CN1261897A - 造血干细胞表面的蛋白质sm1 - Google Patents

Abstract

一种被称为“SM1”的蛋白质,借助于免疫沉淀法和SDS－PAGE测定时,具有大约230KDa的分子量。SM1蛋白质分别存在于人和小鼠造血干细胞的表面,以及原始前身细胞的表面,但是不存在于其它细胞的表面,如FDC－P1髓样前身细胞,EL4T－细胞,WEHI－3骨髓单核细胞,和70Z/3前－B淋巴细胞,或者也不存在于人脐带血或小鼠骨髓的分化造血细胞的表面。可将抗－SM1抗体用于制备一种富含造血干细胞的制剂。

Description

造血干细胞表面的蛋白质SM1

                        发明背景

本发明涉及一种在此被称为SM1的蛋白质，它基本上是以不含有其它蛋白质的纯化形式存在。借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE测定的分子量是大约230 KDa，SM1存在于人和小鼠的造血干细胞及原始前身细胞的表面，但是不存在于其它细胞的表面，包括：FDC-P1髓样前身细胞，EL4 T-细胞，WEHI-3骨髓单核细胞，以及70 Z/3前-B淋巴样细胞，或者也不存在于人脐带血(Cord blood)或小鼠骨髓中已分化的造血干细胞表面。本发明还进一步涉及应用抗-SM1抗体产生富含造血干细胞群的方法。

所有循环中的血细胞都由多能性干细胞通过造血过程形成。造血干细胞是能够自我更新的未分化细胞，并能分化成髓样血细胞系，红细胞样血细胞系，巨核血细胞系，以及淋巴样血细胞系的定型前身细胞。透彻地分析造血干细胞，对充分地理解血淋巴系统的发育生物学是十分重要的。但是，关于造血干细胞所知尚少。

功能上，对于致死性辐射接受者，在体内造血干细胞能够长期重建血淋巴系统。Spangrude & Johnson，PNAS 87：7433-7437(1990)；Spangrude et al.，血液78：1395-1402(1991)。它们还可以分化成为短期造血干细胞，被称为12天脾集落形成单位(CFU-S)，可在体内脾病灶形成试验中观察到。Spangrude et al，科学241：58-62(1988)；Molineux et al.，实验血液学14：710(1986)；Nakahata & Ogawa，PNAS 79：3843-3847(1982)。此外，造血干细胞的另一个特性是当体外粘附于基质细胞层时，呈现出“鹅卵石”的形态。Wong et al.，免疫1：571-583(1994)。

试图更详细地描述造血干细胞特征的努力受到了阻碍，主要是因为与所有的细胞相比较，造血干细胞的含量都较微小(小于0.01％)，甚至在血细胞形成器官如骨髓或胎儿肝脏中也是如此。Li &Johnson，血液85：1472-1479(1995)。因此，为了产生富集的干细胞群，作为一种手段，阐明造血干细胞特有的物理学特征也是所希望的。例如，可参阅Spangrude et al.，Blood 78：1395-1402(1991)。所有已知的造血干细胞富集方案都涉及主要基于选择细胞表面标志的细胞分离法，或者其它的物理学方法，如密度梯度离心法，对流离心淘洗法，以及基于光散射特征的细胞分选法。Bertoncello etal.，实验血液学13：999-1006(1985)；Mulder & Visser，实验血液学15：99-106(1987)；Ploemacher & Brons，实验血液学17：263-271(1989)；Szilvassy et al，PNAS 86：8798-8802(1989)。虽然已有人描述了一些获得富集的造血干细胞群的方法，但是，缺乏专一的标志阻碍了对明确的纯造血干细胞群的分离。

某些造血干细胞表达细胞表面分化抗原(Thy-1)和干细胞抗原-1(Sca-1)。但是，它们不表达B细胞(B220)粒细胞(Gr-1)，髓单核细胞(Mac-1)和T细胞(CD4，CD8)的谱系(Lin)标志。Spangrude et al同上。已报导的最广泛应用的造血干细胞富集方案包括使用抗Thy-1和Sca-1单克隆抗体。Orlic et al.，同上。但是，只是Thy-1⁺，Sca-1⁺和Lin^-细胞的亚群能够使受致死性辐射的对象长期恢复繁殖。Smith et al，PNAS 88：2788-2792(1991)。因此，基于Thy-1和Sca-1表达的选择不能产生纯的造血干细胞群。类似地，其它一些造血干细胞富集技术，例如那些涉及使用抗-蛋白酪氨酸激酶，如W座位基因产物，C-kit，和胎肝激酶-2(flk-2)单克隆抗体的技术，显然不能够区分造血干细胞和前身细胞。见例如Matthews et al.，细胞65：1143-1152(1991)。

与造血干细胞有关的细胞表面标志的另一个例子是CD34。膜磷酸糖蛋白CD34存在于如下的细胞上：造血干细胞，所有造血细胞系的定型的祖先细胞，早期多能性造血祖先细胞，以及内皮细胞。Krause etal.，血液87：1(1996)。经估算CD34⁺细胞占总骨髓细胞的大约2.5％，Osewa et al.，科学273-242(1996)，而在人和狒狒是1-4％，Civin et al.，免疫学杂志；Civin et al.，实验血液学15：10(1987)；Berenson et al.，临床研究杂志81：951(1988)。

经估算，造血干细胞不到总骨髓细胞的0.1％。因此，仅仅基于CD34的选择法不能获得真正纯的造血干细胞群。使CD34同其它细胞表面标志一起，共同定向干细胞的纯化。这些标志包括所谓的谱系特异性抗原，如HLA-DR，Thy-1，CD33，MDR-1，c-kit，CD45和CD38。Sutherland et al.，血液74：1563(1989)；Sutherlandet al.，血液78：666(1991)；Lansdorp et al.，实验医学杂志172：363(1990)；Baum et al.，PNAS 89：2804(1992)；Briddell et al.，血液79：3159(1992)；Drach et al血液78：30(1992)；Gore et al，血液77：1681(1991)；Griffin et al，血液60：30(1982)；Verfillie et al，实验医学172：509(1990)；Terstappen et al，血液77：1218(1991)；Huang & Terstappen，自然360：709(1992)；Huang & Terstappen，血液83：1515(1994)；Cardoso et al.，PNAS 90：8707(1993)；Issaad etal，血液81：2916(1993)；Srour et al，免疫学杂志148：815(1992)。应用这种组合标志，发现CD34⁺/CD38⁺细胞的含量小于人骨髓细胞总数的0.1％，Civin et al，血液88：4102(1996)，而CD34⁺ Thy-1⁺ Lin^-细胞的含量占人胎儿骨髓细胞的0.05％-0.1％，Baum et al，PNAS 89：2804(1992)。

已发现，仅仅通过CD34，或者结合其它标志选择而富集的CD34⁺细胞组分，都显示具有原始前身细胞或干细胞的功能。为了试验CD34-富集的细胞具有作为造血干细胞是定义性特征的长期重建能力，Wong等(同上)，对小鼠进行了体外试验研究。对于人细胞。为了测定真正造血干细胞的典型特征，已应用了多种体外试验法。这些试验包括，检测原始的多谱系造血前身细胞/干细胞，Brand et al，血液83：1507(1994)，Rusten et al，血液84：1473(1994)，检测潜在的高度增殖性细胞，Muench et al，血液83：3170(1994)，检测未成熟的集落形成细胞，Leary & Ogane血液69：953-956(1987)，检测鹅卵石形成细胞，Henschler et al，血液84：2898(1994)，以及检测长期培养起始细胞(LTC-IC)，Lemieux etal，血液86：1339(1995)；Verfaillie & Miller，loc cit 84：1442(1994)。虽然这些原始细胞确实显示出某些与造血干细胞有关的特性，例如高度的增殖能力和能够分化成多种造血细胞的谱系，但是，有争议的是CD34-富集的细胞不能构成真正纯的造血干细胞群。Lord& Dexter实验血液学23：1237(1995)。然而已发现CD34-富集的细胞群具有很高的临床价值，Emerson，同上。

最近报导已从致死性辐射接受者小鼠确立了一个细胞系，此小鼠是用先前以重新配置的反转录病毒基因组转导的胎肝细胞重建的，Wonget al，同上，BL3细胞显示有功能性造血干细胞的所有特点，即它们可以长期重建致死性辐射的接受者，它们可产生前-CFU-S和集落形成细胞，以及它们在与基质细胞结合时会形成“鹅卵石”形。除了是Thy-1⁺，Sca-1⁺和Lin^-之外，BL3细胞还表达一个已知是在造血干细胞表达的转录因子GATA-1，Sposi et al.，PNAS 89：6353-6357(1992)。而且，BL3细胞是从12天龄小鼠胚胎肝细胞得到的胚胎来源性细胞。因此，BL3细胞可能具有不同于成熟造血干细胞的细胞表面标志，Jordan et al，同上，Spangrude et al同上。

上述论述突出地表明，需要有对造血干细胞作标志的其它细胞表面标志物，更具体地是，使之能够产生较高富集的造血干细胞群，并且普遍地促进对未成熟血细胞生长和分化的更深认识。

                       发明概述

因此，本发明的目的之一是鉴别和分离出一个标志物，它存在于人和小鼠造血干细胞和原始前身细胞表面，但是不存在于定型的前身细胞或成熟细胞的表面。本发明还有一个目的是提供这样一种标志在鉴定假定的造血干细胞调节因子中的应用。本发明的另一目的是提供一种针对来自人或小鼠造血干细胞，或者原始前身细胞的细胞表面标志物的抗体，此抗体可用于产生富集的造血干细胞群。

