CN101460850A - Satb2蛋白作为结肠直肠癌标记的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过识别作为结肠直肠癌类型的标记的SATB2蛋白，提供了与这种癌症的检测、鉴定和预后有关的新方法、手段和应用。

Description

SATB2蛋白作为结肠直肠癌标记的应用
技术领域
本发明涉及癌症诊断和预后领域。具体而言，它提供了一种通过鉴别作为结肠直肠癌的标记的SATB2蛋白来用于检测和鉴定结肠直肠癌的新方法。
背景技术
SATB2
编码富含AT的特殊序列结合蛋白2(special AT-richsequence-binding protein 2，SATB2)的基因是在1999年人类基因组测序的浩大工程中被鉴别出的(Kikuno R et al(1999)DNARes.6：197-205)。自此，SATB2基因被认为主要在神经组织中表达。
SATB2是一个形成核基质各部分的转录因子，并且它通过与富含AT的序列(也称为基质结合区(MARs))相互作用来调控高度有序的染色质(high-order chromatin)结构从而进行组织特异性的基因表达(Dickinson LA et al(1992)Cell 70，631-45；FitzPatrick DR et al(2003)Hum.Mol.Genet.12，2491-501；Yasui D，(2002)Nature 419，641-5；Bode，J(2000)Crit.Rev.Eukaryot.Gene.Expr.10，73-90)。
对该基因及其蛋白产物SATB2蛋白的研究，指出它作为转录因子在神经组织中参与基因表达的调控(Dobreva G et al(2003)Genes Dev.17：3048-3061；Britanova O et al(2005)Eur.J.Neurosci.21：658-668)。还有记载，SATB2基因在腭发育和腭裂中起作用(FitzPatrick DR et al(2003)Human Mol.Genet.12：2491-2501；vanBuggenhout G et al(2005)Eur.J.Med.Genet.48：276-289)。
Salahshor等人对一名腺瘤性结肠息肉病(APC)基因突变的患者进行了研究(Salahshor et al(2005)BMC cancer 5：66)。APC患者在年轻时产生异常量的结肠腺瘤，如果不治疗，最终将发展成结肠直肠癌。总基因表达谱揭示了一组包括SATB2在内的84个基因在腺瘤内的表达相比在正常粘膜中有显著改变。SATB2被发现显著下调但未被选用于做进一步的分析。Int J Cancer上关于结肠直肠癌表达图谱的新近研究同样指出SATB2在mRNA水平上的表达状态有所改变(Groene J et al(2006)Int J Cancer119，1829-1836)。
PCT公布文本WO03/022126和WO2006/015742描述了关于癌细胞表达图谱的其他相似研究。对包括SATB2的大量基因的表达进行分析并根据总的表达模式得出结论。
重要地是，上述研究并未提供关于SATB2蛋白作为特异的结肠直肠标记的应用或SATB2作为结肠直肠癌预后工具的应用的暗示。
癌症
癌症是西方最常见的疾病和死亡原因之一。一般而言，大多数的癌症形式的发病率是随年龄增加的。因为人类总体健康状况提高所致的寿命的继续增长，患癌症的个体会更多。尽管日益增加的知识指出环境因素(饮食、烟草、紫外线等)及遗传因素(“癌症基因”如p53、APC、BRCA1、XP等的种系突变)与癌症的发病风险之间有一种联系，但大多数常见类型的癌症的病因一般来说还不清楚。
尽管癌症本质上是一种细胞疾病并被定义为伴有净细胞增长和有害群体行为的转化细胞群，但从细胞生物学角度来看，关于癌症的定义都不能令人完全满意。恶性转化代表基于不可逆转的遗传改变的向恶性表型的转变。尽管还没被正式地证明，恶性转化被认为发生在一个细胞内，由此始发随后产生的肿瘤(“癌症克隆形成能力”学说)。致癌作用是指产生癌症并通常被认为包括多个最终导致恶性肿瘤生长的事件的过程。这个多步过程包括数个速率限制步骤，如突变的增加，还可能包括外遗传(epigenetic)事件，导致癌变前增殖阶段后的癌症形成。最常见类型的癌症发生在体细胞，其中绝大多数起源于上皮组织(皮肤、前列腺、结肠和肺)，然后是从血细胞生成谱系发生的癌症(白血病和淋巴瘤)和从间充质细胞发生的癌症(肉瘤)。逐步的变化包括决定细胞分裂、自我行为和细胞死亡的重要调控通路中的错误(突变)累积。每一种变化都提供相对于周围环境细胞的达尔文选择生长优势，从而导致肿瘤细胞群的净生长。需要强调的是恶性肿瘤不仅由转化的肿瘤细胞自身组成而且还包括作为支持性间质的周围正常细胞。这种补充的癌症间质构成了结缔组织、血管和多种其他正常细胞，如炎性细胞，它们共同起到向转化的肿瘤细胞提供肿瘤继续生长所必需的信号的作用。
癌症诊断
对取自肿瘤的组织切片进行显微评价仍然是确诊癌症的金标准。对基因组DNA、转录基因和表达蛋白的分析在显微镜检测到的组织学特征基础上又增加了重要信息。今后的诊断、预后信息和治疗选择都可能基于对形态学的整体评价和对核酸及蛋白质的分析。现在，基于人类基因组序列和生物化学通路(包括组织中细胞内和细胞间信号传导)的不断进步的认知，已经可以揭示肿瘤形成中不同阶段以及表型变化(这定义了不同的癌症类型)的某些机制。
尽管分子生物学已取得显著进步，癌症诊断仍然要依靠光学显微镜。分子工具的发展对将癌症细胞与普通细胞区分开来起到了重要的作用，而且这种重要性还在增加。除了组织切片的组织化学染色之外，最常用的方法是免疫组织化学法。免疫组织化学法使得可以使用特定的抗体来检测组织和细胞中的蛋白表达模式。免疫组织化学法在临床诊断上的应用不仅可以分析组织结构和细胞形态学，还可以检测不同细胞群中的免疫活性。这对于支持不同原发肿瘤的精确评级和分类，以及对不明起源的转移的诊断已经变得非常重要。现在临床实践中，最常用的抗体包括抗细胞类型标记(如PSA、MelanA、甲状腺球蛋白)的抗体和识别中间丝、分化抗原簇等和潜在恶性标记(如Ki67、p53和HER-2)的抗体。除了免疫组织化学法，应用原位杂交来检测基因扩增和应用基因测序来分析突变是癌症诊断学中正在发展的技术。
结肠直肠癌
结肠直肠癌是世界上最常见的人类癌症形式之一。Parkin等人提供的GLOBOCAM 2002数据库的数据显示每年有大约100万新的结肠直肠癌病例被发现(Parkin et al(2007)CA Cancer J Clin 55，74-108)。另外，世界上结肠直肠癌的发生占全部癌症的9.4％左右，而且结肠直肠癌是西方世界第二最常见的死亡原因。西方世界的结肠直肠癌的五年存活率约为60％，但是在东欧和印度则低至30％。
目前早期检测和切除肿瘤的外科手术对良好的预后是至关重要的。症状取决于肿瘤在远端胃肠道中的位置，它包括肠不良应激、腹泻、便秘、疼痛和贫血(继发于肿瘤出血至肠道中)。恶性肿瘤根据不同的分类方案可被分为几个阶段，如TNM/UICC分类法I到IV期或Dukes A到C期。最轻度恶性肿瘤(Dukes A和B期)可获得合理有利的效果，而另一极端，某些转移性高度恶性肿瘤(Dukes C期)的存活率则很低。目前的诊断基于患者病史、临床和内窥镜检查(直肠镜检查和结肠镜检查)，随后任选地进行放射成像以确定肿瘤生长的范围。对可疑损伤处灶的活组织检查与内窥镜检查结合进行。
显微诊断，指从可疑肿瘤收集活检材料并置于显微镜下观察。为了获得可靠的诊断结果，再将肿瘤组织固定于福尔马林中、进行组织学处理和石蜡包埋。从所得的石蜡块获得组织切片并用组织化学方法和免疫组织化学方法进行染色。
对限定在局部区域的肿瘤，即还没有发展为转移性疾病的肿瘤，通过外科手术将肿瘤及周围的肠和组织完全切除。然后将外科手术标本送去进行粗略的病理学和显微分析。这种分析形成了肿瘤分期的基础。目前最常见形式的结肠直肠癌是代表腺源肿瘤的腺癌，它可高度、中度或低度分化。
对原发性肿瘤，苏木素-伊红染色的组织切片足够用于根据结肠直肠癌分类法作出正确的诊断和分类。但是，由于结肠直肠癌非常常见并经常在检出之前已经生长得很大，转移却不常见。肿瘤一般会转移至局部淋巴结，但是远距离转移至肝或肺的却很少见。癌症的一个常见的临床问题是患者表现出未知来源的转移。如果转移的是腺癌，可怀疑数种可能的原发性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠直肠癌。对于鉴别诊断，可以使用可识别来源细胞的固有特征的免疫组织化学标记。目前，细胞角蛋白20(CK20)被用于作为结肠直肠癌的特征，它是一种胃肠道腺细胞中富含的中间丝标记。但是，几种其他腺癌也是对CK20抗体呈阳性的，尽管不是所有结肠直肠癌都为阳性。另外，现在没有可将低度恶性和低转移风险的肿瘤与威胁生命的高度恶性肿瘤区分开来的可用标记。
为了让医生针对正确的癌症类型给予具体且尽可能早的治疗，提供新的只针对结肠直肠癌并可以将患者按不同风险类别进行区分的分子标记非常重要。总之，目前非常需要能够提高结肠直肠癌诊断和筛选的新方法。
发明内容
本发明的一个目的是通过提供可用于受试者结肠直肠癌的诊断和/或预后的标记来满足上述需要。
本发明的一个相关目的是提供可用于区分结肠直肠癌和其他类型癌症的标记。
本发明的另一目的是提供结肠直肠癌诊断、预后和/或治疗的新方法。
本发明的一个相关目的是提供一种可与结肠直肠癌诊断、预后和/或治疗的方法结合使用的试剂盒。
本发明的另一目的是提供可用于结肠直肠癌诊断、预后和/或治疗的新化合物。
对于这些目的以及本领域技术人员从本发明公开的内容中显而易见的其他目的，本发明在不同方面提供了确定结肠直肠癌状态和预后及其治疗的新方法。
因此，在第一方面，本发明提供了确定患有结肠直肠癌或怀疑患有结肠直肠癌的哺乳动物受试者的结肠直肠癌预后是否不良的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供取自所述受试者的一个样品；
b)对存在于所述样品中的SATB2蛋白进行定量以得到一个样品值；
c)将得自b)的样品值与对照值进行比较；并且，如果所述样品值低于所述对照值，
d)则判断所述受试者的结肠直肠癌预后不良。
本发明的第一方面是基于以往未认识到的事实，即取自患有结肠直肠癌或怀疑患有结肠直肠癌的受试者的样品中SATB2蛋白的表达可作为受试者疾病状态的指示物。更具体地，本发明第一次指出一方面的SATB2的低表达值与另一方面的更具攻击性或高风险的形式的结肠直肠癌之间相关性。基于以SATB2表达作为结肠直肠癌预后指示物的本发明有若干优点。一般来说，对于癌症，攻击性形式肿瘤的早期检测非常重要，因为早期可以治愈。对于结肠直肠癌而言尤其如此，已有几个大型研究表明患有早期即1期和2期(实际上是Dukes A和B期)癌症的受试者的预后，与患有晚期肿瘤的受试者相比要好很多。这种差别不是取决于治疗方式，因为所有类型的结肠直肠癌都会进行完全切除。这种存活上的巨大差别而是与早期检测、正确诊断和适当的外科手术治疗明显有关。SATB2蛋白作为标记，其某种表达水平与某种模式的疾病进程相关，它在例如用于转移性的鉴别诊断方面具有巨大的潜力。
