CN1191606A - BL3造血干细胞上的糖蛋白gp105 - Google Patents

BL3造血干细胞上的糖蛋白gp105 Download PDF

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Abstract

一个N－糖基化糖蛋白,其糖基化分子量为105kDa,非糖基化分子量为85kDa,它存在于BL3造血干细胞表面上,但不存在于包括32D和FDC－P1骨髓母细胞、EL4T细胞和3T3成纤维细胞在内的其它细胞表面上。结合gp105蛋白的抗体抑制在BL3条件培养基(BL3CM)中培养的BL3细胞的增殖。它也可以体外优先抑制胎儿肝细胞来源的多谱系克隆,体内优先抑制骨髓细胞来源的脾细胞克隆形成单位位点的发育。抗gp105抗体可以用来生产富集造血干细胞的制剂。gp105蛋白基本上由其它蛋白质中纯化,它本身是分离和表征负责BL3CM增殖作用的一种或多种因子的有用试剂。

Description

BL3造血干细胞上的糖蛋白gp105
本发明由国家健康研究所提供部分基金，在NIT资助的DK41298和HL46547下进行。
                      发明背景
本发明涉及gp105，一种基本上由其它蛋白纯化的N-糖基化糖蛋白，它的糖基化分子量为105 kDa，非糖基化分子量为85kDa，存在于BL3造血干细胞表面上，但不存在于包括32D和FDC-P1骨髓母细胞(progenitor cell)、EL4T细胞和3T3成纤维细胞在内的那些其它细胞表面上。本发明还涉及使用抗gp105抗体生产富集造血干细胞群体的方法。
所有循环的血细胞都由多能干细胞通过血细胞生成过程发育而来。造血干细胞为未分化细胞，能够自我更新并分化为定型的骨髓细胞谱系、红细胞样细胞谱系、巨核细胞谱系和淋巴样血细胞谱系的母细胞(progenitor cell)。对干细胞的彻底分析是全面理解血淋巴系统(hematolymphoid system)发育生物学的基础。然后，我们对于造血干细胞的了解相当少。
从功能上讲，造血干细胞能够重建长期致死辐射受体体内的血淋巴系统。参见Spangrude & Johnson，PNAS 87：7433-7437(1990)；Spangrude等人，Blood 78：1395-1402(1991)。它们也可以分化为12天大的脾克隆形成单位(CFU-S)，这可以在体内分析中观察到脾位点的形成。参见Spangrude等人，Science 241：58-62(1988)；Molineux等人，Exp.Hematol.14：710(1986)；Nakahata & Ogaw，PNAS 79：3843-3847(1982)。此外，在体外造血干细胞粘附于基质细胞层时，发育为“鹅卵石”形态。参见Wong等人，Immunity1：571-583(1994)。
因为与所有细胞相比，造血干细胞甚至在血细胞生成器官(诸如骨髓或胎儿肝脏等)中的比例也是微量(10-4-10-5)的，因此更详细地表征造血干细胞的努力最初受到阻碍。参见Orlic等人，Blood 82：762-770(1993)。因此，造血干细胞特有物理性质的阐述对于建立生产富集干细胞群体的方法是需要的。参见例如Spangrude等人，Blood 78：1395-1402(1991)。所有已知的造血干细胞的富集方案都涉及基于选择细胞表面标记或遗传(逆转录病毒)标记的细胞分离方法。参见Jordan等人，Science 252：953-963(1990)。尽管已经描述了生产造血干细胞富集群体的方法，但特有标记的缺乏妨碍了真正纯的造血干细胞群体的分离。
造血干细胞表达细胞表面分化抗体(Thy-1)和干细胞抗体-1(Sca-1)。然而，它们不表达B细胞(B220)谱系标记(Lin)特征、粒细胞谱系标记特征(Gr-1)、骨髓单核细胞谱系标记(Mac-1)特征和T细胞谱系标记(CD4，CD8)特征。参见Spangrude等人，Supra。报道最广泛使用的造血干细胞富集方案涉及使用抗Thy-1和Sca-1的单克隆抗体。参见Orlic等人，Supra。然而，只有Thy-1+、Sca-1+和Lin-细胞亚组能够增殖长期致死辐射受体。参见Smith等人，PNAS 88：2788-2792(1991)。因此，基于Thy-1和Sca-1表达的选择不能获得纯的造血干细胞群体。同样地，其它造血干细胞富集技术，诸如涉及使用抗酪氨酸激酶(诸如W位点基因产物、c-kit和胎儿肝激酶-2(flk-2)等)的单克隆抗体的那些技术显然不能区分造血干细胞和造血母细胞。参见例如Mattews等人，Cell 65：1143-1152(1991)。