为达到这一些和其它一些目的，本发明者提供了基本上不含有其它蛋白质的SM1蛋白，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE测定时，SM1具有大约230 KDa的分子量，SM1存在于人和小鼠的造血干细胞原始前身细胞的表面，但是不存在于其它细胞的表面，例如FDC-P1髓样前身细胞，EL4 T-细胞，WEHI-3骨髓单核细胞，以及70Z/3前-B淋巴样细胞，或者也不存在于人脐带血或小鼠骨髓中已分化的造血细胞表面。还可借助于抗SM1抗体并应用此抗体富集造血干细胞达到目的。

按照其中一个实施方案，是将抗SM1抗体用于制备本发明富含造血干细胞的组合物。本发明的方法包括如下步骤：(a)提供结合SM1的抗体，(b)将此抗体固定化在某种支持载体上，使此抗体保持其结合SM1的能力，然后(c)使假定含有造血干细胞的混合细胞群与此抗体接触，致使干细胞附着在支持载体上，(d)除去未附着的细胞，从而，富含造血干细胞的细胞群仍然附着在支持载体上。

本发明的另一个实施方案是一个用于制备富含造血干细胞组合物的试剂盒，包括(i)可结合SM1的抗体和(ii)使用此试剂盒的文字说明，用于指导进行抗体促进的高纯度造血干细胞富集，这种造血干细胞能够实现长期的造血重建过程。为了纯化造血干细胞用于病人的治疗，例如在移植时，可先从HLA相同或几乎相同的供者取得骨髓。然后使骨髓细胞同试剂盒的抗体接触。按这种方式分离的细胞可经受生长因子和细胞因子的作用，变成适合于对病人移植的足够纯的造血干细胞群。

在本发明另外的一个实施方案中，一个用于检测样品中结合SM1的造血因子的方法包括：(a)使怀疑含有此生长因子的样品同标记的SM1接触，和(b)检测此造血因子同标记SM1的结合。

本发明的另一个实施方案是关于一种用于检测结合SM1的造血因子的试剂盒，包括标记的SM1，以及另外还包括使用这种试剂盒的文字说明。

本发明的另一个实施方案包括在体外扩增或扩展人SM1细胞的方法。为了在液体培养系统中生长，可使SM1细胞悬浮在含有补充的生长因子和细胞因子的液体培养基中。在一种基质共培养系统中，可使SM1细胞在含有或不含有补充的生长因子和细胞因子的情况下，生长在混合基质细胞制品粘附层的上面或在其内部。

本发明此外还有另一个实施方案，提供了一个编码SM1的分离出的DNA分子。本发明的一个特定实施方案提供了一个包括如下核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的分离DNA分子：GGAATTCCGN CAGCAAGTTC TTATTCTGCC TAAGAATTTT GTGATTCAGCACAAAGAGGG GAAAGCAGTT GAAAAAGAGA TAGCAGCACC TCAGCAGAAAGGCCCAGAGC ATTGCTCACC TGGCCCACAG ACAAGCGCTA CGTGTTCCTTAGTGTCTGTT CCTGTCACCT CTGTGTCTAC CCAACTGCCT AATACAGTTCTCAGTAAGAC AAGTACACCT TCATCAAATG TGAGTGCTAG ATCACAGCCTTTGTCTCCTG TAGCCTCTGT AAGTAATGCA TTAACATCAC CAGTTAAGACTAGCCAAAGT GAAGCAGGAA AAGTCAAGAG TACCGCTTCA TCCACCACACTCCCCCAGCC TCACACTTCA CCTACCATTT CATCAACAGT TCAGCCTCTCTTGCCAGCAA CAACACTAAA TGAATCTACA GATCCTGGCA GTTCCATCCCCTGTTTTTCA CAGCAAACTG TTGATTCTTC TGAGGCAAAG CAAGAACTAAAAACTGTATG TATACGAGAT TCACAGTCAA TTCTTGTTAG GACTCCAGGTGGGAACACTG GAGTTGTAAA AGTACAAACT AATCCGGAAC AAAATTCACCCAACAGTTTA TCTTCAAGTT CTGTTTTCAC CTTTACACCT CAATTTCAGGCATTTCTTGT GCCAAAATCA ACATCATGCT CTGCTTCCTC ACAAGTAGCCGGAGTGACTA CTACATCTAG TCTACCATCT TTCAGCCAAG CAATCTACGTNTGTGTNGCT TCATCCACCC ATGGGAAAAA TCTCAAATCT ACACAAGGCCAAACCTTGAG CAGTGGTATG TAGGCCCCAT GATAGAAAAA ACGTCATACATGCCCTCTTC ACCCTTGAAG CCTTCTGTTT CTTCCAGCTC ACTGCTACCATCAACAACAA ATAGTTCAGT GAGTGTAATT AGCATATCAA CAGGAAATNNNGGGCAAACC AATACAAATG TTATTCATAC ATCAACTAAA CCACAACAAGTAGATTGTAT CACNAAAAGT TACCCAGTTA CAAGATCAGA AGCAACAACAGCAGTAAATG GTGATGTGCT CGGTGAGACT CCAGGTCAGA AACTGATGCTGGTGTCAGCT CCATCTGGTC TCCCTTCTGG CAGTGTACCT TCAGTTAACACGGCACCAGA ACCGACATCT GCAGGTGTGT CTACCCAGAA GGTAGTTTTTATTAATGCTC CAGTTCCTGG TGGCGCTTCA TCCTCAGCTA TTGTTGCAGAATCATTAAGA CAGTCACTTC CTTCTCCCAC AAATACTGTA TTACTAGTGTGCTTGTAGTA GTTAACTCCA CCATCTTTGT AAGCTAATGA AATTGTGAGTCACCCATTTA TATCTTAATT TTTAATCATG TCAGTTCTTG AATGGGTATCTCCTTAGCCT GCTGATTTCT TTTTCTTTCT AAAGAAAGTG GGTGGAGAAATTAATTTAGA CGTTTGTTTG  CAATAAAAAG AATTC本发明的另一个特定实施方案提供了一个包括如下核苷酸序列(SEQID NO.2)的分离DNA分子：GAATTCTTTT TATTGCAAAC AAACGTCTAA ATTAATTTCT CCACCCACTTTCTTTAGAAA GAAAAAGAAA TCAGCAGGCT AAGGAGATAC CCATTCAAGAACTGACATGA TTAAAAATTA AGATATAAAT NGGTGACTCA CAATTTCATTAGCTTACAAA GATGGTGGAG TTAACTACTA CAAGCACACT AGTTATACAGTATTTTGTGG GAGAAGGGCA TACAGACATG GCTAACTTCA TATAGATCCCATTAGACAAC TGGATTTACA ACAAGTTTTT TTAATAAGAA ATGGGCAAAGCAGCTTTCTT TTCAGAATCA AAATGCAGAA CAAATGGAAA AATTATGGTATTAACCTTCA CAAGTTTGAG CCTCCACAAA TAATGCAACC AAGTTTTACATTTTTAACAG CCCTTCTACA TACACTCCAT CTTCTCTATC TTAGTTCCAAGTTTTAGTTT TCAATCCCAA TTATACCAAT TCCATTGTTA TTTTAAGAAAAAACCTTCCC AGTTATTGTC AGAAACTATG ATTTAGCTTA CCCCCTCCACTACNNAGCAA ACTACAGAGA GGATGGAGTG TAATATGAGC AGTACAGTATCTTAATGCAA TTCATGAGGA CCACTTAGTC CTTACATGAA TCTGGTTGCTAACATTTCTA TTATATTGTG ACAATGACTC CCGACTGTTA TTCTCTGTGAGAAATGGGGG GAGTAAATTC TTAATAAAAG ACACCAGGTA CAAAGCAACATTTTACTTCT GTTGTGATAA AAAAAAAAAA AGGTCACATT TTCAGATAAAATGTGGAACC CTGAAATCTG ACACATTCTC TTATCGTGCC ACCAATGCTGAGGTTCTCTT ACGATTCACT TTTAAACTGC AATTAAAAAT GTACAAAAAAGAAAAGAAAA AAANTCAACC CACAAAGCTT CTAAAAAAGG AACCCGCAGGCACTTCCTCT TGTGGAATGT TTAAAAAGTT AGCCTACTAA AGAAAACAGTCGACTTCTTG TGAAGGTTTT GGAGAAATAT GTATCAGTTC GTTTTATTTGGGTATTCAAT AATATCCTTG GTGATAATGC TGACTCCATG GCTTCTGACCCCAGAATTGA CCCTGCTGCC ACTGGTTGTA GCCCTGAGAT TGATTTTTGTAGCCACGATT GTTTCCTCGT CCTCTGAAGT TCTGGTTGTA GTTCCCTCTGTTGGGCATTC CACCTCTGTT GTAGTTCCCT CTGTTTGAGT AACTACCACGGCCAGGAAAA ACAGGGGCAC GAGGGTATGG ATAGCCGATT CCACCACTTCCTCCACCGCC ACCACCTCTC TGTGGCATGT TGCCCTCCTA TTATATCCGCCACGATTCCC AGGGGCTCCT CCTCTGAAAT TTCCACCACG CATATTGAATCCTCCACGTC TCTATGGCCA CCACCTCTGT TAAACTGGTT CTTGCCACTCTTATTTTTAT TGCTTTTCTT TGAGCCAGTG TTCTGTTTCT TTTCTGGTGGAAGAGCCTTT TTGCTTTCTT CCTTATATTG CTCCAAGAGT TTTTGGGCTTCTTCCTTCTG AAGGGCAACA TAGGTTATTT CATCAAAGCA CTCAGCTACCTCTGGGAGGG TAAAGTTTCC TTTCATTT