在本发明的一个实施方案中，步骤d)中不良预后的结论可能包括表明，所述受试者与其不表现低SATB2表达值的情况相比，具有更短的预期存活时间。或者/另外，不良预后的结论可能包括表明，与不表现低SATB2表达值的情况相比，具有更低的5年存活可能性。例如，结论可能为所述受试者的5年存活可能性为65％或更低，例如，60％或更低，50％或更低，40％或更低或30％或更低。
此外，对于患有或怀疑患有淋巴结阴性肿瘤的受试者，结论可能是所述受试者的5年存活可能性为73％或更低，例如，70％或更低，例如60％或更低，50％或更低，40％或更低，或者30％或更低。对于女性受试者，结论可能为所述受试者的5年存活可能性为74％或更低，例如70％或更低，例如60％或更低，50％或更低，40％或更低或30％或更低。对于患有或怀疑患有结节阴性肿瘤的女性受试者，结论可能为所述受试者的5年存活可能性为80％或更低，例如75％或更低，例如70％或更低，例如60％或更低，50％或更低，40％或更低或30％或更低。
在SATB2的低表达与结肠直肠癌的高风险形式之间所识别的这种相关性也可构成决定对受试者相对于其不表现低SATB2表达值的情况施行不同治疗方案的基础。因此，在第二方面，本发明提供了治疗需要治疗的受试者的结肠直肠癌的方法，包括
a)提供取自该所述受试者的一个样品；
b)对存在于所述样品中的SATB2蛋白进行定量以得到一个样品值；
c)将得自b)的样品值与对照值进行比较；并且，如果所述样品值低于所述对照值，
d)则采用适合于预后不良的结肠直肠癌的一个治疗方案来治疗所述受试者
在本发明的一个实施方案中，所述治疗方案选自化学疗法、新辅助疗法及其组合。
因此，所述治疗方案可以是新辅助疗法。所述新辅助疗法可仅由放射治疗构成或由放射治疗与化学疗法结合构成。
在上述本发明的方法各方面中，所述受试者可以患有或怀疑患有不同形式和/或阶段的结肠直肠癌。
在这些方面的某些实施方案中，要研究的结肠直肠癌是结节阴性的结肠直肠癌，即还没有发展到结节转移阶段的结肠直肠癌。在其他类似的实施方案中，要研究的结肠直肠癌的特征是处于Dukes A或B期。在其他实施方案中，要研究的结肠直肠癌是结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌(carcinoma)。在这些实施方案中，确定受试者表现出低SATB2表达可能对疾病的未来发展预后具有重要价值，并因此形成对未来疾病处理的相关可靠决定的基础。在一组患有这种相对早期阶段疾病的受试者中，低SATB2表达的受试者可能有发展为更具攻击性的疾病相对较高风险。因此，患有结节阴性结肠直肠癌或Dukes A或B期结肠直肠癌的受试者中低SATB2表达可说明这些受试者应该得到比不表现低SATB2表达的受试者更密切地监控和/或被施以与不表现低SATB2表达的受试者不同的治疗。由于SATB2标记提供的补充预后信息，本发明的方法因此提供了使这种受试者能够在某段时间存活和/或存活更长时间的更大可能性。
在其他实施方案中，要研究的结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌。在其他类似的实施方案中，要研究的结肠直肠癌的特征为处于Dukes C期。
在本发明的实施方案中，所述受试者是人类，如女人。如所附实施例所示，SATB2标记的预后价值在患有结节阴性结肠直肠癌的人类女性受试者组中特别显著。
SATB2蛋白表达的样品值低于对照值的确定，本文有时将其表达为“低SATB2表达”的确定。
在本发明的方法中，作为与受试者样品值相比较的对照值可通过不同的方法确定。作为一个非限制性的实例，对照值可对应进行所述预后或治疗的受试者健康组织中的SATB2表达量。作为另一个实例，对照值可由取自另一个对照受试者的正常组织的标准样品测得的SATB2表达量提供。作为另一个实例，对照值可由如Dukes期A或B癌症组织的肿瘤组织的标准样品测得的SATB2表达量提供。
对照值可通过实施本发明上述各方面的方法获得。可替代地，对照值是得自对照样品并且与所述对照样品的SATB2表达量一致的预定值。
对一个样品中的SATB2表达定量的另一种替代方法是测定SATB2表达高于某一水平的样品中细胞分数。所述测定例如可按下面的实施例第4部分“分数分值”的定义中所述进行。本发明以上各方面的方法的实施方案中，步骤d)的结论的标准是SATB2阳性细胞的核分数样品值，即“分数分值”，它低于对照值50％，例如低于40％，如低于30％，如低于25％，如低于20％，如低于15％，如低于10％，如低于5％，如低于1％。另外，不良预后的确定可对应在样品中基本上检测不到SATB2阳性细胞，即“分数分值”基本为零。
对一个样品中的SATB2表达定量的另一种替代方法是用自动扫描仪和图像处理软件自动测量SATB2表达的自动分值(autoscore)。这种测定例如可按下面的实施例第5部分“自动分值”的定义中所述进行。本发明上面各方面的方法的实施方案中，步骤d)的结论的标准是样品细胞中SATB2表达的样品值，即“自动分值”，它低于对照值70，如低于60，如低于50，如低于40，如低于30，如低于25，如低于20，如低于15，如低于10，如低于5。
在本发明的一些实施方案中，无论是作为如上的分数分值或自动分值或作为某种其他已知的或被适当改变的变量的样品值和/或对照值的测定，都是在受试者的远端胃肠道即阑尾、结肠和/或直肠的腺细胞和/或结肠直肠癌细胞上进行的。
在本发明的另一实施方案中，不良预后的确定对应于在受试者的远端胃肠道的腺细胞中没有可检出的SATB2表达。
在本发明的上下文中，对术语“样品值”和“对照值”做宽泛的解释。如上所述，可通过自动方法或通过一个基于样品视觉或显微镜检查的评分系统来对SATB2的表达定量以获得这些值。但是，一个技术人员如组织病理学领域的技术人员，也可仅通过检查例如已进行SATB2表达染色的组织切片就可确定所述样品值和对照值。因此，样品值低于对照值的判断可对应于视觉或显微镜检查后的判断，即样品组织切片比对照组织切片染色密度低和/或有更少的染色细胞。在这样情况下，所述样品值和对照值被认为是技术人员在检查和比较后确定的主观值。因此，本发明不仅限于使用自动分析。
本发明的方法中用于检测SATB2蛋白表达的具体步骤不限于任何特定方式。在本发明方法的某些实施方案中，步骤b)包括：
b1)对所述样品应用一种可定量的亲和配体，所述亲和配体可选择性地与待定量的SATB2蛋白相互作用，所述应用是在允许亲和配体与存在于所述样品中的任何SATB2蛋白结合的条件下施行的。
b2)除去未结合的亲和配体；并且
b3)对于与该样品保持相关联的任何亲和配体进行定量。
在本发明的这些实施方案中，所述的取自所述受试者的样品可为体液样品，如血液、血浆、血清、脑液、尿液、精液和渗出液样品。在本发明的方法中，作为替代方案，所述样品可以是粪便样品、细胞学样品或组织样品，如结肠直肠组织的样品。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法是在体外进行的。
技术人员会认识到本发明的应用不限于对被研究的受试者体内存在的SATB2蛋白任何具体变体定量，只要所述蛋白是被相关基因编码并表现相关的表达形式即可。作为一个非限制性的实例，所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
在某些实施方案中，上面的序列ii)与SEQ ID NO：1至少90％相同，至少91％相同，至少92％相同，至少93％相同，至少94％相同，至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或者至少99％相同。
作为另一个非限制性的实例，所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
在某些实施方案中，上面的序列ii)与SEQ ID NO：2至少90％相同，至少91％相同，至少92％相同，至少93％相同，至少94％相同，至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或者至少99％相同。
在根据本发明的方法的实施方案中，SATB2蛋白是通过对样品应用一种可检测和/或可定量的亲和配体来检测和/或定量的，该亲和配体能够特异性或选择性地与SATB2蛋白相互作用。亲和配体的应用是在允许亲和配体与样品中的任何SATB2蛋白结合的条件下施行的。一旦通过本申请公开内容的教导了解了SATB2与结肠直肠癌之间的关系，本领域普通技术人员就能够选择或制造合适的亲和配体以及选择用于检测和/或定量的合适形式和条件。尽管如此，为了说明，仍然在下面给出证明可用的亲和配体的实例，以及用于检测和/或定量的形式和条件的实例。
因此，在本发明的某些实施方案中，使用的亲和配体选自抗体及其片段和其衍生物，即基于免疫球蛋白支架的亲和配体。抗体包含任何来源的单克隆和多克隆抗体，包括鼠类抗体、人类抗体和其他抗体，以及含有不同物种的序列的嵌合抗体，如部分人源化的小鼠抗体。多克隆抗体是通过用选定抗原免疫动物来生产，而具有确定的特异性的单克隆抗体可通过
Figure A200780020492D0017133740QIETU
和Milstein开发的杂交瘤技术来生产(
Figure A200780020492D0017133740QIETU
G and Milstein C(1976)Eur.J.Immunol.6：511-519)。抗体片段及衍生物包括Fab片段，它由完整免疫球蛋白的重链第一恒定区(CH1)、轻链恒定区(CL)、重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成；Fv片段，它由抗体的两个可变区VH和VL组成(Skerra A and Plückthun A(1988)Science240：1038-1041)；单链Fv片段(scFv)，它由通过可弯曲的肽接头连结在一起的VH和VL区组成(Bird RE and Walker BW(1991)TrendsBiotechnol.9：132-137)；Bence Jones二聚体(Stevens FJ et al(1991)Biochemistry 30：6803-6805)；骆驼(camelid)重链二聚体(Hamers-Casterman C et al(1993)Nature 363：446-448)和单链可变区(Cai X and Garen A(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：6280-6285；Masat L et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：893-896)，以及单结构域链支架如铰口鲨的新抗原受体(NAR)(DooleyH et al(2003)Mol.Immunol.40：25-33)和基于重链可变区的微抗体(minibody)(Skerra A and Plückthun A(1988)Science240：1038-1041)。
多克隆和单克隆抗体以及它们的片段和衍生物，代表在需要选择性生物分子识别的应用中亲和配体的常规选择，例如在根据本发明对SATB2蛋白的检测和/或定量中。然而，本领域的技术人员了解，因为对特异性结合配体的高通量生产和低成本生产系统的需求增加，新的生物分子多样化技术在过去十年中已经发展起来。这使免疫球蛋白源及非免疫球蛋白源的新型亲和配体得以生产，所述非免疫球蛋白源被证明同样可作为结合配体用于生物分子识别应用并可代替免疫球蛋白，或者与其一起使用。
