ES2532644T3

ES2532644T3 - Secernina-1 como marcador de cáncer

Info

Publication number: ES2532644T3
Application number: ES10722311.7T
Authority: ES
Inventors: Norbert Wild; Marie-Luise Hagmann; Johann Karl; Julia Riedlinger; Markus Roessler; Michael Tacke
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-05-29
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2015-03-30
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: CN102449484A; US9518990B2; WO2010136163A8; JP2012528303A; JP5731488B2; CA2760366A1; CN102449484B; EP2435830A1; US20120028835A1; EP2435830B1; HK1170566A1; WO2010136163A1

Abstract

Método para evaluar el cáncer in vitro, que comprende medir en una muestra de suero o plasma la concentración de: (a) proteína secernina-1 (>=SCRN1) y/o fragmentos de la misma, (b) opcionalmente otro u otros marcadores de cáncer, y (c) utilizar el resultado de la medición de la etapa (a), y opcionalmente de la etapa (b), en la evaluación del cáncer, en el que una concentración incrementada de proteína SCRN1 y/o fragmentos de la misma es indicativa de cáncer, y en el que dicho método es un inmunoensayo de tipo sándwich.

Description

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La presente invención proporciona además un kit para llevar a cabo el método según la presente invención, que comprende por lo menos los reactivos requeridos para medir específicamente la proteína SCRN1 y/o fragmentos de la misma y opcionalmente uno o más marcadores del cáncer, por ejemplo marcadores de cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama, cabeza y cuello, vejiga, páncreas, colon, cérvix, riñón o próstata, tal como se ha indicado antriormente, en el que cada uno de los demás marcadores pueden utilizarse individualmente o en cualquier combinación de los mismos.

La presente invención proporciona además un kit para llevar a cabo el método según la presente invención que comprende por lo menos los reactivos requeridos para medir específicamente SCRN1 y otro u otros marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, SCC, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa, y opcionalmente reactivos auxiliares para llevar a cabo la medición.

La presente invención proporciona además una matriz biochip para llevar a cabo el método según la presente invención para medir específicamente SCRN1 y otro u otros marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, SCC, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa, y opcionalmente reactivos auxiliares para llevar a cabo la medición. La presente invención proporciona además una matriz biochip para llevar a cabo el método según la presente invención para medir específicamente SCRN1 y otro u otros marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, SCC, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa en la evaluación del cáncer.

La presente invención proporciona además una matriz biochip para llevar a cabo el método según la presente invención para medir específicamente SCRN1 y otro u otros marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, SCC, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa, y opcionalmente reactivos auxiliares para llevar a cabo la medición en la evaluación del cáncer.

El término "medición" preferentemente comprende una medición cualitativa, semicualitativa o cuantitativa de la proteína SCRN1 y/o fragmentos de la misma en una muestra. En una realización preferente, la medición es semicuantitativa, es decir, se determina si la concentración de una proteína de SCRN1 es superior o inferior a un valor de corte. Tal como apreciará el experto en la materia, en un ensayo de Sí (presencia) o No (ausencia), la sensibilidad del ensayo habitualmente se establece en el valor de corte. Puede determinarse un valor de corte, por ejemplo, a partir del ensayo de un grupo de individuos sanos. Preferentemente, el valor de corte se establece de manera que resulte en una especificidad del 90%; también resulta preferente establecer el valor de corte de manera que resulte en una especificidad del 95%, o también resulta preferente establecer el valor de corte de manera que resulte una especificidad del 98%. Un valor superior al valor de corte puede ser, por ejemplo, indicativo de la presencia de cáncer. En particular, un valor superior al valor de c orte puede ser indicativo, por ejemplo, de la presencia de cáncer de pulmón, colon, mama, ovario, cérvix, cabeza y cuello, endometrio, melanoma, vejiga, riñón, páncreas, próstata, esófago, estómago y/o conducto biliar. En una realización preferente adicional, la medición de SCRN1 es una medición cuantitativa. En realizaciones adicionales, se correlaciona la concentración de SCRN1 con una pregunta diagnóstica subyacente, tal como, por ejemplo, el estadio de la enfermedad, la progresión de la enfermedad o la respuesta a la terapia.