通过下面的详述，将对本发明的其它目的，特点和优越性作进一步说明。但是，应该理解到，这些详述和特定的实施例，尽管指明了本发明的优选实施方案，但仅仅是以说明的方式提出，因为对于本领域的技术人员，根据此详述，在本发明的精髓和范围之内，提出各种变化和修改的形式将是显而易见的。

                 附图简述

图1，小鼠SM1基因的DNA序列。

图2，SM1表面蛋白在BL3细胞上的免疫沉淀反应。35S-甲硫氨酸标记的细胞与SM1抗体的免疫沉淀反应表明，待测样品中，只有BL3细胞在细胞表面表达SM1蛋白。

图3，对来自接受100和1000个SM1⁺细胞的受体小鼠CFU-SDNA的DNA印迹试验分析。初步估计小鼠骨髓中SM1⁺细胞大约是10％。为了探索造血干细胞是否存在于SM1⁺细胞的亚群中，排除了对谱系特异性标志阳性的细胞，即CD4(T辅助细胞)，CD8(T杀伤细胞)，Gr-1(粒细胞)，TER119(红细胞样细胞)，Mac-1(巨噬细胞)和B220(前-B细胞)。可将这些Lin^-细胞(对谱系阴性的)进一步分为SM1⁺和SM1^-细胞。通过应用针对所有的谱系特异性标志的PE(聚赤藓素)标记的抗体和FITC-标记的SM1抗体，对小鼠骨髓细胞进行了FACS分析。图6显示了这种双显色的分析结果。

图4，对小鼠骨髓细胞的双显色-荧光激活细胞分选(FACS)分析。初步估计来自小鼠骨髓的SM1⁺细胞是大约10％。为了探索造血干细胞是否存在于SM1⁺细胞的亚群中，我们排除了具有谱系特异性标志阳性的细胞，即CD4(T辅助细胞)，CD8(T杀伤细胞)，Gr-1(粒细胞)，TER119(红细胞样细胞)，Mac-1(巨噬细胞)和B220(前-B细胞)。可将这些Lin^-细胞(对谱系阴性的)进一步分为SM1⁺和SM¹-细胞。通过应用针对所有的谱系特异性标志的PE(聚赤藓素)标记的抗体对小鼠骨髓细胞进行了FACS分析。

图5，人SM1基因的核苷酸序列

图6，对人脐带血细胞的FACS分析，以PE-标记的谱系特异性抗体和FITC-标记的抗-SM1抗体作双染色。

            优选实施方案详述

发现了一种蛋白质(SM1)，并且随后被纯化使之基本不含其它蛋白质。借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE测定时，它具有大约230 KDa分子量。SM1存在于人和小鼠的造血干细胞和原始前身细胞的表面，但是不存在于包括如下的其它种细胞表面：FDC-P1髓样前身细胞，EL4 T-细胞，WEHI-3骨髓单核细胞，和70Z/3前-B淋巴样细胞，或者不存在于人脐带血或小鼠骨髓的已分化的造血细胞表面。抗SM1抗体

在一个实施方案中，本发明涉及抗SM1抗体。除了将它们用于富集造血干细胞之外，这种抗体还可能在研究造血因子和开发抗体结合的治疗剂中，提供研究和诊断的工具。此外，含有抗SM1抗体的药剂组合物还可能提供有效的治疗作用。本发明的抗体包括多克隆抗体，单克隆抗体，以及多克隆和单克隆抗体的片段。

多克隆抗体的制备对于本领域的技术人员是熟知的，参见例如Green et al.，多克隆抗体的生产，在“免疫化学方案”中(Mansoned)P1-5(Humana Press 1992)；Coligan et al，用家兔，大鼠，小鼠和仓鼠生产多克隆抗血清，在“免疫学中的通用方案”中，第2.4.1部分(1992)，在此均被引入作为参考。

单克隆抗体的制备同样也是按常规法进行，参见例如Kohler &Milstein，自然256：495(1975)；Coligan et al，2.5.1-2.6.7部分；和Harlow et al，抗体：实验室手册，P726(Cold SpringHarboor Pub.1988)，在此均被引入作为参考。简单地说，可通过如下步骤获得单克隆抗体：以含有某一抗原的组合物注射小鼠，通过采取血清样品证实存在产生的抗体，取出脾脏，以便获得B淋巴细胞，使B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，克隆杂交瘤，挑选出能产生针对此抗原抗体的阳性克隆，以及从杂交瘤培养物中分离出抗体。可借助于多种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这类分离技术包括以蛋白-A琼脂糖的亲和层析，大小排阻层析和离子交换层析，参见例如Coligan et al 2.7.1-2.7.12部分和2.9.1-2.9.3部分；Barnes et al，免疫球蛋白(IgG)的纯化，在“分子生物学方法”中，Vol.10 P79-104(Humana Press 1992)。在体外和体内增殖单克隆抗体的方法，对于本领域的技术人员也是熟知的。

体外增殖可以在适当的培养基中进行，例如Dulbecco′s改进的Eagle培养基或RPMI 1640培养基，可任选地补充哺乳动物血清如胎牛血清，或微量成分和维持生长的添加物如正常小鼠的腹膜渗出细胞，脾细胞，骨髓巨噬细胞。体外生产可提供比较纯的抗体制剂，并可能按此例扩大，产生大量所需的抗体。杂交瘤的大规模培养可通过均相悬浮培养来实现，可在空气升液反应器内，在持续搅拌的反应器内，或者在固相化的，或被捕获的细胞培养物内进行。体内增殖可通过将细胞克隆注射进入与其亲代细胞组织相容的哺乳动物中来实现，例如注射给同源性小鼠，导致生长出产生抗体的肿瘤。任选地可在注射之前用碳氢化合物，特别是油是如降植烷(四甲基十五烯)“致敏”动物。注射后1-3周，可从动物的体液中回收所需的单克隆抗体。

对于本发明抗体的治疗应用是可想而知的。例如，本发明的抗体也可以是来自亚人类的灵长类动物抗体。例如，可在如下文献中找到用于从狒狒产生有治疗价值抗体的一般技术：Goldenberg et al，国际专利公开WO 91/11465(1991)，和Losman et al，国际癌症杂志46：310(1990)，特此将它们的有关内容引入作为参考。

按另一种方法，还可能从“人源化”的单克隆抗体得到有治疗价值的抗-SM1抗体。可通过下述步骤产生人源化的单克隆抗体：先将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的互补决定区转移进入人免疫球蛋白的可变区，然后取代鼠对应部分结构区中人的残基。使用来自人源化的单克隆抗体的抗体成分，可避免与鼠恒定区免疫原性有关的潜在性问题。例如，Orland et al.PNAS 86：3833(1989)描述了用于克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术，特此将此文献全部引入作为参考。例如在下列文献中描述了用于产生人源化单克隆抗体的技术：Joneset al，自然321：522(1986)；Riechmann et al，自然332：323(1988)；Verhoeyan et al，科学239：1534(1988)；Carter etal PNAS 89：4285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotecn.12：437(1992)；及Singer et al.免疫学杂志150：2844(1993)，特此将这些文献的有关内容引入作为参考。

本发明的抗体还可能来自从组合的免疫球蛋白文库中分离出的人抗体片段。参见例如，Barbas et al方法：酶学方法手册，Vol.2.p119(1991)；Winter et al，免疫学年评，12：433(1994)，均特此引入作为参考。用于产生人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体，可以从例如STRATAGENE克隆系统(La Jolla.CA)获得。

此外，本发明的抗体还可能从人单克隆抗体获得。这种抗体可从转基因小鼠得到，此小鼠已被“工程构建”，在对抗原刺激的反应中产生了特异性的人抗体。在此技术中，是将人重链和轻链基因座成分导入来自胚胎干细胞系的小鼠品系中，此干细胞系包含有内源性重链和轻链基因座的定向断裂片段。此转基因小鼠可以合成对人抗原特异性的人抗体，并且可以应用这种小鼠产生分泌人抗体的杂交瘤。如下文献中描述了从转基因小鼠获得人抗体的方法：Green et al，Nature Genet.7：13(1994)；Lonberg et al，自然368：956(1994)，和Toylor et al，国际免疫学6：579(1994)，特此均被引入作为参考。

本发明的抗体片段可以通过对该抗体的蛋白水解作用，或者通过在E.Coli中表达编码该片段的DNA来制备。借助于常规的方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体，可以获得抗体片段。例如，通过用胃蛋白酶酶促断开抗体可以产生抗体片段，提供以符号F(ab′)₂表示的5S片段。还可以应用硫醇还原剂并任选地应用巯基封闭基，导致二硫键断开而进一步切开此片段，产生3.5S Fab′单价片断。另一种方式是应用胃蛋白酶的酶促断开，直接产生二个单价的Fab′片段和一个Fc片段。在例如Goldenberg的美国专利No.4,036,945和No.4,331,647，以及其中包含的参考文献中，描述了这些方法。特此将这些专利全部引入作为参考。还可参阅Nisonhoff et al，生物化学和生物物理档案89：230(1960)；Porter，生物化学杂志73：119(1959)；Edelmanet al，酶学方法，Vol.1，p422(Academic Press 1967)；以及Coliganet al，第2.8.1-2.8.10节，和2.10.1-2.10.4节。

还可应用其它断开抗体的方法，例如分开重链形成单价的轻-重链片段，进一步断开这些片段，或者其它的酶促、化学或遗传技术，只要这些片段可同被该完整抗体所识别的抗原相结合。