近期报道表面用经过重组逆转录病毒转导的胎鼠肝细胞重建了致死辐射受体小鼠的一个细胞系。参见Wong等人，Supra。BL3细胞表达功能造血干细胞的所有性质，即它们可以重建长期致死辐射受体，产生pre-CFU-S和克隆形成细胞，它们与基质细胞一起时发育成“鹅卵石”。BL3细胞除为Thy-1+、Sca-1+和Lin-外，也表达已知在造血干细胞中表达的一个转录因子-GATA-1。参见Sposi等人，PNAS89：6353-6357(1992)。此外，由12天大小鼠胚胎肝细胞得到的BL3细胞源自于胚胎。因此，BL3细胞具有不同于成人造血干细胞的细胞表面标记。参见Jordan等人，Supra；Spangrde等人，Supra。
上述讨论表明，鉴别造血干细胞上的其它细胞标记是必要的，特别是使生产更高度富集的造血干细胞群体称为可能，以便于需要帮助我们更好地理解未成熟血细胞的生长和分化。
                     发明概述
因此，本发明的目的是鉴别和分离存在于BL3造血干细胞上、而不存在于定型母细胞或成熟血细胞上的标记，再使用这一标记鉴别假定的造血干细胞的调节因子。本发明的另一目的是抗BL3细胞表面标记的抗体和用它产生富集造血干细胞群体。
通过gp105，一种基本上由其它蛋白质纯化的N-糖基化糖蛋白达到这些目的，该糖蛋白的糖基化分子量为105kDa，而非糖基化分子量为85kDa，它存在于BL3造血干细胞表面上，但不存在于包括32D和FDC-P1骨髓母细胞、EL4 T细胞和3T3成纤维细胞在内的其它细胞表面上。通过抗gp105抗体和使用该抗体富集造血干细胞，进一步达到这些目的。
本发明的一个实施方案提供了用抗go105抗体制备按照本发明的富集造血干细胞组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供结合gp105的抗体，(b)将该抗体固定于固相支持体上，使得抗体保留其gp105结合能力，然后(c)使含有假定造血干细胞的混合细胞群体与抗体接触，使得干细胞粘附于支持体上，(d)除去非粘附的细胞，而富集造血干细胞的群体仍粘附于支持体上。
本发明的另一实施方案提供制备富集造血干细胞组合物的药盒，包含结合gp105的抗体，还包含使用试剂盒的说明。
本发明的再一实施方案提供检测样品中结合gp105的造血调节因子的方法，包括(a)将怀疑含有所述生长因子的样品与标记gp105接触，(b)检测造血调节因子与标记gp105的结合。
本发明的另一实施方案提供检测结合gp105的造血调节因子的药盒，包含标记gp105，还包含使用试剂盒的说明。
本发明的再一实施方案提供分离的编码gp105的DNA分子。本发明的特殊实施方案提供分离的编码gp105的DNA分子。
                附图的简单说明
图1.(A)BL3细胞条件培养基(BL3CM)或促细胞分裂剂刺激的脾细胞条件培养基(SCM)中的刺激活性。将指数生长期的BL3细胞(在100μl最终体积中的浓度为2×104)与BL3CM或SCM的10倍稀释液温育。在R2培养基(添加2％FCS的RPMI)中制备稀释液。培养3天后，按照Chung等人，PNAS 86：7957-7960(1989)所述方法，进行MTT(溴化3(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓)分析。显示这些方法每个实验数据组(由四个平行测定组成)的标准偏差。
(B)抗BL3特异性地抑制BL3细胞的增殖。将指数生长期的BL3细胞(在100μl最终体积中的浓度为2×104)(透明柱)、FDC-P1(条形柱)或MM1细胞(黑色柱)与免疫前抗血清(Pre-S)的1∶100稀释液或抗BL3抗血清(Anti-S)的各种稀释液(1∶100-1∶400)一起温育。在R2培养基中制备稀释液。培养3天后，加入MTT，混合物再温育4小时。每个细胞系的所有记录(其记录以100％表示，但其实际记录BL3为0.147，FDC-P1为0.541，而MM1细胞为0.903)与免疫前血清(pre-S)温育的相应细胞的所有记录归一化。显示这些方法的标准偏差。
(C)抗BL3抗血清阻断刺激活性。在100μl的最终体积中含有R2、BL3CN或SCM的BL3细胞(2.5×104)与或不与pre-S或anti-S一起培养4天，此后进行MTT分析。显示这些方法每个实验数据组(由四个平行测定组成)的标准偏差。
              推荐实施方案的详细描述
现已发现N-糖基化糖蛋白(gp105)，并基本上将其从其它蛋白质中纯化。其糖基化分子量为105kDa，其非糖基化分子量为85kDa。gp105存在于BL3造血干细胞表面上，但不存在于包括32D和FDC-P1骨髓母细胞、EL4T细胞和3T3成纤维细胞在内的其它细胞表面上。Wong等人在Immunity 1：571-583(1994)中详细描述了BL3造血干细胞系的建立和保持。
