CN106137967A - 靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术中的药物制剂领域。公开了一种靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用。本发明将转铁蛋白和富有精氨酸残基的细胞穿透肽分别与脂质体表面聚乙二醇偶联，利用转铁蛋白导向作用改善细胞穿透肽对肿瘤的选择性，发挥细胞穿透肽溶酶体逃逸优势，提高跨血脑屏障能力，促进携载抗肿瘤药物对于脑胶质瘤的治疗。采用导向化合物法和后反应法制备了负载抗肿瘤药物的脑靶向双重修饰脂质体。其中，转铁蛋白和细胞穿透肽的最优密度分别为2％和4％。聚乙二醇分子量为500Da～5000Da，优选2000Da和3400Da。本发明解决了目前脑胶质瘤的治愈难题，本发明的给药系统基本无毒性，制备工艺简单，易于工业化应用。

Description

靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用

技术领域 本发明涉及脂质体给药系统，尤其涉及脑靶向抗肿瘤脂质体给药系统及其制备方法，属于药学中纳米给药系统技术领域。

背景技术 蒽环类药物(Anthracyclines)或蒽环类抗生素(Anthracycline antibiotics)是一类来源于波赛链霉菌青灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)的化疗药物。它们能够治疗的癌症种类比任何其他类型的化疗药物都要多，并且使用它们的化疗目前最有效的抗癌疗法之一；可用于治疗的癌症包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌等。常用的蒽环类药物包括阿霉素、柔红霉素、表阿霉素等。这类药物的主要副作用是心脏毒性，极大程度地限制了它们进一步使用。

脂质体作为新型药物载体，可使抗肿瘤药富集于肿瘤组织，降低毒副作用，减少给药剂量，提高了药物的有效性和安全性。以阿霉素脂质体为例，1995年，在美国和欧洲相继上市，使得阿霉素在临床上的应用有了显著的提高。其明显降低了阿霉素的心脏毒性，在血液中能够维持长时间的有效药物浓度，为药物到达肿瘤部位发挥药效提供了前提。现在上市的阿霉素脂质体主要用于乳腺癌、卡波氏肉和/卵巢癌治疗。由于难以跨越血脑屏障，现在还没有其在脑癌治疗中的应用报道。

为跨越血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，使药物达到脑组织发挥药效，现在大多数研究者采用各种BBB所表达的受体的配体修饰脂质体^[1-4]等给药系统，取得了一定的效果。事实上，BBB上除了表达丰富的受体之外，来源于BBB腔面侧的唾液酸糖蛋白、唾液酸糖脂和类肝素硫酸蛋白聚糖；BBB近腔侧的类肝素硫酸蛋白聚糖和软骨素硫酸蛋白聚糖；以及基底膜侧的类肝素硫酸蛋白聚糖、软骨素硫酸蛋白聚糖和IV型胶原蛋白使得BBB表现出丰富的负电荷，因此利用正电性载药系统与负电BBB作用的吸附介导是一种治疗脑胶质瘤的有效途径。

发现于20世纪中期的细胞穿透肽因富有精氨酸残基，在生理条件下带正电荷，可与细胞表面的阴离子物质发生强烈的相互作用，激活细胞的摄取。二十一世纪，以多聚精氨酸修饰的给药系统如脂质体、胶束以及纳米粒的研究报道也开始涌现^[5，6]。将多聚精氨酸通过PEG-PE偶联到脂质体或胶束表面，能够通过EPR效应增加药物在肿瘤细胞内的浓集^[7，8]，进一步提高了对亚细胞器，如细胞核，线粒体以及溶酶体的靶向性。但遗憾的是，目前为止发明的细胞穿透肽(CPP)均缺乏组织和细胞特异性^[9]，其在穿透肿瘤细胞的同时，对于正常细胞也有促摄取作用，由此造成了对正常组织的损害。为进一步发挥CPP对肿瘤组织的选择性和靶向性，有文献报道^[10]用靶细胞特异性配体如RGD和CPP共同修饰载体系统，利用RGD等对肿瘤的特异性将CPP“带”到肿瘤实现CPP的穿透内化作用。另外，中国专利CN102552929A发明了由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽顺序连接形成可激活细胞穿透肽，利用PSA敏感性发明了一种给药系统，改善了CPP的靶向性。这种双配基修饰脂质体在提高肿瘤靶向特异性方面的优势可见一斑。

