ES2367412T3

ES2367412T3 - Uso de la proteína satb2 como marcador para distinguir el cáncer colorrectal de otros cánceres.

Info

Publication number: ES2367412T3
Application number: ES10158956T
Authority: ES
Inventors: Mathias Uhlén; Fredrik Pontén
Original assignee: Atlas Antibodies AB
Current assignee: Atlas Antibodies AB
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2011-11-03
Anticipated expiration: 2027-06-04
Also published as: DK2211180T3; JP2012073260A; AU2007256391B2; US8465934B2; CN103293307B; JP2009539082A; EP2024747B1; EP2211180B1; JP4990970B2; US20090220975A1; US8241859B2; US20120028836A1; DK2024747T3; EP1862803A1; AU2007256391A1; CN103293307A; ATE514090T1; CA2653952A1; EP2024747A1; US8067190B2

Abstract

Un método in vitro para detectar si una metástasis de origen desconocido se origina de un cáncer colorrectal, detectando la presencia de la proteína SATB

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico del cáncer. En particular, proporciona un medio nuevo para su uso en la detección y en la caracterización del cáncer colorrectal, a través de la identificación de la proteína SATB2 como marcador para este tipo de cáncer.

Antecedentes de la invención

SATB2

El gen que codifica la proteína 2 de unión a la secuencia rica en AT especial (SATB2) se identificó en 1999 durante un esfuerzo masivo por secuenciar el genoma humano (Kikuno R. et al. (1999), DNA Res., 6:197-205). Desde entonces, se ha considerado que el gen SATB2 se expresa principalmente en tejido neuronal.

El SATB2 es un factor de la transcripción que forma parte de la matriz nuclear y orquesta la expresión génica de una manera específica de tejido mediante la regulación de la estructura de cromatina de orden elevado a través de la interacción con secuencias ricas en AT, también denominadas regiones de unión a la matriz (MAR) (Dickinson L.A. et al. (1992), Cell, 70, 631-645; FitzPatrick D.R. et al. (2003), Hum. Mol. Genet., 12, 2491-5C1; Yasui D. (2002), Nature, 419, 641-645; Bode J. (2000), Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr., 10, 73-90).

Los estudios del gen y su producto de proteína, la proteína SATB2, apuntan hacia su implicación en la regulación de la expresión génica como factor de transcripción en tejido neuronal (Dobreva G. et al. (2003), Genes Dev., 17:30483061; Britanova O. et al. (2005), Eur. J. Neurosci., 21:658-668). También se ha indicado que el gen SATB2 desempeña un papel en el desarrollo del paladar y en la fisura del paladar (FitzPatrick D.R. et al. (2003), Human Mol. Genet., 12:2491-2501; van Buggenhout G. et al. (2005), Eur. J. Med. Genet., 48:276-289).

Salahsor et al. han estudiado un paciente con una mutación en el gen de poliopsis coli adenomatosa (APC) (Salahshor et al. (2005), BMC Cancer, 5:66). Los pacientes con APC desarrollan una cantidad anómala de adenomas colónicos en la juventud que finalmente, si no se tratan, avanzan hasta el cáncer colorrectal. El perfil de expresión génica global reveló que un grupo de 84 genes, incluyendo SATB2, tiene una expresión significativamente alterada en adenomas comparado con la mucosa normal. Se descubrió que SATB2 estaba significativamente infrarregulado pero no se seleccionó para posteriores análisis. Un estudio de perfiles de expresión reciente del cáncer colorrectal en Int. J. Cancer indico, de forma similar, un estado de expresión alterado para SATB2 al nivel de ARNm (Groene J. et al. (2006), Int. J. Cancer, 119, 1829-1836).

Las publicaciones PCT WO 03/022126 y WO 2006/015742 describen otros estudios similares dirigidos a determinar el perfil de expresión de células del cáncer. Se analiza la expresión de multitud de genes, incluyendo SATB2, y se extraen conclusiones de los patrones de expresión globales.

De manera importante, estos estudios mencionados anteriormente no proporcionan sugerencias acerca del uso de la proteína SATB2 como marcador colorrectal específico, ni del uso de SATB2 como herramienta de prognóstico para el cáncer colorrectal.

Cáncer

El cáncer es una de las causas más comunes de enfermedad y muerte en el mundo occidental. En general, las tasas de incidencia aumentan con la edad para la mayoría de las formas de cáncer. A medida que las poblaciones humanas sigan viviendo durante más tiempo, debido al aumento en el estado de salud general, el cáncer afectará a un número cada vez mayor de individuos. La causa de los tipos de cáncer más comunes aún es en general desconocida, aunque hay un cuerpo de conocimientos cada vez mayor que proporciona una conexión entre factores ambientales (de la dieta, tabaquismo, radiación UV, etc.), así como factores genéticos (mutaciones de la línea germinal en “genes del cáncer”, tales como p53, APC, BRCA1, XP, etc.), y el riesgo de desarrollar cáncer.

Ninguna definición del cáncer es totalmente satisfactoria desde el punto de vista de la biología celular, a pesar del hecho de que el cáncer es fundamentalmente una enfermedad celular y se define como una población celular transformada con un crecimiento celular neto y un comportamiento antisocial. La transformación maligna representa la transición a un fenotipo maligno basado en alteraciones genéticas irreversibles. Aunque esto no se ha demostrado formalmente, se cree que la transformación maligna se produce en una célula, a partir de la cual se origina un tumor que posteriormente se desarrolla (el dogma de la “clonalidad del cáncer”). La carcinogénesis es el proceso mediante el cual se genera el cáncer y en general se acepta que incluye múltiples acontecimientos que en último término conducen al crecimiento de un tumor maligno. Este proceso de múltiples etapas incluye varias etapas limitantes de la velocidad, tales como la adición de mutaciones y quizás también acontecimientos epigenéticos, que conducen a la formación del cáncer tras unas etapas de proliferación precancerosa. Las formas de cáncer más comunes surgen en células somáticas y son predominantemente de origen epitelial (piel, próstata, mama, colon y pulmón), seguidos de cánceres que se originan a partir del linaje hematopoyético (leucemia y linfoma) y células mesenquimáticas (sarcomas). Los cambios discontinuos implican la acumulación de errores (mutaciones) en vías reguladoras vitales que determinan la división celular, el comportamiento asocial y la muerte celular. Cada uno de estos cambios proporciona una ventaja de crecimiento darwiniano selectivo comparado con las células circundantes, dando como resultado un crecimiento neto de la población de células tumorales. Resulta importante enfatizar que un tumor maligno no sólo consiste en las células tumorales transformadas en sí mismas, sino también en las células normales circundantes que actúan como estroma de apoyo. Este estroma del cáncer reclutado consiste en tejido conectivo, vasos sanguíneos y diversas otras células normales, por ejemplo células inflamatorias, que actúan en concierto para suministrar a las células tumorales transformadas las señales necesarias para un crecimiento tumoral continuado.

Diagnóstico del cáncer

La evaluación microscópica de una sección de tejido tomada de un tumor sigue siendo el patrón oro para determinar un diagnóstico de cáncer. El análisis del ADN genómico, los genes transcritos y las proteínas expresadas añaden información importante a las características histológicas detectadas al microscopio. El diagnóstico, la información de prognóstico y la elección del tratamiento futuros estarán basados, casi con toda probabilidad, en una evaluación sinóptica de la morfología junto con el análisis de los ácidos nucleicos y las proteínas. Ya en la actualidad, el conocimiento en evolución basado en la secuencia del genoma humano y las vías bioquímicas, incluyendo la señalización dentro y entre las células en un tejido, permite la disección de algunos de los mecanismos que subyacen a las diferentes etapas en la formación del tumor, así como la variación de fenotipos, que definen los diferentes tipos de cáncer.

A pesar del extraordinario avance en la biología molecular, el diagnóstico del cáncer sigue dependiendo del uso de la microscopía óptica. El desarrollo de herramientas moleculares ha desempeñado un papel importante, aunque todavía gradual, para discriminar una célula cancerosa de una célula normal. El método que se emplea más habitualmente, además de la tinción histoquímica de secciones de tejidos, es la inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica permite la detección de patrones de expresión de proteínas en tejidos y células que emplean anticuerpos específicos. El uso de la inmunohistoquímica en el diagnóstico clínico ha proporcionado una posibilidad no solo para analizar la arquitectura de tejidos y la morfología celular, sino también para detectar la inmunorreactividad en diferentes poblaciones celulares. Esto ha sido importante para apoyar la clasificación y graduación precisa de diferentes tumores primarios, así como para el diagnóstico de metástasis de origen desconocido. Los anticuerpos que se emplean de modo más habitual en la práctica clínica actual incluyen anticuerpos contra marcadores de tipos celulares, por ejemplo PSA, melanA, tiroglobulina y anticuerpos que reconocen filamentos intermedios, agrupaciones de antígenos de diferenciación (CD), etc., y marcadores del potencial maligno, por ejemplo Ki67, p53, HER-2. Además de la inmunohistoquímica, el uso de la hibridación in situ para detectar la amplificación de genes y la secuenciación de genes para el análisis de mutaciones son tecnologías en desarrollo dentro del diagnóstico del cáncer.

Cáncer colorrectal

El cáncer colorrectal es una de las formas más comunes de cáncer humano en todo el mundo. Los datos de la base de datos GLOBOCAM 2002, presentados por Parkin et al., demuestran que se descubren aproximadamente 1 millón de casos nuevos de cáncer colorrectal al año (Parkin et al. (2007), C.A. Cancer J. Clin., 55, 74-108). Además, la incidencia del cáncer colorrectal en el mundo es aproximadamente 9,4% de todos los cánceres, y el cáncer colorrectal constituye la segunda causa de muerte más común en el mundo occidental. La tasa de supervivencia de cinco años del cáncer colorrectal es aproximadamente 60% en el mundo occidental, pero es tan baja como 30% en la Europa del Este e India.

La detección temprana y la cirugía con excisión del tumor es de importancia crítica en la actualidad para una prognosis favorable. Los síntomas dependen de dónde está localizado el tumor en el tracto gastrointestinal distal, e incluyen insuficiencia intestinal, diarrea, estreñimiento, dolor y anemia (secundaria al sangrado desde el tumor hacia el intestino). Los tumores malignos puede clasificarse en varias etapas según diferentes esquemas de clasificación, tales como la clasificación I-IV de TNM/UICC, o las etapas A-C de Dukes. Los tumores menos malignos (etapas A y B de Dukes) tienen un resultado razonablemente favorable, mientras que en el otro extremo, algunos tumores muy malignos con metástasis (etapa C de Dukes) tienen unas tasas de supervivencia bajas. El diagnóstico actual se basa en la historia del paciente, el examen clínico y endoscópico (rectoscopia y colonoscopia), opcionalmente seguido de un cartografiado radiológico para determinar la extensión del crecimiento tumoral. Junto con el examen endoscópico, se realizan biopsias de tejidos para lesiones dudosas.

Para el diagnóstico microscópico, el material de biopsia procedente de tumores sospechosos se recoge y se estudia al microscopio. Para obtener un diagnóstico firme, el tejido del tumor después se fija en formaldehído, se histoprocesa y se introduce en parafina. A partir del bloque de parafina producido pueden producirse secciones de tejido y teñirse utilizando métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos.

Para tumores localizados, es decir, tumores que no han evolucionado hacia una enfermedad metastatizante, se realiza una intervención quirúrgica con resección radical del tumor y de los tejidos y el intestino circundantes. El espécimen quirúrgico entonces se envía a patología para un análisis bruto y microcópico. Este análisis forma la base para la estadificación clínica del tumor. El forma de cáncer colorrectal que, con mucho, es el más habitual, es el adenocarcinoma, que representa un tumor de origen glandular, que puede estar muy diferenciado, moderamente diferenciado o poco diferenciado.

Para tumores primarios, las secciones de tejidos teñidas con hematoxilina-eosina son suficientes para permitir un diagnóstico y una clasificación correctos según las diferentes clasificaciones de cánceres colorrectales. Sin embargo, puesto que el cáncer colorrectal es muy común y a menudo ha crecido hasta un tamaño considerable antes de su detección, las metástasis no son raras. El tumor generalmente metastatiza hacia los nódulos linfáticos regionales, pero no son raras las metástasis distales en el hígado y el pulmón. Un problema clínico habitual del cáncer son los pacientes que presentan una metástasis de origen desconocido. En el caso en que una metástasis es un adenocarcinoma, se puede sospechar de varios tumores primarios posibles, por ejemplo cáncer de mama, de próstata, pancreático, de estómago y colorrectal. Para un diagnóstico diferencial pueden utilizarse marcadores inmunohistoquímicos que reconozcan características inherentes en la célula de origen. En la actualidad, se emplea la citoqueratina 20 (CK20), un marcador de filamentos intermedios abundante en las células glandulares del tracto GI, para caracterizar el cáncer colorrectal. Sin embargo, varios otros adenocarcinomas también pueden dar positivo para anticuerpos CK20, mientras que no todos los cánceres colorrectales dan positivo. Además, hoy en día no existen marcadores disponibles que puedan distinguir a los tumores de bajo grado de malignidad y bajo riesgo de metástasis, de los tumores muy malignos con una posibilidad reducida de supervivencia.

