ES2315673T3 - Uso de la subunidad de 3 de proteina activadora de proteasoma (pse3) como marcador de cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal (CRC), que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra líquida, obtenida de un individuo, b) contactar la citada muestra, con un agente de enlace específico para la subunidad 3 activadora de preoteasoma (PSE3), bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace y la PSE3, y c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

Description

Uso de la subunidad 3 de proteína activadora de proteasoma (PSE3) como marcador de cáncer colorrectal.

La presente invención, se refiere al diagnóstico de cáncer colorrectal. Ésta da a conocer el uso de la subunidad 3 de la proteína activadora de proteasoma (= PSE3), en el diagnóstico del cáncer colorrectal. Adicionalmente, además, ésta se refiere, específicamente, a un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida, derivada de un individuo, procediendo a medir la PSE3, en la citada muestra. La medición de la PSE3, puede utilizarse en la detección o diagnosis tempranas del cáncer colorrectal.

El cáncer, continúa siendo un desafío público mayor, a pesar el progreso en la detección y la terapia. Entre los varios tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (= CRC), es uno de los cánceres más frecuentes en el mundo occiden-
tal.

Cuanto más pronto se detecta/diagnostica el cáncer, mayor es la tasa global de supervivencia. La prognosis, en estados avanzados del tumor, es pobre. Más de un tercio de los pacientes, morirán de la enfermedad progresiva, dentro de los cinco años después del diagnóstico, correspondiendo a una tasa de supervivencia de aproximadamente un 40%, para cinco años. El tratamiento actual, cura únicamente una fracción de los pacientes, y tiene por supuesto el mejor efecto, en aquéllos pacientes diagnosticados en un estado temprano de la enfermedad.

Con respecto al CRC, como un problema de salud pública, es esencial el hecho de que se desarrollen medidas de rastreo y preventivas para el cáncer colorrectal, que sean más efectivas.

Los procedimientos de detección más tempranos disponibles en el momento presente, para el cáncer colorrectal, involucran la utilización de tests de ensayo para la sangre fecal, o procedimientos de colonoscopia. No obstante, antes de que se detecte sangre fecal, debe existir, típicamente, un tamaño significativo de tumor. La sensibilidad de test de ensayo de sangre fecal oculta, basado en guaiac, es de \sim26%, lo cual significa el hecho de que, aproximadamente un porcentaje del 74% de los pacientes con lesiones malignas, permanecerán indetectados (Ahlquist, D. A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55). La visualización de lesiones precancerosas o cancerosas, representa el mejor método para la detección temprana, pero, la colonoscopia, es invasiva, con significativos costos, riesgos, y complicaciones (Silvis, S.E. et al., JAMA 235 (1976) 928-930; Greenen, J.E. et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235; Anderson, W.F., et al, J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133).

En los años recientes, se ha reportado una tremenda cantidad de los denominados genes específicos del cáncer de colon, o incluso de los denominados genes específicos de cáncer colorrectal. La inmensa mayoría de los correspondientes documentos o solicitudes de patente, se basan en datos obtenidos mediante análisis de modelos patrón de la expresión del RNA, en tejido de (cáncer de) colon versus un tejido diferente o un tejido normal contiguo, respectivamente. Tales tipos de métodos, pueden resumirse como técnicas diferenciales de exposición de mRNA.

Como un ejemplo, para los datos disponibles para las técnicas de exposición de mRNA, debe mencionarse y discutirse, la publicación de patente internacional WP 01/96 390. Esta solicitud de patente, describe y reivindica más de doscientos polinucleótidos aislados, y los correspondientes polipéptidos, como tales, así como su uso en la detección del CRC. No obstante, es de conocimiento general, el hecho de que, diferencias en el nivel de mRNA, no se reflejan mediante el nivel de las proteínas correspondientes. Una proteína codificada por un mRNA raro, puede encontrarse en cantidades muy grandes, y una proteína codificada mediante un mRNA abundante, puede ser no obstante, del todo, dura de detectar y de encontrar. Esta falta de correlación entre el nivel de mRNA y el nivel de proteínas, se debe a razones como la estabilidad del mRNA, la eficacia de traducción, la estabilidad de la proteína, etc.

Existen, también, métodos recientes que investigan las diferencias en los modelos patrones de las proteínas, entre diferentes tejidos, o entre un tejido sano y enfermo, con objeto de identificar moléculas marcadoras candidatas, las cuales podrían ser utilizadas en la diagnosis del CRC. Brünagel, G., et al., Cancer Research 62 (2000) 2437-2442, han identificado siete proteínas matrices nucleares, las cuales parecen ser más abundantes en el tejido del CRC, si se compara con tejido normal contiguo. No se reporta ningún dato de muestras líquidas obtenidas de un individuo.

La publicación de patente internacional WP 02/078 636, reporta sobre nueve puntos o manchas asociados con el cáncer colorrectal, según se encuentra mediante desorción y ionización por laser, intensificada, de superficie (SELDI - del inglés surface-enhanced laser desorption and ionization -). Estos puntos o manchas, se ven de una forma más frecuente, en sueros obtenidos de pacientes con CRC, si se compara con sueros obtenidos de controles sanos. No obstante, la identificación de la(s) molécula(s), comprendida(s) en tales puntos o manchas, por ejemplo, su(s) secuencia(s),
no se conoce(n).

A pesar del de la larga y siempre creciente lista de marcadores de proteínas candidatos, en el sector del CRC, hasta el momento actual, no se conoce ninguna utilidad clínica/de diagnóstico, de estas moléculas. Con objeto de ser de utilidad clínica, un nuevo marcador de diagnóstico, como un marcador individual, debería ser por lo menos tan bueno como el mejor marcador individual conocido en el arte especializado de la técnica. Ahora bien, un nuevo marcador, debería conducir a un progreso en la sensibilidad y/o especificidad de diagnóstico, tanto si se utiliza solo, como si se utiliza en combinación con uno o más marcadores distintos, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad de diagnóstico, de un test de ensayo, se evalúan, de la mejor forma, mediante sus características operativas del receptor destinatario, las cuales se describirán abajo, a continuación, en mayor detalle.

En el momento presente, se encuentran únicamente disponibles, tests de ensayo de diagnóstico, de sangre, basados en la detección de antígeno carcinomoembriónico (CEA), una glicoproteína asociada al tumor, para asistir en la diagnosis, en el sector del CRC. El CEA, se incrementa en un porcentaje del 95% de muestras de tejido obtenidas de pacientes con cánceres colorrectales, gástricos, pancreáticos, y en la mayoría de carcinomas de pecho, de pulmón, y de la cabeza y del cuello (Goldenberg, D.M. et al., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22. Se han reportado también elevados niveles de CEA, en pacientes con enfermedades no malignas, y muchos pacientes con cáncer colorrectal, tienen niveles normales de CEA, en el suero, especialmente, durante la etapa temprana de la enfermedad (Carriquiry, L.A., and Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929; Herrera M.A., et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J., et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-51). La utilidad del CEA, medido a partir del suero o plasma, en la detección de recurrencias, se reporta como controvertido, y debe todavía aplicarse ampliamente (Martell, R.E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C.G. et al., JAMA 270 (1993) 943-947).