我们通过研究BBB和脑胶质瘤的生物学特点，发现BBB和脑肿瘤均高度表达转铁蛋白受体，因此我们采用转铁蛋白Tf为靶向分子，提高细胞穿透肽对靶细胞的选择性。在此之前，J.Singh教授^[11，12]曾经构建了Tf和多聚精氨酸修饰的给药系统，但其研究中的制备工艺等值得商榷。其在制备中采用DSPE-PEG2000-Poly-L-arg通过薄膜法先制备了PR修饰的单靶脂质体，然后和DSPE-PEG-Tf共孵育，通过后插入法制备了双靶脂质体。在其所构建的这种双重修饰脂质体中，Tf的结合率仅有59％，PR的结合率仅有55.6％。这与我们前期研究结果一致(申请号201310701087.0)。在申请的该专利中，我们提出了孵育法的弱势，建议使用后反应法进行蛋白与脂质体的偶联。此外，对于细胞表面，由于存在受体的饱和性，以及利用Tf提高CPP选择性中涉及CPP的最大修饰密度，J.Singh尚没有研究和讨论。而这些因素都是设计一个高效脑靶向给药系统需要考虑的重要因素。

通过体内外详尽的研究，我们发现了一种高效的治疗脑肿瘤的双重修饰给药系统。在其中我们不仅提供了合理的结构及组成，而且优化了配体的修饰密度和制备工艺，在细胞水平和生物药效证实了这种给药系统的优越性和高效性。

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发明内容

本发明的目的之一是将转铁蛋白和富有精氨酸残基短肽应用于制备脑靶向脂质体给药系统；

本发明的目的之二是提供一种制备双重修饰的脂质体给药系统的方法；

本发明的目的之三提供一种最优的双重修饰给药系统的组成和修饰密度，以达到高效低毒治疗脑胶质瘤的目的。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

针对现有的脂质体制剂所存在的不具脑靶向性、不能穿透血脑屏障等缺陷，本发明人通过锐意研究首先发现，转铁蛋白和细胞穿透肽通过合适的偶联方式，以最佳的比例修饰于脂质体，可以实现抗肿瘤药物在治疗脑胶质瘤中高效低毒的目的。在技术上，采用有效的柱分离和体外细胞摄取等研究手段，优化制备工艺和处方，并通过体内实验证实该给药系统的有效性。解决了现有的脂质体制剂不具脑靶向性、不能穿透血脑屏障的技术问题。经制剂学考察，其包封率、粒径符合脂质体用药要求，体外细胞药效和体内脑胶质瘤药效均高于市售阿霉素脂质体，从而完成了本发明。

1.该发明的创新点之一是构建了一种双重修饰的脂质体给药系统。

由于血脑屏障的存在，长期以来限制了药物在脑组织的应用。尽管最近几年，依据血脑屏障上所表达的受体，越来越多的研究者设计了多种受体介导的脑靶向给药系统实现了药物的脑转运，但还没有人关注吸附介导的给药系统在脑组织的应用。

我们根据血脑屏障上所存在的丰富的转铁蛋白受体蛋白和具有负电性的糖蛋白，设计了一种Tf和CPP双重修饰的脂质体给药系统。通过实验证实了这种给药系统不仅有较强的跨BBB能力，而且当其进入肿瘤后，能够进一步发挥CPP的溶酶体逃逸功能，为靶点位于DNA的抗肿瘤药物进入细胞核提供了可能。实现了抗肿瘤药物高效低毒的治疗目的。

2.该发明的创新点之二在于所述双重修饰脂质体的制备工艺和处方构成。

虽然已经有类似我们提出的转铁蛋白和多聚精氨酸修饰脂质体的报道，但处方工艺并不完善，Tf和多聚精氨酸与脂质体的结合率均低于60％，造成给药系统中40％游离转铁蛋白和多聚精氨酸的存在。细胞表面受体的表达具有饱和性，给药系统中过多游离的配体分子会与靶向脂质体竞争与受体结合，造成较低的转运效率以及有可能由此引起免疫原性。因此有必要深入研究制备工艺，提出结合率较高的制备方法，利于双重修饰脂质体的应用。