Para que los médicos impongan un tratamiento específico para el tipo correcto de cáncer y para que se imponga cuanto antes, es crucial el suministro de nuevos marcadores moleculares que sean específicos sólo para el cáncer colorrectal, y que permitan la posibilidad de diferenciar a los pacientes en diferentes categorías de riesgo. En resumen, existe una gran demanda de nuevos medios para avanzar en el diagnóstico y evaluación del cáncer colorrectal.

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es satisfacer esta demanda mediante el suministro de un marcador que es útil para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un sujeto.

Un objeto relacionado de la invención es proporcionar un marcador que es útil para distinguir entre los cánceres colorrectales y otros tipos de cánceres.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos métodos para el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos compuestos útiles para el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Para estos y otros objetos evidentes para los expertos en la técnica a partir de la presente descripción, la presente invención proporciona, en sus diferentes aspectos, medios nuevos para determinar el estado del cáncer colorrectal. Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar si una metástasis de origen desconocido se ha originado de un cáncer colorrectal detectando la presencia de la proteína SATB2.

grandal En otro aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona un método para determinar si una prognosis para el cáncer colorrectal en un sujeto mamífero que tiene o que se sospecha que tiene cáncer colorrectal es mala, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra procedente del sujeto;

b) cuantificar la cantidad de proteína SATB2 presente en dicha muestra para producir un valor de la muestra;

c) comparar el valor de la muestra obtenido en la etapa b) con un valor de referencia; y si dicho valor de la muestra es menor que dicho valor de referencia,

d) concluir que la prognosis para el cáncer colorrectal en dicho sujeto es mala.

Este otro aspecto se basa en el hecho, previamente reconocido, que la expresión de la proteína SATB2 en muestras procedentes de un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene cáncer colorrectal puede servir como indicador del estado de enfermedad en sujetos. Más en concreto, la presente memoria descriptiva identifica, por primera vez, una correlación entre un valor bajo de expresión de SATB2 por una parte, y las formas más agresivas o de alto riesgo del cáncer colorrectal por otra. La presente memoria descriptiva basada en la expresión de SATB2 como indicador de la prognosis del cáncer colorrectal tiene una serie de beneficios. Para el cáncer en general, una detección temprana de las formas agresivas es de vital importancia puesto que permite un tratamiento curativo. Esto es particularmente cierto para el cáncer colorrectal, para el cual varios estudios grandes han demostrado que los sujetos con cánceres tempranos, es decir, que representan tumores de etapa 1 y de etapa 2 (fundamentalmente A y B de Dukes), tienen una prognosis sustancialmente mejor comparado con sujetos con tumores en etapa tardía. Esta diferencia no depende de la modalidad de tratamiento, puesto que la resección radical se realiza en todos los tipos de cáncer colorrectal. En lugar de esto, la gran diferencia en la supervivencia está claramente relacionada con una detección temprana, un diagnóstico correcto y un tratamiento quirúrgico adecuado. La proteína SATB2, como marcador para el cual un cierto nivel de expresión se correlaciona con un cierto patrón de avance de la enfermedad, tiene un gran potencial, por ejemplo en un panel para el diagnóstico diferencial de la metástasis.

La conclusión en la etapa d) de una prognosis mala puede implicar establecer que dicho sujeto tiene una

5 supervivencia esperada más corta que la que tendría en el caso de que el sujeto no hubiese mostrado un valor de expresión bajo de SATB2. Como alternativa, o además, la conclusión de una mala prognosis puede implicar establecer una baja probabilidad de supervivencia de cinco años que la que establecería en el caso de que el sujeto no hubiese mostrado un valor de expresión bajo de SATB2. Por ejemplo, la conclusión puede ser que dicho sujeto tiene una probabilidad de supervivencia de cinco años del 65% o menor, por ejemplo 60% o menor, 50% o menor, 40% o menor, o 30% o menor.

Además, con respecto a los sujetos que tienen o que se sospecha que tienen tumores negativos en nódulos, la conclusión puede ser que dicho sujeto tiene una probabilidad de supervivencia de cinco años del 72% o menor, por ejemplo 70% o menor, 60% o menor, 50% o menor, 40% o menor, o 30% o menor. Con respecto a las mujeres, la conclusión puede ser que dicho sujeto tiene una probabilidad de supervivencia de cinco años del 74% o menor, por

15 ejemplo 70% o menor, 60% o menor, 50% o menor, 40% o menor, o 30% o menor. Con respecto a las pacientes femeninas que tienen o que se sospecha que tienen tumores negativos en nódulos, la conclusión puede ser que dicho sujeto tiene una probabilidad de supervivencia de cinco años del 80% o menor, por ejemplo 75% o menor, 70% o menor, 60% o menor, 50% o menor, 40% o menor, o 30% o menor.

La correlación identificada entre una baja expresión de SATB2 y las formas de alto riesgo de cáncer colorrectal también pueden formar la base para la decisión de aplicar un régimen diferente de tratamiento del sujeto que el que se aplicaría en el caso de que el sujeto no hubiese mostrado un valor de expresión bajo de SATB2. Por tanto, en otro aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona un método de tratamiento del cáncer colorrectal en un sujeto que lo necesita, que comprende:

a) proporcionar una muestra procedente del sujeto;

25 b) cuantificar la cantidad de proteína SATB2 presente en dicha muestra para producir un valor de la muestra;

d) tratar dicho sujeto con un régimen de tratamiento adaptado a una mala prognosis del cáncer colorrectal.

El régimen de tratamiento puede seleccionarse de quimioterapia, terapia neoadyuvante y sus combinaciones.

Por tanto, el régimen de tratamiento puede ser una terapia neoadyuvante. Esta terapia neoadyuvante puede consistir en terapia de radiación sólo, o en terapia de radiación en combinación con quimioterapia.

En los aspectos de método de la presente invención y la memoria descriptiva descritos anteriormente, el sujeto puede tener o puede ser sospechoso de tener cáncer colorrectal en diferentes formas y/o etapas.

En algunos de estos aspectos, el cáncer colorrectal en cuestión es un cáncer colorrectal negativo en nódulos, es

35 decir, un cáncer colorrectal que no ha avanzado hacia la etapa metastatizante de nódulos linfáticos. En otros aspectos, el cáncer colorrectal en cuestión se caracteriza porque está en la etapa A o B de Dukes. En otros aspectos, el cáncer colorrectal en cuestión es un adenoma colorrectal o un carcinoma colorrectal. En estos aspectos, la determinación de que el sujeteo muestra una expresión baja de SATB2 puede tener un gran valor para la prognosis del futuro avance de la enfermedad y, por tanto, forma la base para una decisión informada con respecto a la gestión futura de la enfermedad. Dentro de un grupo de sujetos afectados por dicha etapa comparativamente temprana de la enfermedad, es probable que los sujetos con una baja expresión de SATB2 tengan un riesgo comparativamente alto de desarrollar una enfermedad más agresiva. Una baja expresión de SATB2 en los sujetos que tienen cáncer colorrectal negativo en nódulos o cáncer colorrecta de etapa A o B de Dukes puede indicar, por tanto, que estos sujetos deben controlarse más atentamente y/o tratarse de manera

45 diferente a los sujetos que no muestran una baja expresión de SATB2. Los métodos según la memoria descriptiva por tanto ofrecen la posibilidad de una mayor probabilidad de supervivencia a lo largo de un cierto periodo de tiempo y/o un tiempo de supervivencia más largo para dichos sujetos, debido a la información prognóstica adicional ofrecida por el marcador STAB2.

En otros aspectos, el cáncer colorrectal en cuestión es un cáncer colorrectal metastatizado. En otros aspectos similares, el cáncer colorrectal en cuestión se caracteriza porque está en la etapa C de Dukes.

En realizaciones de la invención, el sujeto es un ser humano, tal como una mujer. Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, el valor de prognóstico del marcador SATB2 es especialmente marcado en el grupo de sujetos humanos femeninos que tienen formas negativas en nódulos de cáncer colorrectal.

La determinación de que el valor de la muestra de la expresion de la proteína SATB2 es menor que el valor de referencia a veces se denomina en la presente “baja expresión de SATB2”.

En los métodos de la memoria descriptiva, el valor de referencia para utilizar como comparación con el valor de la muestra para un sujeto puede establecerse de diversas maneras. Como ejemplo, el valor de referencia puede corresponderse con la cantidad de expresión de SATB2 en el tejido sano del sujeto que se está sometiendo a prognosis o terapia. Como otro ejemplo, el valor de referencia puede ser proporcionado por la cantidad de expresión de SATB2 medida en una muestra patrón de tejido normal procedente de otro sujeto comparable. Como otro ejemplo, el valor de referencia puede ser proporcionado por la cantidad de expresión de SATB2 medida en una muestra patrón de tejido tumoral, tal como un tejido procedente de un cáncer en etapa A o B de Dukes.

El valor de referencia puede obtenerse en el transcurso de realizar el método según los anteriores aspectos de la presente invención. Como alternativa, el valor de referencia es un valor predeterminado obtenido a partir de una muestra de referencia y que se corresponde con la cantidad de expresión de SATB2 en dicha muestra de referencia.

Una alternativa para la cuantificación de la expresión de SATB2 en una muestra es la determinación de la fracción de células en la muestra que muestran una expresión de SATB2 por encima de cierto nivel. Esta determinación puede realizarse, por ejemplo, como se describe a continuación en los ejemplos, sección 4, en la definición de “puntuación de la fracción”. En realizaciones de los métodos de los anteriores aspectos de la presente invención, el criterio para la conclusión en la etapa d) es un valor de la muestra para la fracción nuclear de las células positivas a STAB2, es decir, una “puntación de la fracción”, que es menor que el valor de referencia del 50%, tal como menor que 40%, tal como menor que 30%, tal como menor que 25%, tal como menor que 20%, tal como menor que 15%, tal como menor que 10%, tal como menor que 5%, y tal como menor que 1%. Además, la determinación de una mala prognosis puede corresponder a la no detección fundamentalmente de células positivas a STAB2 en una muestra, es decir, una “puntuación de la fracción” de fundamentalmente cero.

Otra alternativa para la cuantificación de la expresión de SATB2 en una muestra es la medición automática de una puntuación automática para la expresión de SATB2 utilizando un escáner automático y un programa informático de procesamiento de imágenes. Esta determinación puede realizarse, por ejemplo, como se describe a continuación en los ejemplos, sección 5, en la definición de “puntuación automática”. En los métodos de los anteriores aspectos de la presente memoria descriptiva, el criterio para la conclusión en la etapa d) es un valor de la muestra para la expresión de SATB2 en las células de la muestra, es decir, una “puntuación automática”, que es menor que un valor de referencia de 70, tal como menor que 60, tal como menor que 50, tal como menor que 40, tal como menor que 30, tal como menor que 25, tal como menor que 20, tal como menor que 15, tal como menor que 10, y tal como menor que 5.

La medición del valor de la muestra y/o del valor de referencia, como una puntuación de la fracción o como una puntuación automática como se ha indicado anteriormente, o como cualquier otra variable conocida o adaptada, puede realizarse en células glandulares procedentes del tracto gastrointestinal distal de un sujeto, es decir, el apéndice, el colon y/o el recto, y/o en células de cáncer colorrectal.

Como alternativa, la determinación de una mala prognosis se corresponde con una expresión no detectable de SATB2 en células glandulares procedentes del tracto gastrointestinal distal de un sujeto.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, las expresiones “valor de la muestra” y “valor de referencia” deben interpretarse en sentido amplio. Tal como se describió anteriormente, la cuantificación de la expresión de SATB2 para obtener estos valores puede realizarse por medios automáticos, o mediante un sistema de puntuación basado en la inspección visual o microscópica de las muestras. Sin embargo, también es posible que los expertos en la técnica, tales como los expertos en la técnica de la histopatología, determinen el valor de la muestra y de referencia simplemente estudiando, por ejemplo, cortes de tejidos que se han teñido para la expresión de SATB2. La determinación de que el valor de la muestra es menor que el valor de referencia puede corresponder, por tanto, a la determinación, tras examen visual o microscópico, de que la muestra del corte de tejido tiene una tinción menos densa y/o muestra menos células teñidas que un corte de tejido de referencia. En este caso, los valores de la muestra y de referencia se consideran valores mentales determinados por los expertos en la técnica tras el examen y la comparación. Por tanto, la memoria descriptiva no se limita al uso de análisis automáticos.