En otra realización preferente, el valor de corte se establece de manera que resulte en una sensibilidad del 90%; también resulta preferente establecer el valor de corte de manera que resulte en una sensibilidad del 95%, o también resulta preferente establecer el valor de corte para resultar en una sensibilidad del 98%.

Un valor inferior al valor de corte puede ser, por ejemplo, indicativo de la ausencia de cáncer. En particular, un valor inferior al valor de corte puede ser indicativo, por ejemplo, de la presencia de cáncer de pulmón, colon, mama, ovario, cérvix, cabeza y cuello, endometrio, melanoma, vejiga, riñón, páncreas, próstata, esófago, estómago y/o conducto biliar.

En una realización preferente adicional, la medición de SCRN1 es una medición cuantitativa. En realizaciones adicionales, se correlaciona la concentración de SCRN1 con una pregunta diagnóstica subyacente, tal como, por ejemplo, el estadio de la enfermedad, la progresión de la enfermedad o la respuesta a la terapia.

La proteína secernina-1 (=SCRN1), Swiss-PROT ID: Q12765 es una proteína citosólica de 414 aminoácidos con un peso molecular de 46,4 kDa caracterizada por la secuencia proporcionada en SEC ID nº 1 (fig. 14). La secuencia codificante de SCRN1 fue predicha en 1996 por Nagase T. et al. a partir del análisis de clones de ADNc derivados de médula ósea (Nagase T. et al., DNA Res. 3:17-24, 1996). Más recientemente, el gen respectivo se ha localizado en el cromosoma 7 y se ha clarificado la estructura génica (Hillier L.N. et al., Nature 424:157-164, 2003). Aunque el gen ya ha sido bien caracterizado, sólo se entienden parcialmente el papel y función biológicos de SCRN1. Regula la secreción de los mastocitos e incrementa la sensibilidad de las células a la estimulación con calcio (Way G. et al., Mol. Biol. Cell 13:3344-3354, 2002). También se ha detectado SCRN1 en plaquetas mediante métodos de proteómica aunque sin definir una función de la proteína (O'Neill E.E. et al., Proteomics 2:288-305, 2002). En publicaciones recientes se ha asociado el nivel de expresión de ARN al cáncer gástrico (Yamashita S. et al., Cancer

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comprende el marcador SCRN1 y uno o más marcadores adicionales, por ejemplo marcadores generales de cáncer y/o marcadores para el tipo de cáncer anteriormente indicado.

Una combinación de marcadores mejora significativamente el valor del ensayo molecular. En primer lugar, se mejora significativamente la sensibilidad del ensayo utilizando un panel de marcadores. En segundo lugar, unos modelos estadísticos sofisticados permiten el análisis de curva ROC del ensayo multimarcador y los resultados confirman que la exactitud diagnóstica se encuentra significativamente incrementada en comparación con el mejor marcador individual.

También resulta probable que SCRN1 contribuya a paneles de marcadores para determinados tipos específicos de cáncer, por ejemplo cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama, cabeza y cuello, vejiga, páncreas, colon, cérvix, riñón o próstata.

Otros tipos preferentes de cáncer que deben evaluarse con un panel de marcadores que comprende SCRN1 son el cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama, cabeza y cuello, vejiga, páncreas o colon.

Otros tipos preferentes de cáncer que deben evaluarse con un panel de marcadores que comprende SCRN1 son el cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama o cabeza y cuello. Otros tipos preferentes de cáncer que deben evaluarse con un panel de marcadores que comprende SCRN1 son el cáncer de pulmón (CP) o el cáncer de colon (CCR).

Un tipo preferente de cáncer que debe evaluarse con un panel de marcadores que comprende es el cáncer de pulmón (CP).

Los presentes datos indican además que determinadas combinaciones de marcadores resultarán ventajosas en el cribado del cáncer.

Por ejemplo, en referencia a la realización preferente de cribado del cáncer, la presente invención se refiere además a la utilización de un panel de marcadores que comprende SCRN1 y por lo menos uno o más marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, SCC, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa.

Ayuda diagnóstica:

Los marcadores pueden ayudar en el diagnóstico diferencial de enfermedades benignas y malignas en un órgano particular, ayudar a distinguir entre diferentes tipos histológicos de un tumor, o a establecer valores de línea base de un marcador antes de una cirugía.

