，用于进行根据本发明的方法以在癌症评估中特异性测量FEN1和一种或多种选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标记物和任选地用于进行测量的辅助试剂。

术语“测量”优选包括样品中FEN1蛋白和/或其片段的定性、半定量或定量测量。在优选实施方案中，测量是半定量测量，即，确定FEN1的浓度是高于还是低于截止值（cut-off value）。如本领域技术人员将理解的，在是-（存在）或否-（不存在）测定中，通常将测定灵敏度设置至匹配截止值。可以例如根据健康个体组的检测来确定截止值。优选地，将截止值设置至导致90%的特异性，还优选地将截止值设置至导致95%的特异性，或还优选地将截止值设置至导致98%的特异性。高于截止值的值可以例如预示癌症的存在。特别地，高于截止值的值可以例如预示着EC、MM、CC、H/NC、OC、CRC、BLC、PAC、BC、SCLC、PC、KC和/或NSCLC的存在。在另外的优选实施方案中，FEN1的测量是定量测量。在另外的实施方案中FEN1的浓度与潜在的诊断问题如例如疾病的阶段、疾病的进程或对治疗的应答相关。

在另一个优选实施方案中，将截止值设置至导致90%的灵敏度，还优选地将截止值设置至导致95%的灵敏度，或还优选地将截止值设置至导致98%的灵敏度。

低于截止值的值可例如预示不存在癌症。特别地低于截止值的值可例如预示不存在EC、MM、CC、H/NC、OC、CRC、BLC、PAC、BC、SCLC、PC、KC和/或NSCLC。

在另外的优选实施方案中，FEN1的测量是定量测量。在另外的实施方案中FEN1的浓度与潜在的诊断问题如例如疾病的阶段、疾病的进程或对治疗的应答相关。

瓣状内切核酸酶-1蛋白（=FEN1），Swiss-PROT ID: P39748，是具有42.6 kDa分子量的380氨基酸的核蛋白，其由SEQ ID NO:1 (图14)中提供的序列表征。在1994年，Murray(Murray J.M.等人, Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 4878-4888)从新克隆的序列中预测了人FEN1的编码序列。基于酵母同系物rad2的功能，提出了其在高保真染色体分离和紫外光诱导的DNA损伤修复中的功能。由于这些功能是染色体完整性中的基本过程，作者也提出了此蛋白参与癌症避免。后来，Hiraoka等人 (Hiraoka L.R.等人, Genomics 25 (1995) 220-225)和Taylor等人 (Taylor T.D.等人, Nature 440 (2006) 497-500)鉴定了在人染色体11上的基因座。FEN1的功能及其与DNA的相互作用一直是大量研究的焦点(Robins P.等人, J. Biol. Chem. 269 (1994) 28535-28538), Shen B.等人, J. Biol. Chem. 271 (1996) 9173-9176, Hasan S.等人, Mol. Cell 7 (2001) 1221-1231, Qiu J.等人, J. Biol. Chem. 277 (2002) 24659-24666和Sakurai S.等人, EMBO J. 24 (2005) 683-693)。已经证明了一些在DNA代谢中的酶功能，包括切割5’-突出瓣结构的内切核酸酶活性，当DNA聚合酶遭遇冈崎片段下游的5’端时通过位移合成产生所述结构。另外，FEN1也具有对niked或有缺口的双链DNA的5’至3’外切核酸酶活性，并展示RNA酶H活性。Shen等人 (Shen B.等人 BioEssays 27 (2005) 717-729)或Liu等人 (Liu Y.等人, Annu. Rev. Biochem. 73 (2004) 589-615)已综述了这些功能。

直到最近，FEN1的突变、失控表达和功能缺陷才显示与疾病的发展有关。Kucherlapati等人 (Kucherlapati M.等人, PNAS 99 (2002) 9924-9929)将FEN1的表达与肿瘤进展相联系。Sato等人 (Sato M.等人, Oncogene 22 (2003) 7243-7246)已证明了，在肺癌中FEN1的提高的表达，同时Lam等人 (Lam J.S.等人, BJU International 98 (2006) 445-451)发现在前列腺癌中的过表达。Singh等人 (Singh P.等人, Mol. Cancer Res. 6 (2008) 1710-1717)发现在乳腺癌和其他受低甲基化调控的癌症中FEN1的过表达。Zheng等人 (Zheng L.等人, Nature medicine 13 (2007) 812-819)发表了其与疾病过程的更广泛的联系，其中作者可显示FEN1突变可导致自身免疫、慢性炎症和癌症。

尽管现在已经清楚地确定了FEN1参与疾病，尚没有公开FEN1蛋白作为这些疾病的生物标记物的研究。迄今为止可获得的研究集中在基于DNA或RNA的方法。这与有关FEN1的专利一致(WO 2008/089577: Breast cancer gene array, WO 2008/151110: Molecular diagnosis and typing of lung cancer variants, WO2008/077165: Set of tumor markers, WO 2007/073220: Prognosis prediction for colorectal cancer, US 5,874,283: Mammalian flap-specific endonuclease)。

如本文中所使用的，每一个下列术语在该部分中具有与其相关的意义。

冠词“一”在本文中用于指一个或多于一个（即，至少一个）的冠词的语法宾语。例如，“一个标记物”意指一个标记物或多于一个标记物。术语“至少”用于表示任选地一个或更多个另外的物体可存在。例如，包括至少（标记物）FEN1和CYFRA 21-1的标记物组可任选地包括一个或更多个其他标记物。

表述“一个或更多个”表示1至50，优选1至20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。

术语“生物芯片”、“聚合物芯片”或“蛋白质芯片”可互换使用并指排列在共有基质上的大量探针、标记物或生物化学标记物的集合，所述基质可为硅片、尼龙条、塑料条或玻璃片的一部分。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”是有意创造的物质例如分子、标记物、缺口、微型线圈、检测器和/或传感器的集合，所述物质连接或装配在基质或固体表面，例如玻璃、塑料、硅片或其他形成阵列的材料上。阵列可用于测量较大数量的水平，例如几十、几千或几百万同时的反应或组合。阵列也可含有较少数量的物质，例如一，几个或一打。阵列中的物质可为彼此相同的或不同的。阵列可假定多种形式，例如可溶性分子的文库，固定化的分子的文库，固定化的抗体的文库，结合树脂珠的化合物的文库，硅片或其他固体支持物。取决于阵列上衬垫的大小，阵列可为宏阵列或微阵列。宏阵列通常包含约300微米或更大的衬垫大小并可通过凝胶和印迹扫描仪容易地显像。微阵列通常包含小于300微米的衬垫大小。