gp105已通过Western印迹表征，并经过免疫沉淀分离，两者都使用抗BL3细胞多克隆抗体。该多克隆抗体按照以下步骤制备。给一个成年新西兰雌兔静脉内注射1.2×108的BL3细胞。3周后再用1×108细胞的剂量加强。10天后，给雌兔放血，收集30ml血。随后，该动物每6-8周加强1次。收集血，让其于室温下静置4小时，转移至4℃下过夜温育。第二天，收集清亮的血清，然后于56℃下加热失活30分钟，用0.1体积的填充WEHI-3细胞吸收2次，用0.1体积的填充EL4细胞吸收2次，用0.1体积的填充鼠红细胞吸收1次。选择WEHI-3细胞和EL-4细胞用于吸收，是因为它们在Western印迹分析中为gp105阴性。于室温下摇动试管1小时，进行吸收。以1,000g离心10分钟，收集吸收的血清。对于滴定测定，将100μl最终体积中1×104的BL3细胞或WEHI-3细胞在预定最适浓度(1∶15)的兔补体(Low-Tox-M，Accurate Chemical & Scientific Co.NY)存在下，与或不与抗血清的各种稀释液一起温育。于4℃温育45分钟后，将等体积0.4％台盼蓝与处理的细胞一起混合，测定生存能力。按照Shigeno等人在Lancet ii：320-323(1968)和Raff等人，Nature 230：50-51(1971)中描述的方法，分析特异性补体介导的细胞毒性，测试该血清为阳性。这样，在吸收前，在1∶4抗血清稀释液下，特异性杀死58％的WEHI-3细胞，在吸收后，在1∶4稀释液下，特异性杀死0％的WEHI-3细胞，在1∶2稀释液下，特异性杀死12％的WEHI-3细胞；而在吸收前后，在检测为1∶0-1∶128的所有稀释液下，都特异性地杀死95-100％的BL3细胞。基于这一分析，抗BL3抗血清的效价为1∶1,000，效价定义为特异性杀死50％BL3细胞的稀释度。
按照以下步骤，通过Western印迹分析表征gp105。收获BL3细胞，用含有2％胎牛血清(FCS)的PBS洗涤2次，在含有10mMTris-HCl，pH8.0、50mM NaCl、1％Triton X-100、1mM PMST(苯基甲磺酰氟)、1mM EDTA和2μg/ml抑肽酶的10μl裂解缓冲液中裂解。将裂解液置于冰上30分钟，然后于4℃下，以14,000rpm离心5分钟。收集上清液，将其与2×样品缓冲液(含有100mM Tris-HCl，pH6.8、2％甘油、0.02％溴酚蓝、2％SDS和2％2-巯基乙醇)混合。在7％SDS-PAGE凝胶上加样前，将混合物煮沸3-5分钟。生物素化SDS-PAGE标准(BioRad，Richmond，CA)用作分子量标记。在Tris-甘氨酸缓冲液存在下，使用Tall Mighty小垂直板凝胶装置(SE280型，HoefferScientific，San Francisco，CA)进行电泳。电泳后，将凝胶在含有20％甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液中浸泡30分钟，在同一缓冲液存在下，将蛋白质转移至Immobilon PVDF转移膜(Millipore Co.，Bedford，MA)上。该膜用封闭液(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)于室温下封闭60分钟以上，再与5μg/ml第一抗体的封闭液一起于室温下温育60分钟。通过rProtein G Agarose柱(BRL，Gaithersburg，MD)纯化所有血清的IgG。然后，该膜用含有50mM Tris-HCl，pH7.5、200mM NaCl和0.05％v/vTween 20的洗涤液洗涤2次，每次5分钟。然后与1μg/ml生物素化羊抗兔IgG的封闭液(GIBCO-BRL)于室温下温育30分钟。该膜用洗涤液洗涤2次后，与1∶2500链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(BMB)于室温下温育30分钟，然后再洗涤4次。然后用Lumi-Phos 530(BMB)染色并暴露于X-射线薄膜，进行目测。
按照以下步骤，通过免疫沉淀分离gp105。收获两千万BL3细胞，用P2缓冲液(PBS加2％FCS)洗涤2次。将细胞碎片用0.5ml P2缓冲液再悬浮，与10μg IgG于4℃下温育2小时。细胞用P2洗涤2次，用Western印迹所述相同的裂解缓冲液裂解。将细胞裂解液置于冰上30分钟，然后离心，将上清液转移至含有40μl蛋白-琼脂糖悬浮液(50％(体积)溶胀琼脂糖，BMB)的管中。它们于4℃下再温育2小时。收集抗原-抗体-A蛋白-琼脂糖复合物，用裂解缓冲液洗涤3次。碎片再用40μl2×样品缓冲液悬浮，煮沸3分钟，于室温下离心2分钟。收集上清液，通过7％SDS-PAGE分离。按照westerm印迹所述方法目测蛋白质。