A la luz de los datos disponibles, la determinación de CEA en suero, no posee ni las sensibilidad ni la especificidad como para permitir el uso como un test de ensayo de rastreo, para el cáncer colorrectal, en la población asintomática (Reinoso, G., el al., JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48 (2002) 1151-1159).

El suero o plasma de sangre entera, son las fuentes de muestras más ampliamente utilizadas, en la rutina química. La identificación de un marcador de CRC temprano que pudiera permitir la detección fiable de un cáncer, o proporcionar una información temprana del pronóstico, podría llevar a un ensayo de diagnóstico, que ayudaría en gran forma en la diagnosis y en el manejo de la enfermedad. Así, por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente, en cuanto al hecho de mejorar la diagnosis del CRC, a partir de la sangre. Es especialmente importante, el hecho de mejorar la diagnosis temprana del CRC, puesto que, para los pacientes diagnosticados tempranamente, las posibilidades de supervivencia, son mucho mayores, si se comparan con las de aquéllos diagnosticados en un estado avanzado o progresado de la enfermedad.

Era la finalidad de la presente invención, la de investigar si se puede identificar un nuevo marcador, que pudiera ayudar en la diagnosis del CRC.

De una forma sorprendente, se ha encontrado el hecho de que, el uso de la proteína PSE3, puede superar, por lo menos parcialmente, los problemas conocidos del estado actual de la técnica.

La presente invención, se refiere, por lo tanto, a un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra líquida, obtenida de un individuo, b) contactar la citada muestra, con un agente de enlace específico para la PSE3, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace y la PSE3, y c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

Otra forma preferida de prestación de la invención, es un procedimiento para la diagnosis de cáncer colorrectal, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra líquida, obtenida de un individuo, con un agente de enlace específico para la PSE3, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace y la PSE3, y b) correlacionar la cantidad de complejo formado en (a), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

Tal y como podrán apreciar las personas expertas en el arte especializado de la técnica, cualquiera de tales tipos de diagnosis, se realiza in vitro. A continuación, la muestra del paciente, se descarta. La muestra del paciente, se utiliza, únicamente, para el procedimiento de diagnosis in vitro de la invención y, el material de la muestra del paciente, no se transfiere, de vuelta, al cuerpo del paciente. De una forma típica, la muestra, es una muestra líquida.

El proteasoma 26S, es un complejo de proteinasa multicatalítico, con una estructura altamente ordenada, compuesta de dos complejos, un núcleo 20S, y un regulador 19S. Los proteasomas, se distribuyen a través de la totalidad de la células eucariotas, en alta concentración, y segmentan péptidos en un proceso ATP/ubitiquina-dependiente (Coux et al. (1996), Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847; Bochtler et al. (1999), Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 295-317). Un proteasoma modificado, el inmunoproteasoma, es esencial, para el procesado de péptidos MHC de clase I. En el inmunoproteasoma, el regulador 19S, se reemplaza por el regulador 11S (Rock y Goldberg (1999), Annu, Rev. Immunol. 17, 739-779). Se han identificado tres subunidades (alfa, beta y gamma) del regulador 11S (Kandil et al., (1997), Immunogenetics 46, 337-344). La PSE3 (subunidad 3 de activador de proteasoma; SWISS-PROT: Q12920), es la subunidad gamma del regulador S11 y, seis subunidades gamma, se combinan, para formar un anillo homohexamérico.

Se han identificado dos variantes de transcriptos, que codifican diferentes isoformas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2).

El gen que codifica para la PSE3, se aisló originalmente en 1990 y, la proteína correspondiente, se denominó Ki. Los pacientes con el lupus eritomatoso sistémico (SLE), producen anticuerpos contra un gran número de antígenos nucleares, el Ki, entre otros. Nikado et al. (Nikaido et al. (1990), Clin. Exp. Immunol. 79, 209-214, aislaron el correspondiente cDNA, utilizando cDNA bovino, como sonda, y rastreando una biblioteca de cDNA, de un paciente de SLE. Posteriormente, se encontró el hecho de que, el Ki recombinante, activa el proteasoma y, la proteína se identificó como PSE3 (Realini et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 25483 -25492; Tanahashi, N. et al. Genes to Cells 2 (3) (1977) 195-211). Tanahashi, N et al., mencionados anteriormente, arriba, describen, también, un anticuerpo al 28gamma, es decir, a la PSE3. Tukuya, M. et al. (Journal of Gastroenterology and Hepatology 18 (2003) 32-40), reportan el hecho de que, la expresión de subunidades de proteasoma y de antígenos de leucocitos humanos de la clase I, se encuentran dañados, en las células de cáncer de colon humano.

Un trabajo más reciente, reveló el hecho de que, la PSE3, se expresa de una forma altamente anormal, en el cáncer de tiroides, especialmente, en células del crecimiento acelerado, tal y como se estima mediante tinción inmunohistoquímica y transferencia de Western (Okamura et al. (2003), J. Clin. Endocrin. Metab. 88, 1374-1383).

Tal y como resultará obvio para la persona experta en el arte especializado de la técnica, la presente invención, no debe interpretarse como limitándose a la proteína PSE3 de longitud total de la SEQ. IND NO: 1 ó la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos fisiológicos o artificiales de la PSE3, las modificaciones secundarias de PSE3, así como las variantes alélicas de PSE3, se encuentran también abarcadas mediante la presente invención. Los fragmentos artificiales, abarcan, de una forma preferible, un péptido producido sintéticamente o mediante técnicas recombinantes, las cuales comprenden por lo menos un epítope de interés para diagnóstico, que consiste en por lo menos 6 aminoácidos contiguos, tal y como se deriva de la secuencia revelada en la SEQ ID NO: 1 ó la SEQ ID NO: 2. Tal tipo de fragmento, puede utilizarse, de una forma ventajosa, para la generación de anticuerpos, o como un patrón estándar, en un inmunoensayo. De una forma más preferible, el fragmento artificial, comprende por lo menos dos epítopes de interés, apropiados para establecer un inmunoensayo sándwich.

En formas preferidas de presentación, el nuevo marcador PSE3, puede utilizarse para propósitos de control, así como también para propósitos de rastreo.

Cuando se utiliza en el control de un paciente, el procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, puede ayudar en asistir en la carga de un tumor, en la eficacia del tratamiento y en la reaparición del tumor, en el seguimiento de los pacientes. Los niveles incrementados de PSE3, se correlacionan directamente con la carga temática de tumores. Después de la quimioterapia, un incremento a corto plazo de la PSE3 (de pocas horas a 14 días), puede servir como un indicador de la muerte de las células del tumor. En el seguimiento de los pacientes (de 3 meses a 10 años), puede utilizarse un incremento de la PSE3, como un indicador para la reaparición del tumor.

En una forma preferida de presentación, el procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, se utiliza para propósitos de rastreo. Es decir, éste se utiliza para asistir sujetos sin diagnosis previa de CRC, procediendo a medir el nivel de PSE3 y correlacionando el nivel medido, a la presencia o ausencia de CRC.

El cáncer colorrectal, progresa, de la forma más frecuente, a partir de adenomas (pólipos), a carcinomas malignos. Las diferentes etapas del CRC utilizadas para clasificarlos, en concordancia con el sistema de Duke, son las etapas A a D.