“固体支持物”是不可溶的功能化的聚合材料，其上可连接或共价结合（经常通过接头）文库成员或试剂以固定文库成员或试剂或使文库成员或试剂易于从过量的试剂、可溶性反应副产物或溶剂中分离（通过过滤、离心、洗涤等等）。

本文中使用的术语“标记物”或“生物化学标记物”是指被用作靶以分析患者的受试样品的分子。此类分子靶的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标记物的蛋白质或多肽预期包括所述蛋白质的天然发生的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别地免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员应认识到由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可在例如炎症期间被破坏，并且可被降解或被切割成这样的片段。某些标记物以无活性的形式合成，所述形式随后可通过蛋白质水解激活。如本领域技术人员应理解的，蛋白质或其片段还可作为复合物的一部分存在。这样的复合物在本发明的意义上也可用作标记物。标记物多肽的变体由相同基因编码，但作为可选的mRNA或前-mRNA加工的结果，可在它们的等电点(=PI)或分子量 (=MW)或两者上不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列达到95%或更多的相同。此外，或可选地，标记物多肽或其变体可具有翻译后修饰。优选的翻译后修饰是糖基化、酰基化和/或磷酸化。

在合适的样品中检测FEN1蛋白，特别地FEN1蛋白和/或其片段的可溶形式。优选的样品是组织样品、组织裂解液或体液，例如血液、血浆、血清、尿、支气管肺泡灌洗液（=BAL；在疑为肺癌（LC）的情况下优选）或上皮细胞衬液（=ELF；在疑为LC的情况下优选）。优选地，样品来源于人受试者，例如肿瘤患者或具有肿瘤风险的人或疑为具有肿瘤的人。也优选在血清或血浆样品中检测FEN1。

在根据本发明的优选实施方案中，测定FEN1蛋白和/或其片段的浓度。在一个实施方案中，通过使用特异性结合剂从样品中特异性测量标记物FEN1。

特异性结合剂是例如FEN1的受体、结合FEN1的凝集素或与FEN1反应的抗体。特异性结合剂对于其相应的靶分子具有至少10⁷ l/mol的亲和力。特异性结合剂对于其靶分子优选地具有10⁸ l/mol或也优选10⁹ l/mol的亲和力。

如本领域技术人员将理解地，使用术语特异性表示在样品中存在的其他生物分子不与特异性针对FEN1的结合剂显著结合。优选地，与靶分子以外的生物分子的结合水平分别导致至多仅10%或更低，仅5%或更低，仅2%或更低或仅1%或更低的与靶分子的亲和力的结合亲和力。优选的特异性结合剂将同时满足以上亲和力以及特异性的最低标准。

特异性结合剂优选地是与FEN1反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及指包含抗体的结合结构域的基因构建体。

可使用保持特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。通过现有技术方法，例如，如在Tijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 全书, 特别地第43至78页）中描述的方法，产生抗体。此外，本领域技术人员十分了解基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen, P., 同上, 第108至115页)。

为了达到本发明中公开的成就，可使用在兔子中产生的多克隆抗体。然而，也很显然，还可使用来自不同物种例如绵羊或山羊的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆抗体可以以任何需要的量和恒定的性质产生，它们代表了用于临床常规测定的开发的理想的工具。在根据本发明的方法中抗FEN1的单克隆抗体的产生和应用分别代表了其他优选实施方案。

免疫测定是本领域技术人员所熟知的。实施这些测定的方法以及实际应用和步骤总结在相关教科书中。相关教科书的实例是Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody或other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278, Burdon, R.H.和v. Knippenberg, P.H. (编.), Elsevier, Amsterdam (1990)，和“Methods in Enzymology”(S.P. Colowick, N.O. Caplan编, Academic Press)的涉及免疫学检测方法的多卷，特别是第70, 73, 74, 84, 92和121卷。

正如本领域技术人员现在应认识到FEN1已被鉴定为用于评估癌症优选肺癌的标记物，不同的免疫诊断方法可用于获得可与本发明的成就相当的结果。例如，可使用产生抗体的可选策略。这样的可选策略特别包括使用合成肽（代表FEN1的表位以进行免疫）等等。可选地，可使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫。

为了进行测量，将获自个体的样品在适合于结合剂-FEN1复合物形成的条件下与FEN1的特异性结合剂一起温育。这样的条件不必详细说明的，因为本领域技术人员无需任何创造性努力就可容易地鉴定这样的合适的温育条件。在癌症优选肺癌的评估中测量和使用结合剂-FEN1的量。本领域技术人员应理解，存在许多测量特异性结合剂-FEN1的量的方法，其全都详细地描述于相关教科书(参见，例如，Tijssen, P., 同上, 或Diamandis, E.P., 和Christopoulos, T.K. (编), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。

优选，在夹心类型测定形式（=夹心免疫测定）中检测FEN1。在这样的夹心免疫测定中，将连接在固体支持物上的第一特异性结合剂用于将FEN1捕获在一侧，并且将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合剂用于另一侧。用于夹心类型测定形式的特异性结合剂可以是特异性针对FEN1的抗体的组合。

在本发明的意义上“癌症的标记物”是如果与标记物FEN1组合可在癌症的评估中,例如在一般性癌症的评估中或在某些癌症类型的评估中（例如在EC, MM, CC, H/NC, OC, CRC, BLC, PAC, BC, SCLC, PC, KC或NSCLC的评估中）增加相关信息的任何标记物。如果可通过将所述标记物包括入已包含标记物FEN1的标记物组合来分别提高对于癌症评估的灵敏度（在给定的特异性下）或特异性（在给定的灵敏度下），则信息被认为是相关或为相加值（additive value）。在癌症评估的优选实施方案中，灵敏度或特异性的提高分别地在p = .05、.02、.01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选，一个或更多个其他肿瘤标记物选自Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, proGRP, SCC, NNMT, 抗p53自身抗体, Seprase和DPPIV/Seprase。

本文中使用的术语“样品”是指获得用于体外评估目的的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液。优选的样品是组织样品、组织裂解液或体液，例如全血、血清、血浆、尿、支气管肺泡灌洗液（=BAL；在疑为肺癌（LC）的情况下优选）或上皮细胞衬液（=ELF；在疑为LC的情况下优选），血浆或血清是最优选的。

本文中使用的术语“组织样品”和/或“组织切片”指在手术、治疗切除术或涉及细胞或组织切除的用于体外评估的目的的活检（例如切口活检、切除活检、核心活检或针吸活检）期间从患者取得的生物样品。当进行根据本发明的分析时，直接使用组织样品材料，或作为“组织裂解液”使用。本文中使用的“组织样品”也指通常通过使用超薄切片机得到的薄组织切片。在任意公开的涉及生物样品的方法的实施方案中，这样的生物样品可（但不一定）被置于显微镜载玻片上，为组织切片（例如福尔马林固定的和石蜡包埋的组织切片），和/或为肿瘤组织（例如，肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌或恶性胶质瘤）。