En la actualidad, son métodos importantes utilizados en la detección del cáncer de pulmón la radiología y/o los análisis de tomografía computerizada (TC). Pueden visualizarse nódulos pequeños, es decir, pequeñas regiones de tejido sospechoso, mediante dichos métodos. Sin embargo, muchos de dichos nódulos (más de 90% en la TC) representan cambios benignos de los tejidos, y sólo una minoría de los nódulos representan tejido canceroso. La utilización del marcador SCRN1 podría ayudar en la diferenciación de la enfermedad benigna y maligna.

En una realización preferente, se utiliza el marcador SCRN1 en un método inmunohistológico con el fin de establecer o confirmar diferentes tipos histológicos de cáncer.

Debido a que SCRN1 como marcador único podría ser superior a otros marcadores, por ejemplo en el caso del CP, tales como ACE o EEN, debe esperarse que SCRN1 se utilice como ayuda diagnóstica, especialmente en el establecimiento de un valor de línea base previo a la cirugía. De esta manera, la presente invención también se refiere a la utilización de SCRN1 para establecer un valor de línea base antes de la cirugía para el cáncer.

Pronóstico:

Los indicadores pronósticos pueden definirse como características clínicas, patológicas o bioquímicas de los pacientes de cáncer y de sus tumores que predicen con una determinada probabilidad el resultado de una enfermedad. Su utilización principal es en la ayuda a la planificación racional del control de un paciente, es decir, para evitar el infratratamiento de una enfermedad agresiva o el sobretratamiento de una enfermedad indolente, respectivamente. Molina R. et al., Tumor Biol. 24:209-218, 2003, han evaluado el valor pronóstico de ACE, CA 125, CYFRA 21-1, SSC y EEN en el CPCNP. En su estudio, unos niveles en suero anormales de los marcadores EEN, CEA y LDH (lactato deshidrogenasa) aparentemente indicaban un tiempo de supervivencia más corto.

Debido a que SCRN1 por sí solo contribuye significativamente a la diferenciación de los pacientes de cáncer, por ejemplo los pacientes de CP, respecto de los controles sanos, debe esperarse que ayudará en la evaluación del pronóstico de los pacientes que sufren de cáncer, preferentemente de CP. El nivel de SCRN1 preoperatorio muy

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probablemente se combinará con otro u otros marcadores de cáncer y/o en el sistema de estadificación de TNM. En una realización preferente se utiliza SCRN1 en el pronóstico de los pacientes con CP.

Seguimiento de la quimioterapia:

Merle P. et al., Int. J. of Biological Markers 19:310-315, 2004, han evaluado las variaciones del nivel sérico de CYFRA 21-1 en pacientes con CPCNP localmente avanzado bajo tratamiento con quimioterapia de inducción. Concluyeron que el seguimiento temprano de los niveles séricos de CYFRA 21-1 podría ser una herramienta pronóstica útil para la respuesta tumoral y la supervivencia en pacientes de NCPCP de estadio III. Además, algunos informes han descrito la utilización de ACE en el seguimiento del tratamiento de pacientes con CP (Fukasawa T. et al., Cancer & Chemotherapy 13:1862-1867, 1986). La mayoría de ellos han sido retrospectivos, no aleatorizados y contenían un número reducido de pacientes. Tal como en el caso de los estudios con CYFRA 21-1, los estudios de CEA sugieren: a) que los pacientes con una reducción de los niveles de CEA observada durante el tratamiento de quimioterapia generalmente presentaron un mejor resultado que los pacientes cuyos niveles de CEA no habían bajado, y (b) que prácticamente para todos los pacientes, el incremento del nivel de ACE se asoció a progresión de la enfermedad.

Se espera que SCRN1 será un marcador por lo menos tan bueno para el seguimiento de la quimioterapia como CYFRA 21-1 ó ACE, respectivamente. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a la utilización de SCRN1 en el seguimiento de los pacientes de cáncer y preferentemente de cáncer de pulmón (CP) bajo terapia.

En el seguimiento de la terapia, en una realización preferente se combinarán las mediciones de SCRN1 y por lo menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, AnCE, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa, y se utilizarán en la evaluación del cáncer de pulmón (CP).