为了实现Tf提高CPP对肿瘤的选择性的目的，我们用长链PEG偶联Tf，短链PEG偶联CPP，这样，就可以在非靶区域和血液循环中，长链PEG能够有效掩盖CPP对正常组织的穿透效应，而在把靶部位，由于脂质体表面偶联的Tf与Tf-R受体结合，拉进了CPP与细胞的距离，使得CPP的作用能够得以发挥。从而实现了CPP在靶部位的能力的发挥，提高了肿瘤选择性。

考虑到肿瘤细胞和BBB上脑微血管内皮细胞表面所表达的Tf-R的饱和性，我们通过细胞摄取实验和结合率实验优化了Tf在脂质体表面的修饰密度，使其具有最大的转运效率。在此基础上，通过正常细胞和肿瘤细胞的抑制实验，优化了CPP的最佳修饰密度，在此密度下，CPP能够在肿瘤区域发挥最大的穿透作用，而又不被正常组织摄取。

基于上述研究工作，我们发明了简单可行的双重修饰的脂质体的制备工艺和处方，形成了一种制剂形式(混悬剂)的产品。

混悬剂的制备工艺为薄膜水化联用pH梯度法。精确称量适量的大豆磷脂、胆固醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物用CHCl₃充分溶解，在25～35℃水浴下旋转蒸发至形成均匀的脂质薄膜。加入pH4.0酸性缓冲液，涡旋震荡，置于室温下超声。随后加入碱性溶液调节外水相pH至7.5～7.8，形成具有pH梯度的空白脂质体溶液。然后加入阿霉素水溶液，充分搅拌，得到具有蓝色乳光的红色溶液。加入适量巯基化转铁蛋白，室温下孵育12h～24h，该溶液依次过0.8、0.45、0.22μm滤膜除菌得静脉注射液。该法制得脂质体制剂包封率为90％以上，粒径在100nm左右。Tf结合率高于75％，高于文献“后插入法”(仅为59％)，CPP结合率超过90％。

上述抗脑癌药物脂质体处方中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物、巯基化转铁蛋白与大豆磷脂的摩尔比分别为4％，4％和8％，属于方法学创新。该方面研究从未见报道。

上述抗脑癌脂质体制备工艺中小分子CPP采用导向化合物法薄膜水化，大分子Tf采用后反应法，两者结合率均较高，避免了给药系统中游离配体的大量存在。。这种制备方法属于方法学创新，对于其他分子的修饰具有借鉴和指导意义。

3.该发明的创新点之三在于所述双重修饰脂质体具有良好的组织相容性。

由于CPP本身的细胞穿透性和无选择性，其直接偶联于脂质体表面具有一定的溶血性，静脉给药时存在潜在的危险。本发明所述双重修饰脂质体，采用PEG掩盖CPP，使其溶血性明显降低，与普通脂质体无显著差别，适合静脉滴注给药。细胞毒实验也证实了本发明所述的双重修饰的脂质体基本不会造成细胞的凋亡；经长期给药后，裸鼠各器官的HE染色也证明了该系统对正常组织无损伤。上述三个方面的实验说明了所述双重脂质体给药系统的组织相容性，为临床上的安全使用提供了保证。

4.该发明的创新点之四在于所述双重修饰脂质体对于脑胶质瘤的治疗较普通脂质体有更好的优势。

裸鼠脑胶质瘤治疗中，所发明的抗脑癌脂质体抑瘤率高达90％。结果表明，所发明的抗脑胶质瘤双重修饰脂质体制剂具有良好的抗肿瘤药效。

本发明与现有技术相比，创新性在于：

(1)利用转铁蛋白Tf的脑肿瘤靶向性，通过合理设计偶联物和修饰密度，提高细胞穿透肽CPP的肿瘤靶向性。两种配体修饰的脂质体给药系统在治疗脑质瘤方面体现出良好的协同作用。而且在正常组织环境下，Tf通过长链PEG掩盖了CPP的穿透作用，降低了CPP毒性。