抗BL3细胞抗血清的特异性识别表明，gp105对造血干细胞起一定的生物学作用。在补体存在下，该抗血清对BL3细胞的细胞毒性表明，gp105为BL3细胞表面存在的特有分子。western印迹和免疫沉淀分析证实了这一点。对于western印迹分析，将BL3细胞、EL4T细胞、32D骨髓母细胞和3T3成纤维细胞各一百万在缓冲液中裂解、电泳，印迹在PVDF薄膜滤器上，然后将其或者与抗gp105抗血清、或者与免疫前血清温育。只在BL3细胞裂解液中明显存在分子量为105kDa的条带。对于免疫沉淀，在细胞裂解前，将二千万BL3细胞或者与产生的抗BL3细胞抗血清、或者与免疫前血清温育，然后细胞裂解液与A蛋白琼脂糖温育。洗涤复合物并煮沸，以释放蛋白质，然后按照western印迹分析所述的方法进行分析。结果表明，不与免疫前血清发生免疫沉淀、而与抗血清发生的免疫沉淀，仍产生105kDa的主带。此外，该条带只在BL3细胞表面上观察到，而在EL4T细胞、32D骨髓母细胞或3T3成纤维细胞表面上没有观察到。
用N-糖苷酶F(BMB)的处理证实，gp105的确为一糖蛋白。按照以下步骤对gp105进行糖基化研究。免疫沉淀后，蛋白质-Ab-A蛋白-琼脂糖复合物再用6mM Tris-HCl，pH6.8和0.2％SDS悬浮，煮沸5分钟，于室温下离心2分钟。将上清液与等体积2×糖苷酶缓冲液混合，该缓冲液含有200mM磷酸钠缓冲液(pH6.6)、50mM EDTA(pH7.5)、2％Triton X-100、0.1％SDS和300mM 2-巯基乙醇。该混合物与0.4单位N-糖苷酶F(BMB，分类号为1365169)在22μl的总反应体积中，于37℃下温育12-20小时。下一步，再将20μl western研究分析中的2×样品缓冲液加入每个样品中。然后样品在进行凝胶电泳前，煮沸3分钟，以上操作均按照western印迹分析的步骤进行。
用0.4单位N-糖苷酶F于37℃处理过夜后，在免疫沉淀中观察到分子量为85kDa的主带，表明未加工蛋白质的大小为85kDa，其糖基化形式为105kDa。尽管仍未知gp105是否含有O-连接的糖部分，但gp105在酪氨酸残基上不是自体磷酸化的，表明它不含酪氨酸自体磷酸化酶活性。
已知各种分子存在于造血干细胞上，它们已经用于各种分析和造血干细胞的纯化中。然而，这些分子与gp105不同。少至100个Thy-1+，Lin-，Sca-1+细胞可以挽救95％的致死辐射受体。与gp105相反，Thy-1和Sca-1的分子量在非还原条件下分别为30kDa和8kDa，而在还原条件下分别为30kDa和18kDa。
在人造血干细胞上也已发现CD34抗原。其鼠的相应物的生化特性分子量，根据细胞类型为90-110kDa。因此，其分子量与gp105相似。但是，CD34在NIH/3T3细胞、PA6基质细胞和M1白血病细胞中表达。如western印迹分析和免疫沉淀所示，gp105不存在于NIH/3T3细胞、32D、FDC-P1白血病母细胞的裂解液中。由于抗BL3细胞抗血清含有多克隆抗体，它可能识别分子上的几个抗原决定基，gp105不可能是鼠CD34。此外，已经观察到CD34的超磷酸化。相反，BL3细胞上的gp105在正常实验条件下不磷酸化。
造血干细胞似乎也表达重要的调节剂-c-kit，这是一种干细胞因子(SCF)的酪氨酸激酶受体。SCF和c-kit已经用来富集人和小鼠干细胞。然而，如RT-PCR和MTT细胞增殖分析所证明，BL3细胞既不表达c-kit，也不表达SCF。
造血干细胞上的另一分子为AA4.1。该抗原最初显示在pre-B细胞上，而后者在成髓(lymphomyeloid)干细胞上。编码AA4.1的基因及其生化性质尚未表征。最近的研究表明，AA4.1的表达与细胞周期的特殊阶段有关，而不是持续存在于造血干细胞上，表明它不是造血干细胞特有的。BL3细胞为抗AA4.1弱阳性，阳性细胞是多相的；该多相性可能也与细胞周期有关。相反，gp105大量存在于BL3细胞上，表明这两个分子是不同的。
从AA4.1富集的造血干细胞中分离出flk-2cDNA，据报道在造血干细胞和母细胞中限制性地表达。现在，对flt-3的独立克隆和分析认为与flk-2基因相同，表明flt-3/flk-2在几种不同类型的细胞和组织中表达。编码其配体的基因已经分离，已表明flt-3刺激来自胎儿肝脏和成人骨髓的造血干细胞增殖。RT-PCR的初步分析表明，flt-1/flk-2配体和受体都不在BL3细胞中表达，这表明gp105不可能相当于这些分子。
此外，已经成功地产生特异性抗BL3细胞的抗体。该抗体高亲和性和特异性地识别BL3细胞上大量存在的gp105。该抗体也可以中和刺激BL3细胞生长的因子的活性，该因子存在于促细胞分裂剂刺激脾细胞(SCM)或BL3细胞条件培养基(BL3CM)中。