例如，Fv片段包括V_H和V_L链的结合。如在Inbar et al，PNAS69：2659(1972)中所述，这种结合可能是非共价的结合。另外，可变链的连接还可以通过分子间的二硫键，或者借助于化学试剂如戊二醛交连。参见例如Sandhu，同上。优选地，此Fv片段含有通过肽键连接的V_H和V_L链。可通过构建一个结构基因来制备这种单链抗原结合蛋白(sFv)，此结构基因含有编码由寡核苷酸连接的V_H和V_L功能区的DNA序列。将此结构基因插入一个表达载体，随后将此载体导入宿主细胞如E.Coli。此重组的宿主细胞可合成具有连接二个V功能区的连接肽的多肽单链。例如在下面的文献中描述了产生sFvs的方法：Whitlow et al，方法：酶学方法手册，Vol 2，p97(1991)；Bird etal，科学242：423-426(1988)；Ladner et al，美国专利No.4,946,778；Pack et al，生物/技术学11：1271-77(1993)，和Sandhu，同上。

抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。可以通过构建编码所需抗体CDR的基因来获得CDR肽(“最小的识别单位”)。例如可应用聚合酶链反应，从抗体产生细胞的RNA合成此可变区来制备这种基因，参阅例如Larrick et al，方法：酶学方法手册Vol.2p 106(1991)。

通过建立抗SM1单克隆抗体实现了分离和鉴定SM1蛋白的目的。在Harlow & Lan，抗体：实验室手册(冷泉港实验室1988)中描述的一般程序可用于制备特异性单克隆抗体，特此被引入作为参考。对3只雄性Lew/hsd大鼠(Fox Chase癌症研究所动物中心，Philadelphia，PA)，通过皮下注射悬浮在与完全性福氐佐剂混合的0.5mlPBS中的5×10⁷ BL3细胞进行免疫。在注射之前采集免疫前的血清。三周之后以1×10⁸ BL3细胞的剂量作皮下注射加强免疫。随后每隔2周共进行了三次加强注射。在第二次和第三次加强注射之后采集免疫抗血清，并通过活细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫沉淀法进行检测。检测表明所有的血清对BL3细胞显示阳性，对EL4细胞(一个T细胞系)显示阴性。抗血清的滴度范围在1∶1000-1∶10000。

在进行融合前的三天，给一只阳性大鼠静脉内注射无佐剂的另外1亿个BL3细胞。在第三天，通过CO₂窒息法杀此大鼠，取出脾脏，在Dulbecco′s改进的Eagle培养基(DMEM)+2％胎牛血清(FCS)中制备单细胞悬液。以10∶1的比率混合脾细胞和yB 2/0骨髓细胞，在50％聚乙二醇(PEG)的存在下进行融合。通过在HAT选择性培养基中培养此混合细胞，而选择出杂交瘤细胞克隆。

大约二周之后，对此杂交瘤进行筛选，筛选出产生对BL3细胞特异性抗体的杂交瘤。应用间接免疫荧光标记法，通过本领域熟知的标准程序进行筛选。将1百万个洗过的BL3细胞或其它对照细胞如EL4，FDC-P1和WEH-3细胞，与80μl杂交瘤上清液在4℃共孵育30分钟，洗2次之后在同样条件下以FITC结合的羊抗-大鼠IgG+M第二抗体作进一步标记。洗过之后，通过光学显微镜检查对每个细胞克隆进行筛选。以抗血清作阳性对照，以免疫前的血清或某些杂交瘤上清液作阴性对照。来自170个杂交瘤中的3个细胞显示出对BL3细胞具有特异性。这3个细胞中，一个可识别被命为SM1的分子。借助于标准的免疫扩散试验，显示此SM1单克隆抗体是免疫球蛋白IgM的同种异型。SM1 DNA的分离

可通过首先构建Lambda gtll cDNA噬菌体表达文库来实现对SM1 cDNA的分离。构建此cDNA文库的步骤如下。为了分离聚腺苷酸RNA，可应用苯酚/氮仿/胍基硫氰酸盐法提取总RNA，Sambrook etal，分子克隆，第二版(冷泉港实验室出版1989)。在10ml 4M GTC溶液(25mM柠檬酸钠，85mM月桂基肌氨酸钠，4M胍基硫氰酸盐和0.1M 2-巯基乙醇)中使细胞(5×10⁸-10×10⁸)裂解。使之通过20号针头而对DNA进行剪切。通过加入10ml 4M GTC溶液而使体积增加至20ml。加入2ml 4M NaAc(pH4.0)，充分混合均匀，然后加入等体积DEPC-H₂O饱和的苯酚。彻底混匀此混合物之后，加入最后体积为10％的氯仿，再次强力混匀。将此混合物在冰浴上放置15分钟，然后以2500g离心20分钟(在Sorvall RC-5B离心机中，用Sorvall SA600转子，转速5000rpm)。将含有RNA的上层水相转移至另一干净的试管中。使用等体积异丙醇，在-20℃下沉淀RNA 1小时。以2500g离心20分钟后得到RNA沉淀物，将它溶解于0.4ml 4M GTC溶液中。用10μl 1M HAc和300μl乙醇再次沉淀此RNA。将最后得到的RNA沉淀物溶解于0.5ml 1mM EDTA/0.05％SDS中，贮存于-70℃。为选择聚腺苷酸RNA，使之二次通过从Collaborative Research得到的寡脱氧胸苷酸-纤维素柱，Maniatiset al，分子克隆-实验室手册(冷泉港实验室，1982)。1×结合缓冲液是由20mM磷酸钠和0.5M NaCl组成。被选出的聚腺苷酸RNA的含量大约是所使用总RNA的5％，O.D₂₆₀/O.D₂₈₀的比率为2.0。将此聚腺苷酸RNA小份分装，同1/10体积的3M NaAc和3倍体积的乙醇混合，贮存在-70℃。

为了启动第一条cDNA链的合成，可按照BRL的说明书，以寡脱氧胸苷酸(dT)和随机六聚体作引物，借助于逆转录酶Superscript II(GibcobPL)，将20μg BL3或HL60(用于构建人cDNA文库的)聚腺苷酸RNA逆转录成为cDNA。大约有30％聚腺苷酸RNA被转变成为cDNA。使所合成的cDNA：RNA杂合体通过琼脂糖CL-4B柱(Pharmacia)进行大小-分级分离，以便除去小片段cDNA。

将3μg第一条cDNA：RNA杂合体链用于合成第二条cDNA链，通过使用RNA酶H，DNA聚合酶I，E.Coli DNA连接酶，以及T4DNA聚合酶(BMB)，以DNA链取代了RNA链。借助于EcoRI甲基化酶(Promega)将双链DNA中的EcoRI识别位点甲基化，以便防止在后面的步骤中发生被EcoRI消化，将3个不同的EcoRI接头(8聚体，10聚体和12聚体)，按接头：cDNA为100∶1克分子的比率与双链cDNA连接，以便产生3个不同的读框，用于翻译文库中的任何一种cDNA。连接之后，进行EcoRI消化，以便在每个cDNA分子中产生EcoRI粘性末端。使之通过琼脂糖CL-4B柱进行大小-分级分离，除去剩余的EcoRI接头。

下一步是，为了与噬菌体载体连接，并包装进入噬菌体颗粒，应用噬菌体包装提取物(Stratagene)，按照厂商的说明书，使具有EcoRI位点的双链cDNA与λgtll/EcoRI载体(Stratagene)相连接，并被包装进入噬菌体颗粒。可通过滴定此包装混合物来确定cDNA文库的大小，即以稀释的包装混合物感染细菌y 1088。将总共2μgλgtll/EcoRI载体和0.45μg双链cDNA用于连接。对于HL60样品，使用了5个包装提取物。λgtll-HL60 cDNA文库的大小是1.35×10⁶噬斑单位(pfu)。为了构建BL3文库，使用了四个包装提取物。λgtll-BL3 cDNA文库的大小是1.5×10⁷ pfu。通过感染细菌y1088将这些文库扩增了-次。为了确定文库中cDNA的平均大小，随机挑取了18个噬菌体克隆进行分析。提取出噬菌体DNA，并用EcoRI消化，以便释放cDNA插入片段。通过以来自所有18个噬菌体DNA样品的EcoRI片段的总大小除以18，得到了cDNA的平均大小为1.4kb。

为了筛选此噬菌体cDNA文库，通过将系列稀释的抗体上清液，以及YB 2/0骨髓瘤细胞系的上清液(阴性对照)，与BL3细胞的裂解物共同温育，同时以E.Coli裂解物作对照，对将要用于基因筛选的第一抗体SM1单克隆抗体(MAb)的适当用量进行了预先测定。借助于本领域熟知的免疫扩散法，已表明SM1单克隆抗体是IgM形式。同样地，对碱性磷酸酶标记的第二抗体的最佳用量也进行了预测定。对于来自Sigma的碱性磷酸酶标记的抗-大鼠轻链(k和λ)单克隆抗体，和来自Rockland的碱性磷酸酶标记的抗-大鼠IgM(μ-链特异性的)抗体，测定了它们与SM1 MAb的特异性相互作用。将大鼠IgM(来自Rockland)和E.Coli噬菌体裂解物(来自Stratagene)用作阴性对照。以封闭液对每种蛋白质作5倍系列稀释，从起始浓度10μg/ml稀释至2μg/ml，再稀释至，0.4μg/ml，最后稀释至0.08μg/ml。以每种溶液1μl在尼龙膜上点样。作四片相同的膜，将它们的每一片用于以不同稀释度的不同抗体点样。将这些膜片在封闭液中，在室温下振荡1小时。在不同的第二抗体溶液中，即1∶2000和1∶10000稀释的抗(k和λ)及抗μ抗体中温育每个膜片。与用相同稀释度(1∶10000)的抗k和λ轻链单克隆抗体相比较，抗IgM μ链特异性抗体对12A6 IgM抗体具有更高的特异性，更强的信号和较低的背景干扰。因此，将1∶10000稀释度的抗-IgMμ链特异性抗体用于抗体筛选试验。