选择亲和配体所需的生物分子多样性可通过多种可能的支架分子之一的组合工程来产生，然后通过合适的筛选平台来选择特异性和/或选择性的亲和配体。所述支架分子可以是免疫球蛋白源(Bradbury AR andMarks JD(2004)J.Immunol.Meths.290：29-49)、非免疫球蛋白源(Nygren 
Figure A200780020492D0018133900QIETU
 and Skerra A(2004)J.Immunol.Meths.290：3-28)或寡核苷酸源(Gold L et al(1995)Annu.Rev.Biochem.64：763-797)。
许多非免疫球蛋白的蛋白支架已经被用作新结合蛋白的开发中的支持结构。可用于生产本发明中所用抗SATB2的亲和配体的这类结构的非限制性实例为，葡萄球菌A蛋白及其结构域和这些结构域的衍生物，如蛋白Z(Nord K et al(1997)Nat.Biotechnol.15：772-777)；脂质运载蛋白(Beste G et al(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：1898-1903)；锚蛋白重复结构域(Binz HK et al(2003)J.Mol.Biol.332：489-503)；纤维素结合结构域(CBD)(Smith GP et al(1998)J.Mol.Biol.277：317-332；
Figure A200780020492D0018133930QIETU
 J et al(2000)Proteins 41：316-322)；γ晶体(Fiedler U and Rudolph R，WO01/04144)；绿色荧光蛋白(GFP)(Peelle B et al(2001)Chem.Biol.8：521-534)；人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(Hufton SE et al(2000)FEBSLett.475：225-231；Irving RA et al(2001)J.Immunol.Meth.248：31-45)；蛋白酶抑制剂，如Knottin蛋白(Wentzel A et al(2001)J.Bacteriol.183：7273-7284；Baggio R et al(2002)J.Mol.Recognit.15：126-134)和库尼兹(Kunitz)结构域(Roberts BL et al(1992)Gene121：9-15；Dennis MS and Lazarus RA(1994)J.Biol.Chem.269：22137-22144)；PDZ结构域(Schneider S et al(1999)Nat.Biotechnol.17：170-175)；肽适体，如硫氧还蛋白(Lu Z et al(1995)Biotechnology 13：366-372；Klevenz B et al(2002)Cell.Mol.LifeSci.59：1993-1998)；葡萄球菌核酸酶(Norman TC et al(1999)Science285：591-595)；淀粉酶抑肽(McConell SJ and Hoess RH(1995)J.Mol.Biol.250：460-479；Li R et al(2003)Protein Eng.16：65-72)；基于纤维连接蛋白III型结构域的trinectin(Koide A et al(1998)J.Mol.Biol.284：1141-1151；Xu L et al(2002)Chem.Biol.9：933-942)；以及锌指结构(Bianchi E et al(1995)J.Mol.Biol.247：154-160；KlugA(1999)J.Mol.Biol.293：215-218；Segal DJ et al(2003)Biochemistry 42：2137-2148)。
上面提到的非免疫球蛋白的蛋白支架的实例包括：呈现出单随机环的支架蛋白，该环用于新的结合特异性的生成；具有刚性二级结构的蛋白支架，该结构中从蛋白表面突出的侧链是随机的以生成新的结合特异性；和呈现出不连续的高变的环区的支架，该环区用于新结合特异性的生成。
除了非免疫球蛋白的蛋白，寡核苷酸也可被用作亲和配体。被称为适体或诱饵(decoy)的单链核酸，折叠成界限清楚的三维结构并以高亲和性和特异性与它们的靶标结合(Ellington AD and Szostak JW(1990)Nature 346：818-822；Brody EN and Gold L(2000)J.Biotechnol.74：5-13；Mayer G and Jenne A(2004)BioDrugs 18：351-359)。寡核苷酸配体既可以是RNA也可以是DNA，并可与很多类别的目标分子结合。
为了从上面提到的任何支架结构的变体库中选择想要的亲和配体，有许多筛选平台可用于分离特异的抗所选目标蛋白的新型配体。筛选平台包括但不限于：噬菌体展示(Smith GP(1985)Science 228：1315-1317)，核糖体展示(Hanes J and Plückthun A(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4937-4942)，酵母双杂交系统(Fields S and Song O(1989)Nature 340：245-246)，mRNA展示(Roberts RW and Szostak JW(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12297-12302)，SELEX(指数富集式配体系统进化)(Tuerk C and Gold L(1990)Science 249：505-510)和蛋白片段互补测定法(PCA)(Remy I and Michnick SW(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：5394-5399)。
因此，在本发明的实施方案中，可使用如下的亲和配体，它是来自任一上文所列蛋白支架的非免疫球蛋白亲和配体，或者是寡核苷酸分子。
在本发明方法的某些实施方案中，能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的亲和配体可被检测和/或定量。这种亲和配体的检测和/或定量可以通过技术人员知道的任何在基于生物相互作用的测定中对结合试剂进行检测和/或定量的方法完成。因此，如前一部分所述的任何亲和配体，可被定量或定性地用于检测SATB2蛋白的存在。这些“一级”亲和配体自身可被各种标记物标记，或者通过可以检测、目测和/或定量的被标记的二级亲和配体间接检测。这可以使用多种标签的任何一个或多个并使用技术人员已知的许多技术中的任何一种或多种来完成，这其中并不需要任何过多的实验，所述多种标签可与能够与SATB2相互作用的亲和配体或任何二级亲和配体偶联。
可与一级和/或二级亲和配体偶联的标签的非限制性实例包括荧光染料或金属(如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)，发色团染料(如视紫红质)，化学发光化合物(如鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(如萤光素、萤光素酶)，半抗原(如生物素)。多种其他有用的荧光剂和发色团在Stryer L(1968)Science 162：526-533和Brand L和Gohlke JR(1972)Annu.Rev.Biochem.41：843-868中有描述。亲和配体也可被酶(如辣根过氧物酶、碱性磷酸酯酶和β-内酰胺酶)、放射性同位素(如3H、14C、32P、35S或125I)和颗粒(如金)标记。不同类型的标签可通过不同的化学法与亲和配体偶联，如胺反应或巯基反应。但是，也可使用胺和巯基以外的其他反应基团，如醛、羧酸和谷氨酰胺。
本发明的方法的各方面可通过数种已知的形式和设置中的任何形式和设置进行使用，其非限制性的选择将在下面讨论。
在一种基于组织学的设置中，一种与SATB2靶标结合的已标记的亲和配体的检测、定位和/或定量可包括视觉化技术如光学显微镜或免疫荧光显微镜。其他方法可能包括通过流式细胞术或发光法来检测。
如上所阐释，对受试者体内的SATB2蛋白的检测和/或定量可通过从所述受试者采集生物样品来完成，所述生物样品例如采集自例如结肠直肠组织、血样、脑液、尿液或粪便的组织样(活组织检查)。将亲和配体用于生物样品以对SATB2标记蛋白检测和/或定量。这种方法不仅可检测SATB2蛋白，还可显示其分布和相对表达水平。
亲和配体上的标签的视觉化方法包括但不限于：荧光技术、发光技术和/或酶促技术。荧光检测和/或定量是通过将荧光标签暴露在在特定波长的光下，然后对发射出来的特定波长的光进行检测和/或定量而实现。发光标记的亲和配体的存在可通过化学反应中发出的光来检测和/或定量。酶促反应的检测是基于化学反应过程中产生的样品颜色变化。本领域的技术人员应认识到，为了正确的检测和/或定量，可对多种不同方法作出修改。
在本发明的方法中，生物样品可被固定于固相支持物或载体上，如硝化纤维素或其他任何能够固定施加于固体支持基质本身的生物样品中存在的任何SATB2蛋白的固体支持基质。某些可用于本发明的熟知的固态支持材料包括玻璃、碳水化合物(如琼脂糖凝胶(Sepharose))、尼龙、塑料、毛、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、右旋糖苷、淀粉酶、膜、树脂、纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、氧化铝、辉长岩和磁铁矿。如果一级亲和配体本身没有被标记，可以用本领域已知的各种缓冲液清洗支持基质，然后使其与标记的二级亲和配体接触，再用缓冲液清洗一次以除去未结合的亲和配体，然后可以用常规方法检测和/或定量选择性的亲和配体。亲和配体的结合特性会随不同的固态支持而变化，但是本领域的技术人员能够通过常规实验为每个测定确定有效的和最佳的测定条件。
本发明需要的检测和/或定量SATB2蛋白的方法是通过将亲和配体连接至一种随后可以在酶免疫测定(如EIA或ELISA)中被检测和/或定量的酶上。这类技术已经相当成熟，而且它们的实现对于技术人员而言不存在任何过分的困难。在这类方法中，使生物样品与一种固体材料或一种偶联有抗SATB2蛋白亲和配体的固体材料相接触，然后它可通过酶标记的二级亲和配体进行检测和/或定量。随后，使一种合适的底物在合适的缓冲液中与酶标签反应生成一种化学成分，该化学成分可用分光光度计、荧光计、发光计或视觉化方法检测和/或定量。