(2)在制备方法中，小分子CPP通过短链PEG偶联形成导向化合物，经薄膜水化修饰于脂质体表面，大分子Tf通过后反应法修饰脂质体。该方法中Tf结合率高于75％，CPP结合率高于90％，属首次创新。

(3)在处方工艺中，优化了该给药系统中Tf和CPP修饰的最佳密度，使得其作用得以最大程度发挥，所得到的结果属于首创；

(4)发明了该给药系统在负载蒽醌类药物的制备工艺，该工艺所得到的阿霉素的包封率在90％以上，而且不受CPP密度的影响，避免了CN201310701087.0中所提到的CPP和阿霉素(DOX)的相互作用，从而造成的DOX包封率随着CPP密度增加而下降的现象；

(5)该给药系统不仅可以负载脂溶性药物，而且可以负载蒽醌类弱碱性水溶性药物。所得到的制剂制备工艺简单，原料易得，易于大生产质量控制。

附图说明

附图1 双重修饰脂质体中CPP密度与细胞摄取的关系。通过突变点可知，CPP的最优密度为4％。

附图2 Tf-CPP-SSL与红细胞悬液作用后上清液照片(溶血性评价)，阴性对照组为PBS，阳性对照组为TritonX-100(10％，V/V)。

附图3 Tf-CPP-SSL尾静脉给药6次后，荷瘤裸鼠各组织的HE染色。

附图4 荷瘤裸鼠的生存曲线。

附图5 荷瘤裸鼠给药后的肿瘤照片。

具体实施方式

实施例1 载药双重修饰脂质体的制备工艺

精确称量适量的大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物用CHCl₃充分溶解，在25～35℃水浴下旋转蒸发至形成均匀的脂质薄膜。加入pH4.0酸性缓冲液，涡旋震荡，置于室温下超声。随后加入碱性溶液调节外水相pH至7.5～7.8，形成具有pH梯度的空白脂质体溶液。然后加入阿霉素水溶液，充分搅拌，得到具有蓝色乳光的红色溶液。加入适量巯基化转铁蛋白，室温下孵育12h～24h，该溶液依次过0.8、0.45、0.22μm滤膜除菌得静脉注射液。该法制得阿霉素载药率大于90％，粒径在100nm左右。Tf结合率为75％，CPP结合率超过90％。

其优化处方：

磷脂与胆固醇的比例为1∶1～1∶2(重量比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物比例为100∶4～100∶8(摩尔比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物比例为100∶4(摩尔比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物比例为100∶8(摩尔比)，

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物与巯基化转铁蛋白比例为4∶1～8∶1(摩尔比).

阿霉素与脂材比例为1∶10～1∶20(重量比)

实施例2 制剂中Tf和CPP修饰密度的优化

(一)、Tf修饰脂质体(Tf-SSL)中Tf修饰密度与结合率和细胞摄取的关系

1.实验方法：

制备：按实施例中优化的处方分别精密称量适量的大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物、香豆素-6用CHCl₃充分溶解，37℃水浴旋转蒸发，直至形成一层均匀的脂质薄膜，继续抽真空30min，尽可能除去残留的三氯甲烷。随后加入PBS溶液2mL，涡旋，37℃的水浴中超声30min直至水化完全。精确取适量Tf-SH加入上述溶液，室温下搅拌孵育12h。用PBS溶液定容，得包载香豆素-6的Tf-SSL.

结合率测定：精密吸取上述所制Tf-SSL原液200μL，上样至琼脂糖凝胶SepharoseCL-4B柱(d＝2.2cm，H＝21.0cm)，使用PBS缓冲液洗脱，洗脱液流速为2ml/min，每0.5mL收集一管，共收集60管。每管中取出20μL到96孔板中，加入200μL Bradford试剂，轻轻摇匀后室温震荡30min，让其充分反应。以Bradford溶液为空白对照，于波长580nm处测定吸光度A。代入Tf浓度测定标准曲线求得各管中的转铁蛋白浓度cTf，换算成Tf质量。

根据下式计算结合率(ce)：

$\mathrm{ce}=\frac{\underset{i=1}{\overset{A}{\mathrm{\Σ}}}{c}_{\mathrm{Tf}-\mathrm{SSL},i}\·V_{\mathrm{Tf}-\mathrm{SSL},i}}{c_{\mathrm{mix},j}\·V_{\mathrm{mix},j}}\×100\%$