本文中使用的“组织裂解液”、“细胞裂解液”、“裂解液”、“裂解的样品”、“组织提取物”或“细胞提取物”指包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已被破坏。为了释放细胞或组织样品的内含物，通常用酶和/或用化学药品处理材料，以溶解、降解或破坏这些组织或细胞的细胞壁和细胞膜。本领域技术人员非常熟悉用于得到裂解液的方法。此方法包含在术语“裂解”中。

术语“评估癌症”和特别地“评估子宫内膜癌（EC）、恶性黑色素瘤（MM）、子宫颈癌（CC）、头颈癌（H/NC）、卵巢癌（OC）、结肠癌（CRC）、膀胱癌（BLC）、胰腺癌（PAC）、乳腺癌（BC）、小细胞肺癌（SCLC）、前列腺癌（PC）、肾癌（KC）或非小细胞肺癌（NSCLC）”用于表示根据本发明的方法将（单独地或与其他标记物或变量，例如由UICC所示的标准(参见上文)一起）例如帮助医师确定或确认癌症的不存在或存在或帮助医师预后、检测复发（术后患者的随访）和/或监测治疗特别地化学治疗。

如本领域技术人员将理解的，任何此类评估是在体外进行的。之后弃去患者样品。患者样品只用于本发明的体外诊断方法，并且不将患者样品的材料转移回患者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。

除非另外指出，根据常规用法使用技术术语。在细胞和分子生物学中的常用术语的定义可在Lewin, B., Genes, V., Oxford University Press出版(1994), ISBN 0-19-854287 9; Kendrew, J.等人 (编), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版(1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A. (编), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版(1995), ISBN 1-56081-569 8中找到。

在优选实施方案中，本发明涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中FEN1的浓度和将测定的浓度用于癌症的评估。

本发明的发明者已令人惊讶地能够在显著百分比的来源于患有癌症特别是患有EC, MM, CC, H/NC, OC, CRC, BLC, PAC, BC, SCLC, PC, KC或NSCLC的患者的样品中检测到增加的标记物FEN1的浓度。甚至更令人惊讶地，他们已能够证明获自个体的此类样品中增加的FEN1的浓度可用于癌症特别是上述癌症疾病的评估。

进行诊断的理想的情形是其中单个事件或过程可在例如感染性疾病中引起各自疾病的情形。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学未完全弄清楚时，对于许多癌症类型的情况就是如此。如本领域技术人员将理解的，不存在对于给定的多因素疾病的诊断既具有100%的特异性同时又具有100%的灵敏度的生物化学标记物。相反,生物化学标记物例如Cyfra 21-1、CEA、NSE，或如本文中所显示的FEN1可用于以某种可能性或预测值例如存在、不存在或严重度来评估疾病。因此在常规临床诊断中，通常在潜在的疾病的诊断、治疗和管理中一起考虑通常不同的临床症状和生物学标记物。

可以独立地测定生物化学标记物或在本发明的优选实施方案中使用基于生物芯片或珠粒的阵列技术同时测量它们。然后例如使用各标记物的个体截止值独立地解释生物标记物的浓度，或将它们组合以进行解释。

在另外的优选实施方案中，在方法中进行根据本发明的癌症的评估，所述方法包括测量样品中a)FEN1蛋白和/或其片段，和b)一个或更多个其他癌症标记物的浓度，以及c)将测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于癌症的评估。

在癌症的评估中，标记物FEN1在一个或更多个下列方面中是有利的：筛查；诊断帮助；预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。

筛查:

筛查定义为就疾病的指标，例如癌症的存在鉴定个体例如处于风险中的个体的检测的系统性应用。优选筛查群体由已知处于比平均水平更高的癌症风险中的个体组成。例如，肺癌的筛查群体由已知处于比肺癌的平均风险更高的风险中的个体（如吸烟者、曾吸烟者（ex-smoker）和暴露于铀、石英和石棉的工人）组成。

在优选实施方案中，组织样品、组织裂解液或任意体液例如全血、血浆、血清、尿、支气管肺泡灌洗液（=BAL；在疑为LC的情况下优选）或上皮细胞衬液（=ELF；在疑为LC的情况下优选）在癌症筛查中用作样品。

对于许多疾病，循环中没有单个生物化学标记物可以总是满足筛查目的所需的灵敏度和特异性标准。这对于癌症，特别地肺癌似乎也是如此。势必期望必须将包括多个标记物的标记物组用于癌症的筛查。本发明中确定的数据表明标记物FEN1将形成适合用于筛查目的的标记物组的构成整体所必需的（integral）部分。本发明因而涉及FEN1作为癌症标记物组（即包括FEN1和一个或更多个另外的用于癌症筛查目的的标记物的标记物组）的一个标记物的用途。特别地，本发明涉及FEN1作为一般性癌症标记物组中的一个标记物的用途。这样的标记物组包括标记物FEN1和一个或更多另外的标记物，例如一般性癌症标记物和/或用于上述类型的癌症的标记物。

标记物的组合显著提高分子测定的价值。首先，使用标记物组显著提高了测定的灵敏度。第二，复杂的统计模型允许多标记物测定的ROC曲线分析，且结果证明，相比最佳的单独标记物，诊断精确度显著提高。

FEN1还可能贡献于用于某些特定类型癌症例如EC, MM, CC, H/NC, OC, CRC, BLC, PAC, BC, SCLC, PC, KC或NSCLC的标记物组。

使用包括FEN1的标记物组评估的其他优选类型的癌症是EC, MM, CC, H/N, OC, CRC, BLC, PAC或BC。

使用包括FEN1的标记物组评估的其他优选类型的癌症是EC, MM, CC, H/N, OC或CRC。

本数据还表明标记物的某些组合在癌症的筛查中是有利的。

例如，参考筛查癌症的优选实施方案，本发明还涉及包括FEN1和一种或多种选自Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, proGRP, SCC, NNMT, 抗p53 自身抗体, Seprase和DPPIV/Seprase的其他肿瘤标记物的标记物组的用途。

诊断辅助物:

标记物可以有助于特定器官中良性对恶性疾病的鉴别诊断，帮助区分不同的组织学类型的肿瘤或在手术前建立基线标记物值。

目前，在肺癌的检测中使用的重要方法是放射学和/或计算机断层（CT）扫描。小囊肿，即可疑组织的小区域可通过这些方法显现。然而，许多这些囊肿——超过90%的用CT检测的——代表良性组织变化，且仅有少数囊肿代表癌组织。使用标记物FEN1可帮助区分良性和恶性疾病。