La clasificación de las etapas del cáncer, es la clasificación de la enfermedad, en términos de extensión, progresión y gravedad. Esta agrupa a los pacientes con cáncer, de tal forma que puede realizarse una generalización, a propósito de la prognosis y la elección de la terapia.

Hoy en día, el sistema TNM, es la clasificación más ampliamente utilizada, de la extensión anatómica del cáncer. Este representa un sistema uniforme de división en etapas, internacionalmente aceptado. Existen tres variables básicas: T (la extensión del tumor primario), N (el estatus de los nódulos o ganglios linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de metástasis distante). Los criterios de NTN, están publicados en la UICC (Internacional Union Aganist Cancer - [Unión Internacional Contra el Cáncer] -), Sobin, L.H. Wittekind, Ch (eds.): TNM Classification of Malignant Tumours, fifth edition 1997, - Clasificación TNM de tumores malignos, quinta edición, 1997.

Lo que es especialmente importante, es que, la diagnosis temprana del CRC, se traduce en un pronóstico mucho mejor. Los tumores malignos del colorrecto, surgen a partir de tumores benignos, es decir, de adenomas. Así, por lo tanto, la mejor prognosis, la tienen aquéllos pacientes diagnosticados en la etapa del adenoma. Los pacientes diagnosticados en una etapa tan temprana como la T_{is}, N0, M0 ó T1-3; N0; M0, si se tratan apropiadamente, tienen una probabilidad de más de un 90% de supervivencia, 5 años después de la diagnosis, si se compara con la correspondiente a una tasa de supervivencia de únicamente un 10%, para pacientes diagnosticados cuando se encuentran ya presentes metástasis distantes.

En el sentido de la presente invención, la diagnosis temprana del CRC, se refiere a una diagnosis en estado pre-maligno (adenoma) o en una etapa del tumor, en donde no se encuentran presentes metástasis, en absoluto (ni próxima ni distal), es decir, adenoma, T_{is}, N0, M0 ó T1-4; N0; M0. T_{is}, significa carcinoma "in situ".

En una forma preferida de presentación, se utiliza PSE3, para diagnosticar el CRC, tan tempranamente como en la etapa de adenoma.

Se prefiere adicionalmente el hecho de que, el CRC, se diagnostique cuando éste no haya crecido todavía, completamente a través de la pared del intestino y así, de este modo, que no se haya perforado el peritoneo visceral, ni tampoco se hayan invadido otros órganos o estructuras, es decir, que la diagnosis, se realice en la etapa T_{is}, N0, M0 ó T1-3; N0, M0 (= T_{is}-3; N0, M0).

El procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, se basa en una muestra líquida, la cual se deriva de un individuo. Distintamente a los procedimientos conocidos a raíz del arte especializado de la técnica, la PSE3, se mide específicamente, partiendo de esta muestra líquida, mediante la utilización de un agente de enlace específico.

Un agente de enlace específico es, por ejemplo, un receptor para PSE3, una lectina que se enlaza a la PSE3, o un anticuerpo a la PSE3. Un agente de enlace específico, tiene por lo menos una afinidad de 10^{7} l/mol, para su correspondiente molécula diana. El agente de enlace específico tiene, de una forma preferible, una afinidad de 10^{8} l/mol ó, incluso de una forma más preferida, una afinidad de 10^{9} l/mol, para su molécula diana. Tal y como apreciará la persona experta en el arte especializado de la técnica, el término específico, se utiliza para indicar el hecho de que, otras biomoléculas presentes en la muestra, no se enlazan, de una forma específica, con el agente específico para PSE3. De una forma preferible, el nivel de enlace a una biomolécula distinta de la molécula diana, tiene como resultado una afinidad de enlace, que es únicamente del 10%, de una forma más preferible, de únicamente el 5%, de la afinidad de la molécula diana, o menos. Un agente de enlace mayormente preferido, cumplirá con ambos criterios mínimos anteriormente citados, arriba, para la afinidad, así como también para la especificidad.

Un agente de enlace específico es, de una forma preferible, un anticuerpo reactivo con PSE3. El término anticuerpo, se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de tales tipos de anticuerpos, así como también a construcciones genéticas que comprenden el dominio de enlace de un anticuerpo.

Puede utilizarse cualquier fragmento que retenga el criterio anteriormente citado, arriba, de un agente de enlace específico. Los anticuerpos, se generan mediante el estado correspondiente al arte anterior de la técnica, por ejemplo, tal y como se describe en Tijssen (Tijseen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990), - Práctica y teoría de inmonoensayos enzimáticos 11 (1990), en el libro entero, especialmente, en las páginas 43-78; Elsevier, Amsterdam). Adicionalmente, además, el experto en el arte especializado de la técnica, está bien asesorado sobre los procedimientos basados en inmunosorbentes, los cuales pueden utilizarse para el aislamiento específico de anticuerpos. Mediante estos medios, puede mejorarse la calidad de los anticuerpos policlonales y, así, de este modo, sus prestaciones técnicas en inmunoensayos. (Tijssen, P., citado anteriormente, arriba, páginas 108-115).

Para las realizaciones como los que se dan a conocer en la presente invención, se utilizaron anticuerpos policlonales obtenidos en conejos. No obstante, pueden también utilizarse, claramente, anticuerpos policlonales procedentes de diferentes especies, como por ejemplo, ratas o conejillos de indias, así como también, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales. Puesto que, los anticuerpos monoclonales pueden producirse en cualquiera cantidad requerida, con propiedades constantes, éstos representan unas herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina clínica. La generación y el uso de anticuerpos monoclonales a la PSE3, en un procedimiento en concordancia con la presente invención, es todavía otra forma de presentación preferida de la presente invención.

Tal y como apreciará ahora la persona experta en el arte especializado de la técnica, el que la PSE3, haya sido identificada como un marcador, el cual es de utilidad en la diagnosis del CRC, posibilita que puedan utilizarse vías diferentes para alcanzar un resultado comparable a los logros de la presente invención. Así, por ejemplo, pueden utilizarse estrategias alternativas, para generar anticuerpos. Tales tipos de estrategias, comprenden, entre otras, el uso de péptidos sintéticos, que representen un epítope de PSE3 para la inmunización. De una forma alternativa, puede utilizarse la Inmunización de DNA, también conocida como vacunación de DNA.

Para la medición, la muestra líquida obtenida de un individuo, se incuba con un agente de enlace específico para la PSE3, bajo unas condiciones apropiadas, para la formación de un complejo de agente de enlace para PSE3. Tales tipos de condiciones, no necesitan especificarse, debido al hecho de que, la persona experta en el arte especializado de la técnica, puede identificar fácilmente tales tipos de condiciones apropiadas, sin ningún esfuerzo inventivo.

Como etapa final, en concordancia con el procedimiento dado a conocer en la presente invención, la cantidad de complejo, se mide y se correlaciona a la diagnosis del CRC. Tal como apreciará la persona experta en el arte especializado de la técnica, existen numerosos procedimientos, para medir la cantidad de complejo de agente de enlace específico para PSE3, todos ellos descritos en detalle en los libros de texto relevantes (de, por ejemplo, Tijssen P., citado anteriormente, arriba, o Diamandis et al., eds. (1996) Immunoassay, - Inmunoensayo -, Academia Press, Boston).