El procedimiento concreto utilizado para la detección de la expresión de la proteína SATB2 en los métodos de la presente invención no está limitado de ninguna forma. En los métodos según la memoria descriptiva, la etapa b) comprende:

b1) aplicar a la muestra un ligando de afinidad cuantificable capaz de una interacción selectiva con la proteína SATB2 que se va a cuantificar, realizándose dicha aplicación bajo condiciones que permiten la unión del ligando de afinidad a cualquier proteína SATB2 presente en la muestra;

b2) retirar el ligando de afinidad no unido; y

b3) cuantificar cualquier ligando de afinidad que permanezca en asociación con la muestra.

En realizaciones de la invención, la muestra procedente del sujeto puede ser una muestra de fluido corporal, tal como una muestra de sangre, plasma, suero, fluido cerebral, orina, semen y exudado. En el método según la invención, la muestra puede ser, como alternativa, una muestra de heces, una muestra de citología o una muestra de tejido, tal como una muestra de tejido colorrectal.

El método según la invención se realiza in vitro.

Los expertos en la técnica reconocerán que la utilidad de la presente invención no se limita a la cuantificación de cualquier variante particular de la proteína SATB2 presente en el sujeto en cuestión, con la condición de que la proteína esté codificada por el gen pertinente y presente el patrón pertinente de expresión. Como ejemplo no limitante, la proteína SATB2 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada de:

i) SEQ ID NO:1; y

ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:1.

En algunas realizaciones, la secuencia ii) anterior es al menos 90% idéntica, al menos 91% idéntica, al menos 92% idéntica, al menos 93% idéntica, al menos 94% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 96% idéntica, al menos 97% idéntica, al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:1.

Como otro ejemplo no limitante, la proteína SATB2 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada de:

i) SEQ ID NO:2; y

ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:2.

En algunas realizaciones, la secuencia ii) anterior es al menos 90% idéntica, al menos 91% idéntica, al menos 92% idéntica, al menos 93% idéntica, al menos 94% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 96% idéntica, al menos 97% idéntica, al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:2.

En realizaciones de los métodos según la invención, la proteína SATB2 se detecta y/o cuantifica mediante la aplicación a una muestra de un ligando de afinidad detectable y/o cuantificable, que sea capaz de una interacción específica o selectiva con la proteína SATB2. La aplicación del ligando de afinidad se realiza bajo condiciones que permiten la unión del ligando de afinidad a cualquier proteína SATB2 en la muestra. Se contempla dentro de las capacidad de los expertos en la técnica la selección o la fabricación de ligando de afinidad apropiado y la selección del formato y de las condiciones adecuados para la detección y/o la cuantificación, tras haber conocido la conexión entre SATB2 y el cáncer colorrectal por las indicaciones de la presente descripción. No obstante, los ejemplos de ligandos de afinidad que pueden ser útiles, así como los ejemplos de formatos y condiciones para la detección y/o la cuantificación, se ofrecen a continuación como ilustración.

Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, se utiliza un ligando de afinidad que se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, sus fragmentos y sus derivados, es decir, ligandos de afinidad basados en un andamiaje de inmunoglobulina. Los anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales de cualquier origen, incluyendo anticuerpos murinos, humanos y otros anticuerpos, así como anticuerpos quiméricos que comprenden secuencias procedentes de diferentes especies, tales como anticuerpos de ratón parcialmente humanizados. Los anticuerpos policlonales se producen mediante la inmunización de animales con el antígeno elegido, mientras que pueden producirse anticuerpos monoclonales con una especificidad definida utilizando la tecnología de hibridomas desarrollada por Köhler y Milstein (Köhler G. y Milstein C. (1976), Eur. J. Immunol., 6:511-519). Los fragmentos y derivados de anticuerpos comprenden fragmentos Fab, que consisten en el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1), el dominio constante de la cadena ligera (CL), el dominio variable de la cadena pesada (VH), y el dominio variable de la cadena ligera (VL) de una proteína de inmunoglobulina intacta; fragmentos Fv, que consisten en los dos dominios variables de anticuerpos VH y VL (Skerra A. y Plückthun A. (1988), Science, 240:1038-1041); fragmentos Fv monocatenarios (scFv), que consisten en los dominios VH y VL unidos a través de un conector peptídico flexible (Bird R.E. y Walker B.W. (1991), Trends Biotechnol., 9:132-137); dímeros de Bence Jones (Stevens F.J. et al. (1991), Biochemistry, 30:6803-6805); dímeros de cadena pesada de camélido (Hamers-Casterman C. et al. (1993), Nature, 363:446-448) y dominios variables individuales (Cai X. y Garen A. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:6280-6285; Masat L. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 91:893-896), y andamiajes de dominio individual tal como, por ejemplo, el nuevo receptor de antígeno (NAR) procedente del tiburón nodriza (Dooley H. et al. (2003), Mol. Immunol., 40:25-33) y minicuerpos basados en un dominio pesado variable (Skerra A. y Plückthun A. (1988), Science, 240:1038-1041).

Los anticuerpos policlonales y monoclonales, así como sus fragmentos y derivados, representan la elección tradicional de ligandos de afinidad en aplicaciones que requieren un reconocimiento biomolecular selectivo, tales como en la detección y/o cuantificación de la proteína SATB2 según la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica saben que, debido a la demanda cada vez mayor de una generación de alta capacidad de procesamiento de ligandos de unión específica y de sistemas de producción de bajo coste, se han desarrollado nuevas tecnologías de diversidad biomolecular durante la última década. Esto ha permitido generar nuevos tipos de ligandos de afinidad originados a partir de inmunoglobulinas y no originados a partir de inmunoglobulinas que han demostrado ser igualmente útiles como ligandos de afinidad en aplicaciones de reconocimiento biomolecular y que pueden utilizarse en lugar de las inmunoglobulinas o junto con éstas.

La diversidad biomolecular necesaria para la selección de ligandos de afinidad puede generarse mediante modificación combinatoria de una de una pluralidad de posibles moléculas de andamiaje, y después se seleccionan ligandos de afinidad específicos y/o selectivos utilizando una plataforma de selección adecuada. La molécula de andamiaje puede originarse a partir de una proteína de inmunoglobulina (Bradbury A.R. y Marks J.D. (2004), J. Immunol. Meths., 290:29-49), tener un origen diferente a una proteína de inmunoglobulina (Nygren P.Å. y Skerra A. (2004), J. Immunol. Meths., 290:3-28), u originarse a partir de un oligonucleótido (Gold L. et al. (1995), Annu. Rev. Biochem., 64:763-797).

Se ha empleado un gran número de andamiajes que no se originan a partir de una proteína de inmunoglobulina como estructuras de soporte para el desarrollo de nuevas proteínas de unión. Los ejemplos no limitantes de dichas estructuras, útiles para generar ligandos de afinidad contra SATB2 para su uso en la presente invención, sonla proteína A estafilocócica y sus dominios y los derivados de estos dominios, tales como la proteína Z (Nord K. et al. (1997), Nat. Biotechnol., 15:772-777); lipocalinas (Beste G. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:18981903); dominios de repetición de anquirina (Binz H.K. et al. (2003), J. Mol. Biol., 332:489-503); dominios de unión a celulosa (CBD) (Smith G.P. et al. (1998), J. Mol. Biol., 277:317-332; Lehtiö J. et al. (2000), Proteins 41:316-322); cristalinas (Fiedler U. y Rudolph R., documento WO 01/04144); proteína fluorescente verde (GFP) (Peelle B. et al. (2001), Chem. Biol., 8:521-534); antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos humanos (CTLA-4) (Hufton S.E. et al. (2000), FEBS Lett., 475:225-231; Irving R.A. et al. (2001), J. Immunol. Meth., 248:31-45); inhibidores de proteasas, tales como proteínas Knottin (Wentzel A. et al. (2001), J. Bacteriol., 183:7273-7284; Baggio R. et al. (2002), J. Mol. Recognit., 15:126-134) y dominios Kunitz (Roberts B.L. et al. (1992), Gene, 121:9-15; Dennis M.S. y Lazarus R.A. (1994), J. Biol. Chem., 269:22137-22144); dominio PDZ (Schneider S. et al. (1999), Nat. Biotechnol., 17:170-175); aptámeros peptídicos, tales como tiorredoxina (Lu Z. et al. (1995), Biotechnology, 13:366-372; Klevenz B. et al. (2002), Cell. Mol. Life Sci., 59:1993-1998); nucleasa estafilocócica (Norman T.C. et al. (1999), Science, 285:591595); tendamistatos (McConell S.J. y Hoess R.H. (1995), J. Mol. Biol., 250:460-479; Li R. et al. (2003), Protein Eng., 16:65-72); trinectinas basadas en el dominio de la fibronectina de tipo III (Koide A. et al. (1998), J. Mol. Biol., 284:1141-1151; Xu L. et al. (2002), Chem. Biol.. 9:933-942); y dedos de cinc (Bianchi E. et al. (1995), J. Mol. Biol., 247:154-160; Klug A. (1999), J. Mol. Biol., 293:215-218; Segal D.J. et al. (2003), Biochemistry, 42:2137-2148).

Los ejemplos mencionados anteriormente de andamiajes no originados a partir de una proteína de inmunoglobulina incluyen proteínas de andamiaje que presentan un único bucle aleatorizado utilizado para la generación de nuevas especificidades de unión, andamiajes de proteínas con una estructura secundaria rígida en los que las cadenas laterales que sobresalen de la superficie de la proteína se aleatorizan para la generación de nuevas especificidades de unión, y andamiajes que muestra una región de bucle hipervariable no contigua utilizada para la generación de nuevas especificidades de unión.

Además de las proteínas que no son inmunoglobulinas, también pueden utilizarse oligonucleótidos como ligandos de afinidad. Los ácidos nucleicos monocatenarios denominados aptámeros o reclamo se pliegan en estructuras tridimensionales bien definidas y se unen a su diana con alta afinidad y especificidad (Ellington A.D. y Szostak J.W. (1990), Nature, 346:818-822; Brody E.N. y Gold L. (2000), J. Biotechnol., 74:5-13; Mayer G. y Jenne A. (2004), BioDrugs, 18:351-359). Los ligandos oligonucleotídicos pueden ser ADN o ARN y pueden unirse a una amplia gama de clases de moléculas diana.

Para la selección del ligando de afinidad deseado a partir de un conjunto de variantes de cualquiera de las estructuras de andamiaje mencionadas anteriormente, una serie de plataformas de selección están disponibles para el aislamiento de un ligando nuevo específico contra una proteína diana elegida. Las plataformas de selección incluye, pero no se limitan a presentación de fagos (Smith G.P. (1985), Science, 228:1315-1317), presentación de ribosomas (Hanes J. y Plückthun A. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:4937-4942), sistemas de dos híbridos de levaduras (Fields S. y Song O. (1989), Nature, 340:245-246), presentación de ARNm (Roberts R.W. y Szostak

J.W. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:12297-12302), SELEX (“System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment”, sistema de evolución de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk C. y Gold L. (1990), Science, 249:505-510), y ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) (Remy I. y Michnick S.W., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:5394-5399).

Por tanto, en realizaciones de la invención, puede utilizarse un ligando de afinidad que es un ligando de afinidad que no es una inmunoglobulina derivado de cualquiera de los andamiajes de proteínas listados anteriormente, o una molécula oligonucleotídica.

En algunas realizaciones de los métodos según la invención, un ligando de afinidad capza de una interacción selectiva con la proteína SATB2 es detectable y/o cuantificable. La detección y/o cuantificación de dicho ligando de afinidad puede realizarse de cualquier modo conocido por los expertos en la técnica para la detección y/o cuantificación de reactivos de unión en ensayos basados en interacciones biológicas. Por tanto, cualquier ligando de afinidad, según se describió en la sección previa, puede utilizarse de modo cuantitativo y/o cualitativo para detectar la presencia de la proteína SATB2. Estos ligandos de afinidad “primarios” pueden estar marcados con diversos marcadores o ser detectados a su vez por ligandos de afinidad marcados secundarios que permitan la detección, la visualización y/o la cuantificación. Esto puede lograrse utilizando cualquiera o más de una multitud de marcadores, que pueden conjugarse con el ligando de afinidad capaz de interaccionar con SATB2 o con cualquier ligando de afinidad secundario, utilizando cualquiera o más de una multitud de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, y que no impliquen una experimentación excesiva.