在优选的实施方案中在免疫组化方法中使用标记物FEN1以确定或者证实癌症的不同组织学类型。

因为作为单个标记物的FEN1可能优于其他标记物，如CEA或NSE，因此势必期望将FEN1用作诊断辅助物（特别地通过在手术前确定基线值）。本发明因此还涉及FEN1用于在癌症的手术之前确定基线值的用途。

预后:

预后指标可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理学或生物化学特性。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免对侵袭性疾病的处理不足和对怠惰性疾病（indolent disease）的治疗过度。Molina, R.等人, Tumor Biol. 24 (2003) 209-218评估了CEA、CA 125、Cyfra 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后价值（prognostic value）。在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清似乎表示更短的存活时间。

由于FEN1单独地显著促进癌症患者与健康对照的区分，因此必需期望其将有助于评估患有癌症的患者的预后。术前FEN1的水平最可能与一个或更多个其他癌症标记物和/或TNM分期系统组合。在优选实施方案中，FEN1用于患有EC, MM, CC, H/N, OC, CRC, BLC, PAC或BC的患者的预后。

治疗的监测:

Merle, P.等人, Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315已评估了用诱导化疗法治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中Cyfra 21-1血清水平的变化。他们得出Cyfra 21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预后工具。此外，报告已描述了CEA在监测患有LC的患者的治疗中的用途(Fukasawa, T.等人, Gan to Kagku Ryoho 13 (1986) 1862-1867)。大多数此类研究是基于回忆的、非随机化的并且包括少数患者。如在使用Cyfra 21-1的研究的情况下，CEA研究表明：a)CEA水平降低同时接受化学治疗的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的结果以及(b)对于所有患者，CEA水平的增加与疾病的进展相关。

预期FEN1将是分别与CYFRA 21-1或CEA至少一样好的用于化学治疗的监测的标记物。本发明因此还涉及FEN1在监测处于治疗中的癌症患者中的用途。

在一个优选实施方案中的治疗监测中，可将对于FEN1的测量与对于至少一种选自Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, proGRP, SCC, NNMT, 抗p53自身抗体, Seprase和DPPIV/Seprase的标记物的测量组合,然后将其用于癌症的评估。

随访:

大部分经历目的在于完全清除癌性组织的手术切除的LC患者日后发生复发性或转移性疾病(Wagner, H. Jr., Chest 117 (2000) 110S-118S; Buccheri, G.,等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此类复发在术后最初的2至3年内发生。因为如果检测得太迟，复发性/转移性疾病常常是致命的，因此相当多的研究集中在处于早期以及因此潜在地可治疗的时期的癌症复发上。

因此，许多癌症患者经历了频繁包括使用CEA的定期监测的术后监测方案。已显示手术切除术后一年使用CEA的系列监测甚至在疑似症状或体征不存在的情况下，在大约97%的特异性下以大约29%的灵敏度检测到早期术后复发/转移性疾病(Buccheri, G.,等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。因此，术后癌症患者的随访是合适的生物化学标记物的用途的最重要的领域之一。由于FEN1在癌症患者中的高灵敏度，FEN1（单独地或与一个或更多个其他标记物组合）可能极大地帮助术后癌症患者的随访。包括FEN1和一个或更多个癌症标记物的标记物组在癌症患者的随访中的用途代表了本发明的另外的优选实施方案。

在另外的优选实施方案中，本发明涉及FEN1在癌症的诊断领域中的用途。优选，FEN1 分别用于EC, MM, CC, H/NC, OC, CRC, BLC, PAC, BC, SCLC, PC, KC或NSCLC的评估。

在还另外的优选实施方案中，本发明涉及FEN1作为癌症例如一般性癌症或特定类型的癌症（例如EC, MM, CC, H/NC, OC, CRC, BLC, PAC, BC, SCLC, PC, KC或NSCLC）的标记分子与一个或更多个另外的癌症标记分子组合的用途。另外的标记分子可以是癌症类型非特异性一般性标记分子和/或癌症类型特异性标记分子。FEN1和至少一个另外的标记物用于在获自个体的液体样品中评估癌症。优选选择的可将其与FEN1的测量组合的其他癌症标记物是Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, proGRP, SCC, NNMT, 抗p53自身抗体, Seprase和DPPIV/Seprase。特别地，优选选择的可将FEN1的测量与其组合的其他癌症标记物是CYFRA 21-1, CEA, CA 19-9, SCC, CA 125, proGRP和/或NSE。用于评估癌症的还另外优选的标记物组包括FEN1和至少一个选自CYFRA 21-1和CEA的其他标记分子。

如本领域技术人员将理解的，存在许多使用两个或更多个标记物的测量以改进调查中的诊断问题的方法。在相当简单但通常有效的方法中，如果样品对于至少一种被调查的标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以例如是当诊断感染性疾病如AIDS时的情况。

然而，频繁地，评估标记物的组合。优选，将测量的标记物组的标记物例如FEN1和CYFRA 21-1的值算术组合，并且使组合的值与基本诊断问题发生关联。可通过任何合适的现有技术数学方法来组合标记物值。用于使标记物组合与疾病发生关联的熟知的数学方法使用方法如判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化-DA)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器（k-Nearest-Neighbor Classifiers）)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法（Random Forest Method）、Boosting/套袋法（Bagging Methods）)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主要成分的方法（Principal Components based Method）(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的方法（Fuzzy Logic based Method）、神经网络和基于遗传算法的方法。本领域技术人员在选择合适的方法评估本发明的标记物组合中将没有问题。优选，用于使本发明的标记物组合例如与LC的不存在或存在发生关联的方法选自DA(即线性-、二次-、正则化判别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法（Tree-Based Method）(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于此类统计方法的详细内容见于下列参考文献：Ruczinski, I.等人, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T.等人, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L.等人，Classification and regression trees, California: Wadsworth(1984); Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series 28 (2003); 和Duda, R.O.等人, Pattern Classification, Wiley Interscience, 第2版(2001)。

本发明的优选实施方案是使用生物学标记物的基本组合的最优化多变量截止值以及区分状态A与状态B（例如区分患病的与健康的）。在该类型的分析中,标记物不再是独立的而是形成标记物组。

诊断方法的精确性通过其受试者工作特性(ROC；特别地参见Zweig, M.H., 和Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)得到最佳描述。ROC图是由在整个观察到的数据范围内连续改变决策阈值产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。

实验室检测的临床性能取决于其诊断精确性或正确地将受试者分类至临床相关亚组的能力。诊断精确性测量检测的正确区分被调查的受试者的两个不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。