De una forma preferible, la PSE3, se detecta en una forma de ensayo del tipo sándwich. En tal tipo de ensayo, se utiliza un primer agente de ensayo específico, para capturar PSE3, en uno de los lados, y se utiliza un segundo agente de enlace específico, en otro de los lados, el cual se encuentra marcado para que sea directamente o indirectamente detectable.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, arriba, se ha encontrado, de una forma sorprendente, el hecho de que, la PSE3, puede medirse, a partir de una muestra líquida, obtenida de una muestra de un individuo. No se requiere ninguna muestra de tejido ni ninguna biopsia de la muestra, para aplicar el marcador de PSE3 en la diagnosis del CRC.

En una forma preferida de presentación, el procedimiento en concordancia con la presente invención, se practica con suero, como material de muestra líquido.

En una forma preferida de presentación adicional, el procedimiento en concordancia con la presente invención, se practica con plasma, con sangre entera, como material de muestra líquido.

Adicionalmente, además, puede asimismo procederse a preparar heces, en varias formas conocidas por parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica, para dar como resultado una muestra líquida. Tal tipo de muestra líquida derivada de las heces, representa, también, una forma preferida de presentación en concordancia con la presente invención.

Mientras que, la aplicación de procedimientos proteómicos de rutina, a las muestras de tejidos, conduce a la identificación de muchos candidatos de marcadores potenciales para el tejido seleccionado, los inventores de la presente invención, de una forma sorprendente, han sido capaces de detectar la proteína PSE3, en una muestra de fluido corporal. De una forma todavía más sorprendente, éstos han sido capaces de demostrar el hecho de que, la presencia de PSE3, en tal muestra líquida obtenida de un individuo, puede correlacionarse a la diagnosis de cáncer colorrec-
tal.

Los anticuerpos a la PSE3, pueden utilizarse, con gran ventaja, en procedimientos establecidos, como por ejemplo, para detectar células de cáncer colorrectal in situ, en biopsias, o en procedimientos inmunohistológicos.

De una forma preferible, un anticuerpo a la PSE3, se utiliza en un inmunoensayo cualitativo (PSE3 presente o ausente), o cuantitativo (en donde se determina la cantidad de PSE3).

La medición del nivel de proteína PSE3, ha sido comprobada como siendo muy ventajosa, en el sector del CRC. Así, por lo tanto, en una forma preferida de presentación adicional, la presente invención, se refiere al uso de proteína PSE3, como molécula marcadora, en la diagnosis de cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.

El término molécula marcadora, se utiliza para indicar el hecho de que, un nivel incrementado, en el analito PSE3, según se mide, a partir de un fluido corporal de un individuo, marca la presencia de CRC.

Se prefiere, de una forma especial, el utilizar el nuevo marcador PSE3, en la diagnosis temprana del cáncer colorrectal.

El uso de proteína PSE3, en sí mismo, representa un significativo progreso en el desafiante sector de la diagnosis de CRC. La combinación de mediciones de de PSE3, con otros marcadores conocidos, como el CEA, o con otros marcadores de CRC, a ser todavía descubiertos, conduce a mejoras adicionales. Así, por lo tanto, en una forma preferida adicional de presentación, la presente invención, se refiere al uso de PSE3, como molécula marcadora para cáncer colorrectal, en combinación con una o más moléculas marcadoras para cáncer colorrectal, en la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida, obtenida de un individuo. En este sentido, la expresión "una o más", denota 1 a 10, de una forma preferible, 1 a 5, de una forma más preferible, 3. Los otros marcadores de CRC preferidos seleccionados, con los cuales pueden combinarse las mediciones de PSE3, son CEA, CA 19-9, CA 72-4, y/o CA 242. Así, de este modo, una forma de presentación muy preferida de la presente invención, es el uso de la proteína PSE3, como una molécula marcadora, para el cáncer colorrectal, en combinación con una o más moléculas marcadoras para el cáncer colorrectal, en la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un paciente, a cuyo efecto, por lo menos, el otro marcador, se selecciona de entre el grupo consistente en CEA, CA 19-19, CA 72-4, y CA 242. De una forma muy preferida, el marcador PSE3, se utiliza en combinación con CEA.

Los reactivos de diagnóstico, en el sector de los ensayos de enlace específicos, como los inmunoensayos, usualmente, se proporcionan en forma de equipos, a modo de "kit", los cuales comprenden el agente de enlace específico y los reactivos auxiliares requeridos para realizar el ensayo.

La exactitud de un test de ensayo, se describe, de la mejor forma, mediante sus características operativas del receptor (ROC - (del inglés, reciver - operating characteristics)-)(véase, especialmente, Zweig, M. H. y Campbell, G., Clin. Chem 39 (1993) 561-577). El gráfico ROC, es un registro gráfico de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes, a partir de la variación continua del umbral de decisión sobre la gama entera de datos observados.

Las prestaciones técnicas de la realización de un test de ensayo de laboratorio, dependen de la exactitud de la diagnosis, o la capacidad para clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La exactitud de diagnóstico, mide la capacidad del test de ensayo, para distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Tales tipos de condiciones son, por ejemplo, la salud y la enfermedad ó enfermedad benigna versus enfermedad maligna.

En cada caso, el registro gráfico ROC, representa el solapado entre las dos distribuciones, procediendo a hacer un registro gráfico de la sensibilidad versus 1 - especificidad, para la gama completa de umbrales de decisión. En el eje y, se encuentra la sensibilidad, o la fracción positivo cierto [definida como (número de resultados de tests de ensayo positivos ciertos)(número de tests de ensayo positivos ciertos + número de tests de ensayo falsos negativos)]. A esto se le ha hecho también referencia como positividad, en presencia de una enfermedad o trastorno. Ésta, se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x, se encuentra la fracción falso negativo, ó 1 - especificidad [definida como (número de resultados falsos positivos)/(número de resultados de negativos ciertos + número de resultados de falsos positivos)]. Éste, es un índice de especificidad y se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado. Puesto que, las fracciones de positivos ciertos y de falsos positivos, se calculan enteramente por separado, mediante la utilización de estos tests de ensayo, procedentes de dos subgrupos diferentes, el registro gráfico ROC, es independiente del predominio de la enfermedad en la muestra. Cada punto del registro gráfico ROC, representa un par sensibilidad/-especificidad, correspondiente a un umbral de decisión particular. Un test de ensayo con una discriminación perfecta (sin solapado en las dos distribuciones de resultados), tiene un registro gráfico ROC, que pasa a través de la esquina superior izquierda, en donde, la fracción positivo cierto, es 1,0 ó 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción falso positivo, es 0 (especificidad perfecta). El registro gráfico perfecto para un test de ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados, para los dos grupos), es una línea diagonal de 45º, desde la esquina inferior izquierda a la esquina superior derecha. La mayoría de los registros gráficos, se encuentran entre estos dos extremos (si el registro gráfico ROC se encuentra completamente por debajo de la línea en diagonal de 45º, esto se remedia fácilmente mediante la inversión del criterio para "positividad", de "mayor de" a "menos de", o viceversa). De una forma cualitativa, cuanto más cercano se encuentra el registro gráfico, con respecto a la esquina superior izquierda, mayor es la exactitud total del test de ensayo.