Los ejemplos no limitantes de marcadores que pueden conjugarse con ligandos de afinidad primarios y/o secundarios incluyen metales o tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, fluorescamina), tintes cromofóricos (por ejemplo, rodopsina), compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, luminal, imidazol), proteínas bioluminiscentes (por ejemplo, luciferina, luciferasa), y haptenos (por ejemplo, biotina). Una diversidad de otros fluorescentes y cromóforos útiles se describe en Stryer L. (1968), Science, 162:526-533, y Brand

L. y Gohlke J.R. (1972), Annu. Rev. Biochem., 41:843-868. Los ligandos de afinidad también pueden marcarse con enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-lactamasa), radioisótopos (por ejemplo, 3H,14C, 32P, 35S o 125I) y partículas (por ejemplo, oro). Los diferentes tipos de marcadores pueden conjugarse con un ligando de afinidad utilizando diversas químicas, por ejemplo, la reacicón de amina o la reacción de tiol. Sin embargo, pueden utilizarse otros grupos reactivos que no sean aminas ni tioles, por ejemplo aldehídos, ácidos carboxílicos y glutamina.

Los aspectos de métodos de la invención pueden utilizarse en cualquiera de diversos formatos y conformaciones conocidos, cuyos ejemplos no limitantes se analizan a continuación.

En una conformación basada en la histología, la detección, la localización y/o la cuantificación de un ligando de afinidad marcado unido a su diana SATB2 puede implicar técnicas visuales, tales como microscopía óptica o microscopía de inmunofluorescencia. Otros métodos pueden implicar la detección mediante citometría de flujo o luminometría.

Tal como se explicó anteriormente, la detección y/o la cuantificación de la proteína SATB2 en un sujeto se realiza después de extraer una muestra biológica del sujeto, tal como una muestra de tejido (biopsia), por ejemplo de tejido colorrectal, una muestra de sangre, fluido cerebral, orina o heces. El ligando de afinidad se aplica a la muestra biológica para la detección y/o la cuantificacón de la proteína marcadora de SATB2. El procedimiento permite no sólo la detección de la proteína SATB2, sino que además muestra la distribución y el nivel relativo de su expresión.

El método de visualización de los marcadores sobre el ligando de afinidad puede incluir, pero no se limita a técnicas fluorimétricas, luminométricas y/o enzimáticas. La fluorescencia se detecta y/o se cuantifica exponiendo marcadores fluorescentes a una luz de una longitud de onda específica y después detectar y/o cuantificar la luz emitida de una longitud de onda específica. La presencia de un ligando de afinidad marcado de forma luminiscente puede detectarse y/o cuantificarse por la luminiscencia desarrollada durante una reacción química. La detección de una reacción enzimática es debida a un desplazamiento en el color de una muestra que surge de una reacción química. Los expertos en la técnica saben que una diversidad de protocolos diferentes pueden modificarse para una detección y/o cuantificación apropiadas.

En el método según la invención, una muestra biológica puede inmovilizarse sobre un vehículo o soporte en fase sólida, tal como nitrocelulosa o cualquier otra matriz de soporte sólido capaz de inmovilizar cualquier proteína SATB2 presente en la muestra biológica aplicada a ella. Algunos materiales de soporte en estado sólido muy conocidos, útiles en la presente invención, incluyen vidrio, carbohidratos (por ejemplo, Sepharose), nailon, plástico, lana, poliestireno, polietileno, polipropileno, dextrano, amilasa, películas, resinas, celulosa, poliacrilamida, agarosa, alúmina, gabros y magnetita. Si el ligando de afinidad primario no está en sí mismo marcado, la matriz de soporte puede lavarse después con diversos tampones conocidos en la técnica y luego exponerse a un ligando de afinidad marcado secundario, volverse a lavar con los tampones para eliminar los ligandos de afinidad no unidos, y después los ligandos de afinidad selectivos pueden detectarse y/o cuantificarse mediante métodos convencionales. Las propiedades de unión de un ligando de afinidad variarán de un soporte en estado sólido a otro, pero los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación mediante la experimentación habitual.

Un método para detectar y/o cuantificar la proteína SATB2 según se requiere en la presente invención es uniendo el ligando de afinidad a una enzima que después pueda detectarse y/o cuantificarse en un inmunoensayo enzimático (tal como EIA o ELISA). Estas técnicas están bien establecidas, y su realización no presenta dificultades excesivas para los expertos en la técnica. En estos métodos, la muestra biológica se pone en contacto con un material sólido o con un material sólido conjugado con un ligando de afinidad contra la proteína SATB2, que entonces se detecta y/o se cuantifica con un ligando de afinidad secundario marcado de modo enzimático. Tras esto, un sustrato apropiado se hace reaccionar en los tampones adecuados con el marcador enzimático para producir un resto químico, que por ejemplo se detecta y/o se cuantifica utilizando un espectrofotómetro, un fluorómetro, un luminómetro o por medios visuales.

Tal como se indicó anteriormente, los ligandos de afinidad primarios y secundarios pueden marcarse con radioisótopos para permitir la detección y/o la cuantificación. Los ejemplos no limitantes de radiomarcadores apropiados en la presente invención son 3H, 14C, 32P, 35S o 125I. La actividad específica del ligando de afinidad marcado depende de la semivida del radiomarcador, de la pureza isotópica, y de cómo se ha incorporado el marcador al ligando de afinidad. Los ligandos de afinidad se marcan preferiblemente utilizando técnicas muy conocidas (Wensel T.G. y Meares C.F. (1983), en: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel S.W. y Rhodes B.A., eds.), Elsevier, Nueva York, pp 185-196). Un ligando de afinidad marcado de esta manera puede utilizarse para visualizar la proteína SATB2 mediante la detección de la radiactividad in vivo o in vitro. También se emplea el barrido radionuclear, por ejemplo con función de cámaras gamma, espectroscopía de resonancia magnética o tomografía de emisión para la detección in vivo e in vitro, y también se utilizan in vitro contadores gamma/beta, contadores de centelleo y radiografías.

Un kit para realizar los métodos según los aspectos de métodos de la invención anteriores puede comprender:

a) un ligando de afinidad cuantificable capaz de una interacción selectiva con una proteína SATB2; y

b) reactivos necesarios para cuantificar la cantidad de ligando de afinidad.

Los diversos componentes del kit pueden seleccionarse y especificarse como se describió anteriormente en conexión con los aspectos de métodos de la presente invención.

Por tanto, el kit puede comprender un ligando de afinidad contra SATB2, así como otros medios que ayuden a cuantificar el ligando de afinidad específico y/o selectivo después de que se haya unido de modo específico y/o selectivo a SATB2. Por ejemplo, el kit puede contener un ligando de afinidad secundario para detectar y/o cuantificar un complejo formado por cualquier proteína SATB2 y el ligando de afinidad capaz de una interacción selectiva con una proteína SATB2. El kit también puede contener diversas sustancias auxiliares distintas de los ligandos de afinidad, para permitir que el kit se pueda usar de modo fácil y eficaz. Los ejemplos de sustancias auxiliares incluyen disolventes para disolver o reconstituir los componentes de proteína liofilizada del kit, tampones de lavado, sustratos para medir la actividad enzimática en los casos en que se emplea una enzima como marcador, y sustancias, tales como supresores de la reacción, que se emplean habitualmente en kits de reactivos de inmunoensayo.

El kit también puede comprender, de modo ventajoso, una muestra de referencia para suministrar un valor de referencia que se utilizará para la comparación con el valor de la muestra. Esta muestra de referencia puede estar constituida, por ejemplo, por una muestra de tejido que tiene una cantidad predeterminada de proteína SATB2, que entonces puede ser utilizada por los expertos en la técnica de la patología para determinar el estado de expresión de SATB2 en la muestra que se está estudiando, mediante comparación ocular o automática de los niveles de expresión en la muestra de referencia y la muestra del sujeto.

En realizaciones de los aspectos de usos de la invención, la proteína SATB2 puede tener, como ejemplo no limitante, una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada de:

i) SEQ ID NO:1; y

ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:1.

i) SEQ ID NO:2; y

ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:2.

Como otro aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona un ligando de afinidad capaz de una interacción selectiva con una proteína SATB2, que es un anticuerpo o un fragmento Fab o un fragmento Fr o un fragmento scFv de éste. Dicho anticuerpo, o su fragmento, puede ser, por ejemplo, obtenible mediante un proceso que comprende una etapa de inmunización de un animal con una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia SEQ ID NO:1. Los procesos para la producción de anticuerpos o sus fragmentos o sus derivados contra una diana dada son conocidos en la técnica, y pueden aplicarse en conexión con este aspecto. Cualquiera de los variantes de la proteína SATB2 (SEQ ID NO:2) o su fragmento antigénicamente activo (SEQ ID NO:1) que se han analizado anteriormente puede utilizarse, por supuesto, en dicho proceso para generar un anticuerpo o su fragmento.

Como otro aspecto, la presente invención proporciona el uso in vitro del ligando de afinidad según se definió en el párrafo previo, como agente para distinguir el cáncer colorrectal de otros cánceres.

La presente memoria descriptiva también proporciona, en otro aspecto de la misma, un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal, que comprende una etapa de detectar una proteína SATB2. Este aspecto de la presente memoria descriptiva se basa en el descubrimiento de que SATB2 puede actuar como marcador de proteína para el tejido colorrectal en general, y para el cáncer colorrectal en particular. Como se detalla más a fondo a continuación, los anticuerpos generados contra un fragmento de la proteína SATB2 muestran una inmunorreactividad nuclear selectiva y fuerte en células glandulares del tracto gastrointestinal distal, es decir, el apéndice, el colon y el recto, y en el cáncer colorrectal. El descubrimiento más sorprendente es una positividad en 11 de 11 carcinomas colorrectales. Además del cáncer colorrectal, sólo muy pocos otros tumores fueron débil o moderamente positivos.

Además, SATB2 está relativamente poco presente en otros tipos de cáncer, lo cual a su vez hace que los ligandos de afinidad dirigidos a SATB2 sean herramientas muy interesantes para distinguir, de modo específico, el cáncer colorrectal de otros cánceres. La mayoría de los cánceres colorrectales son derivados de glándulas y, por tanto, se clasifican como adenocarcinomas. Este es un tipo de cáncer típico, y puede derivarse también de diversos otros órganos. Por tanto, el descubrimiento de la presente invención es muy interesante cuando se emplea para tipificar al metástasis tumoral, en la que el órgano de origen del tumor a menudo es desconocido. En la actualidad, los marcadores moleculares disponibles para el cáncer colorrectal presentan reactividad cruzada con respecto a otros adenocarcinomas y, por tanto, es difícil localizar un tumor e identificar el origen de la metástasis. El marcador del cáncer colorrectal específico según la invención permitirá al médico localizar el cáncer de modo eficaz, proporciona un tratamiento más eficaz y, en último término, ayuda a dar una prognosis más dependiente a los pacientes.

Otro aspecto de la presente memoria descriptiva implica el ensayo simultáneo de muestras de cáncer para los marcadores SATB2 y CK20. Tal como se detalla en los ejemplos, sección 6, el valor predictivo de la combinación de ensayar la expresión de ambos SATB2 y CK20 para distinguir el cáncer colorrectal excede a la de ensayar cada uno de los marcadores por sí mismos. Por tanto, la memoria descriptiva proporciona, en este aspecto, un método para diagnosticar el cáncer colorrectal, que comprende las etapas de detectar la proteína SATB2 y detectar la proteína CK20. Además, la memoria descriptiva proporciona un método para detectar si una metástasis se origina de un cáncer colorrectal detectando la presencia de la proteína SATB2 y/o la proteína CK20. Combinando la información de ambas CK20 y SATB2, los paciente obtendrán con más faciliada un diagnóstico preciso para la enfermedad colorrectal. Los expertos en la técnica serán capaces de adaptar las indicaciones de la presente que se relacionan con la detección de SATB2 al método según este aspecto de la memoria descriptiva, y podrán realizar la detección y/o cuantificación simultánea o secuencial de SATB2 y CK20 sin cargas excesivas a la luz de la descripción en la presente y a la luz del conocimiento en el campo, por ejemplo la inmunohistoquímica.