在各情况下，ROC曲线通过在完全的决策阈值范围内将灵敏度对1-特异性作图来描述两个分布之间的重叠。灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检测结果的数目)/(真阳性检测结果的数目 + 假阴性检测结果的数目)] 在y轴上。这也称为在疾病或病状存在的情况下的阳性。其只根据受影响的亚组来计算。假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目 + 假阳性结果的数目)] 在x轴上。其是特异性的指数并且完全根据未受影响的亚组来计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检测结果完全分别地计算真阳性分数和假阳性分数，因此ROC曲线不依赖于样品中疾病的流行性（prevalence）。ROC曲线上的各点代表相应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分（两个结果的分布中无重叠）的检测具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0或100%(完美的灵敏度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(对于两组为相同的结果分布)的检测的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部分曲线落在这两个极端值之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，这可通过将“阳性”标准从“大于”转变成“小于”或反之亦然来容易地矫正)。定性地，曲线越接近左上方的角，检测的总体精确性越高。

定量实验室检测的诊断精确性的一个优选方法是利用单个数字表示其性能。这样的总体参数例如称为“总误差（total error）”或可选地“曲线下的面积=AUC”。最普遍的全局测量是ROC曲线下的面积。按常规，该面积总是大于等于0.5(如果不是，可颠倒决策规则来使其大于等于0.5)。值在1.0(两组的检测值完全分离)至0.5(两组检测值之间无显著分布差异)之间变化。面积不仅取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90%特异性下的灵敏度，而且还取决于整个曲线。这是ROC曲线接近完美曲线(面积 = 1.0)的程度的定量描述性表述。

将FEN1和其他标记物如CYFRA 21-1或CEA，或和其他尚未发现的癌症标记物的测量组合，FEN1分别导致和将导致在癌症评估中的进一步改进。

在优选的实施方案中，本发明涉及通过分别测量样品中至少FEN1和一种或多种其他选自CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, proGRP, SCC, NNMT, 抗p53自身抗体, Seprase和DPPIV/Seprase的肿瘤标记物的浓度，以及使测定的浓度与癌症的存在或不存在发生关联来提高癌症相对于健康对照的诊断精确性的方法，当与基于任何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌症相对于健康对照。

在另外的优选实施方案中，本发明涉及通过分别测量样品中至少FEN1和Cyfra 21-1，和任选地CEA和/或NSE的浓度，以及使测定的浓度与癌症的存在或不存在发生关联来提高癌症相对于健康对照的诊断精确性的方法，当与基于任何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌症相对于健康对照。

提供下列实施例、序列表和图来帮助理解本发明，其真实范围示于所附权利要求中。应当理解，可在所示的方法中进行变动而不背离本发明的精神。

附图说明

图1显示了20个肺癌组织裂解液的蛋白质印迹分析。如实施例3中描述的分析15 µg总蛋白质癌症（CA）组织裂解液和匹配的对照组织裂解液。M=分子量标记物；T=肿瘤组织裂解液；N=匹配的对照组织裂解液；rec ag=重组产生的瓣状内切核酸酶-1（=FEN1）；箭头指示FEN1的位置。

图2显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估365个从LC患者得到的样品的人肺癌（LC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.87。

图3显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估30个从H/NC患者得到的样品的人头颈癌（H/NC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.92。

图4显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估23个从EC患者得到的样品的人子宫内膜癌（EC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.92。

图5显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估41个从OC患者得到的样品的人卵巢癌（OC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.79。

图6显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估16个从MM患者得到的样品的人恶性黑色素瘤（MM）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.95。

图7显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估47个从BC患者得到的样品的人乳腺癌（BC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.79。

图8显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估20个从CC患者得到的样品的人子宫颈癌（CC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.88。

图9显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估50个从PAC患者得到的样品的人胰腺癌（PAC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.84。

图10显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估50个从CRC患者得到的样品的人结直肠癌（CRC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.79。

图11显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估50个从BLC患者得到的样品的人膀胱癌（BLC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.76。

图12显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估25个从KC患者得到的样品的人肾癌（KC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.65。

图13显示了与50个从明显健康的个体得到的对照样品相比，用于评估50个从PC患者得到的样品的人前列腺癌（PC）样品中的FEN1的受试者工作特性图（ROC图），AUC为0.73。

图14显示了人FEN1蛋白的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号：P39748 (SEQ ID NO:1)。

序列描述

SEQ ID NO：1显示了根据图14的人FEN1蛋白的氨基酸序列；SwissProt数据库登录号：P39748。

SEQ ID NO：2显示了合成的肽延伸。

SEQ ID NO: 3显示了合成的正向引物。

SEQ ID NO: 4显示了合成的反向引物。

实施例 1

将FEN1鉴别为肺癌的潜在标志物

组织来源：

为了鉴定作为肺癌的潜在诊断标志物的肿瘤特异性蛋白质，使用蛋白质组学方法进行了2种不同组织的分析。

总共分析了20个患有肺癌（LC）的患者的组织样本。在治疗切除术中从每个患者处收集了2种不同组织类型：肿瘤组织（>80%肿瘤）（T）和相邻的健康组织（N）。后者作为匹配的健康对照样品。切除后立即将组织速冻并在处理前贮存于–80℃。通过组织病理学标准诊断肿瘤。

组织制备：

将0.8-1.2 g冷冻组织切成小块，转移至冷的搅拌球磨机的研磨罐中并通过液氮完全冷冻。在球磨机中将组织磨成粉末，溶解于10倍体积（w/v）的裂解缓冲液（40 mM柠檬酸钠, 5 mM MgCl₂, 1% Genapol X-080, 0.02%叠氮化钠, Complete^®无EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1 873 580]）并之后在Wheaton®玻璃均质器中均质（20 x 松配合, 20 x 紧配合）。离心匀浆液（10’，以5,000 x g），将上清转移至另一个小管并再次离心（15’，以20,000 x g）。得到的上清包含可溶性蛋白质并用于进一步的分析。

等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE

用于IEF，3 ml悬浮物与12 ml样品缓冲液（7M脲，2M硫脲，2% CHAPS，0.4% IPG缓冲液 pH4-7，0.5% DTT）混合并孵育1小时。在Amicon^® Ultra-15 装置(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)中浓缩样品并使用Bio-Rad^® 蛋白质测定(货号500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany)根据供应商手册的说明测定蛋白质浓度。对对应1.5 mg蛋白质的体积加入样品缓冲液至350 µl的终体积。使用此溶液再水化IPG条（pH 4-7）(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)过夜。使用以下梯度方案进行IEF：1.）1分钟至500 V；2.）2h至3500 V；3.）22h，从恒压3500V开始至82 kVh。IEF之后，在–80℃贮存条或直接用于SDS-PAGE。