按照以下步骤制备BL3CM。增殖BL3细胞，直至它们在对数期中。然后将浓度为二百万细胞/ml的BL3细胞再悬浮于添加10％FCS的新鲜PRMI中36小时。于4℃以1,400g离心，收集用过的培养基。上清液贮藏于-20℃下，直至使用。按照Wlng等人，PNAS 86：7957-7960(1989)中所述方法制备脾细胞-条件培养基。
按照以下步骤分析BL3细胞的增殖。指数生长的BL3细胞用添加2％FCS和10μg/ml庆大霉素的RPMI(R2培养基)洗涤3次，通常在R2培养基中，将细胞浓度调至4×105/ml。然后细胞与系列稀释的抗血清或条件培养基制剂混合，沉积到96孔微量滴定板的各个孔中。通常每个实验点建立4-5个平行测定。在37℃、潮湿的5％CO2培养箱中培养3-4天。培养结束时，进行增殖分析。为此，每孔加入10μl5mg/ml MTT(Sigma，溴化3(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓)(Chung等人，PNAS 86：7957-7960(1989))。这些板于37℃再温育4小时，然后加入100μl酸性异丙醇，以溶解MTT还原的甲  产物。然后用微孔板读板仪(BioTek Instmment Inc.，LE311)在570/630双波长下测定每个反应混合物的着色程度。
在BL3细胞中加入抗BL3细胞抗血清导致细胞死亡的事实表明，中和结合gp105的抗体柱阻断了自泌生长因子的作用。BL3细胞的死亡是因为维持它们的最低培养条件和它们不能与许多不同的已知生长因子反应的独特性质。另一方面，将抗血清加入胎儿肝细胞培养物的基因克隆(clonogenic)分析表明，多能母细胞只是生长停止，在缺乏抗体下再铺平板时，它们仍能够继续发育为多谱系克隆。在这种培养条件中，包括最适生长刺激量的SCM、许多生长因子源。胎儿肝脏多谱系母细胞已知对这些单独和或组合的因子反应。这些因子中的许多因子也可以维持细胞存活。因此，使用三种不同的生物学分析，用抗血清识别细胞表面的gp105的结果是，观察到特异性干细胞的作用。
这些数据表明，条件培养基中的造血调节因子或者是gp105的配体，或者gp105为配体结合的受体的亚基。有两个原因似乎可以说明，gp105不可能代表完全与配体-受体复合体无关的一般表面分子，因此，其抗体的识别以主要方式抑制细胞生长。首先，gp105特异性地存在于保留许多造血干细胞性质的BL3上，因此它不可能是诸如存在于所有细胞上传递生长抑制信号的一般分子。第二，抗体与BL3细胞的温育导致细胞死亡(图1)。相反，与胎儿肝脏多能细胞温育似乎导致生长停止，而不是细胞死亡。这种多效性作用可能是受体-配体分子的特征。
除了BL3细胞具有的几个重要的干细胞性质外，它们对或者单独加入或者组合加入培养物中的细胞因子无反应，后者已知作用于造血干细胞。然而，采用BL3细胞作为应答细胞的增殖分析表明，BL3细胞对以高细胞密度制备的自身条件培养基有反应(图1a)。刺激活性也存在于促细胞分裂剂激活的脾细胞条件培养基中(图1c)。应答与剂量有关(图1)。由于未知的原因，在BL3条件培养基中检测到的活性批批不同，而脾细胞条件培养基的活性非常一致。考虑到BL3细胞不产生多数已知的细胞因子，而促细胞分裂剂刺激的脾细胞则产生这些细胞因子，可能需要额外的分子稳定该造血调节因子。
数据(图1b)表明，加入抗gp105抗血清可以特异性地抑制BL3细胞的增殖，但不抑制FDC-P1骨髓母细胞和v-abl转化的MM1肥大细胞的增殖。参见Dexter等人，Nature 277：471-474(1979)；Chung等人，PNAS 88：1585-1589(1991)。此外，抗血清也可以阻断促细胞分裂剂刺激的脾细胞调节培养基中发现的刺激活性(图1c)。该抑制与剂量有关，在1∶100的稀释液中可以达到完全抑制。在抗体存在下，BL3细胞保持的生存曲线与在不允许细胞生长的低细胞浓度下细胞保持的生存曲线没有区别。这表明抗体对BL3细胞没有细胞毒性，因为否则可以观察到细胞死亡速率加快。
为了确定由正常胎儿肝脏或骨髓分离的多能造血母细胞的生长和分化在抗gp105抗体存在下是否受影响，我们进行了体外克隆分析。12天大鼠胚胎的胎儿肝细胞(在0.1ml R2培养基中6×105细胞)在半固体甲基纤维素培养物(含有1％SCM、1U/ml Epo(BMB)和0.9％甲基纤维素)中铺平板之前，与0.1ml抗血清或免疫前血清的1∶10或1∶100稀释液预温育(于4℃下2小时)。6-8天后，如下记录克隆的数目和类型。
表1.在抗BL3抗血清存在下造血克隆的形成
        克隆数/3×104铺平板的细胞