Un objetivo conveniente para cuantificar la exactitud de diagnóstico, en un test de ensayo de laboratorio, es el consistente en expresar sus prestaciones técnicas, mediante un número individual. La medida global más usual, es la correspondiente al área que se encuentra bajo el registro gráfico ROC. Por convención, esta área, es siempre \geq 0,5 (si no lo es, pueden invertirse las reglas de decisión, para que así sea). Los valores, se encuentran comprendidos dentro de unos márgenes situados entre 1,0 (separación perfecta de los valores de test de ensayo de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia aparente de la distribución entre los dos grupos de valores de test de ensayo). Esta área, no depende únicamente de una porción particular del registro gráfico, tal como el punto más cercano a la diagonal, o la sensibilidad a un 90% de especificidad, sino del registro gráfico entero. Éste es una expresión descriptiva, cuantitativa, de cuan cercano es el registro gráfico ROC, al perfecto (área = 1,0).

Se ha procedido a valorar la utilidad clínica del nuevo marcador PSE3, en comparación con el marcador establecido CEA, y en combinación con éste, utilizando un análisis de la curva operador receptor (ROC); Zweig, M. H. y Campbell, G. Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). Este análisis, se ha basado en cohortes de pacientes bien conocidos, consistentes en 50 muestras, cada una, de pacientes en T1-3; N0, M0, tumor más progresado, es decir, T4 y/o varias gravedades de metástasis (N+ y/o M+), y controles sanos, respectivamente, ha sido valorada.

Los ejemplos, referencias, listados de secuencias y figuras que se facilitan a continuación, se proporcionan para ayudar en la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance, se expone en las reivindicaciones adjuntas.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de las figuras

Figura 1

Identificación de PSE3, con un MW aparente de aproximadamente 30 kDa, y un punto isoeléctrico de aproximadamente pH 5,5 (mayor), en tejido tumoral del colon. La figura 1, muestra un ejemplo típico de un gel 2D, cargado con una muestra de tumor (lado izquierdo), y un gel, cargado con una muestra de control emparejada (lado derecho), obtenida de mucosa contigua sana. El círculo, en la sección ampliada, de estos geles, indica la posición para la proteína PSE3. Esta proteína, no era detectable, mediante el mismo procedimiento, en mucosa sana. El punto (mancha) indicado, se encuentra obviamente presente en el control, en la misma extensión que en tejido tumoral. Esto es debido al hecho de que, la PSE3, se indica siempre en el mismo punto (mancha) que la ANX4 (anexina4), en tejidos tumorales. El MW y pI de la PSE3 (variante de corte y empalme 2) (31 kD/5,79) y ANX4 (35 kDa/5,85), son muy similares, explicando esta co-migración aparente. La PSE3, nunca se identificó en este punto (mancha), ni en ningún otro punto, en geles de control, sino que se expresaba exclusivamente en tejido tumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 2

Ejemplo típico de una transferencia de Western. Se procedió a cargar un gel de poliacrilamida, con lisados de tejido procedentes de tejido de tumor colorrectal, y con tejidos de control contiguos, sanos, procedentes de 4 pacientes (sujeto 34: colon ca (carcinoma), Dukes B; sujeto 36; rectum ca, Dukes B; sujeto 37: rectum ca, Dukes A; y sujeto 39; colon ca, Dukes A) y, después de electroforesis, las proteínas, se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Se procedió a someter a test de ensayo, la presencia de PSE3, en las muestras, utilizando un suero anti-PSE3 de conejo, policlonal. Las franjas o líneas que contienen lisados tumorales, se indican con "T", y las franjas que contienen tejido de control, normal, se indican con "N". La flecha, indica la posición en el gel, de la banda de PSE3. Todas las muestras del tumor, proporcionaron una señal fuerte, en la posición de PSE3, mientras que, únicamente puede detectarse una débil señal, en los lisados procedentes de tejido de control, normal, contiguo.

\newpage

Abreviaciones

ABTS

Sal diamónica de 2,2'-azino-di-[3-etilbenzo-tiazolinsulfonato (6)]

BSA

Albúmina de suero bovino

cDNA

DNA complementario

CHAPS

(3-[3-(colamidopropil)-dimetilamonio]-1-pro-panosulfonato)

DMSO

Dimetilsulfóxido

DTT

Ditiotreitol

EDTA

Acido etilen-diaminotetraacético

ELISA

Ensayo inmunosorbente ligado a una encima

HPR

Peroxidasa del rábano picante

IAA

Yodoacetamida

IgG

Inmunoglobulina G

IEF

Focalización isoeléctrica

IPG

Gradiente pH inmovilizado

LDS

Dodecilsulfato de litio

MALDI-TOF

Espectrometría de masa con tiempo de fuga de desorción/ionización por láser, asistido mediante matriz

MES

Mesitil,2,4,6-trimetilfenilo

OD

Densidad óptica

PAGE

Electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS

Suero salino tamponado con fosfato

PI

Punto isoeléctrico

RTS

Sistema de traducción rápida

SDS

Dodecilsulfato de sodio

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Identificación de PSE3, como un marcador potencial de cáncer colorrectal Fuentes de tejido

Con objeto de identificar proteínas específicas de tumores, como marcadores potenciales de diagnóstico, para el cáncer colorrectal, se procede a realizar análisis de tres diferentes clases de tejido, utilizando procedimientos proteómicos.

En total, se procede a analizar espécimen de tejido procedente de 10 pacientes que sufren de cáncer colorrectal. Se procede a recolectar tres diferentes tipos de tejido, de cada paciente, procedente de resecciones terapéuticas: tejido tumoral (> 80% tumor) (T), tejido sano contiguo o adyacente (N), y mucosa retirada de la mucosa sana contigua (M). Los dos últimos tipos de tejidos, sirven como ejemplos de control, sanos, emparejados. Los tejidos, se congelan inmediatamente en breve tiempo, después de la resección, y se almacenan a una temperatura de -80ºC, antes de procesarlos. Los tumores, se diagnostican mediante criterios histopatológicos.

Preparación del tejido

Se procede a colocar 0,8-1,2 g de tejido, en un mortero, y se congela completamente, mediante nitrógeno líquido. El tejido, se pulveriza en el mortero, se disuelve en el volumen 10 veces más grande (peso/volumen) de tampón de lisis (40 mM citrato de Na, 5 mM MgCl_{2}, 1% Genapol X-080, 0,02% Azida de Na, Complete® exento de EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. Nº 1 873 580] y, subsiguientemente, se homogeneiza en un homogeneizador de vidrio del tipo Wheaton® (20 x carga suelta, 20 x carga apretada). Se procede a someter 3 ml del homogeneizado, a centrifugación por densidad de sucrosa (10-60% de sucrosa), durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a 4.500 x g. Después de esta etapa de centrifugación, se obtienen tres fracciones. La fracción en la parte superior del gradiente, contiene las proteínas solubles, para análisis posterior.