然后以抗-SM1抗体，按照厂商的说明书(Stratagene，La Jolla，CA)在最佳条件下对cDNA文库进行了筛选。取一接种环生长在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板中的Y1090R菌，接种于以0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄补充的15ml LB中。将此培养物在37℃振荡培养直至O.D₆₀₀达到0.5-1.0。使细胞沉淀后，再悬浮于10mM MgSO₄中使成0.5 O.D₆₀₀/ml。取0.6ml细菌，与含有50000pfu的λgtll-BL3文库噬菌体贮备液混合，在37℃温育15分钟。对此混合物加入8ml顶层琼脂(在NZCYM中的0.7％琼脂糖)，在150mm NZCYM板上铺平板。制备20块这种平板，在42℃温育3.5-4小时，直到形成清晰的噬菌斑。将以10mM IPTG预处理过的干尼龙膜(来自MSI)复盖于此平板上，并在37℃温育此平板3.5小时，以及使此噬斑转移至膜上。从平板上揭下此膜，在TBST(20mM Tris.Cl pH7.5/150mMNaCl/0.05％ Tween 20)中漂洗膜4次，每次15分钟。在封闭液(溶于TBS(20mM Tris.Cl pH7.5/150mM NaCl)中的1％ BSA)中将它们进一步封闭至少1小时，以便消除非特异性信号。此后，将10倍稀释的SM1单克隆抗体培养物上清液加到封闭液中，每片膜8ml，在室温下振荡培育3小时。下一步是在TBST中漂洗此膜5次，每次5分钟，并在含有以碱性磷酸酶标记的第二抗体(Rockland，抗-大鼠IgM(μ)-AP，1∶10000稀释)的新鲜封闭液中，室温下缓慢振荡温育3小时。最后，在TBST中漂洗此膜片，在显色液(以0.1M Tris.ClpH9.5/50mM MgCl₂/0.1M NaCl1：50稀释的NBT/BCIP贮备液，来自BMB)中，黑暗环境下温育5-10分钟，并记录实验结果。

从被筛选的大约1千万个噬斑中，鉴别出了10个强阳性克隆。作基因排列图和杂交研究显示，其中6个克隆是相同的，二个不含有插入的DNA，另外2个没有充分地分析。对6个强阳性克隆中2个的DNA进行了测序。

对表达SM1的阳性克隆的序列分析揭示了部分核苷酸序列，显示在图1中。应用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST网络服务，在基因库中搜索，以及从非冗余的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的数据库中搜索，表明在SM1 DNA序列与任何其它长度小于100碱基对的序列之间，没有任何同源性。在转变成为氨基酸序列之后，一个读框翻译成与如下其它已知的蛋白质具有小于30％序列同源性的蛋白质：酵母葡糖淀粉酶前体(检索号#p08640)，糖蛋白X前体(检索号#p28968)，酵母α-凝集素吸附亚单前体(检索号#p32323)，孢子外壳蛋白sp96(检索号#1103869)，牛疱疹病毒gp80(检索号#z84818，e300478)，皮肤粘蛋白C.1(Q05049)，或微丝蚴鞘蛋白(检索号#1163086，U43510)。SM1基因的表达

在RNA水平和蛋白质水平检测了小鼠SM1基因的表达。应用购自Clontech(Palo Alto，CA)的RNA印迹试验滤器，对来自小鼠多种器官的样品进行了RNA印迹分析。用SM1的1.5kb EcoRI片段或γ-肌动蛋白DNA作探针。按照厂商的建议所确定的标准程序进行杂交和随后的漂洗。对X-射线胶片曝光3天之后，在大多数组织观察到与此SM1探针杂交的7.5kb特异性片段。在以γ-肌动蛋白探针的感光带校正之后，可见睾丸中感光带的密度最高，在脾和肺中密度最低。因此，似乎普遍存在SM1基因在RNA水平的表达。对于从包括BL3，EL4，WEHI-3和70 Z/3的不同细胞系提取的RNA，得到了类似的结果，显示存在相同的7.5kb SM1 RNA感光带(未公布的资料)。

借助于免疫沉淀法，按照如下的程序对SM1蛋白的特征进行了鉴定。获得2千万个BL3细胞，用P2缓冲液(PBS加2％ FCS)洗2次。用0.5ml P2缓冲液再悬浮此细胞沉淀，同10μg IgG在4℃共培育2小时。用P2洗细胞2次，并用与所述用于蛋白质印迹试验相同的裂解缓冲液使细胞溶胞。将细胞裂解物在冰浴上放置30分钟，离心，将上清液转移至装有40μl蛋白A-琼脂糖悬液(50％体积膨胀的琼脂糖，BMB)的试管内。在4℃，将它们再培育2小时。收集抗原-抗体-蛋白A-琼脂糖复合物，用裂解缓冲液洗3次。用40μl 2X样品缓冲液再悬浮此沉淀物，煮沸3分钟，在室温下离心2分钟。收集上清液，借助于7％ SDS-PAGE进行分离。

35S-甲硫氨酸标记的细胞与SM1抗体的免疫沉淀反应表明，只有BL3细胞在细胞表面表达SM1蛋白，而表达SM1 RNA的其它细胞系不表达SM1蛋白。见图2。

如上面所指出的，本发明一方面是关于基本上不含有其它蛋白质的SM1蛋白，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE测定时它具有大约230KDa的分子量，并且SM1蛋白存在于人和小鼠的造血干细胞及原始前身细胞的表面，但是不存在于包括FDC-P1髓样前身细胞，EL4 T-细胞，WEHI-3骨髓单核细胞，以及70 Z/3前-B淋巴细胞的其它细胞表面，或者也不存在于人脐带血或小鼠骨髓中已分化的造血细胞表面。本发明还包括SM1的肽片段。在对造血干细胞发育的研究中，这些肽片段可能提供研究和诊断的工具。此外，含有分离和纯化的SM1肽片段的药剂组合物，还可能对多种疾病如获得性免疫缺损综合症(艾滋病)提供有效的治疗作用。

应用SM1 DNA序列在基因库中的搜索表明，它与编码一种受体分子的序列具有微弱的序列同源性。最近，有人将人免疫缺损病毒(HIV)的感染过程与趋化因子/细胞因子的受体分子相关连，并认为HIV病毒的进入需要不只1个受体分子。Cocchi et al，科学270：1811(1995)：Paxton et al，Nature Med.2：412(1996)；Dragic et al，自然381：661(1996)；Simmons et al，科学276：276(1997)。由于细胞因子或趋化因子与它们的对应受体相结合，可达到阻止病毒进入目的。SM1也可能是一种新型受体，以致使通过与其配体的结合可能阻止HIV病毒的进入，因此，使靶细胞对HIV感染具有抗性。

本发明不仅涉及天然存在的SM1片段，而且还涉及SM1突变体和SM1的化学合成衍生物。例如，本发明考虑到SM1的氨基酸序列发生改变的情况。可通过改变编码SM1蛋白质的DNA来修改SM1。优选地，应用具有相同或类似特点的氨基酸，只尝试改变保守的氨基酸。例证性的氨基酸取代包括：丙氨酸变成丝氨酸，精氨酸变成赖氨酸，天冬酰胺变成谷氨酰胺或组氨酸，天冬氨酸变成谷氨酸，半胱氨酸变成丝氨酸，谷氨酰胺变成天冬酰胺，谷氨酸变成天冬氨酸，甘氨酸变成脯氨酸，组氨酸变成天冬酰胺或谷氨酰胺，异亮氨酸变成亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸变成缬氨酸或异亮氨酸，赖氨酸变成精氨酸，谷氨酰胺或谷氨酸，甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨酸，苯丙氨酸变成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸，丝氨酸变成苏氨酸，苏氨酸变成丝氨酸，色氨酸变成酪氨酸，酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸，缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸。

此外，其它的SM1变异体和片段也可以用于本发明。变异体包括SM 1的相似物，同源物，衍生物，突变蛋白和拟态物。SM1的片段指的是SM1的部分氨基酸序列。可通过化学修饰，蛋白水解酶消化，或者它们的组合处理，从SM1本身直接产生这种变异体和片段。此外还可以应用遗传工程技术，以及从氨基酸残基直接合成多肽的方法。

通过在Saragovi et al，科学253：792-95(1991)中所概述的方法，可以产生模拟SM1的结合和功能的非肽化合物(“拟态物”)。拟态物是可模拟蛋白质二级结构要素的分子，参阅例如Johnsonet al“肽与拟态物”(“Peptide Turn Mimetics”)，在“生物技术学和药学”中，Pezzuto et al，Eds(Chapman and Hall，NewYork 1993)。使用肽拟态物的基本理由是，蛋白质肽骨干的存在主要是为了以这样一种方式定向氨基酸侧链，以便于分子的相互作用。对于本发明的目的，可以把适当的拟态物认为是SM1本身的等价物。

还可以应用基因组或cDNA克隆法，通过重组技术产生变异体和片段。可应用位点特异性诱变和区域定向诱变技术。参阅现代分子生物学方案第一卷，第8章(Ausubel et al，eds.，J.Wiley & Sons 1989& Supp.1990-93)；“蛋白质工程”(Oxender & Fox eds.，A.Liss，Inc.1987)。此外，还可以将接头分区技术和PCR-介导技术用于诱变，参阅“PCR技术”(Erlich ed.，Stockton Press 1989)；“现代分子生物学方案”Vol1和2，同上。在“蛋白质工程”(同上)和“现代分子生物学方案”第一和第二卷(同上)中，公开了应用上述任何一种技术的蛋白质测序，构建和仿造手段。应用抗-SM1抗体富集造血干细胞