Un aspecto interesante de la presente memoria descriptiva es la filtración predicha de la proteína SATB2 hacia el plasma y las heces en pacientes con cáncer. Como comparación, un marcador del cáncer de próstata muy conocido, PSA, que también se expresa en la próstata normal, se filtra desde la próstata al plasma incluso en pacientes sanos. Sin embargo, muchos pacientes con cáncer de próstata tienen un nivel elevado de PSA en su plasma y, por tanto, la evaluación de niveles elevados de PSA en la sangre es un procedimiento de evaluación temprana habitual para los hombres en el grupo de riesgo de desarrollar cáncer de próstata. Se predice que esto mismo es cierto también para la conexión entre SATB2 y el cáncer colorrectal. Por tanto, SATB2 también es útil como herramienta para la evaluación del cáncer colorrectal utilizando plasma humano u otro fluido corporal o heces como muestra en la presente memoria descriptiva. A este respecto, la presente memoria descriptiva se corresponde con un extensión valiosa y quizás con la sustitución de las evaluaciones del cáncer colorrectal actuales, tales como colorrectoscopia o sigmoidoscopia, que son tan incómodas que muchas personas no las realizan, a pesar de que the American Cancer Institute recomienda revisiones frecuentes para los grupos en riesgo de cáncer de colon. Un método de evaluación basado en la presente memoria descriptiva, que emplea SATB2 como marcador de proteína para el cáncer colorrectal, produce beneficios significativos en la evaluación, la detección temprana y el tratamiento de pacientes que han sufrido este tipo de cáncer.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, “prognosis” se refiere a la predicción del desarrollo o del resultado de una enfermedad y su tratamiento. La prognosis también puede referirse a la determinación de la probabilidad de supervivencia o recuperación de una enfermedad, así como a la predicción del tiempo de supervivencia esperado de un sujeto. Una prognosis puede implicar, de modo específico, establecer la probabilidad de supervivencia de un sujeto durante un periodo de tiempo hacia el futuro, tal como tres años, cinco años, diez años o cualquier otro periodo de tiempo.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, “diagnosis” se refiere a la determinación de la presencia o a la identificación de una enfermedad o trastorno. El diagnóstico también se refiere a la conclusión alcanzada mediante ese proceso. En este contexto, “diagnóstico” significa relacionar y ayudar a la determinación de la existencia o la naturaleza de una enfermedad. En el contexto de la presente memoria descriptiva, “diagnosis” y “diagnóstico” también significan controlar cualquier cambio que se produce de modo natural en una enfermedad a lo largo del tiempo o cualquier cambio debido al tratamiento.

Como resulta evidente a partir de las anteriores definiciones, los términos “prognosis” y “diagnosis” tienen significados solapantes y no son mútuamente excluyentes.

En el contexto de la presente invención, una interacción “específica” o “selectiva” de, por ejemplo, un ligando de afinidad con su diana o antígeno significa que la interacción es de tal forma que una distinción entre una interacción específica y no específica, o entre una interacción selectiva y no selectiva, se convierte en significativa. La interacción entre dos proteínas a veces se mide mediante la constante de disociación. La constante de disociación describe la fuerza de unión (o afinida) entre dos moléculas. Generalmente, la constante de disociación entre un anticuerpo y su antígeno es de 10-7 a 10-11 M. Sin embargo, una alta especificidad no requiere necesariamente una alta afinidad. Se ha demostrado que las moléculas con baja afinidad (en el intervalo molar) por su homólogo son tan específicas como las moléculas con mucha mayor afinidad. En el caso de la presente invención, una interacción específica o selectiva se refiere al grado en que puede utilizarse un método particular para determinar la presencia y/o la cantidad de una proteína específica, la proteína diana o su fragmento, bajo condiciones dadas en presencia de otras proteínas en una muestra de un fluido biológico natural o procesado. En otras palabras, la especificidad o la selectividad es la capacidad para distinguir entre proteínas relacionadas. Específico y selectivo a veces se emplean de modo intercambiable en la presente descripción.

En el contexto de la presente invención, un “anticuerpo monoespecífico” es uno de una población de anticuerpos policlonales que se han purificado por afinidad con su propio antígeno, separando con ello dichos anticuerpos monoespecíficos de otras proteínas antiséricas y anticuerpos no específicos. Esta purificación de afinidad produce anticuerpos que se unen de modo selectivo a su antígeno. En el caso de la presente invención, los antisueros policlonales se purifican mediante un protocolo basado en la inmunoafinidad de dos etapas para obtener anticuerpos monoespecíficos selectivos para la proteína diana. Los anticuerpos dirigidos contra marcadores de afinidad genéricos de fragmentos antigénicos se retiran en una etapa de reducción primaria, utilizando la proteína marcadora inmovilizada como agente de captura. Tras la primera etapa de reducción, el suero se carga en una segunda columna de afinidad con el antígeno como agente de captura, para realizar un enriquecimiento en anticuerpos específicos para el antígeno (véase también Nilsson P. et al. (2005), Proteomics, 5:4327-4337).

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra la especificidad del anticuerpo generado contra un fragmento SATB2 (SEQ ID NO:1) sobre un microchip de proteína que contiene 94 proteínas humanas diferentes más por duplicado.

La figura 2 ilustra un análisis de la transferencia Western de tejidos del anticuerpo monoespecífico purificado. Extractos de proteínas totales procedentes de las líneas celulares humanas RT-4 (carril 1), EFO-21 (carril 2) y A-431 (carril 3), así como procedentes de hígado humano normal (carril 4) y amígdala humana normal (carril 5).

Las figuras 3A y 3B muestran la tinción inmunohistoquímica de SATB2 en los núcleos celulares de (A) corteza cerebral normal e hipocampo, y (B) testículos normales. Las figuras 3C-3E muestra la tinción de SATB2 en células glandulares en la mucosa del (C) apéndice, (D) colon, y (E) recto, todos de sujetos normales. La figura 3F muestra una magnificación mayor de la tinción en mucosa colónica.

La figura 4A muestra la tinción inmunohistoquímica de SATB2 en todas las once muestras de cáncer colorrectal ensayadas (por duplicado). La figura 4B muestra una mayor magnificación de seis de las muestras de cáncer que aparecen en la figura 4A.

La figura 5 muestra la tinción inmunohistoquímica de un adenocarcinoma colorrectal con diferenciación intermedia. La figura 5A (izquierda) muestra una sección con expresión de SATB2, mientras que la figura 5B (derecha) muestra una sección en la que está ausente la expresión de SATB2. Ambas muestras de tumor se ofrecen por duplicado.

La figura 6 muestra los resultados de un análisis de la supervivencia basado en la tinción inmunohistoquímica de 122 sujetos diagnosticados con carcinomas colorrectales. La parte central del tejido se puntuó para un nivel alto o bajo de SATB2. Líneas continuas: fracción nuclear >25%. Líneas discontinuos/de puntos: fracción nuclear <25%. Tejidos de (A) todos los pacientes, (B) sólo las mujeres, (C) todos los pacientes negativos en nódulos, (D) las mujeres negativas en nódulos.

La figura 7 muestra el resultado del agrupamiento jerárquico de los datos de expresión de 216 tejidos de cáncer que se tiñeron de modo inmunohistoquímico para la expresión de SATB2 y para la expresión de los marcadores del cáncer de colon convencionales CEA, CK20, CDK2, p53, Ki67 y ciclina B1 (CCNB1).

La figura 8 muestra una comparación detallada de la expresión de CK20 y SATB2 basada en tinciones inmunohistoquímicas de tejidos procedentes de 122 sujetos diagnosticados con carcinomas colorrectales. La parte central del tejido se puntuó para un nivel alto o bajo de SATB2, y para un nivel alto o bajo de CK20.

La figura 9 muestra una comparación de la expresión de CK20 y SATB2 basada en tinciones inmunohistoquímicas de metástasis de nódulos linfáticos procedentes de 17 sujetos diagnosticados con carcinoma colorrectal. La parte central del tejido se puntuó para la fracción nuclear de SATB2 y la tinción de CK20.

Ejemplos

Generación de anticuerpos monoespecíficos contra SATB2 y su uso para detectar SATB2 en muestras normales y cancerosas

1) Generación del antígeno

a. Materiales y métodos

Se diseñó un fragmento adecuado de la proteína diana codificada por el gen EnsEMBL ID ENSG00000119042 utilizando herramientas bioinformáticas con la secuencia del genoma humano como molde (Lindskog M. et al. (2005), Biotechniques, 38:723-727, EnsEMBL, www.ensembl.org). Se diseñó un fragmento de 123 aminoácidos que se corresponde con los aminoácidos 377-499 (SEQ ID NO:1) de la proteína SATB2 (SEQ ID NO:2; entrada EnsEMBL nº ENSP00000260926). Un polinucleótido que codifica la proteína diana, conteniendo dicho polinucleótido los nucleótidos 1542-1910 del transcrito del gen SATB2 largo (SEQ ID NO:3; entrada EnsEMBL nº ENST00000260926), se aisló mediante un kit de amplificación de RT-PCR en una etapa Superscript™ con Taq Platinum (Invitrogen) y un panel de un agrupamiento de ARN total humano como molde (panel IV de ARN total humano, BD Biosciences Clontech). Se introdujeron sitios de restricción flanqueantes NotI y AscI en el fragmento a través de cebadores de amplificación de PCR, para permitir la clonación dentro del marco en el vector de expresión (cebador directo: GTGTCCCAAGCTGTCTTTG, cebador inverso: CTTGGCCCTTTTCATCTCC). Después, el cebador cadena abajo se biotiniló para permitir la clonación en fase sólida como se ha descrito previamente, y el producto de PCR biotinilado resultante se inmovilizó sobre Dynabeads M280-estreptavidina (Dynal Biotech) (Larsson

M. et al. (2000), J. Biotechnol., 80:143-157). El fragmento se liberó del soporte sólido mediante digestión con NotI-AscI (New England Labs), se acopló al vector pAff8c (Larsson M. et al., supra) dentro del marco con un marcador de afinidad dual que consiste en un marcador de hexahistidilo para una purificación mediante cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y una proteína de unión a albúmina inmunopotenciadora (ABP) procedente de la proteína G estreptocócica (Sjölander A. et al. (1997), J. Immunol. Methods, 201:115-123; Ståhl S. et al. (1999), Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation (Fleckinger M.C. y Drew S.W., eds.), John Wiley and Sons Inc., Nueva York, pp. 49-63), y se transformó en células E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Las secuencias de los clones se verificaron mediante una secuenciación de ciclo tinte-terminador del ADN plasmídico amplificado utilizando el kit de amplificación de secuenciación de ADN TempliPhi (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) según las recomendaciones del fabricante.

Las células BL21 (DE3) que portan el vector de expresión se inocularon en 100 ml de caldo de cultivo de soja tríptico 20 g/l (Merck KGaA) suplementado con extracto de levadura 5 g/l (Merck KGaA) y kanamicina 50 mg/l (Sigma-Aldrich) mediante la adición de 1 ml del cultivo durante la noche en el mismo medio de cultivo. El cultivo celular se incubó en un matraz de agitación de 1 litro a 37 ºC y 150 rpm hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,51,5. Entonces se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil--D-tiogalactopiranósido (Apollo Scientific) hasta una concentración final de 1 mM, y la incubación continuó durante la noche a 25 ºC y 150 rpm. Las células se recogieron mediante centrifugación a 2400 g, y el sedimento se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis (clorhidrato de guanidina 7 M, Na2HPO4 47 mM, NaH2PO4 2,65 mM, Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, mercaptoetanol 20 mM, pH 8,0) y se incubó durante 2 horas a 37 ºC y 150 rpm. Después de una centrifugación a 35300 g se recogió el sobrenadante que contenía los productos génicos desnaturalizados y solubilizados.

La proteína de fusión marcada con His6 se purificó mediante una cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) sobre columnas con 1 ml de resina de afinidad metálica (Co2+) Talon (BD Biosciences Clontech) utilizando un procedimiento de purificación de proteínas automática (Steen J. et al. (2006), Protein Expr. Purif., 46:173-178) en un ASPEC XL4™ (Gilson). La resina se equilibró con 20 ml de tampón de lavado desnaturalizante (clorhidrato de guanidina 6 M, Na2HPO4 46,6 mM, NaH2PO4 3,4 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0-8,2). La resina entonces se lavó con un mínimo de 31,5 ml de tampón de lavado antes de la elución en 2,5 ml de tampón de elución (urea 6 M, Na2HPO4 50 mM, NaCl 100 mM, ácido acético 30 mM, acetato de Na 70 mM, pH 5,0). El material eluido se fraccionó en tres agrupaciones de 500, 700 y 1300 l. La fracción de 700 l, que contenía el antígeno, y las fracciones agrupadas de 500 y 1300 l se conservaron para su posterior uso.