Focalización isoeléctrica (IEF) y SDS-PAGE

Para la IEF, se procede a mezclar 3 ml de suspensión, con 12 ml de tampón de muestra (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 0,4% tampón de IPG pH 4-7, 0,5% DTT) y a incubar, durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Las muestras, se concentran en un dispositivo del tipo Amicon® Ultra-15 divice (Millipore GmbH, Schwallbach, Alemania), y la concentración de proteínas, se determina utilizando el ensayo de proteínas de Bio-Rad® (Cat. nº 500-0006; Bio-Rad Laboratorios GMBH, Manchen, Alemania), siguiendo las instrucciones del manual del proveedor. A un volumen correspondiente a 1,5 mg de proteína, se le añade tampón de muestra, hasta un volumen final de 350 \mum. Esta solución, se utiliza para rehidratar tiras de IPG pH 4-7 (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania), durante el transcurso de toda la noche. La realización de la IEF, se lleva a cabo utilizando el siguiente protocolo de gradientes: 1.) 1 minuto a 500 V; 2.) 2 horas a 3.500 V; 3.) 22 horas a 3.500 V, constantes, dando lugar a 82 kVh. Después de la IEF, las tiras, se almacenan a una temperatura de -80ºC, o se utilizan directamente para SDS-PAGE.

Previamente a la SDS-PAGE, las tiras, se incuban en tampón de equilibrio (6 M urea, 50 mM Tris/HCl), pH 8,8, 30% glicerol, 2% SDS), y para la reducción, se añade DDT (15 min, + 50 mg DTT/10 ml), y para la alquilación, se añade IAA (15 min - 235 mg yodoacetamida/10 ml). Las tiras, se colocan sobre geles de poliacrilamida al 12,5%, y se someten a electroforesis, a 1 W/gel, durante un transcurso de tiempo de 1 hora y, a continuación, a 17 W/gel. Subsiguientemente, los geles, se fijan (50% metanol, 10% acetato), y se someten a tinción, durante el transcurso de toda la noche, con un equipo de tinción coloidal, azul, a modo de kit, del tipo Novex® Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karslruhe, Alemania, Cat nº LC6025, 45 7101).

Detección de la PSE3, con un marcador potencial para el cáncer colorrectal

Se procede a analizar cada paciente, separadamente, mediante análisis de formación de imágenes, con un sistema de software informático del tipo ProteomeWeaver® (Definiens AG, Alemania, Munich). Adicionalmente, además, todos los puntos o manchas de gel, se suprimen, mediante un robot de recolección y, las proteínas presentes en los puntos o manchas, se identifican mediante espectrometría de masa MALDI-TOF (Ultraflex® Tof/Tof, Broker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). Para cada paciente, se procede a comparar 4 geles procedentes de la muestra del tumor, con 4 geles, cada uno de ellos procedentes de tejido de mucosa normal, y contiguo, extraído, y se analizaron en cuanto a lo referente a los puntos o manchas distintivas correspondientes a proteínas diferencialmente expresadas. Mediante estos medios, se encuentra que, la proteína PSE3, está específicamente expresada o fuertemente sobreexpresada, en tejido tumoral, y no es detectable, o está expresada de una forma menos fuerte, en tejido de control sano. Así, por lo tanto, ésta se cualifica - entre muchas otras proteínas - como un marcador candidato para su uso en la diagnosis de cáncer colorrectal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos a la proteína marcadora de cáncer colorrectal, PSE3

Se genera anticuerpo policlonal para la proteína PSE3 de cáncer colorrectal, para el uso adicional de un anticuerpo, en la medición de los niveles de PSE3, en suero y plasma y sangre, mediante ensayos de inmunodetección, por ejemplo, de Transferencia Western y ELISA.

Expresión de proteína, recombinante, en E. coli

Con objeto de generar anticuerpos a PSE3, se procede a realizar expresión recombinante de la proteína, para la obtención de inmunógenos. La expresión, se realiza aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En una primera etapa, la secuencia de DNA, se analiza, y se obtienen recomendaciones para la un alto rendimiento productivo de variantes mutacionales silenciosas de canal, y las respectivas secuencias de cebadores de PCR, utilizando el sistema de "ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio comercial basado en una web informática de Internet (www.proteoexpert.com). Utilizando los pares de cebadores recomendados, se usa el sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. nº 3186237), para generar moldes de PCR lineales, a partir de cDNA, y para la transcripción y expresión in-vitro de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína PSE3. Para la detección de Transferencia de Western, y purificación posterior, la proteína expresada, contiene un His-tag. La mejor variante expresante, se identifica. Todas las etapas, desde la PCR hasta la expresión y detección, se llevan a cabo en concordancia con las instrucciones del fabricante. El respectivo producto de PCR, que contiene todas las regiones reguladoras de T7 necesarias, (promotor, sitio de enlace ribosómico, y terminador de T7), se clonan en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Cat. nº K 43001/01), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión, utilizando las secuencias reguladoras de T7, la construcción, se transforma en E. coli BL 21 (DE 3)(Studier, F.W., et al., Methods Ezymol. 185 (1990) 60-89) y, las bacterias transformadas, se cultivan en 1 l de batch (lote) para la expresión de proteínas.

La purificación de la proteína de fusión His-PSE3, se realiza siguiendo procedimientos Standard, en una columna de quelato de Ni. En resumen, se procede a granular, mediante centrifugación, 1 l de cultivo de bacterias que contiene el vector de expresión para la proteína de fusión His-PSE3. El gránulo celular, se suspende de nuevo en tampón de lisis, que contiene fosfato, pH 8,0, 7 M cloruro de guanidio, imidazol y tioglicerol, seguido de homogeneización, utilizando Ultra-Turrax®. Se procede a granular el material insoluble, mediante centrifugación a alta velocidad y, el sobrenadante, se aplica a una columna cromatográfica de quelato de Ni. La columna, se lava con varios volúmenes de lecho de tampón de lisis, mediante lavados con tampón, que contiene fosfato, pH 8,0 y urea. Finalmente, se procede a eluir el antígeno ligado, utilizando un tampón fosfato, que contiene SDS, bajo condiciones ácidas.

Producción de anticuerpos monoclonales contra la PSE3 a) Inmunización de ratones

Se procede, inicialmente, a inmunizar, intra-peritonealmente, ratones A/J de 12 semanas de edad, con 10 \mug de PSE3. Esto viene seguido, después de un transcurso de tiempo de 6 semanas, de dos inmunizaciones intraperitoneales, a intervalos mensuales. En este proceso, a cada ratón, se le administran 100 \mug de PSE3, adsorbidos en hidróxido de aluminio, y 10^{9} gramos de Bordetella pertussis. Subsiguientemente, las dos últimas inmunizaciones, se llevan a cabo por vía intravenosa, en el 3^{er.} y 2º día antes de la infusión, utilizando 100 \mug de PSE3, en tampón de PBS, para cada una.