如上所述，一级和任何二级亲和配体可用放射性同位素标记从而能够被检测和/或定量。本发明中合适的放射性标签的非限制性实例为3H、14C、32P、35S或125I。经标记的亲和配体的比放射性活度依赖于放射性标签的半衰期、同位素纯度和标签是如何掺入亲和配体中的。对亲和配体的标记优选地使用熟知的技术(Wensel TG and Meares CF(1983)in：Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy(Burchiel SW andRhodes BA eds.)Elsevier，New York，pp 185-196)。可通过在体内或体外检测放射活性，将这种经放射性标记的亲和配体用于显示SATB2蛋白。放射性核扫描(如用γ相机)、磁共振波谱或发射断层术可用于体外或体内检测，而γ/β计数器、闪烁计数器和射线照相术也可在体外使用。
本发明的另一方面提供了一种用于实施本发明上述各方法方面的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)一种能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的可定量的亲和配体；和
b)对所述亲和配体定量所必需的试剂。
本发明的试剂盒的各种成分按照上面本发明的方法方面的阐述进行选择和确定。
因此，本发明的试剂盒包含抗SATB2亲和配体，以及其他在特异和/或选择性的亲和配体与SATB2特异地和/或选择性地结合之后帮助对所述亲和配体定量的工具。例如，本发明的试剂盒可含有一种二级亲和配体，所述二级亲和配体用于检测和/或定量任何由SATB2蛋白与所述能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的亲和配体形成的复合物。本发明的试剂盒还可含有多种除亲和配体之外的辅助物质，以使得可容易有效地使用该试剂盒。所述辅助物质的实例包括溶解或复原该试剂盒中冻干蛋白组分的溶剂、洗涤缓冲液、当酶用作标签时用于测定酶活性的底物，以及免疫测定试剂盒中的常用物质例如反应终止剂。
本发明的试剂盒还可有利地包含用于提供对照值的对照样品，对照值用于与样品值相比较。这种对照样品可由例如一个具有预定量SATB2蛋白的组织样品构成，病理学领域技术人员可使用所述预定量的SATB2蛋白，通过目测比较或自动比较对照样品与受试者样品之间的SATB2表达水平来确定SATB2在被研究的样品中的表达状态。
本发明的另一个方面提供了SATB2蛋白作为一种预后标记的应用。还提供了SATB2蛋白作为一种结肠直肠癌预后标记的应用。
本发明的一个相关方面提供了SATB2蛋白或其抗原活性片段在制造用于结肠直肠癌预后的预后药剂中的应用。SATB2蛋白的抗原活性片段是足够大的可用于产生亲和配体(如抗体)的片段，该亲和配体将与含有所述片段的SATB2蛋白相互作用。
在本发明的这些应用方面的实施方案中，作为一个非限制性的实例，SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
在某些实施方案中，上面的序列ii)与SEQ ID NO：1至少90％相同，至少91％相同，至少92％相同，至少93％相同，至少94％相同，至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或者至少99％相同。
作为另一个非限制性的实例，SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
在某些实施方案中，上面的序列ii)与SEQ ID NO：2至少90％相同，至少91％相同，至少92％相同，至少93％相同，至少94％相同，至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或者至少99％相同。
在另一个方面，本发明提供能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的亲和配体，它是一个抗体或者抗体的片段或抗体的衍生物。这样的抗体或者其片段或衍生物，可例如通过包含用氨基酸序列含有SEQ ID NO：1序列的蛋白免疫动物的步骤的方法获得。生成针对给定靶标的抗体或者其衍生物或片段的方法是本领域已知的，且可用于本发明的这一方面。任何上面讨论的SATB2蛋白(SEQ ID NO：2)或其抗原活性的片段(SEQ ID NO：1)的变体，当然可用于这种产生抗体或者其片段或衍生物的方法中。
另一个方面，本发明提供了根据本发明的亲和配体作为预后药剂的应用。该应用的一个优选的实施方案是将亲和配体用作结肠直肠癌预后的预后药剂。本发明还提供了所述亲和配体用于结肠直肠癌的预后的应用。作为其相关的方面，本发明提供了本发明的亲和配体在制造用于结肠直肠癌预后的预后药剂中的应用。
本发明还在其另一个方面提供了一种用于结肠直肠癌预后的方法，所述方法包括检测SATB2蛋白的步骤。本发明的这一方面是基于发现SATB2在一般情况下可以用作结肠直肠组织——具体而言，结肠直肠癌——的蛋白标记。如下面要详述的，针对SATB2蛋白片段产生的抗体在远端胃肠道即阑尾、结肠和直肠的腺细胞和结肠直肠癌中表现出选择性的强核免疫活性。最显著的发现是在11种结肠直肠癌中全部都为阳性。除了结肠直肠癌，只在极少数的其他肿瘤中呈弱或中度阳性。
另外，SATB2在其他类型癌症中相对来说几乎不存在，这又使针对SATB2的亲和配体成为可特异地将结肠直肠癌和其他癌症区分开来的高度引人关注的工具。大多数结肠直肠癌是腺源的并因此被分类为腺癌。这是一种典型的癌症类型，并且也可以源自多种其他器官。因此，本发明的发现在用于确定肿瘤转移的类型时受到高度关注，其中所述肿瘤源自哪个器官通常是未知的。目前，可用的结肠直肠癌分子标记会与其他腺癌交叉反应，并因此对肿瘤的定位和转移源的确定造成了困难。本发明特定的结肠直肠癌标记可使医生有效定位癌症，提供更有效的治疗并最终为患者提供更可靠的预后。
本发明的另一方面包括同时用SATB2和CK20标记来检测癌症样品。如实施例的第6部分所详述，对SATB2和CK20表达的联合检测在分辨结肠直肠癌方面的预测价值超过对每种标记物单独检测的预测价值。因此，本发明在此方面提供了一种诊断结肠直肠癌的方法，包括检测SATB2蛋白和检测CK20蛋白的步骤。此外，本发明还提供了一种通过检测SATB2蛋白和/或CK20蛋白的存在来检测一种转移是否源自结肠直肠癌的方法。通过综合从CK20和SATB2获得的信息，患者会更容易地获得结肠直肠疾病的精确诊断。技术人员能够对本文关于SATB2检测的教导作适当改变以使其适应本发明此方面的方法，并且按照本文的描述和按照例如免疫组织化学领域的知识不需要过分的负担就能进行SATB2和CK20的同时或顺序检测和/或定量。
本发明的一个引人关注的方面是预测癌症患者的SATB2蛋白会泄漏到血浆和粪便中。作为对比，一个熟知的前列腺癌标记PSA(也在正常前列腺中表达)甚至在健康患者中也会从前列腺泄漏到血浆中。但是，许多前列腺癌患者的血浆的PSA水平有所升高，因此对于具有患前列腺癌风险的男性群体，检测PSA水平的升高是一种常用的早期筛选方法。SATB2和结肠直肠癌之间被预测有同样的联系。因此，也可通过将人类血浆或其他体液或粪便作为本发明的样品从而将SATB2用作筛选结肠直肠癌的工具。在这一点上，本发明具有广泛的应用价值，甚至可能替代目前结肠直肠癌的筛选方法例如结肠直肠镜检查或乙状结肠镜检查，这些检查非常令人不适因此很多人放弃，尽管美国癌症研究所建议结肠直肠癌危险群体做定期检查。基于本发明的、将SATB2作为结肠直肠癌标记蛋白的筛选方法，对患此类癌症的患者的筛查、及早发现和治疗都有很大的好处。
在本发明的背景下，“预后”是指对一种疾病及其治疗的过程或结果的预测。预后也可指一种疾病的存活或痊愈机会的确定，以及对受试者的预期存活时间的预测。预后特别地可包括确定受试者在到将来的一段时间内存活的可能性，如三年、五年、十年或任何其他时间段。
在本发明的背景下，“诊断”是指确定一种疾病或病症的存在或对其进行鉴定。诊断也指通过这个过程得到的结论。在本文中，“诊断的”是指关于或有助于确定疾病存在或性质。在本发明的上下文中，“诊断”和“诊断的”也指监控一种疾病随时间自然发生的任何改变或者由于治疗产生的任何改变。
根据上面的定义，显然，术语“预后”和“诊断”有重叠的意义，它们不互相排斥。
在本发明的背景下，例如一个亲和配体与其靶标或抗原的“特异性的”或“选择性的”相互作用是指特异性和非特异性的相互作用之间的区别或者选择性和非选择性的相互作用之间的区别具有意义。两种蛋白之间的相互作用有时用离解常数来衡量。离解常数描述了两个分子之间的结合(或亲和性)强度。一般，抗体及其抗原之间的离解常数是10-7到10-11M。但高特异性不必需要求高亲和性。已证明，对其对方具有低亲和性(在摩尔范围内)的分子已经被证明与具有更高亲和性的分子的特异性一样。在本发明的情况下，特异性的或选择性的相互作用是指，在天然存在的或经加工的生物流体样品中在存在其他蛋白的给定条件下，使得一种具体方法可用于确定一种特定蛋白即所述靶蛋白或其片段的存在和/或量的程度。换言之，特异性或选择性是分辨各相关蛋白的能力。本说明书中特异性和选择性有时是可互换使用的。
在本发明的背景下，“单特异性抗体”是用其自身抗原亲和纯化的一群多克隆抗体中的一种，通过所述亲和纯化可将该单特异性抗体与其他抗血清蛋白和非特异性抗体分开。这种亲和纯化可产生与自身抗原选择性结合的抗体。本发明中，用一种基于免疫亲和的两步法纯化多克隆抗血清，获得对目标蛋白有选择性的单特异性抗体。通过将固定化标签蛋白用作捕获剂，在初次消耗步骤中除去针对抗原片段通用亲和标签的抗体。在该初次消耗步骤之后，将血清加载到以所述抗原为捕获剂的第二亲和柱，以富集特异性针对所述抗原的抗体(也可参考Nilsson P et al(2005)Proteomics 5：4327-4337)。
附图简要说明
图1说明了在含有另外94种不同人类蛋白(两个重复)的蛋白微芯片上，针对SATB2片段(SEQ ID NO：1)所生成的抗体的特异性。
图2显示了纯化的单特异性抗体的组织蛋白质印迹分析。从人类细胞系RT-4(泳道1)、EFO-21(泳道2)和A-431(泳道3)，以及从正常人类肝脏(泳道4)和正常人类扁桃体(泳道5)提取的总蛋白提取物。
图3A和3B显示了(A)正常大脑皮层和海马体以及(B)正常睾丸的细胞核中的SATB2的免疫组织化学染色。图3C-3E显示了来自正常受试者的(C)阑尾、(D)结肠和(E)直肠的粘膜的腺细胞中SATB2的染色。图3F显示了结肠粘膜的染色的高倍放大图。
图4A显示了所有11个测试的结肠直肠癌样品(两个重复)中的SATB2的免疫组织化学染色。图4B显示了图4A所示6个癌症样品的高倍放大图。
图5显示了中间分化型结肠直肠腺癌的免疫组织化学染色。图5A(左图)显示了有SATB2表达的切片，而图5B(右图)显示了无SATB2表达的切片。显示的两肿瘤样品都是两份。
图6显示了基于122名被诊断有结肠直肠癌的受试者的免疫组织化学染色的存活分析结果。根据SATB2水平的高低对组织芯(tissue core)评分。实线：核分数>25％。虚线/点线：核分数<25％。组织取自(A)所有患者、(B)仅女性、(C)所有结节阴性患者和(D)结节阴性女性。
图7显示了对SATB2表达和常规结肠癌标记CEA、CK20、CDX2、p53、Ki67和细胞周期蛋白B1(CCNB1)表达进行免疫组织化学染色的216个癌组织的表达数据的分级聚类结果。
图8显示了基于122个被诊断有结肠直肠癌的受试者组织的免疫组织化学染色的CK20和SATB2表达的具体比较。根据SATB2水平的高低和CK20水平的高低对组织芯评分。