La fracción del antígeno se diluyó hasta una concentración final de urea 1 M con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; Na2HPO4 1,9 mM, NaH2PO4 8,1 mM, NaCl 154 mM), seguido de una etapa de concentración para aumentar la concentración de proteína utilizando un concentrador Vivapore 10/20 con un límite de exclusión de peso molecular a 7500 Da (Vivascience AG). Se determinó la concentración de proteínas utilizando un protocolo de microensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) con un patrón de albúmina de suero bovina según las recomendaciones del fabricante. Se analizó la calidad de las proteínas con un instrumento Bioanalyzer utilizando el ensayo Protein 50 ó 200 (Agilent Technologies).

b) Resultados

Un fragmento génico que se corresponde con los nucleótidos 1542-1910 del transcrito largo (SEQ ID NO:3) del gen SATB2 y que codifica un péptido (SEQ ID NO:1) que consiste en los aminoácidos 377 a 499 de la proteína diana SATB2 (SEQ ID NO:2) se aisló de modo satisfactorio mediante una RT-PCR de un agrupamiento de ARN humano utilizando cebadores específicos para el fragmento de proteína. Sin embargo, había una mutación de un solo nucleótido silenciosa en la secuencia, comparada con la secuencia de ENSG00000119042 de EnsEMBL. Se diseñó el fragmento de 123 aminoácidos (SEQ ID NO:1) de la proteína diana (SEQ ID NO:2) para que careciese de las regiones transmembrana para asegurar una expresión eficaz en E. coli, y para que careciese de cualquier péptido señal, puesto que éstos se escinden de la proteína madura. Además, el fragmento de proteína se diseñó para que consistiera en una secuencia exclusiva con baja homología con otras proteínas humanas, para minimizar la reactividad cruzada de los reactivos de afinidad generados, y para tener un tamaño adecuado para permitir la formación de epitopos conformacionales y aún permitir una clonación y expresión eficaces en sistemas bacterianos.

Se identificó un clon que codificaba la secuencia de aminoácidos correcta y, tras la expresión en E. coli, se produjo una única proteína con el tamaño correcto y posteriormente se purificó utilizando una cromatografía de iones metálicos inmovilizados. Después de la dilución de la muestra eluida hasta una concentración final de urea 1 M y de la concentración de la muestra hasta 1 ml, se determinó que la concentración del fragmento de proteína era de 7,4 mg/ml y que era 98% pura según un análisis de pureza.

2) Generación de anticuerpos

a) Materiales y métodos

El fragmento de SATB2 purificado, obtenido como se indicó anteriormente, se empleó como antígeno para inmunizar un conejo según las líneas directrices nacionales (permiso sueco nº A 84-02). El conejo se inmunizó por vía intramuscular con 200 g del antígeno en adyuvante completo de Freund como inmunización primaria, y se reforzó tres veces en intervalos de cuatro semanas con 100 g de antígeno en adyuvante incompleto de Freund.

Se purificó el antisuero del animal inmunizado mediante un protocolo basado en inmunoafinidad de tres etapas (Agaton C. et al. (2004), J. Chromatogr., A 1043:33-40; Nilsson P. et al. (2005), Proteomics, 5:4327-4337). En la primera etapa, se tamponaron 10 ml del antisuero total con 10x PBS hasta una concentración final de 1x PBS (Na2HPO4 1,9 mM, NaH2PO4 8,1 mM, NaCl 154 mM), se filtró utilizando un filtro de tamaño de poro 0,46 m (Acrodisc, Life Science) acoplado a la proteína del marcador de afinidad dual His6-ABP (un marcador de hexahistidilo y un marcador de proteína de unión a la albúmina) expresada a partir del vector pAff8c y purificada de la misma manera que se describió anteriormente para el fragmento de proteína del antígeno. En la segunda etapa, la corriente, sin los anticuerpos contra el marcador de afinidad dual His6-ABP, se cargó con un caudal de 0,5 ml/min en una columna HP NHS-activada Hi-Trap de 1 ml (GE Healthcare) acoplada con el fragmento de proteína de SATB2 utilizada como antígeno para la inmunizacón (SEQ ID NO:1). La proteína His6-ABP y el antígeno de fragmento de proteína se habían acoplado a la matriz activada NHS según recomendia el fabricante. El material no unido se eliminó mediante lavado con 1x PBST (1x PBS, Tween20 al 0,1%, pH 7,25), y los anticuerpos capturados se eluyeron utilizando un tampón de glicina de pH bajo (glicina 0,2 M, EGTA 1 mM, pH 2,5). La fracción de anticuerpos eluida se recogió de modo automático, y se cargó sobre dos columnas desaladoras HiTrap™ de 5 ml (GE Healthcare) conectadas en serie para un eficaz intercambio de tampón en la tercera etapa. La segunda y tercera etapa de purificación se realizaron en la plataforma ÄKTAxpress™ (GE Healthcare). Los anticuerpos selectivos para el antígeno (monoespecíficos) (msAb) se eluyeron con tampón PBS, se suplementaron con glicerol y NaN3 hasta unas concentraciones finales de 50% y 0,02%, respectivamente, para una conservación a largo plazo a 20 ºC (Nilsson P. et al. (2005), Proteomics, 5:4327-4337).

La especificidad y la selectividad de la fracción de anticuerpo purificado por afinidad se analizó mediante un análisis de unión contra el propio antígeno y contra otros 94 fragmentos de proteínas humanas en una disposición de matriz de proteínas (Nilsson P. et al. (2005), Proteomics, 5:4327-4337). Los fragmentos de proteínas se diluyeron hasta 40 g/ml en urea 0,1 M y 1x PBS (pH 7,4), y se trasladaron 50 l de cada uno a los pocillos de una placa de puntos de 96 pocillos. Los fragmentos de proteínas se dispusieron en puntos y se inmovilizaron sobre portaobjetos epoxídicos (SuperEpoxy, TeleChem) utilizando un formador de matriz de perno y anillo (Affymetrix 427). El portaobjetos se lavó en 1x PBS (5 min) y después la superficie se bloqueó (SuperBlock, Pierce) durante 30 minutos. Se aplicó un adhesivo de mascara de silicona de 16 pocillos (Schleicher & Schuell) al vidrio antes de añadir los anticuerpos monoespecíficos (diluidos 1:2000 en 1x PBST hasta aproximadamente 50 ng/ml) y se incubó en un agitador durante 60 min. Se coincubaron anticuerpos IgY específicos del marcador de afinidad, junto con los anticuerpos monoespecíficos para cuantificar la cantidad de proteína en cada punto. El portaobjetos se lavó con 1x PBST y 1x PBS dos veces durante 10 min cada una. Anticuerpos secundarios (anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con Alexa 647, y anticuerpo antipollo de cabra conjugado con Alexa 555, Molecular Probes) se diluyeron 1:60000 hasta 30 ng/ml en 1x PBST y se incubaron durante 60 min. Después del mismo procedimiento de lavado que se realizó para la primera incubación, el portaobjetos se secó por centrifugación y se barrió (aparato de barrido de matrices G2565BA, Agilent), y las imágenes se cuantificaron utilizando un programa informático de análisis de imágenes (GenePix 5.1, Axon Instruments). Los resultados se analizan a continuacón y se presentan en la figura 1.

Además, se analizó la especificidad y la selectividad del anticuerpo purificado por afinidad mediante un análisis de la transferencia Western. La transferencia Western se realizó mediante la separación de los extractos de proteínas totales procedentes de líneas celulares y tejidos humanos sobre geles de gradiente de SDS-PAGE Criterion™ al 1020% premoldeados (Bio-Rad Laboratories) bajo condiciones reductoras, seguido de una electrotransferencia hacia membranas de PVDF (Bio-Rad Laboratories) según las recomendaciones del fabricante. Las membranas se bloquearon (leche en polvo al 5%, 1x TBST; Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tween20 al 0,5%) durante 1 h a temperatura ambiente, se incubaron con el anticuerpo purificado por afinidad primario diluido 1:500 en tampón de bloqueo y se lavaron en TBST. El anticuerpo conjugado con HRP secundario (inmunoglobulina anticonejo de cerdo/HRP, DakoCytomation) se diluyó 1:3000 en tampón de bloqueo y la detección de la quimioluminiscencia se realizó utilizando una cámara CCD Chemidoc™ (Bio-Rad Laboratories) y un sustrato SuperSignal West Dura Extended Duration (Pierce), según el protocolo del fabricante. Los resultados se analizan a continuación y se presentan en la figura 2.

b) Resultados

La calidad de las preparaciones de los anticuerpos policlonales ha demostrado ser dependiente del grado de rigurosidad en las preparaciones de anticuerpos, y previamente se había demostrado que la eliminación de los anticuerpos dirigidos contra epitopos que no se originan de la proteína diana es necesaria para evitar la reactividad cruzada con otras proteínas y la unión de fondo (Agaton C. et al. (2004), J. Chromatogr., A 1043:33-40).

Por tanto, se realizó un análisis de micromatriz de proteínas para asegurarse de que se habían generado anticuerpos policlonales monoespecíficos de alta especificidad por la eliminación de los anticuerpos dirigidos contra el marcador His6, así como los de anticuerpos contra el marcador ABP. A esto le siguió la captura por afinidad de anticuerpos selectivos del antígeno en una columna de afinidad con el antígeno inmovilizado.

Para cuantificar la cantidad de proteína en cada punto de la matriz de proteínas se empleó un sistema de marcaje de dos tintes de color, con una combinación de anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos IgY específicos del marcador generados en gallinas se detectaron con un anticuerpo antigallina de cabra secundario marcado con el tinte fluorescente Alexa 555. La unión específica de los msAb de conejo a su antígeno sobre la matriz se detectó con un anticuerpo anticonejo de cabra marcado de modo fluorescente con Alexa 647. En la figura 1, los resultados de la matriz se muestran como barras que se corresponden con la cantidad de la intensidad de fluorescencia de Alexa 647 (eje de ordenadas) detectada a partir de cada punto de la matriz. Cada fragmento de proteína se aplica en puntos por duplicado, y cada barra sobre el eje de abscisas del diagrama representa un punto de proteína. El análisis de la matriz de proteínas demuestra que el anticuerpo monoespecífico purificado por afinidad contra SATB2 es muy selectivo para el fragmento de proteína correcto y demuestra un fondo muy bajo para todos los demás fragmentos de proteínas analizados en la matriz.

El resultado del análisis de la transferencia Western (figura 2) demuestra que el anticuerpo detecta de modo específico una única banda de aproximadamente 100 kDa en una línea celular de tumor de vejiga (RT-4), una línea celular de cistadenocarcinoma de ovario (EFO-21), y una línea celular epidermoide (A-431) (carriles 1-3). Además, se observa una banda específica más débil en muestras de tejido de hígado y amígdala (carriles 4-5). El peso molecular teórico de SATB2 es 82 kDa (calculado a partir de la secuencia de aminoácidos de SATB2, SEQ ID NO:2), que se corresponde bien con los resultados obtenidos teniendo en cuenta el hecho de que la proteína analizada puede estar glicosilada o modificada de otra manera bajo las condiciones del análisis.

3) Establecimiento del perfil de tejidos mediante inmunohistoquímica

a) Materiales y métodos

En total, se analizaron 576 núcleos de parafina que contenían tejidos humanos utilizando la muestra de anticuerpo monoespecífico. Todos los tejidos utilizados como bloques donantes para la producción de una micromatriz de tejidos (TMA) se seleccionaron de los archivos del Departamento de Patología, Hospital Universitario, Uppsala, de acuerdo con la aprobación del comité ético local. Se estudiaron secciones de tejidos correspondientes para determinar el diagnóstico y para seleccionar áreas representativas en los bloques donantes. El tejido normal se definió como microscópicamente normal (no neoplásico) y se seleccionó de forma más habitual de especímenes recogidos de la vecindad de tumores retirados quirúrgicamente. El tejido del cáncer se evaluó para el diagnóstico y la clasificación. Todos los tejidos se fijaron en formaldehido, se sumergieron en parafina, y se cortaron en secciones para objetivos de diagnóstico.

La producción de TMA se realizó fundamentalmente como se ha descrito previamente (Kononen J. et al. (1998), Nature Med., 4:844-847; Kallioniemi O.P. et al. (2001), Hum. Mol. Genet., 10:657-662). Brevemente, se realizó un orificio en el bloque de TMA receptor. Se extrajo una muestra cilíndrica de la parte central del tejido del bloque donante y se depositó en el bloque de TMA receptor. Esto se repitió en un formador de matrices de tejidos automático de Beecher Instruments (ATA-27, Beecher Instruments, Sun Prairie, CA, EEUU) hasta que se produjo un diseño de TMA completo. Los bloques receptores de TMA se cocieron a 42 ºC durante 2 h antes de cortar las secciones.