其中，cTf-SSL，cTf，VTf-SSL，VTf分别为洗脱液Tf-SSL、游离Tf部分各收集管中Tf的浓度和体积(0.5mL)，cmix，Vmix为制备的Tf-SSL原液的浓度和上样体积(200μL)，n为稀释倍数。

细胞摄取率测定：取对数生长期的C6细胞，消化后以每孔106个细胞的浓度(六孔板中培养液体积为2mL)接种于六孔板中，置于含5％CO2、相对湿度为90％的37℃恒温培养箱中培养。24h后细胞均匀贴壁生长，吸出培养液，用PBS清洗三遍，随后加入上述含有coumarin-6-x％Tf-SSL的培养基，于恒温培养箱中孵育2h。4℃的PBS终止细胞摄取。加入细胞消化液消化，待细胞开始脱落于瓶壁时加入培养液终止消化，用弯头滴管轻轻吹打细胞至形成单细胞悬液。1000rpm下离心5min，移除上清液，加入PBS轻轻吹打使细胞重悬，再次离心，反复三次。最后用0.5mL的PBS重悬细胞，过300目的细胞筛后用流式细胞仪(BDBiosciences，San Jose，CA，USA，给出检测波长)检测。每次分析所收集的细胞数为10000个。

2.实验结果和结论：

不同Tf修饰密度的脂质体中Tf与脂质体的结合率和细胞摄取率的结果如表1所示。

表1.不同Tf修饰密度(X％)的脂质体中Tf与脂质体的结合率(ce)和细胞摄取率(uptake ratio)

由表中数据可以看出，Tf密度增加，结合率降低，但程度并不显著，修饰密度为2％时，结合率为75％，高于文献报道59％。细胞摄取率随Tf密度增加而增加，当达到2％时，基本上摄取率达到最大值。经过SPSS软件中最小二乘法对摄取比和结合率进行相关性分析，得到Tf修饰最佳密度为1.8％。

【结论】：Tf修饰密度显著影响结合率和细胞摄取，为实现最优转运效率，双重修饰脂质体中Tf最优密度为2％。

(二)、CPP修饰密度的优化

双重修饰脂质体是一种具有高转运效率的药物载体。本文为实现脑胶质瘤的治疗，构建以Tf和CPP双配基修饰的脂质体，其中用长链PEG偶联具有靶BBB和肿瘤的Tf，用短链PEG偶联CPP。期望通过Tf的靶向能力，提高CPP对肿瘤的穿透能力和内化能力。并且在正常体循环中，长链PEG3400发挥“掩盖”保护作用，避免CPP对正常细胞的穿透。目前对于这种双靶向脂质体的研究还处在功能性评价阶段，尚没有两个配基的密度优化的研究报道。在双靶向给药系统中为获得CPP最佳修饰密度，需要满足两个条件：(1)在体循环中，CPP能够被PEG所掩盖，避免被正常组织的摄取；(2)在肿瘤部位，能够最大发挥CPP的细胞穿透性。因此我们将从这两个方面入手，探讨双靶向给药系统中CPP的最佳修饰密度。

1.实验方法：

分别制备直接偶联于脂质体表面的CPP-SSL(I)和以双靶脂质体PEG组成和密度一致的CPP-SSL(II)。称取适量的大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物，、香豆素-6用CHCl₃充分溶解，涡旋混匀，置于旋转蒸发仪上，于37℃水浴条件下将有机溶剂旋干，直至在茄形瓶底部形成均匀的脂质薄膜，再持续抽真空30min，除去残存的有机溶剂。然后向茄形瓶中加入适量的PBS溶液，涡旋震荡，37℃的水浴中超声30min直至水化完全，即得CPP-SSL(I)。在处方中加入如本实施例(一)中相同量的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物，采用如上方法制备CPP-SSL(II)。