Seguimiento:

Una gran parte de los pacientes de CP sometidos a resección quirúrgica destinada a la eliminación completa del tejido canceroso desarrollaron posteriormente una enfermedad recurrente o metastásica (Wagner H., Chest 117:110118, 2000; Buccheri G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75:973-980, 2003). La mayoría de dichas recaídas se produjeron en los primeros 2-3 años posteriores a la cirugía. Debido a que la enfermedad recurrente/metastásica es invariablemente fatal en el caso de que se detecte tarde, se ha dedicado un considerable esfuerzo de investigación a la recaída del cáncer en un estadio precoz y, de esta manera, potencialmente tratable.

En coEENcuencia, muchos pacientes de cáncer, por ejemplo de CP, se someten a un programa de vigilancia postoperatoria que frecuentemente incluye el seguimiento periódico del ACE. El seguimiento seriado del ACE un año después de la resección quirúrgica se ha demostrado que detecta una enfermedad recurrente/metastásica postoperatoria temprana con una sensibilidad de aproximadamente 29%, a una especificidad de aproximadamente 97%, incluso en ausencia de síntomas o signos sospechosos (Buccheri G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75:973-980, 2003). De esta manera, el seguimiento de los pacientes con LC tras la cirugía es uno de los campos más importantes de utilización de un marcador bioquímico apropiado. Debido a la elevada sensibilidad de SCRN1 en los pacientes de CP investigados, es probable que SCRN1 solo o en combinación con otro u otros marcadores resultará de gran ayuda en el seguimiento de los pacientes de CP, especialmente en el caso de pacientes de CP después de la cirugía. La utilización de un panel de marcadores que comprende SCRN1 y otro u otros marcadores de CP en el seguimiento de los pacientes de CP representa una realización preferente adicional de la presente invención.

La presente invención en una realización preferente se refiere a la utilización de SCRN1 en el campo del diagnóstico del cáncer. Preferentemente se utiliza SCRN1 en la evaluación del cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama, cabeza y cuello, vejiga, páncreas, colon, cérvix, riñón o próstata, respectivamente.

En todavía una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a la utilización de SCRN1 como molécula marcadora del cáncer, por ejemplo del cáncer en general o de tipos específicos de cáncer, tales como el cáncer de pulmón, ovario, endometrio, melanoma, mama, cabeza y cuello, vejiga, páncreas, colon, cérvix, riñón o próstata en combinación con una o más moléculas marcadoras adicionales del cáncer. Las moléculas marcadoras adicionales pueden ser moléculas marcadores generales inespecíficas de tipo cáncer y/o moléculas marcadores específicas de tipo cáncer, por ejemplo moléculas marcadoras del cáncer de pulmón. Se utiliza SCRN1 y por lo menos un marcador adicional en la evaluación del cáncer, por ejemplo el cáncer de pulmón, en una muestra líquida obtenida de un individuo. Otros marcadores de cáncer seleccionados preferentes con los que puede combinarse la medición de SCRN1 son Cyfra 21-1, ACE, EEN, CA 19-9, CA 125, AEP, PLProG, AnCE, NNMT, autoanticuerpos anti-p53, seprasa y DPPIV/seprasa. En particular, otros marcadores de CP seleccionados preferentes con los que puede combinarse la medición de SCRN1 son CYFRA 21-1, ACE, CA 19-9, EEN, CA 125, PLProG y/o AnCE. Todavía más preferentemente, el panel de marcadores utilizado en la evaluación del cáncer, por ejemplo el CP, comprende SCRN1 y por lo menos otra molécula marcadora seleccionada de entre el grupo que consiste de CYFRA 21-1 y ACE.

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(el sitio EcoRI se encuentra subrayadado; los nucleótidos codificantes se muestran en mayúsculas).

Cebador inverso (SEC ID nº 4): 5’-acgtaagcttTCATTACTTAAAGAACTTAATCTCeGTG-3’ (el sitio HindIII se encuentra subrayado; los nucleótidos codificantes se muestran en mayúsculas).