图9显示了基于17个被诊断有结肠直肠癌的受试者的结节转移的免疫组织化学染色的CK20和SATB2表达的比较。根据SATB核分数和CK20染色对组织芯评分。
实例
抗SATB2的单特异性抗体的生成和其在正常和癌症样品中检测SATB2的应 用
1)抗原的生成
a.材料和方法
以人类基因组序列为模板，用分子信息学工具设计了由EnsEMBLGene ID ENSG00000119042编码的目标蛋白的一个合适片段(Lindskog Met al(2005)Biotechniques 38：723-727，EnsEMBL，www.ensembl.org)。设计由对应于SATB2蛋白(SEQ ID NO：2；EnsEMBL登录号为ENSP00000260926)第377-499位氨基酸(SEQ ID NO：1)的123个氨基酸组成的一个片段。以人类总RNA库组(Human Total RNA Panel IV，BDBiosc iences Clontech)为模板，用含有
Figure A200780020492D00261
 Taq酶的SuperscriptTM One-Step RT-PCR扩增试剂盒(Invitrogen)分离编码目标蛋白的多核苷酸，该多核苷酸含有长SATB2基因转录物(SEQ ID NO：3；EnsEMBL登录号为ENST00000260926)的第1542-1910位核苷酸。通过PCR扩增引物将侧翼限制酶切位点NotI和AscI引入到该片段中，使其可框内(in frame)克隆到表达载体中(正向引物：GTGTCCCAAGCTGTCTTTG，反向引物：CTTGGCCCTTTTCATCTCC)。然后，下游引物被生物素化以允许如前所述的固相克隆，并且产生的生物素化PCR产物被固定在Dynabeads M280Streptavidin(Dynal Biotech)上(Larsson M et al(2000)J.Biotechnol.80：143-157)。通过NotI-AscI(New England Biolabs)消化将该片段从固体支持物上释放出来，该片段被框内的连入到具有双亲和标签的pAff8c载体(Larsson M et al，见上文)中，所述双亲和标签包括一个用于固定化金属离子色谱(IMAC)纯化的六组氨酰标签和一个来自链球菌蛋白G的免疫增强白蛋白结合蛋白(ABP)(
Figure A200780020492D0027141442QIETU
 A et al(1997)J.Immunol.Methods 201：115-123；
Figure A200780020492D0027141455QIETU
 S et al(1999)Encyclopediaof Bioprocess Technology：Fermentation，Biocatalysis andBioseparation(Fleckinger MC and Drew SW，eds)John Wiley and SonsInc.，New York，pp 49-63)，并转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞(Novagen)中。按照厂商建议使用TempliPhi DNA测序扩增试剂盒(GEHealthcare，Uppsala，Sweden)，对扩增的质粒DNA进行染料终止循环测序以确认克隆的序列。
将1ml含有该表达载体的BL21(DE3)细胞的过夜培养物加入到添加有5g/l酵母提取物(Merck KGaA)和50mg/l卡那霉素(Sigma-Aldrich)的100ml 30g/l的胰蛋白酶大豆肉汤(Merck KGaA)中进行接种，所述过夜培养物在相同的培养基中。将该细胞培养物在1升摇瓶中于37℃，150rpm条件下培养，直到600nm处的光密度达到0.5-1.5。然后加入异丙基-β-D硫乳吡喃糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Apollo Scientific)至终浓度为1mM以诱导蛋白表达，并且在25℃和150rpm下继续培养过夜。以2400g离心来收集细胞，再用5ml裂解缓冲液(7M盐酸胍，47mM Na2HPO4，2.65mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，100mM NaCl，20mM β-巯基乙醇；pH＝8.0)重新悬浮沉淀物，然后在37℃，150rpm下培养2小时。在以35300g离心之后，收集含有变性和溶解的基因产物的上清液。
通过ASPEC XL4TM上(Gilson)的一个自动蛋白纯化程序(Steen J et al(2006)Protein Expr.Purif.46：173-178)，使用加有1ml 金属(Co2+)亲和树脂(BD Biosciences Clontech)的色谱柱对具有His6标签的融合蛋白进行固定化金属离子亲和色谱(IMAC)纯化。用20ml变性洗涤缓冲液(6M盐酸胍，46.6mM Na2HPO4，3.4mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0-8.2)平衡树脂。然后用最小量为31.5ml的洗涤缓冲液冲洗树脂，再用2.5ml洗脱缓冲液(6M尿素，50mM NaH2PO4，100mM NaCl，30mM乙酸，70mM乙酸钠，pH 5.0)洗脱。洗脱下来的物质被分为500、700和1300μl三个级分。700μl的级分含有抗原，该级分以及收集的500和1300μl的级分都储存备用。
用磷酸缓冲盐溶液(PBS；1.9mM NaH2PO4，8.1mM Na2HPO4，154mM NaCl)将该抗原级分稀释到尿素的终浓度为1M，然后用截留分子量为7500Da的Vivapore 10/20ml浓缩器(Vivascience AG)进行一个浓缩步骤以提高蛋白浓度。根据厂商的建议，用以一种牛血清白蛋白为标准品的二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)微测定方法(Pierce)，测定蛋白浓度。用一台Bioanalyzer仪器通过用蛋白50或200测定(AgilentTechnologies)来分析该蛋白质量。
b)结果
用特异性针对所述蛋白片段的引物通过RT-PCR将对应于STAB2基因长转录物(SEQ ID NO：3)的第1542-1910位核苷酸的基因片段从人类RNA库中成功地分离出来，所述基因片段编码由目标蛋白SATB2(SEQ ID NO：2)的第377-499位氨基酸组成的一个肽(SEQ ID NO：1)。但是，与EnsEMBL中ENSG00000119042的序列相比，该序列中有一个单核苷酸沉默突变。目标蛋白(SEQ ID NO：2)的123个氨基酸片段(SEQ ID NO：1)被设计为不含跨膜区域，以保证其在大肠杆菌中有效表达；并且被设计为不含任何信号肽，因为它们在成熟蛋白中会被切除。此外，所述蛋白片段被设计为由一段与其他人类蛋白低同源性的独特序列组成，以尽可能减少所生成的亲和试剂的交叉反应；并且被设计为具有合适的大小，以允许构象表位的形成以及细菌系统内的有效克隆和表达。
鉴定出一个编码该正确氨基酸序列的克隆，并且，在大肠杆菌中表达后产生了正确大小的一个单一蛋白，随后用固定化金属离子色谱纯化。将洗脱出的样品稀释到尿素终浓度为1M之后并且浓缩样品到1ml，测定该蛋白片段浓度为7.4mg/ml，纯度分析结果为98％的纯度。
2)抗体的生成
a)材料和方法
按照国家标准(Swedish permit no.A84-02)用上面得到的纯化的SATB2片段作为抗原来免疫家兔。用含200μg抗原的弗氏完全佐剂对家兔进行肌内免疫作为初次免疫，然后用含100μg抗原的弗氏不完全佐剂加强免疫三次，每次之间间隔为四周。
用基于免疫亲和的三步法纯化来自该被免疫的动物的抗血清(Agaton C et al(2004)J.Chromatogr.A 1043：33-40；Nilsson P etal(2005)Proteomics 5：4327-4337)。第一步，用10x PBS将10ml总抗血清缓冲至1x PBS的终浓度(1.9mM NaH2PO4，8.1mM Na2HPO4，154mMNaCl)，用0.46μm孔径的过滤器(
Figure A200780020492D00291
Life Science)过滤，并将其加入到一个亲和柱中，该柱中含有5ml偶合有双亲和标签蛋白His6-ABP(一个六组氨酰基标签和一个白蛋白结合蛋白标签)的N-羟基琥珀酰亚胺活化的SepharoseTM 4 Fast Flow填料(GE Healthcare)，该标签蛋白His6-ABP是用pAff8c载体表达并用与上述纯化抗原蛋白片段同样的方法纯化。第二步，将流过全柱的去除了抗双亲和标签His6-ABP的抗体以0.5ml/分钟的流速载入1ml Hi-Trap NHS活化的HP柱(GEHealthcare)中，该柱偶合有用作免疫抗原的SATB2蛋白片段(SEQ IDNO：1)。按照厂商的建议，将所述His6-ABP蛋白和所述蛋白片段抗原偶合到NHS活化的基质上。用1x PBST(1x PBS，0.1％吐温20，pH 7.25)洗去没有结合的材料，并且用低pH的甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸，1mMEGTA，pH 2.5)洗脱捕获到的抗体。洗脱的抗体级分被自动收集，并载入到两个串联的5ml HiTrapTM脱盐柱(GE Healthcare)中，这样在第三步可进行有效的缓冲液置换。第二和第三纯化步骤在平台(GEHealthcare)上进行。用添加有终浓度分别为50％和0.02％的甘油和NaN3的PBS缓冲液洗脱该抗原选择性(单特异性)抗体(msAb)，在-20℃长期储存(Nilsson P et al(2005)Proteomics 5：4327-4337)。
通过对自身抗原及蛋白质阵列设置中的其他94种人类蛋白片段的结合分析，对亲和纯化的抗体级分的特异性和选择性进行分析(Nilsson P etal(2005)Proteomics 5：4327-4337)。将这些蛋白片段在含0.1M尿素的1x PBS(pH 7.4)中稀释至40μg/ml，并且每种取50μl转移到一个96孔点样板的孔中。用销环阵列点样仪(pin-and-ring arrayer)(Affymetrix 427)将这些蛋白片段点加并固定化在环氧树脂载片(SuperEpoxy，TeleChem)上。用1x PBS漂洗该载片5分钟并且封闭
Figure A200780020492D00301
Pierce)其表面30分钟。将一个粘性16孔硅酮掩罩(Schleicher & Schuell)加在玻璃上，然后加入该单特异性抗体(用1xPBST以1:2000稀释至大约50ng/ml)并置于摇床上孵育60分钟。使亲和标签特异的IgY抗体与单特异性抗体共同孵育以确定每个点中的蛋白量。用1x PBST和1x PBS漂洗该载片两次，每次10分钟。二抗(偶联有Alexa 647的山羊抗-兔抗体和偶联有Alexa 555的山羊抗-鸡抗体，Molecular Probes)用1x PBST以1:60000稀释至30ng/ml，并孵育60分钟。在进行与首次孵育时的相同洗涤步骤之后，该载片被甩干并扫描(G2565BA阵列扫描仪，Agilent)，然后用图像分析软件(GenePix 5.1，Axon Instruments)对图像进行定量。结果在下面讨论并示于图1中。