CFU-S-形成细胞是多能性造血前身细胞能够短期重建受致死性辐射的小鼠。如在Wong et al，(1994)，(同上)中所述，应用供体成熟的骨髓细胞进行CFU-S-脾-病灶试验(spleen-focusassays)。供体小鼠是近交的雄性C57BL/6J小鼠(Jackson实验室，Bar Harbor，ME)，受体小鼠是同品系的雌性小鼠。为了制备标记的骨髓细胞，用颈脱臼法处死雄性小鼠，按照我们以前所述的方法(Wonget al，(1994)同上)制备骨髓细胞。通过以5∶3的体积比率(细胞：LSM)，将全骨髓(BM)细胞群覆盖在淋巴细胞分离培养基(LSM)上，在25℃以1600rpm的速度离心20分钟，分离出单核细胞(MNC)。用P5(以5％ FCS和0.02％叠氨钠补充的磷酸缓冲盐水(PBS))洗2次之后，将此细胞与FITC-标记的抗体(Ab)，按照每毫升10×10⁶个细胞/10μg Ab的浓度混合，并在冰浴上培育30分钟。将Ab-标记的细胞洗3次，按5×10⁶个细胞/ml的浓度再悬浮于P5中，用于FACS分析和细胞分选。最初的分析提示，应用间接免疫荧光试验可能有1-5％骨髓细胞与SM1杂交瘤细胞上清液为染色阳性，因为在骨髓中仅含有少量原始干细胞或前身细胞，所以只分选了用SM1清晰染色的0.1％BM细胞。将这些分选的雄性小鼠细胞用作供体细胞的来源。

对于受体雌性小鼠，在输入SM1分选的细胞之前，对每只小鼠以9.5Gy的剂量照射。用铯源Mark 1(30-1型)辐射源(JL Shepherd& Associates，San Fernando，CA)实验照射。随后将不同数量分选的SM1细胞悬浮于0.5ml R2培养基中，静脉内输入受照射的受体雌性小鼠，12天之后，从接受供体小鼠100-1000个SM1分选细胞的，雄性小鼠对照未分选骨髓细胞的，或者雌性辅助细胞的受体小鼠，分别解剖取出CFU-S脾病灶。然后从其中的每个病灶中提取出DNA。

为了提取DNA，将每个解剖出的CFU-S病灶置于含有0.5mlPBS的Eppendorf小试管内，通过反复吸吹制备成单细胞悬液。用PBS洗细胞一次，并在DNA提取缓冲液中使细胞溶胞。随后用100μg/mlRNA酶在37℃处理1小时，并在56℃用100μg/ml蛋白酶K处理3小时。然后用苯酚/氯仿提取DNA2次，并用2M乙酸铵和2X体积无水乙醇使之沉淀。此后再将DNA溶解于0.4ml TE缓冲液中，并测定DNA的浓度。为了检测此病灶是否起源于供体小鼠SM1⁺细胞，使用了pY2探针。此探针显示出对雄性细胞中Y染色体具有相对特异性，Lamer& Palmer细胞37：171(1984)。因为此探针对于雄性染色体的特异性不是绝对的，所以应作二步分析：首先对全部样品进行斑点印迹分析，随之对斑点印迹试验的阳性样品进行DNA印迹分析。

为了作斑点印迹分析，将每个样品的5μg DNA与0.1体积的3MNaOH混合在65℃温育30分钟，以便使DNA变性，并破坏RNA。然后用0.1体积pH7.0的2M乙酸铵使之中和，并在NYTRAN尼龙滤膜上点样。将4/5的样品用于与pY2探针杂交，1/5的样品与GAPDH探针杂交。然后，应用pY2 DNA片段作探针，将阳性样品用于DNA印迹分析，以便证实存在Y-特异性带。为了进行DNA印迹分析，一般是将10μg DNA用BamHI限制性酶消化，消化的DNA经处理后，转移至尼龙滤膜并与随机引物标记的pY2探针杂交。

来自100 SM1⁺细胞受体小鼠的某些CFU-S病灶的DNA，显示出与pY2雄性特异性探针杂交阳性(图3)。那些杂交阴性的DNA推测是来源于内源性短期CFU-S形成细胞。这些CFU-S病灶的每一个都显示出含有已分化的红细胞样细胞和髓样细胞。为了从斑点印迹分析或DNA印迹分析得到阳性信号，大约需要150万个细胞，产生15μg雄性-特异性DNA。因此，这些结果表明，某些供体的SM1⁺细胞是多潜能性短期造血干细胞。

估计小鼠骨髓中SM1^-细胞大约是1-5％。为了探索造血干细胞是否存在于SM1⁺细胞的亚群中，排除了具有谱系特异性标志阳性的细胞，即CD4细胞(T辅助细胞)，CD8细胞(T杀伤细胞)，Gr-1细胞(粒细胞)，TER119细胞(红细胞样细胞)，Mac-1细胞(巨噬细胞)和B220细胞(前B细胞)，可将这些Lin^-细胞(对谱系阴性的)进一步分为SM1⁺细胞和SM1^-细胞。通过应用针对所有的谱系特异性标志的PE(聚赤藓素)标记抗体和FITC-标记的SM1抗体，对小鼠骨髓细胞进行了FACS分析。图4显示了这种双显色的分析结果。

为了检测原始干细胞/前身细胞的存在，将SM1⁺/Lin^-分选的细胞，在本领域技术人员熟悉的半固体甲基纤维素基因克隆培养基上作平板接种。Han et al，PNAS，92：11014(1995)中详细地描述了此测定法，特此引入作为参考。是通过分选出SM1⁺/Lin^-细胞来进行这次实验，此细胞由0.06％小鼠单核细胞群组成(0.3％×0.2％[面积A的百分数]＝0.06％)。在美洲商陆-分裂素刺激的脾细胞条件化培养基(SCM)，或者BL3条件化培养基(BLCM)存在的条件下，在每个平皿上平板接种了大约1000个细胞。7-12天之后，记录造血细胞集落的数目和类型。

在没有条件化培养基作为生长因子的来源时，不能看到有集落。在SCM存在的条件下，由不同类型晚期分化细胞组成的多谱系混合型集落，以显著的频率存在(表1)。比此多谱系集落更早的是未成熟细胞集落，这种集落在开始培养后12天较为明显。未成熟细胞集落中的细胞已显示出具有CFU-S形成的能力，因此，其中的一些细胞至少是处于CFU-S形成细胞，即短期造血干细胞的阶段。值得注意的是，存在新型的紧密集落。这些集落是未分化细胞的紧密凝集，只是当培养物中在存SCM或BL3CM时才能发现。以前就发现了BL3CM含有独特的干细胞活性，但是缺乏许多已知的造血生长因子，Wong et al(1994)同上。也已发现BL3的这种干细胞活性存在于SCM中。因此，紧密集落中的细胞甚至可能比存在于未成熟细胞集落中的细胞更早。

培养12天之后，在仅有BL3CM存在的实验条件下，已不再观察到紧密的集落(表1)。在培养7天之后，发现这些集落正在瓦解。这也与此活性是干细胞特异性的，并且它只刺激干细胞自我更新的观察是一致的，但是，为了集落能进一步发育，并扩大体积，则需要例如SCM中的辅助生长因子。表1.骨髓来源的SM1⁺/Lin^-细胞的集落形成能力。

每个平皿上每1000个细胞集落的数目和类型

                   第7天                                 第12天

     紧密型    分散型   混合型   未成熟型   紧密型   混合型   未成熟型   CFU-C1 无GF      0         0        0         0         0        0        0         02 SCM    6，5，11  7，6，6  0，1，0             5，3，4   4，5，4  3，2，3  4，4，53 BL3CM  5，8，4      0        0         0         0        0        0         0

在开始培养之后的第7天和第12天，记录集落的数目和类型。每个试验点平行制备三个平皿。在所有的平皿中都未观察到集落的试验点以一个数字“0”表示。除了新型的紧密集落之外，其余的集落类型按照Han et al(1995)，(同上)中报导的确定。紧密型集落是未分化的细胞显示紧密凝集的集落，估计其平均大小为50-200个细胞。对人SM1 DNA的特征鉴定：

为了分离出SM1基因的人对应物，用HL60细胞系的mRNA构建了λgtll cDNA文库，此HL60细胞系是人骨髓单核细胞白血病细胞系，它表达对小鼠SM1 DNA特异性的三种mRNA。如已描述的，HL60cDNA文库的构建法类似于构建BL3λgtll cDNA文库的方法。将1.5kb的EcoRI小鼠SM1片段用于筛选HL60 cDNA文库。获得了几个阳性克隆。对二个克隆的DNA进行了测序，并且，如在图5中所显示的，它发现带有此序列的一个区域是二种DNA样品共有的。在基因库的EST文库中的搜索表明，此序列与人cDNA(例如检索号H98251)是同源的；甚至对此cDNA的已知功能尚无报导。人SM1基因的表达

为了检测人SM1基因是否被表达，对来自不同人器官(Clontech，La Jolla)和人细胞系的RNA样品进行了RNA印迹试验分析。虽然在BL3 RNA中只存在单一的7.5kd预期带，但是，在HL60骨髓单核细胞系的RNA中存在三个带(9.0kb，7.5kb和4.0kb)，而在K562细胞的RNA中仅存在4.0kb带。在对来自人器官RNA的RNA印迹试验分析时，在绝大多数样品都观察到所有的三个带，4.0kb带最显著，在睾丸和卵巢中9.7kb带和7.5kb带最丰富，特别是在以γ-肌动蛋白对信号强度进行校正之后。

