JP4282087B2 - 結腸直腸癌に対するマーカーとしてのタンパク質プロテアソームアクチベーターサブユニット3(pse3)の使用 - Google Patents
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Description
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸(6)]二アンモニウム塩
BSA ウシ血清アルブミン
cDNA 相補DNA
CHAPS (3-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホン酸)
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素結合免疫吸着定量法
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IAA ヨードアセタミド
IgG 免疫グロブリンG
IEF 等電点電気泳動法
IPG 固定化pH勾配
LDS ドデシル硫酸リチウム
MALDI-TOF マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析
MES メシチル、2,4,6-トリメチルフェニル
OD 光学密度
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PI 等電点
RTS 迅速翻訳装置
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
潜在的な結腸直腸癌マーカーとしてのPSE3の同定
組織の供給源
結腸直腸癌の潜在的な診断マーカーとして腫瘍特異的なタンパク質を同定するために、プロテオミクス方法を用いて3つの異なる種類の組織の分析を行なう。
0.8〜1.2gの凍結組織をモルタルに入れ、液体窒素で完全に凍結させる。組織をモルタル中で粉砕し、10倍容積(w/v)の溶解バッファー(40mM クエン酸Na、5mM MgCl2、1% Genapol X-080、0.02%アジドNa、Complete(登録商標)EDTAフリー [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号 1 873 580])中に溶解させ、続いてWheaton(登録商標)グラスホモジナイザー(20×ルーズフィッティング、20×タイトフィッティング)でホモジナイズする。3 mlのホモジェネートを1時間4500xgでスクロース密度遠心分離(10〜60%スクロース)に供する。この遠心分離工程後、3画分を得る。グラジェントの上部の画分は、可溶性タンパク質を含み、更なる解析に用いる。
IEFのために、3 mlの懸濁液を12 mlの試料バッファー(7M 尿素、2M チオ尿素、2% CHAPS、0.4% IPGバッファー pH4〜7、0.5% DTT)と混合し、1時間インキュベートする。試料をAmicon(登録商標)Ultra-15装置(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)で濃縮し、Bio-Rad(登録商標)タンパク質アッセイ(カタログ番号 500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Germany)を用いて製造業者のマニュアルの指示に従ってタンパク質濃度を測定する。1.5 mgのタンパク質試料に相当する容積に、最終体積350 μlまでバッファーを加える。この溶液を用いてIPG条片pH4〜7(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を一晩再水和させる。以下の勾配プロトコルを用いてIEFを行なう:1.)500Vまで1分;2.)3,500Vまで2時間;3.)3,500Vの一定で22時間、82 kVhを生じさせる。IEF後、条片を-80℃で保存するか、またはSDS-PAGEで直接使用する。
各患者を、ProteomeWeaver(登録商標)ソフトウェア(Definiens AG, Germany, Munchen)を用いてイメージ分析により別々に分析する。さらに、ゲルの全てのスポットを、ピッキングロボットにより切り出し、スポットに存在するタンパク質をMALDI-TOFマススペクトロメトリー(UltraflexTMTof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)により同定する。各患者について、腫瘍試料由来の4つのゲルを、隣接する正常なおよび細片化した粘膜組織由来の4つのゲルと比較し、差次的に発現したタンパク質に対応する独自のスポットについて分析する。この手段により、タンパク質PSE3は腫瘍組織中に特異的に発現するか、強く過剰発現するが、健康な対照組織中では検出されないか、それ程強くは発現しないことが見出される。それゆえ、多くのタンパク質の中でもとりわけ、結腸直腸癌の診断に使用するための候補マーカーとして適切である。
結腸直腸癌マーカータンパク質PSE3に対する抗体の産生
結腸直腸癌マーカータンパク質PSE3に対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングおよびELISAによりPSE3の血清および血漿および血液レベルの測定における抗体のさらなる使用のために産生する。
PSE3に対する抗体を産生するために、免疫原を得るためにタンパク質の組換え発現を行なう。発現は、RTS100発現系および大腸菌の組み合わせを適用して行なう。第一の工程において、DNA配列を分析し、高収率cDNAサイレント変異バリアントおよび個々のPCRプライマー配列の推奨を「ProteoExpert RTS E.coli HY」系を用いて得る。これは商業用のウェブベースサービスである(www.proteoexpert.com)。推奨されたプライマー対を用いて、cDNAから直鎖PCRテンプレートを産生するため、およびPSE3タンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロ転写および発現のために「RTS 100 E.coli Linear Template Generation Set, His-tag」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号. 3186237)系を使用する。ウエスタンブロット検出およびその後の精製のために、発現タンパク質はHis-tagを含む。最良の発現バリアントを同定する。PCRから発現および検出までの全ての工程を製造業者の指示に従って行なう。全ての必要なT7調節領域(プロモーター、リボソーム結合部位およびT7ターミネーター)を含む各々のPCR産物を、製造業者の指示に従ってpBAD TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号. K 4300/01)にクローニングする。T7調節配列を用いる発現のために、構築物を大腸菌BL 21(DE 3)(Studier, F.W.ら、Methods Enzymol. 185 (1990)60-89)に形質転換し、形質転換細菌をタンパク質発現のために1lバッチ中で培養する。
a)マウスの免疫化
12週齢のA/Jマウスを100μgのPSE3で腹腔内に初回免疫する。6週間後、一月間隔で2回のさらなる腹腔内免疫を行なう。この過程において、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着した100μgのPSE3および109個の細菌の百日咳菌を投与する。続いて、最後の2回の免疫を、PBSバッファー中の100μgのPSE3を用いて融合の3日前および2日前におのおの静脈内に行う。