稀释度BFU-E CFU-M E-mix CFU-GM其它成纤维细胞免疫前血清  1∶10   16±1  49±6  24±4  25±6  9±6    0抗血清      1∶10   12±2  68±6    0    25±2  5±1  26±6免疫前血清  1∶100  14±3  42±2  25±6  19±2  8±3    0抗血清      1∶100  14±1  49±2  26±4  21±4  10±1   0每个实验点进行重复。数值表示数±方法的标准偏差。在wong等人PNAS 83：3851-3854(1986)提出的标准的基础上记录克隆类型，只是“其它”定义为粒细胞或肥大细胞谱系的克隆，而“成纤维细胞”定义为少于100个具有成纤维细胞表型的细胞的小克隆。在相同条件下，在其它三个实验中获得相似的结果。
惊人的是，在含有1∶10抗血清稀释液的培养物中没有观察到典型的多谱系E-mix克隆，而它们存在于免疫前血清的培养物中。在1∶100的免疫前血清和免疫血清两者中观察到的克隆数目和类型没有差异。在与抗血清的培养物中总克隆数大致保持不变。此外，只在与1∶10的抗血清稀释液的培养物中可能观察到小的成纤维细胞样克隆。再将10个这样的克隆细胞在缺乏抗体的情况下铺平板，形成10个E-mix克隆、2个CFU-M克隆和肥大细胞样克隆。因此，抗体可以特异性地抑制胎儿肝细胞来源的多能母细胞的体外发育，而不是对其有细胞毒性。
CEU-S形成细胞为多能造血母细胞，能够重建短期致死辐射的受体鼠。按Wong等人(1994)，Supra所述方法，采用用或不用抗体加补体处理的供体成人骨髓细胞进行CFU-S脾位点分析。在第一个实验中，将得自7周大C57BL/6雌鼠股骨的骨髓细胞(20×106细胞/ml)与15μg/ml免疫前血清或纯化的预定浓度的抗gp105抗体，在1∶15稀释的低毒素兔补体存在下温育(于37℃下45分钟)。由抗体识别的细胞由补体裂解。用台盼蓝法排除进行生存能力检查后，将0.5ml R2培养基中的1×105肝细胞注射到每只致死辐射小鼠中(每只接受137Cs源辐照器释放的10cGy)。移植后13天取出脾或受体，将其在布安液中固定，记录CFU-S克隆。在第二个实验中，采用8周大的BALB/C雌鼠，按照第一个实验的相同条件，只是抗体量不同。
  表2.用抗gp105和补体处理后CFU-S的还原处理      CFU-S数/CFU-s受体平均值+SD实验1+抗-BL3    6，13，6，8，7，57.5±2.9-抗-BL3    15，13，20，17，1917.0±2.7实验250μg/ml抗-BL3        4，4，5，5  4.5±0.612.5μg/ml抗-BL3      10，9，13，6，89.2±2.650μg/ml Pre-IgG      17，16，18，14，1616.2±1.512.5μg/ml Pre-IgG    16，16，17，1516.0±0.8
在两个实验中，与不用血清或免疫前抗血清处理的脾或骨髓中的CFU-S位点数相比，在用抗血清处理的脾或骨髓中的CFU-S位点数的还原一致。该还原与抗体的用量成正比。
使用抗BL3细胞的抗体，用λgtll/EcoRI/CIAP处理的载体药盒(Stratagene，La Jolla，CA)，得到BL3来源的λgtll cDNA噬菌体库。通过picoBlue免疫筛选药盒(Stratagene，La Jolla，CA)，按照书面说明，进行阳性克隆的鉴别。阳性克隆大于1kB DNA的核苷酸序列分析表明，编码gp105的基因是独特的，但与编码几个生长因子受体或生长因子的几个基因具有同源性。此外，表达gp105的阳性克隆的序列分析揭示以下部分核苷酸顺序(SEQ ID NO：1)：GAATTCTGAC ACCTCGTCTGTGCTCCATTT GGAAACTCTA CTAGCTGGGA TACCCAGACA GTCGGAAGAAGCTTGCTCTG CTGCTCCCAG CGCAAGGGCA GACACGGAAT GGGAGGCTTAAAGGAGAGAA ATACTGCTGA GCGTCGCTGG GCCTGCTGCT GGGTCTGGGCTTGCTGCTGG GTGGGCTGAG CTGTTGAACC TGCTGAGGCT GTTGGACGGGTGGGGCCTGC TTGAGGCTGC TGGGCCTGCT GGGGCTGCTG GGCCTGCTGAGCCTGTGGAG CCTGCTGGGC CTGCTGGACT GTGGCGCCTG CTGGGCTGCTGGACCTGTGG CGCCTGCTGG GCTGTGGAGT CTGTGGGGCC TGTGGAGCCTGCGGGCCTGC TGGGCTTGCT GGGCCTGCTG GCTCGGACGT.