在SDS-PAGE以前，将条在平衡缓冲液（6 M脲, 50 mM Tris/HCl, pH 8.8, 30%甘油, 2 % SDS）中孵育，加入DDT用于还原（15分钟，+50 mg DTT/10 ml），和加入IAA用于烷化（15分钟，+ 235 mg碘乙酰胺/10 ml）。将条置于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上并以1 W/凝胶电泳1小时和之后以17 W/凝胶电泳。之后，固定凝胶（50%甲醇，10%醋酸）并用Novex^TM Colloidal Blue Staining试剂盒(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 货号LC6025, 45-7101)染色过夜。

FEN1作为人肺癌的潜在标志物的检测：

使用ProteomeWeaver®软件(Definiens AG, Germany, München)通过图像分析分别分析了每个患者。另外，通过捡取机器人切下凝胶上的所有点并通过MALDI-TOF质谱(Ultraflex^TM Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)鉴定了点中存在的蛋白质。对每个患者，比较来自肿瘤样品的3块胶和来自相邻正常组织的3块胶，并分析对应差异表达的蛋白质的不同点。在10位患者的肿瘤样品中和仅1个对照样品中鉴定出FEN1。通过此方法，发现蛋白质FEN1分别在肿瘤组织中特异性表达或强烈地过表达。因此其有资格作为候选标志物用于肺癌的诊断。鉴定了来源于FEN1的以下胰蛋白酶消化肽。

表 2：通过MALDI-TOF鉴定的胰蛋白酶消化肽

鉴定的肽	来自 FEN1 的氨基酸区域 ( 试比较 SEQ ID NO: 1)
		LIADVAPSAIR	9 - 19
KVAIDASMSIYQFLIAVR	30-47
		VAIDASMSIYQFLIAVR	31-47
QGGDVLQNEEGETTSHLMGMFYR	48-70
		QLQQAQAAGAEQEVEK	110-125
KLPIQEFHLSR	201-211
		LPIQEFHLSR	202-211
RAVDLIQK	245-252
		LDPNKYPVPENWLHK	263-277
YPVPENWLHK	268-277
		EAHQLFLEPEVLDPESVELK	278-297
WSEPNEEELIK	298-308
		QFSEERIR	315-322

实施例 2

生成针对癌症标志物蛋白FEN1的抗体

生成了针对肺癌标志物蛋白FEN1的多克隆抗体，用于进一步使用此抗体通过免疫检测测定（例如蛋白质印迹和ELISA）测量FEN1的血清和血浆水平或在其他体液中的浓度。

在大肠杆菌中的重组蛋白质表达

为了产生针对FEN1的抗体，在大肠杆菌中产生重组抗原：因此，从全长cDNA克隆（从德国基因组研究资源中心(German Resource Center for Genome Research) (RZPD, Berlin, Germany)得到）上PCR扩增FEN1编码区，使用以下引物：

正向引物(SEQ ID NO. 3)：

5’-cacacacaattgattaaagaggagaaattaactATGAGAGGATCGCATCACCAT

CACCATCACATTGAAGGCCGTGGAATTCAAGGCCTGGCC-3’

（下划线为MunI位点，编码核苷酸为大写字母）。

反向引物(SEQ ID NO. 4)：

5’-acgtacgtaagcttTCATTATTTTCCCCTTTTAAACTTC-3’

（下划线为HindIII位点，编码核苷酸为大写字母）。

正向引物（除了MunI克隆位点和核糖体结合位点以外）编码了在FEN1基因的5’端依读框融合的N-端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸(在SEQ ID NO. 2中显示)。将MunI/HindIII消化的PCR片段连接进pQE80L载体(Qiagen, Hilden, Germany)。之后，用生成的质粒转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞。在序列分析后，遵照制造商的说明书用生成的质粒转化大肠杆菌C600感受态细胞用于处于pQE载体系列的T5启动子控制下的IPTG诱导表达。

为了纯化MRGSHHHHHHIEGR-FEN1融合蛋白，通过离心沉淀1L诱导的过夜细菌培养物，并在裂解缓冲液(20 mM磷酸钠缓冲液, pH 7.4, 500 mM氯化钠(NaCl))中重悬细胞沉淀。在French压碎器中破碎细胞，使用1500 bar的压力。通过离心(25000 g, 15分钟, 4℃)沉淀不可溶的物质，并将上清应用于镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金属亲和柱：用几倍柱床体积的洗涤缓冲液(20 mM磷酸纳缓冲液, pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑)洗涤柱。最后，使用具有20 mM – 500 mM咪唑的线性梯度的洗涤缓冲液洗脱结合的抗原，用紫外检测仪在O.D.₂₈₀处鉴定包含抗原的组分（每个7 ml）。合并包含抗原的组分，对贮存缓冲液(75 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6.5 % (w/v)蔗糖)透析并分别贮存于4℃或-80℃。

生成用于免疫的肽免疫原：

为了产生特异性针对FEN1的多克隆抗体，鉴定了与其他已知的人蛋白质未显示有显著同源性的肽序列。使用Blast软件在瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）上可获得的人蛋白质数据库上运行FEN1的氨基酸序列。氨基酸序列260-273没有显示与其他人蛋白质的显著同源性并因此被选为引发FEN1特异性抗体。合成了相应序列并化学缀合至KLH（=钥孔虫戚血蓝素）以得到用于免疫的免疫原。

生成多克隆抗体：

a）免疫

用于免疫，以1：1的比例制备蛋白质溶液（100 µg/ml蛋白质FEN1或500 µg/ml连接来自FEN1氨基酸260-273的肽的KLH）和弗氏完全佐剂的新鲜乳剂。用1ml乳剂在第1、7、14和30、60和90天免疫每只兔子。抽血并将得到的抗-FEN1血清用于进一步的实验（如在实施例3和4中描述）。

b）通过用辛酸和硫酸铵相继沉淀从兔血清中纯化IgG（免疫球蛋白G）

用4倍体积的醋酸缓冲液(60 mM, pH 4.0)稀释1倍体积的兔血清。用2M Tris碱调节pH至4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸（25 µl/ml稀释样品）。30分钟后离心(13 000 x g, 30分钟, 4℃)样品，弃沉淀并收集上清。通过加入2M Tris碱将上清的pH调节至7.5并过滤(0.2 µm)。

在剧烈搅拌下通过逐滴加入4M 硫酸铵溶液至2M的终浓度沉淀上清中的免疫球蛋白。通过离心(8000 x g, 15分钟, 4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。

弃上清。在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中溶解沉淀并彻底透析。离心透析液(13 000 x g, 15分钟, 4℃)，并过滤(0.2 µm)。

多克隆兔IgG的生物素化：

在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中将多克隆兔IgG溶为10 mg/ml。对每ml IgG溶液加入50 µl 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6 mg/ml，在DMSO中)。在室温30分钟后，样品在Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上层析。收集包含生物素化IgG的组分。已根据相同的程序生物素化单克隆抗体。