a)に従って免疫化したマウスの脾臓細胞をGalfre, G.およびMilstein, C., Methods in Enzymology 73(1981)3-46に従ってミエローマ細胞と融合する。この過程において、免疫化マウスの約1×108個の脾臓細胞を2×107個のミエローマ細胞(P3X63-Ag8-653、ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離(300 xgおよび4℃で10分間)する。次いで、細胞をウシ胎仔血清(FCS)を含まないRPMI 1640培地で一度洗浄し、50 mlコニカルチューブ中にて400 xgで再び遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈殿物をタッピングにより穏やかに解し、1 mlのPEG(分子量4000、Merck、Darmstadt)を加え、ピペッティングにより混合する。37℃の温浴中で1分間の後、4〜5分以内に室温でFCSを含まない5 mlのRPMI 1640を滴下する。その後、10%FCSを含む5 mlのRPMI 1640を約1分以内に滴下し、十分に混合し、培地(RPMI 1640+10% FCS)で50 mlにし、続いて400 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。沈殿した細胞を、10% FCSを含むRPMI 1640培地中にとり、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地(RPMI 1640+10% FCS中に100 mmol/l ヒポキサンチン、1 μg/ml アザセリン)中に播種する。100 U/mlのインターロイキン6を成長因子として培地に添加する。
得られたハイブリドーマ細胞を、10%FCSを含むRPMI 1640培地中に1 mlあたり1×105個の細胞の密度で播種し、発酵槽(Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, 注文番号. 144-050)中で7日間増殖させる。1 mlあたり100 μgの平均濃度のモノクローナル抗体が培養上清中に得られる。培養上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法(例えば、Bruck, C.ら、Methods in Enzymology 121(1986)587-695による)により行なう。
a)免疫
免疫のために、1:1の比のタンパク質溶液(100 μg/ml タンパク質PSE3)および完全なフロイントアジュバントの新鮮なエマルジョンを調製する。各ウサギを1 mlのエマルジョンで1、7、14および30、60および90日に免疫する。血液を抜き取り、得られた抗PSE3血清を実施例3および4に記載されるさらなる実験のために使用する。
1容積のウサギ血清を4容積の酢酸バッファー(60 mM、pH4.0)で希釈する。pHを2 M Tris塩基を用いて4.5に調整する。カプリル酸(希釈試料の25 μl/ml)を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離(13,000 xg、30分、4℃)し、ペレットを廃棄し、上清を収集する。上清のpHを2 M Tris塩基を加えることによって7.5に調整し、濾過(0.2 μm)する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50 μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中に3.6 mg/ml)を加える。室温で30分後、試料をSuperdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行う。ビオチン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってビオチン化する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中に10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり、50 μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミド エステル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号. 1 333 054)(DMSO中に3.8 mg/ml)を加える。室温で30分後、試料をSuperdex(登録商標) 200(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行う。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を収集する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってジゴキシゲニンで標識する。
実施例2で産生したポリクローナル抗体を使用したヒト結腸直腸癌組織におけるPSE3の検出のためのウエスタンブロッティング
腫瘍試料および健康な対照試料由来の組織溶解物を実施例1「組織調製」に記載されたように調製する。
ヒト血清および血漿試料中のPSE3の測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のPSE3の検出のために、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉および検出のために、抗PSE3ポリクローナル抗体(実施例2参照)のアリコートをビオチンおよびジゴキシゲニンそれぞれとコンジュゲートする。
診断の正確度の点から臨床的有用性を評価するためのROC分析
正確度を、十分に特徴づけられた患者コホート、すなわち結腸内視術を受け、腺腫またはCRCを有さないと判明した50人の患者、診断されCRCのT1〜3、N0、M0に病期分類された50人の患者、および少なくとも一つの近傍リンパ節に少なくとも腫瘍浸潤を有するかまたはより重篤な形態の転移を有する進行したCRCと診断された50人の患者それぞれから得られた個々の液体試料を分析することにより評価する。市販のアッセイ(Roche Diagnostics, CEA-アッセイ(Elecsys(登録商標)Systemsイムノアッセイアナライザーのカタログ番号. 1 173 1629))により測定されるCEAおよび上記のように測定されるPSE3は、これらの個体の各々から得られた血清中で定量する。ROC分析をZweig, M. H.およびCampbell, 前出に従って行なう。PSE3と確立されたマーカーCEAとの組み合わせについてTis〜3、N0、M0群の患者と健康な個体とを区別するための判別能力は、調整した判別式分析によって計算される(Friedman, J. H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
Claims (9)
- a)個体から得られた液体試料を提供する工程、
b)該試料と、プロテアソームアクチベーターサブユニット3 (PSE3)に対して特異的に結合する試薬とを、該結合試薬とPSE3との間での複合体形成に適切な条件下で接触させる工程、及び
c)(b)で形成した複合体の量を、結腸直腸癌の検出に対して相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の検出方法。 - 前記試料が血清であることをさらに特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記試料が血漿であることをさらに特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記試料が全血であることをさらに特徴とする、請求項1記載の方法。
- 個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の検出における、マーカー分子としてのタンパク質PSE3の使用。
- 個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の早期検出における、マーカー分子としてのタンパク質PSE3の使用。
- 腺腫期のCRC患者由来の試料で早期検出が行われる、請求項6記載の使用。
- Tis〜3; N0; M0期のCRC患者由来の試料を用いて早期検出が行われる、請求項6記載の使用。
- 個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の検出における、結腸直腸癌に対するマーカー分子としてのタンパク質PSE3の、結腸直腸癌に対する別のマーカー分子と組み合わせた使用。
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