El cebador directo (aparte de los sitios EcoRI de clonación y de unión ribosómica) codifica una extensión peptídica N-terminal MRGSHHHHHHIEGR (mostrada en SEC ID nº 2) fusionada en el mismo marco de lectura en el extremo 5' del gen SCRN1. El fragmento de PCR digerido con EcoRI/HindIII se liga en el vector pQE80L (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, se transforman células competentes E. coli XL1-blue con el plásmido generado. Tras el análisis de secuencias, las células competentes E. coli C600 se transforman con el plásmido generado para la expresión inducible con IPTG bajo el control del promotor de T5 de la serie de vectores pQE siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la purificación de la proteína de fusión MRGSHHHHHHIEGR-SCRN1, se peletizó mediante centrifugación 1 litro de un cultivo bacteriano inducido durante la noche y el pellet celular se resuspendió en tampón de lisis (fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, cloruro sódico (NaCl) 500 mM). Las células se fragmentaron en una prensa francesa con una presión de 1.500 bar. El material insoluble se peletizó mediante centrifugación (25.000 g, 15 min., 4ºC) y el sobrenadante se hizo pasar por una columna de afinidad de metal de Ni-ácido nitriloacético (Ni-NTA). Tras la aplicación del antígeno, la columna se lavó con varios volúmenes de lecho de tampón de lavado (tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM). Finalmente, el antígeno unido se eluyó utilizando el tampón de lavado con un gradiente lineal de imidazol 20 mM-500 mM, las fracciones que contenían antígeno (7 ml cada una) se identificaron a DO280 en un detector de UV. Se agruparon las fracciones que contenían antígeno, se dializaron frente a tampón de almacenamiento (HEPES 75 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, sacarosa al 6,5% (p/v)) y se almacenaron a 4ºC o a -80ºC, respectivamente.

Generación de inmunogenes de péptido para la inmunización:

Para generar anticuerpos policlonales específicos para SCRN1, se identificaron las secuencias de péptido que mostraban una homología significativa respecto a otras proteínas humanas conocidas. Se comparó la secuencia de aminoácidos de SCRN1 con el banco de datos de proteínas humanas disponible en el Swiss Institute of Bioinformatics utilizando el software Blast. La secuencia de aminoácidos 398-413 no mostraba homologías significativas respecto a la secernina-2 (=SCRN2) u otras proteínas humanas y por lo tanto se seleccionó para generar anticuerpos específicos para SCRN1. Se sintetizó la secuencia respectiva y se conjugó químicamente con HLA (=hemocianina de lapa americana) con el fin de obtener un inmunogén para la inmunización.

Generación de anticuerpos policlonales:

a) Inmunización

Para la inmunización, se preparó una emulsión fresca de la solución de proteína (100 mg/ml de proteína SCRN1 ó 500 mg/ml de HLA acoplada con un péptido entre los aminoácidos 398 a 413 de SCRN1) y adyuvante completo de Freund en una proporción 1:1. Se inmunizó cada conejo con 1 ml de la emulsión los días 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrajo sangre y el suero anti-SCRN1 resultante se utilizó para experimentos adicionales tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4.

b) Purificación de IgG (inmunoglobulina G) procedente de suero de conejo mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico

Se diluyó un volumen de suero de conejo con 4 volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). Se ajustó el pH a 4,5 con base Tris 2 M. Se añadió gota a gota ácido caprílico (25 µl/ml de muestra diluida) bajo agitación vigorosa. Tras 30 minutos, la muestra se centrifugó (13.000 x g, 30 minutos, 4ºC), se descartó el pellet y se recogió el sobrenadante. Se ajustó el pH del sobrenadante a 7,5 mediante la adición de base Tris 2 M y se filtró (0,2 μm).

Se precipitó la inmunoglobulina en el sobrenadante bajo agitación vigorosa mediante la adición gota a gota de una solución 4 M de sulfato amónico hasta una concentración final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogieron mediante centrifugación (8.000 x g, 15 minutos, 4ºC).

Se descartó el sobrenadante. Se disolvió el pellet en NaH2PO4/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM y se dializó exhaustivamente. Se centrifugó el dializado (13.000 x g, 15 minutos, 4ºC) y se filtró (0,2 µm).

Biotinilación de IgG policlonal de conejo:

Se llevó la IgG policlonal de conejo a 10 mg/ml en NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de IgG se añadieron 50 µl de biotín-N-hidroxisuccinimida (3,6 mg/ml en DMSO). Tras 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra se cromatografió en Superdex 200 (NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30

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