人细胞中有三种mRNA与小鼠SM1探针显示杂交阳性。在这三种mRNA中，可能只有一种对人SM1蛋白质的细胞表面表达负责。考虑到这几种mRNA中都具有共同的RNA序列的事实，说明这三种mRNA可能是通过有差异的剪接方式相关联。按另一种方式，这三种mRNA可能代表作为单基因家族成员的三种不同基因的产物。

对于人细胞中存在三种mRNA的生物学意义尚不了解，是否它们是三种不同但相关的SM1基因的产物，或者是有差异剪接的结果也不清楚。值得注意的是，CD34基因转录产生二种mRNA，并且这是由于有差异剪接的结果，Sude et al，血液79：2288(1992)；Nakamura et al实验血液学21：236(1993)。从造血干细胞富集的角度，有可能不是所有几种SM1 RNA都将导致产生SM1蛋白质。因此，重要的是指出，在睾丸和卵巢中9kb带和7.5kb带是丰富的，类似于在小鼠睾丸中SM 17.5kb RNA的情况。此结果也与在CD34中，全长度而不是截短的CD34可抑制造血细胞分化的发现相一致，Fackler et al，血液，85：3040(1995)。

对不同的人细胞系的分析表明，表达全部三种SM1 mRNA的HL60细胞，在它们的细胞表面也表达SM1；而仅表达4kb种类RNA的K562细胞，在它们的表面不表达SM1蛋白。在另一个细胞系J45也微弱地检测出SM1蛋白。

将不同细胞系的裂解物与SM1抗体进行免疫沉淀反应，并借助于SDS-PAGE对免疫沉淀物进行分辨。用BL3细胞裂解物作阳性对照。用35S-甲硫氨酸(0.25mCi)对每个样品的5百万个细胞标记1小时，然后在4℃与20μg SM1抗体免疫沉淀反应2小时。用PBS洗细胞之后，在0.5ml IP缓冲液(130mM NaCl，10mM Tris.Cl pH7.5，5mM EDTA，1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)中溶胞。通过离心使裂解物澄清。然后对每个样品加入4μg羊抗大鼠IgM抗体，并将此样品在4℃温育过夜。用蛋白G-琼脂糖将蛋白质-抗体复合物拉出后，将样品煮沸，并在5％ SDS-PAGE上进行分辨。然后用25％异丙醇和10％乙酸固定此凝胶30分钟，并用增强液(Enlightaning，DuPont)再处理30分钟。此后，使凝胶干燥，并对X-射线胶片曝光。应用SM 1抗体富集人造血干细胞

SM1单克隆抗体也可以识别人造血细胞(图6)。因此可进行荧光激活细胞分类(FACS)分析，以便测定在其细胞表面表达SM1分子的细胞比例。为此，首先对来自人脐带血的1百万个单核细胞以一种抗体混合物染色，此抗体混合物包含大鼠抗-CD38，大鼠-抗-血型糖蛋白A和/或抗-CD33和抗-HLA-DR以及PE标记的抗-大鼠抗体。这些抗体可检测谱系特异性抗原，具有这些抗原的细胞被称为Lin⁺细胞。洗2次之后，将这些细胞与100μl抗-SM1杂交瘤上清液在冰浴上共孵育30分钟。然后再洗这些细胞，并进一步用FITC标记的抗-大鼠IgM第二抗体染色。基于右角和前向散射，对淋巴样细胞群启动FACS分析，然后根据荧光强度进行分析。在左面的A区显示出淋巴细胞和小细胞的分布，在此细胞群中已知存在造血干细胞。如图6右面所示，对A区再分析和再绘图表明，SM1⁺ Lin^-细胞构成整个脐带血单核细胞样品的大约0.3％(在区域4中显示为0.4％)。单独应用SM1抗体时，发现1％人脐带血单核细胞携带SM1抗原。已经发现在人脐带血中造血干细胞以非常高的频率存在，Xiao et al，血液20：455(1994)。相比之下，也被Haylock et al，血液80：1405(1992)用于造血干细胞富集的CD34抗原，已显示存在于大约2％脐带血细胞上，Broxmeyer et al，PNAS 86：3828(1989)，存在于大约2％骨髓细胞和0.2％外周血细胞上，Bender et al，血液77：2591-2596(1991)。

为了检测造血干细胞活性的一个方面，借助于基因克隆试验，对构成总脐带血单核细胞群0.3％的SM1⁺/Lin^-富集的脐带血细胞进行了检测。将1千个分选的细胞在甲基纤维素培养基中作平板接种，在存在或不存在条件培养基的情况下培养，此条件培养基(CM)是来自由患有膀胱癌病人产生的5367细胞，已知含有多种能够刺激原始造血干细胞和前身细胞生长的生长因子，Broxmeyer et al，同上。在10％5367CM存在下培育10天之后，可观察到含有分散细胞的未成熟细胞的集落(表2)。不存在5376CM时，未发现有集落。这些资料表明，SM1⁺/Lin^-富集的细胞群中含有原始的造血干细胞和前身细胞。

表2.由人脐带血SM1⁺/Lin^-细胞形成未成熟细胞集落

                 每个平皿中每1000个细胞

                 形成的未成熟细胞集落数目1.不存在5367CM                   02.存在5367CM                     3，2，3

在本发明的一个实施方案中，将抗-SM1抗体用于制备一种富含造血干细胞的组合物。通过提供结合SM1的抗体可达到此目的；将抗-SM1抗体固定化在一种支持载体上，使些抗体保留了它结合SM1的能力，然后使一个混合细胞群与此抗体接触，当此混合细胞群都含有造血干细胞时，致使干细胞会粘附于支持载体，除去未粘附的细胞，以致使富含造血干细胞的细胞群仍然粘附在支持载体上。“支持载体”意指任何一种固体支持物，如小珠，空心纤维膜，树脂，塑料Petri氏平皿，或者是一种针对抗-SM1抗体的抗体。

可使此抗体与标记物结合，使之容易分离出这种特殊的细胞类型，例如可同磁性微珠结合，使之可能直接分离，与生物素结合，用结合于载体的亲和素或链霉亲和素可以将它分离出，与荧光染料结合，可用于荧光激活细胞分选法，或者其它的标记物。任何不会过分地损害所保留细胞生命力的技术都可以应用。

通常是在对人移植时，用抗-CD34抗体和生物素化的第二抗体，使之通过亲合素柱，以便除去乳腺癌细胞，Bensinger et al，J.Clin.Aphersis 5：74-76(1990)；Berenson et al，Blood 76：509-515(1986)。优选的分离方法包括柱层析法，荧光激活细胞分选法，磁性微珠分离法，以及直接免疫吸附法。

在另一个实施方案中，本发明涉及一个试剂盒，用于检测结合于SM1的造血因子。“造血因子”意指与血细胞生成有关的任何一种蛋白质。此试剂盒包括本发明的抗体，还可以包括一种可检测的标记物，以及一套使用此试剂盒的文字说明。这种试盒还可能包括一个被分隔成小室的小盒，以便装入一个或几个容器如小药瓶，小试管等，这些容器内装有本发明的不同成分。

在再一个实施方案中，是将SM1用于一个检测方法，检测样品中能结合SM1的造血因子。这种方法可用于检测和评价与造血细胞的再生，分化和成熟有关的因子。可将SM1，以及SM1⁺细胞用于测定培养基如条件培养基活性的试验法，并可用于评价液体对细胞生长的活性，包括对特定谱系细胞的贡献等。在体外这种试验法包括，使怀疑含有结合SM1的造血因子的样品与可检测标记的SM1相接触。然后检测造血因子。“样品”意指任何细胞培养物的培养基，或者任何体液或组织，包括血，尿，唾液，脊髓液，精液，膜液，以及来自身体任何部分的组织。这种试验法可能包括将SM1结合于固体表面。本领域已知有许多方法可用于将生物分子固定化在固体表面。例如，固体表面可能是一种膜(如硝酸纤维素膜)，微量滴定板，或小珠。结合的分子可能通过非特异性结合，共价或非共价地附着。对于将广泛不同的化合物连接于各种表面的方法已充分了解，在文献中也有充分的报导。参阅例如，Chibata，免疫酶，Halsted Press(1978)，和Cuatvecasos，生物化学杂志245：3059(1970)，特此将它们的有关内容引入作为参考。

在本发明的测定法中，为了检测结合SM1的造血因子，可通过本领域熟知的方法标记SM1。通用的方法包括使用放射性同位素如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C或³²P。检测可通过放射自显影法实现。非放射性标记包括将生物素共价结合于本发明的化合物。然后使生物素与一种抗-配体如链霉亲和素结合，这种抗-配体或者具有内在性标记，或者结合于一个信号系统，如可检测的酶，荧光化合物或化学发光化合物。

在另外的一个实施方案中，可将SM1⁺细胞应用于促进更好地描述参与SM1自我-更新和从其中衍生的细胞群分化的调节的分子机制和细胞相互作用的特征。例如，这种机制可能包括，与SM1介导的信号-转导相关的，或干扰这种信号转导的，造血的或非造血的任何一种分子或因子。

还可以将按照本发明纯化的造血细胞用于基因治疗法中。这种方法可能包含几种基因构建物，包括通过病毒(例如反转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，E-B病毒，肝炎病毒，慢病毒)介导的方法，以及非病毒介导的方法，例如将基因转移进入纯细胞。反转录病毒介导的基因转移法是本领域熟悉的，Bodine et al，PNAS 86：8897-8901(1989)，但是迄今为止，尚不可能应用这种具有SM1的同源细胞群作为转染的细胞。然后可以将这种转染的细胞用于治疗应用。