b) Fusión y clonación

Células del bazo, de los ratones inmunizados en concordancia con a), se fusionan con células de mieloma, en concordancia con Galfre, Gl, y Milstain, C, Methods in Ezymology, - Procedimientos en enzimología -, 73 (1981) 3-46. En el proceso correspondiente a este procedimiento, se procede a mezclar aproximadamente 1*10^{8} células del bazo del ratón inmunizado, con 2x10^{7} células de mieloma (P3X63Ag(-653, ATCC CRL1580), y se centrifugan (10 minutos, a 300 x g, y a una temperatura de 4ºC). A continuación, se procede a lavar las células, una vez, con medios RPMI 1640, sin suero de ternero fetal (FCS) y se centrifugan otra vez, a 400 x g, en un tubo cónico, de 50 ml. El sobrenadante, se deshecha, el sedimento de células, se suelta suavemente mediante golpecitos, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 400, Merck, Darmstad) y se mezcla mediante pipeta. Después de un transcurso de tiempo de 1 minuto, en un baño de agua, a una temperatura de 37ºC, se procede a añadir 5 ml de RPMI 1640, sin FCS, mediante procedimiento de goteo, a la temperatura ambiente, en un transcurso de tiempo de 4-5 minutos. A continuación de ello, se procede a añadir 5 ml de RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS, por procedimiento de goteo, en un transcurso de tiempo de aproximadamente 1 minuto, se mezcla íntimamente PDX, se llena a 50 ml con medio (RPMI 1640 + 10% FCS) y, a continuación, se centrifuga, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a 400 x g, y a una temperatura de 4ºC. Las células sedimentadas, se recogen en medio RPM 1640, que contiene un 10% de FCS, y se siembran en un medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmol/l hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% FCS). Se procede a añadir interleucina 6, a 100 U/ml, al medio, como factor de crecimiento.

Después de un transcurso de tiempo de 10 días, los cultivos primarios, se someten a test de ensayo, para anticuerpo específico. Los cultivos primarios PSE3-positivos, se clonan en placas de cultivo de 96 hoyos, por mediación de un clasificador de células activado mediante fluorescencia. En este proceso, se añade interleucina 6, otra vez, a 100 U /ml, al medio, como factor de crecimiento.

c) Aislamiento de inmunoglobulina a partir de sobrenadantes del cultivo de células

Las células de hibridoma obtenidas, se siembran a una densidad de 1 x 10^{5} células por ml, en medio de cultivo RPMI 1640, que contiene un 10% de FCS, y proliferan durante un transcurso de tiempo de 7 días, en un fermentador (Thermodux Co, Wetheim/Main, Modelo MCS-104XL, nº de pedido 144-050). Se obtienen, de media, en el cultivo de sobrenadante, concentraciones de 100 \mug de anticuerpo monoclonal por ml. La purificación de este anticuerpo, a partir del cultivo del sobrenadante, se lleva a cabo mediante medios convencionales en la química de la proteínas (por ejemplo, según Bruck C., et al., Methods in Enzymology, - Procedimientos en enzimología -, 121 (1986) 587-695).

Generación de anticuerpos policlonales a) Inmunización

Para la inmunización, se procede a preparar una emulsión fresca de solución de proteína (100 \mug/ml de proteína PSE3), y adyuvante de Freund, completo, a un valor de relación de 1:1. Cada conejo, se inmuniza con un 1 ml de la emulsión, en los días 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrae sangre y, el suero anti-PSE3 resultante, se utiliza para experimentos adicionales, tal y como se describen en los ejemplos 3 y 4.

b) Purificación de igG (inmunoglobulina G) a partir de suero de conejo, mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico

Se procede a diluir un volumen de suero de conejo, con 4 volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). El pH, se ajusta a un valor de 4,5, con base Tris 2M. Se añade ácido caprílico (25 \mul/ml de muestra diluida), por procedimiento de goteo, bajo una agitación vigorosa. Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, la muestra, se centrifuga (13.000xg, 30 minutos, 4ºC), se deshecha el gránulo, y se recolecta el sobrenadante. El pH del sobrenadante, se ajusta a un valor de 7,5, mediante la adición de base Tris 2M, y se filtra (0,2 \mum).

La inmunoglobulina en el sobrenadante, se precipita bajo la acción de una agitación vigorosa, mediante adición por procedimiento de goteo, de una solución de sulfato amónico 4 M, a una concentración final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas, se recolectan, mediante centrifugación (8.000xg, 15 minutos, 4ºC).

Se deshecha el sobrenadante. El gránulo, se disuelve en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl, y se dializa de una forma exhaustiva. El dializado, se centrifuga (13.000xg, 15 minutos, 4ºC), y se filtra (0,2 \mum).

Biotinilación de IgG del conejo

Se procede a llevar IgG policlonal del conejo, a 10 mg/ml, en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl. Se procede a añadir, por ml de solución de IgG, 50 \mul de Biotin-N-hidroxisuccinamida (3,6 mg/ml en DMSO). Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, la muestra, se cromatografía sobre Superdex 200 (10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). La fracción que contiene igG biotinilizada, se recolecta. Los anticuerpos monoclonales, se biotinilizan en concordancia con el mismo procedimiento.

Digoxigenilación de IgG del conejo

Se procede a llevar IgG policlonal del conejo, a 10 mg/ml, en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl.
Se procede a añadir, por ml de solución de IgG, 50 \mul de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocapróico (Roche Diagnostis, Mannheim, Alemania, Cat. nº 1 333 054) (3,8 mg/ml en
DMSO). Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, la muestra, se cromatografía sobre Superdex 200 (10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). La fracción que contiene igG digoxigenilizada, se recolecta. Los anticuerpos monoclonales, se marcan con digoxigenina, en concordancia con el mismo
procedimiento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Transferencia Western, para la detección de PSE3, en tejido de cáncer colorrectal humano, utilizando anticuerpo policlonal, tal y como se ha generado en el ejemplo 2

Se procede a preparar lisados de tejido, a partir de muestras de tumores, y muestras de control sanas, tal y como se describe en el ejemplo 1, "Preparación del tejido".

Se procede a realizar SDS-PAGE y transferencia Western, utilizando reactivos y equipamiento de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Para cada muestra de tejido sometida a test de ensayo, se procede a diluir 10 \mug de lisado de tejido, en tampón de muestra en SDS de NuPAGE® de reducción (Invitrogen) y se calienta, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95ºC. Las muestras, se ensayan sobre geles de NuPAGE® al 4-12% (Tris-glicina), en el sistema de tampón de ensayo de MES. La mezcla de proteína separada en gel, se transfiere, sobre membranas de microcelulosa, utilizando el módulo de transferencia del tipo Invitrogen XCEll II® Blot Module (Invitrogen), y el sistema de tampón de transferencia de NuPAGE®. Las membranas, se lavan 3 veces, en PBS/0,05% Tween-20 y se bloquean con tampón de bloqueo Roti®Block (A141.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania), durante un transcurso de tiempo de 2 horas. El anticuerpo primario, suero anti-PSE3 de conejo, policlonal (generación descrita en el ejemplo 2), se diluye a 1:10.000 en tampón de bloqueo Roti®-Block,y se incuba con la membrana, durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Las membranas, se lavan 6 veces, en PBS/0,05% Tween-20. El anticuerpo primario de conejo, específicamente enlazado, se marca con un anticuerpo anti-IgG de conejo, policlonal, de oveja, diluido a 10 mU/ml, en 0,5 x tampón de bloqueo Roti®-Block. Después de la incubación, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, las membranas, se lavan 6 veces en PBS/0,05% Tween-20. Para la detección del anticuerpo anti-conejo POD-conjugado, la membrana, se incuba con el Substrato de transferencia Western Lumi-Light^{PLUS} (Nº de pedido, 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), y se expone a una película anti-radiográfica.