此外，用蛋白质印迹法分析该亲和纯化的抗体的特异性和选择性。根据厂商的建议，通过于还原条件下在预制的10-20％ CriterionTM SDS-PAGE梯度胶(Bio-Rad Laboratories)上分离来自选定人类细胞系和组织的总蛋白提取物，然后电转导至PVDF膜(Bio-Rad Laboratories)上，来进行蛋白质印迹法。此膜在室温下封闭(5％奶粉，1x TBST；0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.5％吐温20)1小时，与用封闭缓冲液以1:500稀释的一级亲和纯化抗体一起孵育，再用TBST漂洗。将偶联HRP的二抗(猪抗兔免疫球蛋白/HRP，DakoCytomation)用封闭缓冲液以1:3000稀释，并按照厂商的方法，用ChemidocTM CCD相机(Bio-Rad Laboratories)和
Figure A200780020492D00302
 West Dura Extended Duration底物(Pierce)进行化学发光检测。结果在下面讨论并被示于图2。
b)结果
已证明该多克隆抗体制剂的质量依赖于该抗体纯化的严格程度，并且先前已证明，针对非目标蛋白源的表位的抗体的去除对于避免与其他蛋白的交叉反应和背景结合而言是必需的(Agaton C et al(2004)J.Chromatogr.A 1043：33-40)。
因此，进行蛋白微阵列分析，确保通过去除针对该His6标签的抗体和针对该ABP标签的抗体，已生成具有高特异性的单特异性多克隆抗体。随后在带有固定化的抗原的一个亲和柱上进行抗原选择性抗体的亲和捕获。
为对蛋白阵列的每个点的蛋白定量，使用了一套联合使用一抗和二抗的双色染料标记系统。用Alexa 555荧光染料标记的山羊抗鸡的二抗来检测在鸡体内生成的标签特异的IgY抗体。用Alexa 647荧光标记的山羊抗兔抗体检测兔msAb与该阵列上其抗原的特异性结合。在图1中，阵列结果以条柱显示，对应从阵列上每点检测到的Alexa 647的荧光强度(y轴)的量。每种蛋白片段都重复点样两份，并且图中x轴上的每个条柱都代表一个蛋白点。蛋白阵列分析显示该亲和纯化的抗SATB2的单特异性抗体对正确的蛋白片段具有高度选择性，并对该阵列上分析的所有其他蛋白片段呈现一个很低的背景。
蛋白质印迹法分析的结果(图2)显示该抗体可在一个膀胱癌细胞系(RT-4)、一个卵巢囊腺癌细胞系(EFO-21)以及一个表皮样细胞系(A-431)中特异性地检测出一条大约100kDa的条带(1-3泳道)。另外，在肝脏和扁桃腺组织样品中观察到一个较弱的特异性条带(4-5泳道)。SATB2的理论分子量为82kDa(按SATB2的氨基酸序列SEQ ID NO：2计算)，考虑到该被分析的蛋白在分析条件下可能被糖基化或作其他修饰，获得的结果与理论充分符合。
3)免疫组织化学的组织分析
a)材料和方法
总计用该单特异性抗体样品分析了576个含人类组织的石蜡块。作为供体块(donor block)用于制作组织微阵列(TMA)的所有组织都选自乌普萨拉大学医院病理科的档案，并征得当地伦理委员会的同意。检查相应的组织切片以确诊并在供体块中选择代表区域。正常组织被定义为显微镜下正常(无肿瘤)，其中绝大部分选自从手术切除肿瘤的附近区域采集的标本。检查癌症组织以诊断和分类。所有组织用福尔马林固定、石蜡包埋并进行诊断切片。
TMA的制作基本上如前人所述(Kononen J et al(1998)Nature Med.4：844-847；Kallioniemi OP et al(2001)Hum.Mol.Genet.10：657-662)。简言之，在TMA受体块上制造一个洞。需要来自供体块的一个核心组织样品并且将该样品置于TMA受体块中。在一个BeecherInstrument(ATA-27，Beecher Instruments，Sun Prairie，CA，USA)的自动组织阵列点样仪中重复进行此步骤，直到产生一个完整的TMA设计。TMA受体块在42℃温育2小时，然后切片。
TMA设计的重点在于从大范围的代表性正常组织中获得样品，以及在于包括代表性癌组织。这在以前的文献Kampf C et al(2004)ClinProteomics 1：285-300中有详述。简言之，样品选自48种正常组织和20种人类最常患的癌症类型。总计制造了8种不同设计的TMA块，每种都包含72个1mm直径的组织芯。2个TMA代表正常组织，对应于48种从不同个体获得的不同的正常组织(设三个重复)。剩下的6个TMA代表选自20种不同癌症类型的癌组织。对于20种癌症类型中的17种，采集了各不相同的12个肿瘤，并且对于剩下的3种癌症类型，采集了各不相同的4个肿瘤，所有样品对于同一肿瘤均设两个重复。用悬瀑切片机(waterfall microtome)(Leica)将所述TMA块切成4μm的厚度并置于
Figure A200780020492D00321
(Roche Applied Science)玻片上用于免疫组织化学分析。
自动免疫组织化学分析的实现如前人所述(Kampf C et al(2004)Clin.Proteomics 1：285-300)。简言之，玻片在60℃孵育45分钟，在二甲苯中脱蜡(2 x 15min)，然后在分级乙醇中水化。为回收抗原，将玻片浸于TRS(目标回收溶液，pH 6.0，DakoCytomation)中，并在Decloaking (Biocare Medical)中于125℃下煮沸4分钟。将玻片置于
Figure A200780020492D00323
(DakoCytomation)中，并用H2O2(DakoCytomation)初步阻断内源过氧化物酶。该一抗和山羊抗兔过氧化物酶偶联的
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都在室温下孵育30分钟。每步之间，都用洗涤缓冲液(DakoCytomation)漂洗玻片。最后，用二氨基联苯胺(DakoCytomation)作为发色团，并用哈里斯(Harris)苏木精(Sigma-Aldrich)进行复染色。用
Figure A200780020492D00325
(Histolab)封固玻片。
用ScanScope T2自动切片扫描系统(Aperio Technologies)扫描所有免疫组织化学染色的8种不同TMA的切片。为了表示8种TMA的总含量，生成了576张数字图像。扫描是20倍放大的。数字图像被分离并提取成独立标记的图像文件格式(TIFF)以储存原始数据。为了能够在一个基于网络的注释系统中处理图像，将各图像从TIFF格式压缩为JPEG格式。免疫组织化学染色的组织的所有图像均在显微镜下被人工评估并被经委员会认证的病理学专家注释或被专业人员注释(然后由病理专家验证)。用一种对免疫组织化学结果分类的简化方案对每种不同的正常组织以及癌组织进行注释。检查每种组织的代表性和免疫反应性。注释包括在每种正常组织类型中的不同组织特异性的细胞类型。对每种癌症，注释肿瘤细胞和间质。基本注解参数包括评估：i)染色强度，ii)染色细胞分数和iii)亚细胞定位(细胞核和/或细胞质/细胞膜)。按照在临床组织病理学诊断中使用的标准主观评估染色强度，并且结果作如下分类：阴性＝没有免疫反应性，弱＝微弱免疫反应性，中度＝中等免疫反应性或者强＝明显或强烈的免疫反应性。染色细胞分数被分为免疫反应活性细胞占代表性细胞群体的比例为<2％，2-25％，26-75％或>75％。基于强度和免疫反应活性细胞分数，对每个组织样品给出“染色分值”：0＝阴性，1＝弱，2＝中度以及3＝强。
b)结果
用针对该人类目标蛋白SATB2的一个重组蛋白片段产生的单特异性抗体进行组织分析的结果显示在几种正常组织和结肠直肠癌中(表1-4及图3-4)有一种特殊的免疫反应性(深灰)。
表1显示了正常人类组织中的该SATB2蛋白表达模式。应用免疫组织化学和TMA技术，筛选了代表48种不同正常组织类型的144个点(直径1mm)的SATB2表达。表1示出了在不同组织中的表达水平。在远端胃肠道组织和脑中两个区域组织中发现强表达(染色分值为3)。在睾丸和附睾中检测到中度(染色分值为2)表达水平。局灶淋巴细胞显示出中度或弱(染色分值为1)表达。所有其他细胞和组织为阴性(染色分值为0)。N.R.指无代表性组织。SATB2也在某些神经组织和睾丸中表达。
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Figure A200780020492D00361
图3A显示了一个显微镜放大图，其表示大脑皮层和海马体的神经元细胞核为阳性(深灰)。周围组织和神经胶质细胞为阴性(浅灰)。睾丸组织切片显示输精管中为中度和大部分核阳性(深灰)(图3B)。
在关于本发明的组织学阵列中具体发现了阑尾(图3C)、结肠(图3D)和直肠(图3E)中的粘膜腺细胞为明显、强烈的核阳性(深灰)。注意其他细胞类型如炎性细胞、内皮细胞的阴性染色(浅灰)，也存在于粘膜中。图3F示出了结肠粘膜的两个高倍放大图，显示出所有腺细胞具有该SATB2蛋白的强核表达(深灰)。
表2显示了216个不同癌症组织中SATB2的表达水平。作为代表的所有11个结肠直肠癌都显示阳性，并且其中8个为强表达。图4A示出了表示分析的11个结肠直肠癌病例的免疫组织化学染色组织切片的低倍显微镜放大图，同时4B示出了6个结肠直肠癌的代表性区域的高倍放大图。大部分癌细胞显示强核染色(深灰)，表明SATB2相对周围含有正常细胞的阴性(浅灰)组织呈高水平表达。
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4)结肠直肠癌TMA
a)材料和方法
取自122名在1999到2002年被诊断有结肠直肠癌的患者(63名女性和59名男性)的福尔马林固定石蜡包埋的存档组织，是从瑞典马尔默大学医院病理科收集的。患者的年龄中位数为75(32-88)岁。39个肿瘤处于Dukes A期，42个处于Dukes B期，41个处于Dukes C期。死亡日期的信息得自地区所有患者的死因登记。伦理许可得自地方伦理委员会。
所有122个结肠直肠癌病例都基于用苏木精和曙红染色的切片重新进行组织病理学评价。从每个病例侵袭性癌症的代表区域取2个1.0mm的芯样以构建TMA。TMA的制备和自动免疫组织化学分析的进行如上面第3部分所述，所用SATB2抗体的制备如上面第2部分所述。
组织注释的进行基本上如上面第3部分所述，除了染色强度只划分为阴性(无或弱免疫反应性)或阳性(中度或强反应性)。然后计算在细胞核中表现阳性染色强度的细胞分数，产生被称为“分数分值”的样品值。因此，“分数分值”对应样品中根据本部分中的定义表现为阳性染色强度的细胞百分比。
基于所有不同层级的存活趋势，建立一个二元变量用于进一步的统计分析，将高/阳性的SATB2表达定义为阳性细胞核>25％，将低/阴性的SATB2表达定义为阳性细胞核<25％。然后基于该分数分值将样品分为两组，划分标准为分数分值为25％。因此，若组织样品(芯)中的根本没有信号或细胞的阳性染色强度<25％，则该样品属于“<25％”组；而若细胞阳性染色强度>25％，则该样品属于“>25％”组。