多克隆兔IgG的地高辛化：

在10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl, pH 7.5中将多克隆兔IgG溶为10 mg/ml。对每ml IgG溶液加入50 µl 地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, 货号1 333 054)(3.8 mg/ml，在DMSO中)。在室温30分钟后，样品在Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上层析。收集包含地高辛化IgG的组分。已根据相同的程序用地高辛标记单克隆抗体。

实施例 3

蛋白质印迹检测人肺癌（LC）组织中的FEN1，使用如实施例2中生成的多克隆抗体

如实施例1，“组织制备”中描述的制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解物。

使用Invitrogen, Karlsruhe, Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对检测的每个组织样品，在还原性NuPAGE® (Invitrogen) SDS样品缓冲液中稀释15 µg组织裂解物，并在95℃加热10分钟。在4-12% NuPAGE®凝胶(Tris-甘氨酸)上在MES电泳缓冲液系统中电泳样品。使用Invitrogen XCell II^TM 印迹组件(Invitrogen)和NuPAGE^®转移缓冲液系统将凝胶分离的蛋白质混合物印在硝酸纤维素膜上。在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜3次，并用Roti®-Block封闭缓冲液(A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)封闭2小时。以1:10,000在Roti®-Block封闭缓冲液中稀释第一抗体，多克隆兔抗-FEN1血清（在实施例2中描述了生成），并与膜孵育1小时。在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜6次。用POD缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体（在0.5 xRoti®-Block封闭缓冲液中稀释至10 mU/ml）标记特异性结合的第一兔抗体。孵育1小时后，在PBS/0.05% Tween-20中洗涤膜6次。为了检测结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-Light^PLUS 蛋白质印迹底物(目录号2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)孵育并在放射自显影胶片上曝光。

在从20个不同的LC患者处得到的20个肿瘤组织裂解物的19个中，针对FEN1的信号强度提高（图1）。因此，通过蛋白质印迹分析清楚地验证了在实施例1中通过MALDI检测的，在肿瘤组织中提高的FEN1丰度。

实施例 4

ELISA测量人血清和血浆样品或其他体液中的FEN1

为了检测人血清或血浆中的FEN1，使用实施例2中的抗体进行夹心ELISA。为了捕获抗原，用生物素缀合针对肽398-413的抗体，而用地高辛缀合针对FEN1全长序列的抗体。

为了校准测定，增殖HT-29细胞（一种结肠癌细胞系，包括在美国国家癌症研究所的NCI60肿瘤细胞系中），并使用细胞裂解物用于校准。将10.0 mg/ml的裂解物稀释为40 µg/ml并强制设定为100 U/ml。

将50 µl作为标准抗原的HT-29裂解液的连续稀释液或来自患者的血清/血浆/ELF样品与200 µl在10 mM磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中的分别包含1,25 µg/ml的生物素化抗FEN1，aa260-273和2.5 µg/ml的地高辛化抗FEN-1抗体的抗体混合物孵育过夜。之后将100 µl等分试样转移至链霉抗生物素包被的96孔微滴定板，并在环境温度下孵育1小时。孵育后，用0.9% NaCl , 0.1% Tween 20洗涤板3次。在下一步中，将孔与100 mU/ml的抗地高辛-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1633716)在10 mM 磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中孵育60分钟。之后用相同的缓冲液洗涤板3次。为了检测抗原-抗体复合物，将孔与100 µl TMB溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号11484281001)孵育，并在60分钟后使用ELISA阅读器在450 nm处测量OD。

实施例 5

FEN1作为人肺癌（LC）的血清标志物

使用来源于365位良好表征的肺癌患者（146位腺癌，87位鳞状细胞癌，44位小细胞癌，88位其他肺癌）的样品，在表3中给出了UICC分类。

表 3：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	182
UICC III	118
		UICC IV	62
未知分期	3
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表3的LC样品中的FEN1水平，AUC为0.87（图2）。

实施例 6

FEN1作为人头/颈癌（H/NC）的血清标志物

使用来源于30位良好表征的头/颈癌患者的样品，在表4中给出了UICC分类。

表 4：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	4
UICC III	3
		UICC IV	21
未知分期	2
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的H/NC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.92（图3）。

实施例 7

FEN1作为人子宫内膜癌（EC）的血清标志物

使用来源于23位良好表征的子宫内膜癌患者的样品，在表5中给出了UICC分类。

表 5：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	12
UICC III	3
		UICC IV	3
未知分期	5
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的EC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.92（图4）。

实施例 8

FEN1作为人卵巢癌（OC）的血清标志物

使用来源于42位良好表征的卵巢癌（OC）患者的样品，在表6中给出了UICC分类。

表 6：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	7
UICC III	14
		UICC IV	8
未知分期	12
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的OC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.79（图5）。

实施例 9

FEN1作为人恶性黑色素瘤（MM）的血清标志物

使用来源于16位良好表征的恶性黑色素瘤患者的样品，在表7中给出了UICC分类。

表 7：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	3
UICC III	1
		UICC IV	0
未知分期	12
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的MM样品中的FEN1水平，得到AUC为0.95（图6）。

实施例 10

FEN1作为人乳腺癌（BC）的血清标志物

使用来源于47位良好表征的乳腺癌患者的样品，在表8中给出了UICC分类。

表 8：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	26
UICC III	9
		UICC IV	12
明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表5的BC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.79（图7）。

实施例 11

FEN1作为人子宫颈癌（CC）的血清标志物

使用来源于20位良好表征的子宫颈癌患者的样品，在表9中给出了UICC分类。

表 9：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC is/I/II	11
UICC III	7
		UICC IV	2
未知分期	0
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的CC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.88（图8）。

实施例 12

FEN1作为人胰腺癌（PAC）的血清标志物

使用来源于49位良好表征的胰腺癌患者的样品，在表10中给出了UICC分类。

表 10：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	26
UICC III	5
		UICC IV	15
未知分期	4
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的PAC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.84（图9）。

实施例 13

FEN1作为人结直肠癌（CRC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的结直肠癌患者的样品，在表11中给出了UICC分类。

表 11：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	25
UICC III	13
		UICC IV	6
未知分期	6
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表4的CRC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.79（图10）。

实施例 14

FEN1作为人膀胱癌（BLC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的膀胱癌患者的样品，在表12中给出了UICC分类。

表 12：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC 0/I/II	41
UICC III	1
		UICC IV	3
未知分期	4
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的BLC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.76（图11）。

实施例 15

FEN1作为人肾癌（KC）的血清标志物

使用来源于25位良好表征的肾癌患者的样品，在表13中给出了UICC分类。

表 13：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	13
UICC III	4
		UICC IV	3
未知分期	5
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的KC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.65（图12）。