El diseño de las TMA se centró en obtener muestras de una amplia gama de tejidos normales representativos, y en incluir tejidos de cánceres representativos. Esto se ha descrito previamente en detalle en Kampf C. et al. (2004), Clin. Proteomics, 1:285-300. Brevemente, se seleccionaron muestras de 48 tejidos normales y de 20 de los tipos más comunes de cáncer que afectan al ser humano. En total, se produjeron ocho diseños diferentes de bloques de TMA, conteniendo cada uno 72 partes centrales de tejidos con un diámetro de 1 mm. Dos de las TMA representan tejidos normales, que se corresponden con 48 tejidos normales diferentes por triplicado procedentes de individuos diferentes. Las 6 TMA remanentes representa tejidos de cánceres de 20 tipos diferentes de cáncer. Para 17 de los 20 tipos de cánceres se muestrearon 12 tumores individuales diferentes, y para los 3 tipos de cáncer remanentes se muestrearon 4 tumores individuales diferentes, todos por duplicado del mismo tumor. Los bloques de TMA se cortaron en secciones con un espesor de 4 m utilizando un microtomo de cascada (Leica) y se colocaron en portaobjetos de vidrio SuperFrost (Roche Applied Science) para un análisis inmunohistoquímico.

La inmunohistoquímica automática se realizó como se describió previamente (Kampf C. et al. (2004), Clin. Proteomics, 1:285-300). Brevemente, los portaobjetos de vidrio se incubaron durante 45 min a 60 ºC, se desparafinaron en xileno (2 x 15 min) y se hidrataron en alcoholes graduados. Para la obtención del antígeno, los portaobjetos se sumergieron en TRS (“Target Retrieval Solution”, disolución de obtención de la diana, pH 6,0, 5 DakoCytomation) y se hirvieron durante 4 min a 125 ºC en una cámara Decloaking (Biocare Medical). Los portaobjetos se colocaron en el Autostainer (DakoCytomation), y la peroxidasa endógena se bloqueó inicialmente con H2O2 (DakoCytomation). El anticuerpo primario y Envision conjugado con peroxidasa anticonejo de cabra se incubaron durante 30 min cada uno a temperatura ambiente. Entre todas las etapas, los portaobjetos se enjuagaron con tampón de lavado (DakoCytomation). Por último, se empleó diaminobenzidina (DakoCytomation) como

10 cromógeno y se empleó hematoxilina de Harris (Sigma-Aldrich) para la contratinción. Los portaobjetos se montaron con Pertex (Histolab).

Todas las secciones inmunohistoquímicamente teñidas de las ocho TMA diferentes se barrieron utilizando un sistema de barrido de portaobjetos automático ScanScope T2 (Aperio Technologies). Para representar el contenido total de las ocho TMA se generaron 576 imágenes digitales. El barrido se realizó con una magnificación en 20 veces. 15 Las imágenes digitales se separaron y se extrajeron como archivos de formato de archivo de imágenes de etiqueta (TIFF) individuales para el almacenamiento de los datos originales. Para poder manejar las imágenes en un sistema de anotación basado en la Red, las imágenes individuales se comprimieron desde el formato TIFF al formato JPEG. Todas las imágentes del tejido inmunohistoquímicamente teñido se evaluaron de forma manual al microscopio y fueron anotadas por un patólogo certificado por la junta o por personal especialmente cualificado (seguido de la 20 verificación por un patólogo). La anotación de cada tejido normal y de cáncer diferente se realizó utilizando un esquema simplificado para la clasificación de resultados inmunohistoquímicos. Cada tejido se estudió para la representatividad y la inmunorreactividad. Los diferentes tipos celulares específicos de tejidos incluidos en cada tipo de tejido normal se anotaron. Para cada cáncer se anotaron las células tumorales y el estroma. Los parámetros de anotación básicos incluían una evaluación de i) la intensidad de la tinción, ii) la fracción de células teñidas, y iii) la 25 localización subcelular (nuclear y/o citoplásmica/membranosa). La intensidad de la tinción se evaluó subjetivamente según patrones utilizados en el diagnóstico histopatológico clínico, y los resultados se clasifican como: negativo = no hay inmunorreactividad, débil = una inmunorreactividad débil, moderado = una inmunorreactividad media, o fuerte = una inmunorreactividad marcada y fuerte. La fracción de células teñidas se clasificó como <2%, 2-25%, 26-75%, o >75% de células inmunorreactivas de la población celular representativa. Basándose en la intensidad y la fracción de

30 células inmunorreactivas se produjo una “puntuación de tinción” para cada muestra de tejido: 0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderada, y 3 = fuerte.

b) Resultados

Los resultados del establecimiento del perfil de tejidos con el anticuerpo monoespecífico generado contra un fragmento de proteína recombinante de la proteína diana humana SATB2 muestran una inmunorreactividad 35 particular (gris oscuro) en varios tejidos normales y en cáncer colorrectal (tablas 1-4 y figuras 3-4).

La tabla 1 muestra el patrón de expresión de la proteína SATB2 en tejidos humanos normales. Utilizando la inmunohistoquímica y la tecnología de TMA, se evaluaron 144 puntos (diámetro de 1 mm) que representan 48 tipos diferentes de tejido normal para la expresión de SATB2. La tabla 1 muestra el nivel de expresión en los diferentes tejidos. Se descubrió una expresión fuerte (puntuación de tinción 3) en tejidos del tracto GI distal y en dos áreas del

40 cerebro. Se detectaron unos niveles moderados de expresión (puntuación de tinción 2) en los testículos y el epidídimo. Las células linfoides focales mostraron una expresión moderada o débil (puntuación de tinción 1). Todas las demás células y tejidos fueron negativos (puntuación de tinción 0). N.R. significa que había tejidos representativos. El SATB2 también se expresa en algunos tejidos neuronales y en testículos.

Tabla 1: Patrón de expresión de SATB2 en tejidos normales

Tipo de tejido: Tipo celular Puntuación de tinción

Glándula adrenal: células corticales 0

células medulares: N.R.

Apéndice: células glandulares 3

tejido linfoide: 0

Médula ósea: células poyéticas de la médula ósea 0

Mama: células glandulares 0

Bronquio: células epiteliales superficiales 0

Cerebelo: células en la capa granular 0

Tabla 1: Patrón de expresión de SATB2 en tejidos normales

Tipo de tejido: Tipo celular Puntuación de tinción

células en la capa molecular: 0

células de Purkinje: 0

Corteza cerebral: células neuronales 3

células no neuronales: 0

Cérvix, útero: células glandulares 0

células epiteliales superficiales (escamosas): N.R.

Colon: células glandulares 3

Duodeno: células glandulares 0

Endometrio 1: células en el estroma endometrial/ECM 0

células en el miometrio/ECM: 0

células glandulares: 0

Endometrio 2: células en el estroma endometrial/ECM 0

células en el miometrio/ECM: 0

células glandulares: 0

Epidídimo: células glandulares 2

Esófago: células epiteliales superficiales 0

Tubo de Falopio: células glandulares 0

Vesicula biliar: células glandulares 0

Músculo cardíaco: miocitos 0

Hipocampo: células neuronales 3

células no neuronales: 0

Riñón: células en glomérulos 0

células en túbulos: 0

Ventrículo lateral: células neuronales 0

células no neuronales: 0

Hígado: células del conducto biliar 0

hepatocitos: 0

Pulmón: células alveolares 0

macrófagos: 0

Nódulo linfático: células foliculares (corteza) 0

células no foliculares (paracorteza): 2

Nasofaringe: células epiteliales superficiales 0

Mucosa oral: células epiteliales superficiales 0

Tabla 1: Patrón de expresión de SATB2 en tejidos normales

Tipo de tejido: Tipo celular Puntuación de tinción

Ovario: células foliculares 0

células estromáticas ováricas: 0

Páncreas: páncrease exocrino 0

células de los islotes: 0

Glándula paratiroide: células glandulares 0

Placenta: células deciduales 0

células trofoblásticas: 0

Próstata: células glandulares 0

Recto: células glandulares 3

Glándula salivar: células glandulares 0

Vesícula seminal: células glandulares 0

Músculo esquelético: miocitos 0

Piel: células adnexales 0

células epidérmicas: 0

Intestino delgado: células glandulares 0

Músculo liso: células del músculo liso 0

Tejido blando 1: células mesenquimáticas 0

Tejido blando 2: células mesenquimáticas 0

Bazo: células en la pulpa roja 0

células en la pulpa blanca: 0

Estómago 1: células glandulares 0

Estómago 2: células glandulares 0

Testículos: células en el conducto seminal 2

células de Leydig: 0

Glándula tiroides: células glandulares 0

Amígdala: células foliculares (corteza) 0

células no foliculares (paracorteza): 1

células epiteliales superficiales: 0

Vejiga urinaria: células epiteliales superficiales 0

Vagina: células epiteliales superficiales 0

Piel de la vulva/anal: células epiteliales superficiales 0

En la figura 3A aparece una ampliación microscópica que muestra positividad nuclear (gris oscuro) en neuronas de la corteza cerebral y del hipocampo. El tejido circundante y las células gliales son negativas (gris claro). Las secciones de tejidos de los testículos muestra una positividad moderada y principalmente nuclear (gris oscuro) en el conducto seminal (figura 3B).

Un descubrimiento específico en la matriz histológica que implica a esta invención es la positividad nuclear marcada y fuerte (gris oscuro) encontrada en las células glandulares de la mucosa en el apéndice (figura 3C), colon (3D) y recto (3E). Nótese la tinción negativa (gris claro) en otros tipos celulares, por ejemplo células inflamatorias, células endoteliales, también presentes en la mucosa. La figura 3F muestra dos ampliaciones de alta potencia de la mucosa

5 colónica que demuestran que todas las células glandualres presentan una expresión nuclear fuerte (gris oscuro) de la proteína SATB2.

La tabla 2 muestra el nivel de expresión de SATB2 en 216 diferentes tejidos de cánceres. La totalidad de los 11 carcinomas colorrectales representados muestran positividad, y en 8 de éstos la expresión fue fuerte. En la figura 4A se muestran ampliaciones microscópicas de baja potencia de secciones de tejidos inmunohistoquímicamente

10 teñidos que muestran los 11 casos analizados de carcinoma colorrectal, mientras que en la figura 4B se muestran ampliaciones de alta potencia de áreas representativas de seis de los carcinomas colorrectales. Una amplia mayoría de las células de cáncer muestra una tinción nuclear fuerte (gris oscuro), que indica un alto nivel de expresión de SATB2 comparado con el tejido negativo circundante (gris claro) que contiene células normales.

Tabla 2: Patrón de expresión de SATB2 en 20 tipos de cánceres

Tipo de cáncer: Sujeto nº

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Cáncer de mama: 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R.

Cáncer cervical: 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer colorrectal: 3 3 3 3 3 3 3 3 2 1 1 N.R.

Cáncer endometrial: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer de cabeza y cuello: 0 0 0 0

Cáncer de riñón: 3 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R.

Cáncer de hígado: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer de pulmón: 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Carcinoide maligno: 0 0 0 0

Glioma maligno: 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Linfoma maligno: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Melanoma maligno: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R. N.R. N.R.

Cáncer de ovario: 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer pancreático: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R.

Cáncer de próstata: 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer de piel: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer de estómago: 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Cáncer de testículos: 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R.

Cáncer de tiroides: 0 0 0 0

Cáncer urotelial: 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 N.R.

4) TMA de cáncer colorrectal

15 a) Materiales y métodos

Se recogió tejido incrustado en parafina fijado en formaldehído de archivo procedente de 122 pacientes (63 mujeres y 59 hombres) diagnosticados de carcinoma colorrectal entre 1999 y 2002 del Departamento de Patología, Hospital Universitario de Malmö, Suecia. La edad media de los pacientes era de 75 años (32-88 años). Treinta y nueve tumores estaban en la etapa A de Dukes, 42 en la etapa B de Dukes, y 41 en la etapa C de Dukes. La información sobre la fecha de la muerte se obtuvo de los registros regionales de causas de muerte para todos los pacientes. Seobtuvo el permiso ético del Comité Ético Local.

La totalidad de los 122 casos de carcinoma colorrectal se reevaluó histopatológicamente en portaobjetos teñidos con hexatoxilina y eosina. Entonces se construyeron las TMA muestreando 2 x 1,0 mm de la parte central por caso de áreas representativas de cáncer invasivo. Las TMA se prepararon y se realizó una inmunohistoquímica automática según se describió en la sección 3 anterior, utilizando el anticuerpo SATB2 preparado como se describió en la sección 2 anterior.

La anotación del tejido se realizó fundalmentalmente como se describió en la sección 3 anterior, con la excepción de que la intensidad de la tinción se consideró negativa (sin inmunorreactividad o inmunorreactividad débil) o positiva (inmunorreactividad moderada o fuerte). Entonces se calculó la fracción de células que muestran una intensidad de tinción positiva en los núcleos celulares, produciendo un valor denominado “puntuación de fracción” para la muestra. Por tanto, la “puntuación de fracción” corresponde al porcentaje de células en una muestra que exhiben una intensidad de tinción positiva según la definición en esta sección.