上述样品分类被用于基于Kaplan-Meier估计量的总存活分析，且时序检验(the log-rank test)也被用于比较不同层级的存活情况。所有统计检验都是双侧检验，且p值<0.05％时被认为具有显著性。所有计算都是用统计软件包SPSS 12.0(SPSS Inc.Illinois，USA)进行。
b)结果
对122个结肠直肠癌的组织微阵列分析显示，99个肿瘤(81％)为SATB2阳性。令人惊讶地，不能通过常规切片或组化染色来预测SATB2的低表达或无表达，如图5所示。两个肿瘤样品(一式两份的切片)都被诊断为中间分化型直肠腺癌。图5A显示出一个SATB2强表达的切片；而在图5B中，样品无SATB2表达。
存活分析的结果示于图6，该图表显示了不同患者组随时间的累计存活。基于全部患者的存活分析显示了一个趋势(p＝0.14)，即患有SATB2低表达肿瘤的患者的总存活时间(OS)更短(图6A)。还考察了SATB2表达与临床病理学变量性别及Dukes期之间的关系。患有SATB2低表达肿瘤的女性患者(n＝63)相对全部受试者其OS更短的趋势增加(p＝0.11)(图6B)。图6C显示了在结节阴性(Dukes A和B期)的患者(n＝80)中观察到相似的趋势(p＝0.10)。在节结阴性的女性患者(n＝44)的亚群中，此趋势很显著(p＝0.04)(图6D)。
提供存活分析数据的其他方法可以是应用上面第3部分所述的“染色分值”。这种情况下，分值为0和1的样品会被定义为SATB2低表达，分值为2和3的样品会被定义为SATB2高表达。预期其结果类似于图6所显示。
5)TMA数据的定量图像分析
为了进行定量表达测量，使用Aperio ScanScope CS SlideScanner(Aperio Technologies，Vista，CA，USA)系统来捕获按上面第4部分所述制备的杂交的TMA玻片的数字图像。进行20倍放大扫描且图像被储存为多层TIFF格式。使用ImageScope(Aperio)来浏览这些适合分析的数字图像。使用TMA Lab(Aperio)对这些图像去排列以观察单个组织芯。首先，使用Color Deconvolution算法(Aperio)将每个图像分离到三个通道，即红、绿和蓝(RGB)。这使得每种染色可被分别测量，并因此可从二氨基联苯胺铬精(chromogene)染色中减去苏木精复染色。
然后，将许多不同的算法用于对细胞核、细胞质或细胞膜的染色定量。IHC Nuclear算法(Aperio)被用于定量SATB2的核染色。基于强度来识别核。使用一种边界阈值法来识别核的边界，这种方法可根据边界像素的平均值来自动调整阈值。从Aperio Technologies可得到所有算法的完整介绍。TMA上每个芯的伪色补偿图像被生成和评估以确认每种算法的精确性。
Nuclear算法的输出值是阳性核的一个百分比和TMA玻片上每个芯的一个核RGB强度值。通过用每个芯的核RGB强度乘以阳性核的百分比来计算每个组织芯上SATB2表达水平的一个自动分值(AS)。对于例如上面第4部分所述的癌症TMA样品和根据Kaplan-Meier方法估计的总存活进行AS分析。时序检验用于比较不同层级的存活。统计计算是用统计软件包SPSS12.0(SPSS Inc.Illinois，USA)进行的。
6)聚类分析
a)材料和方法
为了研究已知的结肠癌标记和SATB2之间在蛋白表达上的一致性，进行分级聚类分析。聚类是一种评估初始挖掘步骤的数据的趋势和结构的合适方法。只浏览数据集时不明显的分组和分类可以容易地通过非监督式方法例如分级聚类检测出来。在生命科学中，聚类已经十分广泛地用于RNA转录分析，如微阵列数据。
第3部分所述的6种癌症TMA被再次使用，即共计216个癌组织样品。除了按上面第2部分制备的识别SATB2的抗体，针对已知标记CEA(DAKO，Glostrup，Denmark)、CK20(DAKO，Glostrup，Denmark)、CDX2(Novocastra，Newcastle upon Tyne，UK)、p53(DAKO，Glostrup，Denmark)、Ki67(DAKO，Glostrup，Denmark)和Cyclin B1(Transductionlaboratories，Lexington，USA)的抗体也通过一种自动免疫组织化学方法被检测，该方法类似于第3部分中所述。
如第3部分所述由病理学家注释TMA，并对每个芯给出0-3范围的一个染色分值，其中3是强(黑)染色而0是无(白)染色。用统计计算语言R进行聚类分析。将聚类算法用于数据矩阵的两个维度，即组织和抗体。聚类过程总计使用了7个抗体和216个组织。8个组织由于没有可定量表达水平的图像而被去掉。使用自上而下的分级方法进行群聚分析，该方法使用了基于欧几里得距离公制的平均集聚，其中群之间的距离在每个阶段都使用Lance-Williams差异更新公式根据平均连接重新计算。聚类所用算法决定了子树(sub-tree)从而使更紧的群示于每个节点的左侧。
为了进一步研究SATB2和CK20的异同，使用具有第4部分所述的122个癌组织芯的癌组织TMA进行免疫组织化学分析。用按第2部分所述制备的SATB2抗体和获自DAKO(Glostrup，Denmark)的CK20抗体对TMA染色。根据第4部分中定义的“分数分值”注释两个TMA，然后比较。
b)结果
在216个不同肿瘤中检查SATB2与已知标记CEA、CK20、CDX2、p53、Ki67和Cyclin B1相比较作为结肠直肠癌标记的特异性。对这7种不同蛋白的表达谱的数据的分级聚类得出了热图和伴随的树状图，如图7所示。从肿瘤的热图和树状图清楚地看出，大部分结肠直肠癌形成一个群集，该群集基于SATB2、CK20、CDX2和CEA高表达水平以最高水平被分离。另外，分析显示SATB2群集以及CK20和CDX2群集都具有比其他显示出更一般的表达模式的被测标记更特异的表达。在8个结肠直肠癌的群集中，也有强SATB2阳性的一个宫颈腺癌和一个胆管细胞型肝癌病例。除该群集外，有三个结肠直肠癌为SATB2阴性。引人注意的是，SATB2表达模式与CK20的表达没有明显的关联，因此能够在结肠直肠癌鉴定中作为CK20的补充。
在第4部分所描述的122个癌组织的TMA上对SATB2和CK20进行了更详细的分析。其中，按照分值分值>25％的标准，单独的CK20确认为122个结肠直肠癌的86％(105/122)，且单独的SATB2确认为81％(99/122)(图8)。引人注意的是，结合两种标记的染色数据，93％(113/122)的结肠直肠癌明显地对两种标记中的一种或两种呈阳性。只有5名患者完全缺乏CK20或SATB2的表达。这个信息在诊断癌症时——更具体来说在试图鉴定转移时——是有价值的，因为癌症的一个临床常见问题是患者出现来源未知的转移。因此，通过结合得自CK20和SATB2的信息，患者可更容易地获得结肠直肠腺癌的精确诊断。
另外，还分析了SATB2和CK20在17个结肠直肠癌患者的淋巴结转移中的表达。按照染色分值为2或3，单独的CK20确认为88％(15/17)的转移的来源。按照分数分值>25％，单独的SATB2确认为82％(14/17)的转移的来源(图9)。结合两种标记的染色数据，确认了94％(16/17)的转移的来源。这进一步支持了在确定转移是否源自结肠直肠癌时，关于SATB2和CK20表达的信息是人们希望得到的。
本发明实施方案的逐项列表
下面是本发明实施方案的非限制性逐项列表，目的是提供关于本发明某些方面的各个特征和组合的进一步的信息。
1.诊断结肠直肠癌的方法，包含检测SATB2蛋白的一个步骤。
2.根据第1项的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
3.根据前述项中任一项的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
4.根据前述项的任一项的方法，包括下列步骤：
a)提供来自怀疑患有结肠直肠癌的患者的样品；
b)对所述样品应用可检测的亲和配体，所述亲和配体可选择性地与待检测的SATB2蛋白相互作用，所述应用是在允许亲和配体与存在于样品中的任何SATB2蛋白结合的条件下施行的。
c)除去未结合的亲和配体；并且
d)检测与该样品保持关联的任何亲和配体。
5.根据第4项的方法，其中所述样品是一种体液样品。
6.根据第5项的方法，其中所述体液选自下组，其构成为血液、血浆、血清、脑液、尿液、精液和渗出液。
7.根据第4项的方法，其中所述样品是一种粪便样品。
8.根据第4项的方法，其中所述样品是一种组织样品。
9.根据第4项的方法，其中所述样品是一种细胞学样品。
10.根据第4-9项的任一项的方法，其中所述可检测的亲和配体选自抗体、其片段和其衍生物。
11.根据第4-9项的任一项的方法，其中所述可检测的亲和配体是源自一种支架的蛋白配体，该支架选自下组，其构成为葡萄球菌A蛋白及其结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤维连接蛋白III型结构域和锌指结构。
12.根据第4-9项的任一项的方法，其中所述可检测的亲和配体是一种寡核苷酸分子。
13.根据4-12项的任一项的方法，其中所述可检测的亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
14.根据第4-12项的任一项的方法，其中所述可检测的亲和配体是用一种能够识别所述可检测的亲和配体的二级亲和配体检测的。
15.根据第14项的方法，其中所述能够识别所述可检测的亲和配体的二级亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
16.执行第1-15项的任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的可检测的亲和配体；和
b)用于检测亲和配体存在的必需的试剂。
17.根据第16项的试剂盒，其中所述可检测的亲和配体选自抗体、其片段和其衍生物。
18.根据第16项的试剂盒，其中所述可检测的亲和配体是源自一种支架的蛋白配体，该支架选自下组，其构成为葡萄球菌A蛋白及其结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤维连接蛋白III型结构域和锌指结构。
19.根据第16项的试剂盒，其中所述可检测的亲和配体是一种寡核苷酸分子。
20.根据第16-19项的任一项的试剂盒，其中所述可检测的亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
21.根据第16-19项的任一项的试剂盒，其中所述用于检测所述亲和配体存在所必需的试剂包括能够识别所述可检测的亲和配体的二级亲和配体。
22.根据第21项的试剂盒，其中所述所述能够识别所述可检测的亲和配体的二级亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料或金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
23.SATB2蛋白作为一种结肠直肠癌诊断标记的应用。
24.SATB2蛋白或其抗原活性的片段在制造用于诊断结肠直肠癌的诊断试剂中的应用。