Los resultados de un experimento típico, se muestran en la figura 2. La sobreexpresión fuerte de la PSE3, en tejido tumoral versus tejido contiguo, de control, se encuentra, en 15 sujetos, de entre 16, con cáncer colorrectal, que han sido sometidos a test de ensayo.

\newpage

Ejemplo 4 ELISA para la medición del PSE3, en suero y plasma humano

Para la detección de PSE3 en suero humano o plasma, se desarrollo un ELISA sándwich. Para la captura y detección del antígeno, se procede a conjugar alícuotos del anticuerpo policlonal anti-PSE3 (véase el ejemplo 2), con biotina y digoxigenina, respectivamente.

Se procede a incubar placas de microtítulo, con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-PSE3 biotinilado, durante un transcurso de tiempo de 60 minutos, a 10 \mug/ml, en 10 mM fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween-20. Después de la incubación, las placas, se lavan tres veces con 0,9% NaCl, 0,1% Tween-20. Se procede, a continuación, a incubar los hoyos, durante un transcurso de tiempo de 2 horas, con, bien ya sea una dilución en serie de la proteína recombinante (véase el ejemplo 2), como antígeno standard, o bien ya sea con muestras de plasma diluido, procedente de los pacientes. Para la detección específica del PSE3 enlazado, los hoyos, se incuban con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-PSE3, digoxigenilado, durante un transcurso de tiempo de 60 minutos, a 10 \mug/ml en 10 mM fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween-20. A continuación, las placas, se lavan tres veces, para eliminar anticuerpo no enlazado. En una siguiente etapa, los hoyos, se incuban con 20 mU/ml de conjugados de anti-digoxigenin-POD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catálogo nº 1633716), durante un transcurso de tiempo de 60 minutos, en 10 mM fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween-20. A continuación, las placas, se lavan tres veces, con el mismo tampón. Para la detección de complejos de antígeno-anticuerpo, los hoyos, se incuban con 100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catálogo nº 11685767), y se procede a medir la OD, después de un transcurso de tiempo de 30-60 minutos, a 405 nm, con un lector de ELISA.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Análisis de ROC para valorar la utilidad clínica, en términos de precisión de diagnóstico

La precisión, se valora procediendo a analizar muestras líquidas individuales obtenidas de cohortes de pacientes bien caracterizados, por ejemplo, 50 pacientes que hayan experimentado colonoscopia y que hayan sido encontrados como encontrándose exentos de adenoma o CRC, 50 pacientes diagnosticados y clasificados como encontrándose en la etapa T1-3, N0, M0 de CRC, y 50 pacientes diagnosticados con CRC progresado, que tienen por lo menos infiltración del tumor, en por lo menos un ganglio linfático próximo, o formas más graves de metástasis, respectivamente. El CEA, se mide mediante un ensayo comercialmente disponible en el mercado (CEA Roche Diagnostics CEA-assay (Cat. nº 1 173 1629 para analizador de inmunoensayo del tipo Elecsys® Systems immunoassay analyzer) y el PSE3, se mide tal y como se describe anteriormente, arriba, y se cuantifica en un suero obtenido de cada uno de estos individuos. El análisis de ROC, se, se realiza en concordancia con Zweig, M. H., y Cambpell, citados anteriormente, arriba. Se procede a calcular la potencia discriminatoria para diferentes pacientes, en el grupo T_{is}-3, N0, M0 procedente de individuos sanos, para la combinación de PSE3 con marcador CEA establecido, mediante análisis discriminatorio regularizado (Friedman, J. H., Regularized Discriminant Analysis, - Regularizad Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175).

Los datos preliminares, indican el hecho de que, la PSE3, puede también ser de mucha ayuda en el seguimiento de los pacientes, después de la cirugía.

\vskip1.000000\baselineskip

Lista de referencias

Ahlquist, D. A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55

Anderson, W. F., et al., J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133

Bochtler et al. (1999), Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 295-317

Bruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1988) 587-695

Brünagel, G., et al, Cancer Research 62 (2002) 2437-2442

Carriquiry, L. A., and Pineyro, A. Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929

Coux et al. (1996), Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847

Diamandis, et al., eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston.

Friedman, J. H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175

Galfre G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46

Geenen, J.E., et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235

Goldenberg, D. M., et al, J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22

Herrera, MA, et al, Ann. Surg. 183 (1976) 5-9

Kandil et al. (1997), Immunogenetics 46, 337-344

Martell, R. E., et al., Int. J. Blot Markers 13 (1998) 145-149

Moertel, C.G., et al., JAMA 270 (1993) 943-947

Nikaido et al. (1990), Clin. Exp. Immunol. 79, 209-214

Okamura et al. (2003), J. Clin. Endocrin. Metab. 88, 1374-1383

Realini et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 25483-25492

Reynosa, G., et al., JAMA 220 (1972) 361-365

Rock and Goldberg (1999), Annu. Rev. Immunol. 17, 739-779

Silvis, S. E., et al., JAMA 235 (1976) 928-930

Sobin, L. H., Wittekind, Ch. (eds), TNM Classification of Malignant Tumours, fifth edition, 1997

Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89

Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48 (2002) 1151-1159

Tanahashi et al. (1997), Genes Cells 2, 195-211

Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990) the whole book, especially pages 43-78; Elsevier, Amsterdam

UICC (International union Against Cancer), Sobin, L. H., Wittekind, Ch. (eds), TNM Classification of Malignant Tumours, fifth edition, 1997

Wanebo, H. J., et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451

WO 01/96390

WO 02/078636

Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577

<110> Roche Diagnostics GmbH

\hskip1cm

F. Hoffmann-La Roche AG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Uso de proteína PSE3, como marcador para cáncer colorrectal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 21882

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 03017582.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-08-08

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> subunidad 3 de activador de proteasoma, isoforma

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

Claims (9)

1. Procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal (CRC), que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra líquida, obtenida de un individuo,

b) contactar la citada muestra, con un agente de enlace específico para la subunidad 3 activadora de preoteasoma (PSE3), bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace y la PSE3, y

c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b), a la diagnosis de cáncer colorrectal.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente por el hecho de que, la citada muestra, es suero.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente por el hecho de que, la citada muestra, es plasma.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente por el hecho de que, la citada muestra, es sangre entera.

5. Uso de proteína PSE3, como una molécula marcadora, en la diagnosis de cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.

6. Uso de proteína PSE3, como una molécula marcadora, en la diagnosis temprana de cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.

7. Uso, según la reivindicación 6, en donde, la diagnosis temprana, se realiza con una muestra derivada de pacientes de CRC, en la etapa de adenoma.

8. Uso, según la reivindicación 6, en donde, la diagnosis temprana, se realiza con una muestra derivada de pacientes de CRC, en la etapa T_{is}-3; N0, M0.

9. Uso de proteína PSE3, como marcador de cáncer colorrectal, en combinación con otra molécula marcadora para cáncer colorrectal, en la diagnosis de cáncer colorrectal, a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.