遗传性疾病的治疗可通过对SM1细胞进行遗传修饰，以便矫正其遗传缺损。例如，几种疾病如B-地中海贫血症，镰状细胞贫血症，腺苷脱氨酶缺乏症等，可能通过将野生型基因导入SM1细胞而给予矫正。基因治疗的其它方式包括导入病毒或细菌抗性基因，反义序列或核酶，以便阻止病原体在SM1造血细胞中繁殖。另一种情况是，某些疾病与特殊分泌产物如激素，酶等的过度产生有关，也可将核酶，反义序列或其它抑制因子插入SM1造血细胞，以便抑制这种特殊的疾病。

可以相信，借助于上面的描述，不必进一步精心改进，本领域的技术人员就可以最充分地应用本发明。

Claims (13)

1.一种基本上不含其它蛋白质的纯蛋白质，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE测定时，它具有大约230 KDa的分子量，此蛋白质存在于人或小鼠造血干细胞和原始前身细胞的表面，但是它不存于选自如下的细胞的表面：FDC-P1髓样前身细胞，EL4 T-细胞，WEHI-3骨髓单核细胞，和70 Z/3前-B淋巴样细胞，以及分化的人脐带血造血细胞和分化的小鼠骨髓造血细胞。

2.一种抗权利要求1蛋白质的抗体。

3.权利要求2的抗体，它是一种单克隆抗体。

4.一种用于制备富含造血干细胞组合物的方法，包括步骤：(a)提供结合SM1的抗体，(b)将此抗体固定化在支持载体上，使此抗体保持其结合SM1的能力，然后(c)使一个混合细胞群与此抗体接触，其中该混合细胞群含有造血干细胞，致使干细胞附着在支持载体上，(d)除去未附着的细胞，从而，富含造血干细胞的细胞群仍然附着在支持载体上。

5.一种用于制备富含造血干细胞组合物的试剂盒，包含抗权利要求1的蛋白质的抗体。

6.权利要求6的试剂盒，另外还包含有使用此试剂盒的文字说明。

7.一种用于检测样品中结合权利要求1蛋白质的造血因子的方法，包括(a)使怀疑含有此生长因子的样品同权利要求1的蛋白质相接触，其中该蛋白质具有可检测的标记，以及(b)检测该生长因子同可检测标记的蛋白质的结合。

8.一种用于检测样品中造血因子的试剂盒，包含权利要求1的蛋白质。

9.权利要求8的试剂盒，另外还包含一种选自以下的可检测性标记物：荧光标记物，放射性标记物，和酶标记物。

10.权利要求8的试剂盒，另外还包含使用此试剂盒的文字说明。

11.一种分离的DNA分子，它编码相当于权利要求1蛋白质的蛋白质。

12.权利要求11的分离的DNA分子，包含如下的核苷酸序列：GGAATTCCGN CAGCAAGTTC TTATTCTGCC TAAGAATTTT GTGATTCAGCACAAAGAGGG GAAAGCAGTT GAAAAAGAGA TAGCAGCACC TCAGCAGAAAGGCCCAGAGC ATTGCTCACC TGGCCCACAG ACAAGCGCTA CGTGTTCCTTAGTGTCTGTT CCTGTCACCT CTGTGTCTAC CCAACTGCCT AATACAGTTCTCAGTAAGAC AAGTACACCT TCATCAAATG TGAGTGCTAG ATCACAGCCTTTGTCTCCTG TAGCCTCTGT AAGTAATGCA TTAACATCAC CAGTTAAGACTAGCCAAAGT GAAGCAGGAA AAGTCAAGAG TACCGCTTCA TCCACCACACTCCCCCAGCC TCACACTTCA CCTACCATTT CATCAACAGT TCAGCCTCTCTTGCCAGCAA CAACACTAAA TGAATCTACA GATCCTGGCA GTTCCATCCCCTGTTTTTCA CAGCAAACTG TTGATTCTTC TGAGGCAAAG CAAGAACTAAAAACTGTATG TATACGAGAT TCACAGTCAA TTCTTGTTAG GACTCCAGGT-GGGAACACTG GAGTTGTAAA AGTACAAACT AATCCGGAAC AAAATTCACCCAACAGTTTA TCTTCAAGTT CTGTTTTCAC CTTTACACCT CAATTTCAGGCATTTCTTGT GCCAAAATCA ACATCATGCT CTGCTTCCTC ACAAGTAGCCGGAGTGACTA CTACATCTAG TCTACCATCT TTCAGCCAAG CAATCTACGTNTGTGTNGCT TCATCCACCC ATGGGAAAAA TCTCAAATCT ACACAAGGCCAAACCTTGAG CAGTGGTATG TAGGCCCCAT GATAGAAAAA ACGTCATACATGCCCTCTTC ACCCTTGAAG CCTTCTGTTT CTTCCAGCTC ACTGCTACCATCAACAACAA ATAGTTCAGT GAGTGTAATT AGCATATCAA CAGGAAATNNNGGGCAAACC AATACAAATG TTATTCATAC ATCAACTAAA CCACAACAAGTAGATTGTAT CACNAAAAGT TACCCAGTTA CAAGATCAGA AGCAACAACAGCAGTAAATG GTGATGTGCT CGGTGAGACT CCAGGTCAGA AACTGATGCTGGTGTCAGCT CCATCTGGTC TCCCTTCTGG CAGTGTACCT TCAGTTAACACGGCACCAGA ACCGACATCT GCAGGTGTGT CTACCCAGAA GGTAGTTTTTATTAATGCTC CAGTTCCTGG TGGCGCTTCA TCCTCAGCTA TTGTTGCAGAATCATTAAGA CAGTCACTTC CTTCTCCCAC AAATACTGTA TTACTAGTGTGCTTGTAGTA GTTAACTCCA CCATCTTTGT AAGCTAATGA AATTGTGAGTCACCCATTTA TATCTTAATT TTTAATCATG TCAGTTCTTG AATGGGTATCTCCTTAGCCT GCTGATTTCT TTTTCTTTCT AAAGAAAGTG GGTGGAGAAATTAATTTAGA CGTTTGTTTG CAATAAAAAG AATTC

13.权利要求11的分离的DNA分子，包含如下的核苷酸序列：GAATTCTTTT TATTGCAAAC AAACGTCTAA ATTAATTTCT CCACCCACTTTCTTTAGAAA GAAAAAGAAA TCAGCAGGCT AAGGAGATAC CCATTCAAGAACTGACATGA TTAAAAATTA AGATATAAAT NGGTGACTCA CAATTTCATTAGCTTACAAA GATGGTGGAG TTAACTACTA CAAGCACACT AGTTATACAGTATTTTGTGG GAGAAGGGCA TACAGACATG GCTAACTTCA TATAGATCCCATTAGACAAC TGGATTTACA ACAAGTTTTT TTAATAAGAA ATGGGCAAAGCAGCTTTCTT TTCAGAATCA AAATGCAGAA CAAATGGAAA AATTATGGTATTAACCTTCA CAAGTTTGAG CCTCCACAAA TAATGCAACC AAGTTTTACATTTTTAACAG CCCTTCTACA TACACTCCAT CTTCTCTATC TTAGTTCCAAGTTTTAGTTT TCAATCCCAA TTATACCAAT TCCATTGTTA TTTTAAGAAAAAACCTTCCC AGTTATTGTC AGAAACTATG ATTTAGCTTA CCCCCTCCACTACNNAGCAA ACTACAGAGA GGATGGAGTG TAATATGAGC AGTACAGAGTCTTAATGCAA TTCATGAGGA CCACTTAGTC CTTACATGAA TCTGGTTGCTAACATTTCTA TTATATTGTG ACAATGACTC CCGACTGTTA TTCTCTGTGAGAAATGGGGG GAGTAAATTC TTAATAAAAG ACACCAGGTA CAAAGCAACATTTTACTTCT GTTGTGATAA AAAAAAAAAA AGGTCACATT TTCAGATAAAATGTGGAACC CTGAAATCTG ACACATTCTC TTATCGTGCC ACCAATGCTGAGGTTCTCTT ACGATTCACT TTTAAACTGC AATTAAAAAT GTACAAAAAAGAAAAGAAAA AAANTCAACC CACAAAGCTT CTAAAAAAGG AACCCGCAGGCACTTCCTCT TGTGGAATGT TTAAAAAGTT AGCCTACTAA AGAAAACAGTCGACTTCTTG TGAAGGTTTT GGAGAAATAT GTATCAGTTC GTTTTATTTGGGTATTCAAT AATATCCTTG GTGATAATGC TGACTCCATG GCTTCTGACCCCAGAATTGA CCCTGCTGCC ACTGGTTGTA GCCCTGAGAT TGATTTTTGTAGCCACGATT GTTTCCTCGT CCTCTGAAGT TCTGGTTGTA GTTCCCTCTGTTGGGCATTC CACCTCTGTT GTAGTTCCCT CTGTTTGAGT AACTACCACGGCCAGGAAAA ACAGGGGCAC GAGGGTATGG ATAGCCGATT CCACCACTTCCTCCACCGCC ACCACCTCTC TGTGGCATGT TGCCCTCCTA TTATATCCGCCACGATTCCC AGGGGCTCCT CCTCTGAAAT TTCCACCACG CATATTGAATCCTCCACGTC TCTATGGCCA CCACCTCTGT TAAACTGGTT CTTGCCACTCTTATTTTTAT TGCTTTTCTT TGAGCCAGTG TTCTGTTTCT TTTCTGGTGGAAGAGCCTTT TTGCTTTCTT CCTTATATTG CTCCAAGAGT TTTTGGGCTTCTTCCTTCTG AAGGGCAACA TAGGTTATTT CATCAAAGCA CTCAGCTACCTCTGGGAGGG TAAAGTTTCC TTTCATTT

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