25.根据第23和24的任一项的应用，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
26.根据第23和24项的任一项的应用，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括选自如下序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
27.能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的亲和配体，所述亲和配体是一种抗体或其片段或其衍生物。
28.根据第27项的亲和配体，所述亲和配体可从一种包括用一种蛋白免疫动物的步骤的方法中获得，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1序列。
29.根据第27-28项的任一项的亲和配体作为诊断试剂的应用。
30.根据第27-28项的任一项的亲和配体在制造用于诊断结肠直肠癌的诊断试剂中的应用。
序列表
<110>阿特拉斯抗体有限公司
<120>SATB2蛋白作为结肠直肠癌标记的应用
<130>21031658
<150>EP06114954.8
<151>2006-06-02
<150>US 60/816613
<151>2006-06-27
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>123
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
Figure A200780020492D00461
<210>2
<211>733
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
Figure A200780020492D00481
<210>3
<211>5318
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>3
Figure A200780020492D00492
Figure A200780020492D00501
Figure A200780020492D00511
Figure A200780020492D00521

Claims (53)

1 确定患有或怀疑患有结肠直肠癌的哺乳动物受试者的结肠直肠癌预后是否不良的方法，包括以下步骤：
a)提供一个来自该受试者的样品；
b)对存在于所述样品中的SATB2蛋白进行定量以得到一个样品值；
c)将得自步骤b)的样品值与一个对照值进行比较；并且，如果所述样品值低于所述对照值，
d)则判断所述受试者的结肠直肠癌预后不良。
2 根据权利要求1的方法，其中步骤d)中的不良预后对应五年存活的可能性为65％或更低。
3 根据权利要求2的方法，其中步骤d)中的不良预后对应五年存活的可能性为60％或更低。
4 对有需要的结肠直肠癌受试者的治疗方法，包括：
a)提供一个来自该受试者的样品；
b)对存在于所述样品中的SATB2蛋白进行定量，得到一个样品值；
c)将得自步骤b)的样品值与对照值进行比较；并且，如果所述样品值低于所述对照值，
d)则用一个适用于结肠直肠癌的预后不良的治疗方案治疗所述受试者。
5 根据权利要求4的方法，其中所述治疗方案选自化学疗法、新辅助疗法及它们的组合。
6 根据权利要求5的方法，其中所述治疗方案为新辅助疗法。
7 根据权利要求6的方法，其中所述新辅助疗法选自i)仅放射疗法和ii)放射疗法结合化学疗法。
8 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述结肠直肠癌是结节阴性的。
9 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述结肠直肠癌处于Dukes A或B期。
10 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述结肠直肠癌是结肠直肠腺瘤。
11 根据权利要求1-9的任一项的方法，其中所述结肠直肠癌是结肠直肠上皮癌(colo-rectal carcinoma)。
12 根据权利要求1-7的任一项的方法，其中所述结肠直肠癌是转移性癌。
13 根据权利要求1-7和12的任一项的方法，其中所述结肠直肠癌处于Dukes C期。
14 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述受试者是人类。
15 根据权利要求14的方法，其中所述受试者是女性。
16 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述对照值是一个预定值，该值与一个对照样品中的SATB2表达量相对应。
17 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述对照值是SATB2阳性细胞的分数分值为50％。
18 根据权利要求17的方法，其中所述对照值是SATB2阳性细胞的分数分值为25％。
19 根据权利要求1-16任一项的方法，其中所述对照值是SATB2表达的自动分值为70。
20 根据权利要求19的方法，其中所述对照值是SATB2表达的自动分值为50。
21 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述样品是一种体液样品。
22 根据权利要求21的方法，其中所述体液选自下组，其构成为血液、血浆、血清、脑液、尿液、精液和渗出液。
23 根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述样品是一种粪便样品。
24 根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述样品是一种组织样品。
25 根据权利要求24的方法，其中所述组织样品是一种结肠直肠组织样品。
26 根据权利要求1-20任一项的方法，其中所述样品是一种细胞学样品。
27 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
28 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
29 根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括：
b1)对所述样品应用一种可定量的亲和配体，所述亲和配体能够选择性地与待定量的SATB2蛋白相互作用，所述应用是在使所述亲和配体能够与存在于所述样品中的任何SATB2蛋白结合的条件下施行的；
b2)除去未结合的亲和配体；并且
b3)对与该样品保持相关联的任何亲和配体进行定量。
30 根据权利要求29的方法，其中所述可定量的亲和配体选自下组，其构成为抗体、其片段和其衍生物。
31 根据权利要求29的方法，其中所述可定量的亲和配体是源自一种支架的蛋白配体，该支架选自下组，其构成为葡萄球菌A蛋白及其结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤维连接蛋白III型结构域和锌指结构。
32 根据权利要求29的方法，其中所述可定量的亲和配体是一种寡核苷酸分子。
33 根据权利要求29的方法，其中所述可定量的亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
34 根据权利要求29-33的任一项的方法，其中所述可定量的亲和配体是用一种能够识别所述可定量的亲和配体的二级亲和配体检测的。
35 根据权利要求34的方法，其中所述能够识别所述可定量的亲和配体的二级亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
36 执行根据前述权利要求任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的可定量的亲和配体；和
b)对所述亲和配体进行定量所必需的试剂。
37 根据权利要求36的试剂盒，其中所述可定量的亲和配体选自下组，其构成为抗体、其片段和其衍生物。
38 根据权利要求36的试剂盒，其中所述可定量的亲和配体是源自一种支架的蛋白配体，该支架选自下组，其构成为葡萄球菌A蛋白及其结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤维连接蛋白III型结构域和锌指结构。
39 根据权利要求36的试剂盒，其中可定量的亲和配体是一种寡核苷酸分子。
40 根据权利要求36-39的任一项的试剂盒，其中所述可检测的亲和配体含有一个标签，该标签选自荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
41 根据权利要求36-39的任一项的试剂盒，其中所述用于亲和配体进行定量的必需试剂包括能够识别所述可定量的亲和配体的一种二级亲和配体。
42 根据权利要求41的试剂盒，其中所述能够识别所述可定量的亲和配体的二级亲和配体含有一个标签，该标签选自下组，其构成为荧光染料或金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素和颗粒。
43 根据权利要求36-42的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于提供对照值的一个对照样品。
44 SATB2蛋白作为一种预后标记的应用。
45 SATB2蛋白作为一种结肠直肠癌预后标记的应用。
46 SATB2蛋白或其抗原活性片段在制造用于结肠直肠癌预后的预后试剂中的应用。
47 根据权利要求44-46任一项的应用，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包含一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：1；和
ii)一个与SEQ ID NO：1至少85％相同的序列。
48 根据权利要求44-46任一项的应用，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包含一个选自如下的序列：
i)SEQ ID NO：2；和
ii)一个与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列。
49 能够选择性地与SATB2蛋白相互作用的亲和配体，所述亲和配体是一种抗体或其片段或衍生物。
50 根据权利要求49的亲和配体，所述亲和配体可从一种包括用一种蛋白免疫动物的步骤的方法中获得，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1序列。
51 根据权利要求49和50的任一项的亲和配体作为预后试剂的应用。
52 根据权利要求49和50的任一项的亲和配体用于结肠直肠癌预后的应用。
53 根据权利要求49和50的任一项的亲和配体在制造用于结肠直肠癌预后的预后试剂中的应用。
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