Basándose en las tendencias de supervivencia para todos los estratos diferentes, se construyó una variable dicotomizada para posteriores análisis estadísticos, que define una expresión de SATB2 alta/positiva como >25% de núcleos positivos, y una expresión de SATB2 baja/negativa como <25% de núcleos positivos. Las muestras entonces se clasificaron en dos grupos basados en la puntuación de fracción, utilizando 25% de la puntuación de fracción como criterio divisorio. Por tanto, la ausencia de señal o una intensidad de tinción positiva en <25% de las células en una muestra de tejido (parte central) clasifica dicha muestra en el grupo “<25%”, mientras que una intensidad de tinción positiva en >25% de las células en la parte central clasifica dicha muestra en el grupo “>25%”.

La anterior clasificación de muestras se utilizó para un análisis de la supervivencia global según el estimador de Kaplan-Meier, y se empleó el ensayo de rangos logarítmicos para comparar la supervivencia en diferentes estratos. Todos los ensayos estadísticos fueron bilaterales, y unos valores p < 0,05% se consideraron significativos. Todos los cálculos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 12.0 (SPSS Inc., Illinois, EEUU).

b) Resultados

Un análisis basado en micromatrices de tejidos de 122 carcinomas colorrectales demostró que 99 tumores (81%) eran positivos para SATB2. De modo sorprendente, no fue posible predecir una baja expresión o una ausencia de expresión de SATB2 mediante el corte de secciones y la tinción histoquímica habitual, tal como se muestra en la figura 5. Ambas muestras de tumor (las secciones se muestran por duplicado) se diagnosticaron como adenocarcinoma colorrectal con diferenciación intermedia. La figura 5A muestra una sección con una fuerte expresión de SATB2, y en la figura 5B, la muestra carece de expresión de SATB2.

Los resultados del análisis de la supervivencia se muestran en la figura 6, en la que los diagramas muestran la supervivencia cumulativa en diferentes agrupaciones de pacientes a lo largo del tiempo. El análisis de la supervivencia basado en la cohorte completa reveló una tendencia (p = 0,14) hacia una supervivencia global (SG) más corta para pacientes que tienen tumores con baja expresión de SATB2 (figura 6A). La relación entre la expresión de SATB2 y las variables clinicopatológicas del género y la etapa de Dukes también se estudió. Las pacientes mujeres (n = 63) que tienen tumores con baja expresión de SATB2 muestra una mayor tendencia (p = 0,11) para una SG aún más corta comparado con la cohorte completa (figura 6B). La figura 6C muestra que se observó una tendencia similar (p = 0,10) en pacientes negativos en nódulo (etapa A y B de Dukes) (n =80). En el subgrupo de mujeres negativas en nódulos (n = 44), esta tendencia era significativa (p = 0,04) (figura 6D).

Otra manera de presentar los datos del análisis de la supervivencia puede ser utilizando la “puntuación de tinción” descrita en la sección 3 anterior. En este caso, las muestras puntuadas como 0 y 1 se definirían como baja expresión de SATB2, y las muestras puntuadas como 2 y 3 se definirían como alta expresión de SATB2. Se espera un resultado similar al observado en la figura 6.

5) Análisis de imágenes cuantitativo de los datos de TMA

Para obtener una medición de la expresion cuantitativa, se utiliza el sistema Aperio ScanScope CS Slide Scanner (Aperio Technologies, Vista, CA, EEUU) para capturar imágenes digitales de los portaobjetos de TMA hibridados preparados como se describió en la sección 4 anterior. El barrido se realiza con una ampliación en 20 veces y las imágenes se almacenan como TIFF de múltiples capas. Estas imágenes digitales se visualizan utilizando ImageScope (Aperio) y se consideran adecuadas para el análisis. Las imágenes se extraen de la matriz para visualizar las partes centrales de los tejidos individuales utilizando TMA Lab (Aperio). En un primer momento se emplea el algoritmo Color Deconvolution (Aperio) para separar cada imagen en tres canales, es decir, rojo, verde y azul (RGB). Esto permite medir por separado cada mancha y, por tanto, posibilita restar la contratinción de hematoxilina de la tinción de cromógeno diaminobenzidina.

Posteriormente, se empleó una serie de algoritmos diferentes para cuantificar la tinción nuclear, citoplásmica o membranosa. Se empleó el algoritmo IHC Nuclear (Aperio) para cuantificar la tinción nuclear de SATB2. Los núcleos se identificaron basándose en la intensidad. Los bordes de los núcleos se identificaron utilizando un procedimiento de umbral de borde, que ajusta automáticamente el umbral según la media de los píxeles del borde. Una descripción completa del algoritmo se encuentra disponible en Aperio Technologies. Se generó una imagen de margen de pseudocolor y se evaluó para confirmar la precisión de cada algoritmo.

Los valores de salida del algoritmo Nuclear son un porcentaje de núcleos positivos y un valor de intensidad RGB nuclear para cada parte central en el portaobjetos de TMA. Se calcula una autopuntuación (AP) para el nivel de expresión de SATB2 en cada parte central de tejido multiplicando el porcentaje de núcleos positivos por la intensidad RGB nuclear para cada parte central. El análisis de AP se realiza en muestra de TMA de cáncer, por ejemplo, las descritas en la sección 4 anterior, y se calcula la supervivencia global según el método de Kaplan-Meier. Se emplea el ensayo de rangos logarítmicos para comparar la supervivencia en diferentes estratos. Los cálculos estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 12.0 (SPSS Inc., Illinois, EEUU).

6) Análisis de agrupamientos

a) Materiales y método

Para investigar la concordancia en expresión de proteínas entre marcadores conocidos para el cáncer de colon y SATB2, se realizó un agrupamiento jerárquico. El agrupamiento es un método adecuado para evaluar tendencias y estructuras en datos en etapas de minado iniciales. Las agrupaciones y las categorías que no son obvias sólo observando los datos pueden detectarse con facilidad utilizando métodos no supervisados, tales como el agrupamiento jerárquico. En la ciencia real, el agrupamiento se ha utilizado mucho en análisis transcripcionales de ARN, tales como en datos de micromatrices.

Los 6 TMA de cáncer descritos en la sección 3 anterior se volvieron a utilizar, es decir, un total de 216 muestras de tejido de cáncer. Además de los anticuerpos que reconocen a SATB2 preparados como en la sección 2 anterior, se ensayaron anticuerpos contra los marcadores establecidos CEA (DAKO, Glostrup, Dinamarca), CK20 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), CDX2 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido), p53 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), Ki67 (DAKO, Glostrup, Dinamarca) y ciclina B1 (Transduction laboratories, Lexington, EEUU) utilizando un método de inmunohistoquímica automático análogo al descrito en la sección 3.

Los patólogos anotaron los TMA tal como se presenta en la sección 3, y ofrecieron una puntuación de tinción a cada parte central utilizando una escala de 0-3, en la que 3 es una tinción fuerte (negro) y 0 es no tinción (blanco). El agrupamiento se realizó utilizando el lenguaje de cálculo estadístico R. El algoritmo de agrupamiento se utilizó en las dos dimensiones de la matriz de datos, los tejidos y los anticuerpos. En total se utilizaron 7 anticuerpos y 216 tejidos en el procedimiento de agrupamiento. Se retiraron 8 tejidos porque no había imágenes que pudiesen cuantificar los niveles de expresión. El agrupamiento se realizó utilizando un método jerárquico de arriba a abajo con aglomeración media basado en una métrica de distancia euclidiana, en que las distancias entre agrupamientos se recalculan en cada etapa mediante la fórmula de actualización de desemejanza de Lance-Williams según el enlace medio. El algoritmo utilizado en el agrupamiento ordena los subárboles de forma que el agrupamiento más apretado se muestra a la izquierda de cada nudo.

Para estudiar más a fondo la diferencia y la similitud entre SATB2 y CK20, se realizó un análisis de inmunohistoquímica utilizando el TMA de cáncer con las 122 partes centrales de carcinomas descritos en la sección

4. Los TMA se tiñeron con anticuerpo SATB2 preparado como en la sección 2, y con anticuerpo CK20 obtenido en DAKO (Glostrup, Dinamarca). Los dos TMA se compararon después de ser anotados según la “puntuación de fracción” definida en la sección 4.

b) Resultados

La especificidad de SATB2 como marcador para el carcinoma colorrectal comparado con los marcadores establecidos CEA, CK20, CDX2, p53, Ki67 y ciclina B1 se estudió en 216 tumores diferentes. El agrupamiento jerárquico de los datos procedentes de los perfiles de expresión de estas 7 proteínas diferentes produjeron un mapa de calor y los dendrogramas adjuntos que aparecen en la figura 7. A partir del mapa de calor y dendrograma de los tumores, es evidentes que una amplia mayoría de los carcinomas colorrectales forman un agrupamiento que se separa en el nivel mayor basándose en los altos niveles de expresión de SATB2, CK20, CDX2 y CEA. Además, el análisis muestra que SATB2 se agrupa junto con el agrupamiento de CK20 y CDX2, teniendo todos una expresión más específica que otros marcadores ensayados que muestran un patrón de expresión más general. En el agrupamiento de 8 carcinomas colorrectales también había un adenocarcinoma cervical y un caso de carcinoma de hígado colangiocelular que eran muy positivos para SATB2. Fuera de este agrupamiento, había tres carcinomas colorrectales negativos para SATB2. De modo interesente, el patrón de expresión de SATB2 no se correlaciona claramente con la expresión de CK20 y, por tanto, podría actuar como complemento a CK20 durante la caracterización del cáncer colorrectal.

SATB2 y CK20 se analizaron con más detalle en los 122 TMA de carcinoma descritos en la sección 4. El CK20 por sí solo confirmó 86% (105/122), y el SATB2 por sí solo confirmó 81% (99/122) de los 122 carcinomas colorrectales con una puntuación de fracción de >25% (figura 8). De modo interesante, combinando los datos de la tinción para ambos marcadores, 93% (113/112) de lo cánceres colorrectales fueron claramente positivos para uno o ambos marcadores. Sólo 5 pacientes carecieron completamente de expresión de CK20 o STAB2. Esta información resulta de interés cuando se diagnostica un cáncer y, más específicamente, cuando se intenta identificar una metástasis, puesto que un problema clínico habitual con el cáncer son los pacientes que presentan una metástasis de origen desconocido. Por tanto, combinando la información de CK20 y SATB2, los pacientes pueden obtener con más facilidad un diagnóstico preciso para el adenocarcinoma colorrectal.

5 Además se analizó la expresión de SATB2 y CK20 en metástasis de nódulos linfáticos de 17 pacientes con cáncer colorrectal. El CK20 por sí solo confirmó el origen de 88% (15/17) de las metástasis con una puntuación de tinción de 2 ó 3. El SATB2 por sí solo confirmó el origen de 82% (14/17) de las metástasis con una puntuación de fracción de >25% (figura 9). Combinando los datos de la tinción para ambos marcadores se confirma el origen de 94% (16/17) de las metástasis. Esto apoya aún más la noción de que la información con respecto a la expresión de

10 SATB2 y CK20 resulta deseable cuando se determinar si una metástasis se origina a partir de un cáncer colorrectal.

<110> Atlas Antibodies AB

5: <120> NUEVOS MÉTODOS <130> 21031658

10: <150> documento EP06114954.8 <151> 2 de junio de 2006 <150> documento US 60/816 613 <151> 27 de junio de 2006

15: <160> 3 <170> PatentIn version 3.3

20: <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

25 <210> 2

<211> 733

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 2

LISTADO DE SECUENCIAS

imagen1

<210> 3

<211> 5318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

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Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método in vitro para detectar si una metástasis de origen desconocido se origina de un cáncer colorrectal, detectando la presencia de la proteína SATB2. 2.- El método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína SATB2 comprende 5 una secuencia seleccionada de: i) SEQ ID NO:1; y

ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:1. 3.- El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína SATB2 comprende una secuencia seleccionada de:

10 i) SEQ ID NO:2; y ii) una secuencia que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:2. 4.- Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la detección y/o la cuantificación

simultánea o secuencial de la proteína SATB2 y la proteína CK20. 5.- El uso in vitro de una proteína SATB2 como marcador molecular para distinguir el cáncer colorrectal de otros 15 cánceres. 6.- El uso in vitro de un anticuerpo, o un fragmento Fab o un fragmento Fr o un fragmento Fr monocatenario (scFr) de éste, capaz de una interacción selectiva con una proteína SATB2, como agente para distinguir el cáncer colorrectal de otros cánceres.