采用本领域普通技术人员众所周知的技术，可以以各种方式生产抗gp105的单克隆抗体。在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人，Cold Spring Harbor Publications，第726页(1988)中描述了这些技术的细节。将按照本发明的单克隆抗体，按照本领域众所周知的体外法和体内法进行放大。体外放大可以在适当的培养基中进行，这些培养基诸如Dulbecco’s Modified Eagle培养基或RPMI 1640培养基等，可选地添加哺乳动物血清(诸如胎牛血清等)或微量元素和维持生长的添加物，例如喂养细胞，诸如正常小鼠腹膜渗漏细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞等。体外生产提供相对纯的抗体制剂，并允许进行扩大生产，产生大量的所需抗体。在组织培养条件下的大规模杂交瘤培养技术是本领域已知的，包括例如在气升式反应器或连续搅拌式反应器中的均相悬浮培养或固定化或捕捉式细胞培养。
大量的本发明单克隆抗体也可以通过体内增殖杂交瘤细胞获得。将与母细胞组织相容的细胞克隆注入哺乳动物中，例如同系小鼠中，引法抗体产生肿瘤的生长。这些动物在注射前，可选地灌注烃类，尤其是油，诸如姥鲛烷(四甲基十五烷)等。1-3周后，从哺乳动物体液回收所需的单克隆抗体。
按照本发明，按照上述方法(包括用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通过化学还原裂解二硫键降解)，可以从生产的单克隆抗体获得本发明的单克隆抗体片断。或者，本发明包括的单克隆抗体片断可以使用自动多肽合成仪(如Applied Biosystems提供的合成仪)、多肽放大系统等进行合成，或它们可以采用本领域众所周知的技术进行人工合成。参见Geysen等人，J.Immunol.Methods 102：259-274(1978)。
在另一实施方案中，本发明涉及检测与gp105结合的造血调节因子的药盒。该药盒包含本发明的抗体。该药盒也可以包含一个检测标记和一套使用这一药盒的书面说明。这一药盒可以包含接受一个或多个容器(诸如小瓶、管等)的隔间化贮器，这类容器装有本发明的各个成分。
在另一实施方案中，在样品中检测结合gp105的造血调节因子的方法中使用gp105。这一体外分析涉及将怀疑含有结合gp105的造血调节因子的样品与检测标记的gp105接触。然后检测造血调节因子。“样品”是指任何细胞培养基或任何体液或组织，包括血液、尿、唾液、脊髓液、精液、腹膜液和身体各部位的组织。这类分析可能涉及将gp105结合到固体表面上。将生物分子固定在固体表面的许多方法是本领域已知的。例如，固体表面可以是膜(例如硝酸纤维素)、微量滴定板或玻璃珠。结合的分子可以是共价连接或通过非特异性结合非共价连接。将多种化合物连接到各种表面的方式是众所周知的，并在文献中有完整的记录。参见例如Chibata，Immunological Enzyms，HalstedPress(1978)；Cuatvecasos，J.Biol.Chem.245：3059(1970)。
在本发明检测结合gp105的造血调节因子的分析中，gp105通过本领域众所周知的方法进行标记。常用的方法涉及使用放射性同位素，诸如3H、125I、35S、14C或32P等。通过放射自显影完成检测。非放射性标记包括将生物素共价结合到本发明化合物上。然后将生物素结合到抗配体(诸如链霉抗生物素蛋白等)上，后者或者为固有标记的，或者结合到一个信号系统(诸如检测酶、荧光化合物或化学发光化合物等)上。
无需进一步的详细描述，相信本领域技术人员可以使用前述说明，最大程度地利用本发明。
              顺序表(1)一般资料：
(i)申请人：
  (A)姓名：Stemcell Therapeutics，Inc.
  (B)街道：Two Bala Plaza，Suite 300
  (C)城市：Bala Cynwyd
  (D)州：PA
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：19004
(ii)发明题目：BL3造血干细胞上的糖蛋白gp105
(iii)顺序数：1
(iv)相应的地址：
  (A)收信人：Foley & Lardner
  (B)街道：3000 K Street，N.W.，Suite 500
  (C)城市：Washington
  (D)州：D.C.