如本实施例(一)中所述细胞摄取法测定不同CPP修饰密度的CPP-SSL(I)和CPP-SSL(II)在脑胶质瘤c6细胞的摄取率。

2.实验结果和结论：

CPP-SSL(I)和CPP-SSL(II)中不同CPP修饰密度与相应的细胞摄取Coumarin-6后的荧光强度如附图1所示。从结果中可以看出，CPP-SSL(I)中CPP暴露于脂质体表面，C6细胞对Coumarin-6的摄取能力随着CPP修饰密度的增加而增加，CPP修饰密度在0mol％～8mol％范围内，没有出现饱和。而对于有长链PEG存在的CPP-SSL(II)，在低密度下，C6细胞摄取率随CPP密度增加，无显著变化，直到当CPP密度达到4％时，细胞摄取率出现明显增加。说明PEG能够掩盖的最大CPP修饰密度为4％。

【结论】根据优化CPP密度的标准，在双重修饰脂质体中，CPP的最佳修饰密度为4％。

实施例3 双重修饰脂质体的性质和组织相容性

1.实验方法：

(1)基本性质：按实施例1制备双重修饰脂质体，采用G50柱分离法测定阿霉素包封率，采用Zetasizer Nano ZS动态光散射仪分别测定粒径、粒子的多分散系数PDI和Zeta电位。

(2)溶血性：按实施例1和实施例2制备SSL、Tf-SSL和Tf-CPP-SSL。用PBS将各组脂质体混悬液稀释成磷脂SPC浓度分别为50、100、200、400、600、800μmol/L的脂质体混悬液。将脂质体混悬液加入到等体积红细胞悬液中，37℃下孵育60min。以PBS和TritonX-100(10％，V/V)为阴性和阳性对照。样品于2000rpm下离心15min，取上清液在540nm处测定吸光度A，计算溶血百分数，以溶血百分数小于10％为无溶血性。

(3)载体细胞毒：将融合达到90％的C6细胞消化后，计数，按10⁴cells/孔的密度接种于96孔板中，每孔200μL。将96孔板置于相对湿度为90％、5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h后，移去培养液，加入200μL上述受试药液，平行重复六次，继续培养24h。取出96板，吸出收试培养液，使用PBS轻轻漂洗三次，随后向每孔中加入50μL的50％TCA溶液，4℃下固定1h后移除TCA。使用PBS清洗5遍后在37℃下烘干。随后向每孔中加入100μL 0.4％SRB的1％醋酸溶液，室温染色30min，移除SRB，用1％的醋酸溶液清洗5遍，于37℃下烘干。每孔加入200μL浓度为10mM的Tris缓冲液，37℃震荡30min后在540nm处测定溶液的吸光值(OD值)。按照如下公式计算细胞存活率：

其中，ODtest为实验组的吸光度，ODcontrol为阴性对照组的吸光度。以细胞存活率SR％对DOX浓度作图，使用SPSS软件计算不同制剂的IC₅₀(μg·mL^-1)。

(4)组织的HE染色：荷瘤裸鼠药效试验结束后，处死，瘤体剥离后取材，迅速固定于福尔马林中，将标本用石蜡包埋，制成蜡块常温保存。用组织切片机将包埋好的蜡块切成厚度为4μm的切片，做HE染色。

2.实验结果和结论：

基本性质：所制备的双重修饰脂质体的粒径为110nm，多分散系数小于0.25。Zeta电位为-25mv。

溶血性质：以生理盐水为阴性对照，TritonX-100为阳性对照，Tf-CPP-SSL溶血性结果如附图2所示。以10％的溶血百分数为无毒的评价标准，Tf-CPP-SSL的安全使用浓度为374μmol/L。阿霉素脂质体的临床注射剂量为1.2-2.4mg·kg-1其中阿霉素和磷脂的质量比为1∶10，而人体血容量为86mL·kg^-1。因此，实际的临床使用过程中，磷脂在血液中的浓度为186～372μmol/L(静脉推注)，若为静脉滴注，其在血液中被稀释，浓度将进一步降低，因此Tf-CPP-SSL在静脉中不易造成溶血，可以用作临床使用。