实施例 16

FEN1作为人前列腺癌（PC）的血清标志物

使用来源于50位良好表征的结直肠癌患者的样品，在表14中给出了UICC分类。

表 14：研究群体

根据UICC的分期	样品数
		UICC I/II	24
UICC III	4
		UICC IV	6
未知分期	16
		明显健康的献血者	50

在与50个从明显健康的个体中得到的对照样品（=对照组群）的比较之下，评估了表6的PC样品中的FEN1水平，得到AUC为0.73（图13）。

实施例 17

在上皮细胞衬液（ELF）中的FEN1——支气管镜微量取样

支气管镜微量取样（BMS）提供了主要以非侵害性方式在小肺结节附近收集上皮细胞衬液（ELF）的可能性。之后，有可能测量ELF中肿瘤标志物的浓度以鉴定恶性结节。通过在对侧肺中取样ELF得到相应的肿瘤标志物的患者特异性基线浓度。

通过支气管镜将BMS探针(Olympus Medical Systems Corp. Tokyo, Japan, 货号: BC-402C)插入肺，BMS探针由外部的聚乙烯护套和内部的附着在不锈钢引导物上的棉探针组成。内部探针深入结节附近并进行几秒种的BMS。之后，内部探针收回外部护套且2种装置同时收回。切掉棉尖端并直接冷冻在-80℃。用于测定，从棉尖端上洗脱ELF且之后可分析ELF。使用如实施例4中描述的ELISA在ELF中测定FEN1的浓度。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 作为癌症的标记物的瓣状内切核酸酶-1

<130> 26208 WO

<150> EP09165636.3

<151> 2009-07-16

<160> 4

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Ile Gln Gly Leu Ala Lys Leu Ile Ala Asp Val Ala Pro Ser

1 5 10 15

Ala Ile Arg Glu Asn Asp Ile Lys Ser Tyr Phe Gly Arg Lys Val Ala

20 25 30

Ile Asp Ala Ser Met Ser Ile Tyr Gln Phe Leu Ile Ala Val Arg Gln

35 40 45

Gly Gly Asp Val Leu Gln Asn Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ser His Leu

50 55 60

Met Gly Met Phe Tyr Arg Thr Ile Arg Met Met Glu Asn Gly Ile Lys

65 70 75 80

Pro Val Tyr Val Phe Asp Gly Lys Pro Pro Gln Leu Lys Ser Gly Glu

85 90 95

Leu Ala Lys Arg Ser Glu Arg Arg Ala Glu Ala Glu Lys Gln Leu Gln

100 105 110

Gln Ala Gln Ala Ala Gly Ala Glu Gln Glu Val Glu Lys Phe Thr Lys

115 120 125

Arg Leu Val Lys Val Thr Lys Gln His Asn Asp Glu Cys Lys His Leu

130 135 140

Leu Ser Leu Met Gly Ile Pro Tyr Leu Asp Ala Pro Ser Glu Ala Glu

145 150 155 160

Ala Ser Cys Ala Ala Leu Val Lys Ala Gly Lys Val Tyr Ala Ala Ala

165 170 175

Thr Glu Asp Met Asp Cys Leu Thr Phe Gly Ser Pro Val Leu Met Arg

180 185 190

His Leu Thr Ala Ser Glu Ala Lys Lys Leu Pro Ile Gln Glu Phe His

195 200 205

Leu Ser Arg Ile Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Glu Gln Phe Val

210 215 220

Asp Leu Cys Ile Leu Leu Gly Ser Asp Tyr Cys Glu Ser Ile Arg Gly

225 230 235 240

Ile Gly Pro Lys Arg Ala Val Asp Leu Ile Gln Lys His Lys Ser Ile

245 250 255

Glu Glu Ile Val Arg Arg Leu Asp Pro Asn Lys Tyr Pro Val Pro Glu

260 265 270

Asn Trp Leu His Lys Glu Ala His Gln Leu Phe Leu Glu Pro Glu Val

275 280 285

Leu Asp Pro Glu Ser Val Glu Leu Lys Trp Ser Glu Pro Asn Glu Glu

290 295 300

Glu Leu Ile Lys Phe Met Cys Gly Glu Lys Gln Phe Ser Glu Glu Arg

305 310 315 320

Ile Arg Ser Gly Val Lys Arg Leu Ser Lys Ser Arg Gln Gly Ser Thr

325 330 335

Gln Gly Arg Leu Asp Asp Phe Phe Lys Val Thr Gly Ser Leu Ser Ser

340 345 350

Ala Lys Arg Lys Glu Pro Glu Pro Lys Gly Ser Thr Lys Lys Lys Ala

355 360 365

Lys Thr Gly Ala Ala Gly Lys Phe Lys Arg Gly Lys

370 375 380

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的肽延伸

<400> 2

Met Arg Gly Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的正向引物

<400> 3

cacacacaat tgattaaaga ggagaaatta actatgagag gatcgcatca ccatcaccat 60

cacattgaag gccgtggaat tcaaggcctg gcc 93

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的反向引物

<400> 4

acgtacgtaa gctttcatta ttttcccctt ttaaacttc 39

Claims

1.特异性测量瓣状内切核酸酶-1（FEN1）蛋白所需要的试剂在制备用于体外在血清或血浆样品中评估癌症的试剂盒中的用途，其中增加的FEN1蛋白的浓度预示着癌症。

2.特异性测量瓣状内切核酸酶-1（FEN1）蛋白所需要的试剂以及特异性测量一种或多种其他癌症标记物所需要的试剂在制备用于体外在血清或血浆样品中评估癌症的试剂盒中的用途，其中增加的FEN1蛋白的浓度预示着癌症。

3.根据权利要求1的用途，其中所述试剂盒用于夹心免疫测定。

4.根据权利要求2中的用途，其中所述试剂盒用于夹心免疫测定。

5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中所述癌症选自子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌和非小细胞肺癌。

6.根据权利要求2或4的用途，其进一步的特征在于所述一种或多种其他癌症标记物选自CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。

7.根据权利要求1或2的用途，其进一步的特征在于通过免疫学方法测量所述浓度。

8.根据权利要求1或2的用途，其中所述特异性测量瓣状内切核酸酶-1（FEN1）蛋白所需要的试剂是针对FEN1蛋白的抗体。

9.进行根据权利要求2的用途的试剂盒，其包含特异性测量FEN1蛋白所需要的试剂和特异性测量一种或多种其他癌症标记物所需要的试剂。

10.用于进行根据权利要求2的用途的生物芯片阵列，其用于特异性测量FEN1和一种或多种选自CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase的其他标记物。