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：20007-5109
(v)计算机可读形式：
  (A)媒介类型：Floppy磁盘
  (B)计算机：IBMPC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)本申请数据：
  (A)申请号：尚未颁发
  (B)申请日期：
(vii)先前申请数据：
  (A)申请号：US 08/471,188
  (B)申请日期：1995年6月6日
(viii)代理律师/代理人资料：
  (A)姓名：Bent，Stephen A.
  (B)注册号：29，768
  (C)参考/代理机构编号：46074/103/FEIN
(ix)远程通信资料：
  (A)电话：(202)672-5300
  (B)传真机：(202)672-5399
  (C)电传：904136(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)顺序特性：
  (A)长度：410个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1：GAATTCTGAC  ACCTCGTCTG  TGCTCCATTT  GGAAACTCTA  CTAGCTGGGA  TACCCAGACA    60GTCGGAAGAA  GCTTGCTCTG  CTGCTCCCAG  CGCAAGGGCA  GACACGGAAT  GGGAGGCTTA   120AAGGAGAGAA  ATACTGCTGA  GCGTCGCTGG  GCCTGCTGCT  GGGTCTGGGC  TTGCTGCTGG   180GTGGGCTGAG  CTGTTGAACC  TGCTGAGGCT  GTTGGACGGG  TGGGGCCTGC  TTGAGGCTGC   240TGGCCCTGCT  GGGGCTGCTG  GGCCTGCTGA  GCCTGTGGAG  CCTGCTGGGC  CTGCTGGACT   300GTGGCGCCTG  CTGGGCTGCT  GGACCTGTGG  CGCCTGCTGG  GCTGTGGAGT  CTGTGGGGCC   360TGTGGAGCCT  GCGGGCCTGC  TGGGCTTGCT  GGGCCTGCTG  GCTCGGACGT               410

Claims (12)

1.一种基本上由其它蛋白质纯化的N-糖基化糖蛋白，其糖基化分子量为105kDa，存在于BL3细胞表面上，但不存在于选自32D和FDC-P1骨髓母细胞、EL4 T细胞和3T3成纤维细胞的细胞表面，该糖蛋白产生的多克隆抗体特异性地抑制培养物中BL3细胞的生长。
2.抗权利要求1糖蛋白的抗体。
3.权利要求2的抗体，它为单克隆抗体。
4.富集造血干细胞的组合物的制备方法，包括以下步骤：(a)提供结合gp105的抗体，(b)将抗体固定于固相支持体上，使得抗体保留其gp105结合的能力，然后(c)使混合细胞群体与抗体接触(其中所述混合群体含有造血干细胞)，使得所述干细胞粘附于载体上，(d)除去非粘附细胞，藉此富集造血干细胞的群体保持粘附于载体上。
5.制备富集造血干细胞的组合物的药盒，包含抗权利要求1糖蛋白的抗体。
6.权利要求的药盒，还包含使用所述药盒的书面说明。
7.样品中结合权利要求1糖蛋白的造血调节因子的检测方法，包括(a)将怀疑含有所述生长因子的样品与权利要求1糖蛋白接触，其中所述糖蛋白为检测标记的，(b)检测所述生长因子与所述检测标记的糖蛋白的结合。
8.样品中结合权利要求1糖蛋白的造血调节因子的检测药盒，包含权利要求1的糖蛋白。
9.权利要求8的药盒，还包含选自荧光标记、放射性标记和酶标的检测标记。
10.权利要求9的药盒，还包含使用所述药盒的书面说明。
11.分离的DNA分子，它编码相当于权利要求1糖蛋白的非糖基化蛋白。
12.权利要求11的分离的DNA分子，包含核苷酸顺序(SEQ IDNO：1)：GAATTCTGAC  ACCTCGTCTG  TGCTCCATTT  GGAAACTCTA  CTAGCTGGGATACCCAGACA  GTCGGAAGAA  GCTTGCTCTG  CTGCTCCCAG  CGCAAGGGCAGACACGGAAT  GGGAGGCTTA  AAGGAGAGAA  ATACTGCTGA  GCGTCGCTGGGCCTGCTGCT  GGGTCTGGGC  TTGCTGCTGG  GTGGGCTGAG  CTGTTGAACCTGCTGAGGCT  GTTGGACGGG  TGGGGCCTGC  TTGAGGCTGC  TGGGCCTGCTGGGGCTGCTG  GGCCTGCTGA  GCCTGTGGAG  CCTGCTGGGC  CTGCTGGACTGTGGCGCCTG  CTGGGCTGCT  GGACCTGTGG  CGCCTGCTGG  GCTGTGGAGTCTGTGGGGCC  TGTGGAGCCT  GCGGGCCTGC  TGGGCTTGCT  GGGCCTGCTGGCTCGGACGT.
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