细胞毒评价：SSL，Tf-SSL，Tf-CPP-SSL与C6共孵育，未见明显细胞凋亡。当磷脂浓度高于800ug/ml时，细胞存活率高于90％。

HE染色Tf-CPP-SSL尾静脉给药6次后，荷瘤裸鼠各组织的HE染色如附图3。未见明显的组织损伤。

【结论】Tf-CPP-SSL无溶血性、无正常组织细胞损伤，临床上用于静脉滴注具有一定的安全性。

实施例4 载阿霉素双重修饰脂质体治疗脑胶质瘤的药效

采用脑立体定位仪对裸鼠脑部非功能区进行定位，注射高浓度C6细胞悬液制备裸鼠脑胶质瘤原位模型。动物造模后均匀分组，以生理盐水、阿霉素长循环脂质体和转铁蛋白单配体修饰脂质体为对照，考察Tf-CPP-SSL(DOX)的抗脑胶质瘤药效。

1.实验方法：

制备Nu/Nu裸鼠脑胶质瘤模型，肿瘤动物模型均匀分四组。每组6只。造模15天后，尾静脉注射给药，给药剂量为5mg DOX·kg-1，隔两天给药一次，即每三天给药一次，共给药6次。肿瘤模型裸鼠2只于一鼠笼中，自由进食。隔天称取体重，并观察模型动物生存状态，每天称量动物体重、记录存活数。

药效考察期间死亡大鼠，剥离脑部肿瘤，精确称量肿瘤重量，同时精确测量肿瘤横纵长度；给药6次后继续喂养三天，将尚存活的大鼠脱颈处死，剥离脑部肿瘤，精确测量肿瘤横纵长度。并根据下述公式计算相对肿瘤体积：

V＝length(cm)×width(cm²)×0.5236

药效学采取生存率、抑瘤率进行评价，相应计算公式如下：

大鼠脑肿瘤模型生存率(survival ratio％)的计算方法：

$\mathrm{survival\; ratio}\%=\frac{\mathrm{number}\left(t\right)}{\mathrm{number}\left(0\right)}\×100\%$

Number(t)为第t天尚存活大鼠数量，Number(0)为给药起始时大鼠数量

抑瘤率(Inhibit tummor ratio％)：

$\mathrm{IT}\%=[1-\frac{V\left(\mathrm{test}\right)}{V\left(\mathrm{NS}\right)}]\×100\%$

V(test)为测试组平均肿瘤体积(mm3)，V(NS)为NS组平均肿瘤体积(mm3)。IT％表示为抑制肿瘤生长的比率，IT％值越大，表明抑制肿瘤生长越明显。

(2)实验结果和结论：

裸鼠生存率曲线如附图4所示，由结果可知，各组动物在给药期间均有出现死亡现象，生理盐水组存活时间最短，给药后的第12d，裸鼠全部死亡；SSL组的存活时间已有明显增加，直到给药后的第15d，裸鼠全部死亡；Tf-SSL组的存活时间再次增加，直到给药后的第18d，裸鼠全部死亡；而Tf-CPP-SSL组的存活时间最长，到实验结束的第18d时，存活率依旧高达66.67％。给药18天内，存活率由大至小的顺序为Tf-CPP-SSL＞Tf-SSL＞SSL＞NS。荷瘤裸鼠尾静脉给药后肿瘤的图片如附5所示。

荷瘤裸鼠尾静脉给药后的抑瘤率和日均肿瘤增长比率结果列入表2.

表2各组肿瘤体积和抑瘤率(n＝6)

从上述结果可以看出，市售普通SSL(DOX)抑瘤率仅为22％，肿瘤体积与NS无显著性差异，几乎没有药效。Tf-SSL提高了DOX向肿瘤的转运，Tf-CPP-SSL进一步使得药效提高，抑瘤率达到91％，体现了双重修饰脂质体治疗脑胶质瘤的极大潜力。

【结论】体内研究结果表明，Tf-CPP-SSL(DOX)的药效优于Tf-SSL(DOX)和SSL(DOX)，体现了Tf和CPP的协同作用。Tf-CPP-SSL有利于提高阿霉素等抗癌药物抗脑胶质瘤药效，是一种具有前景的抗脑癌新型给药系统。

Claims (8)

1.一种双重修饰脂质体给药系统，包括脂质体和配体成分；所述脂质体包含磷脂、胆固醇以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-复合物；所述配体含有富有精氨酸残基短肽和转铁蛋白。

2.按权利要求1所述的双重修饰脂质体，其特征在于：转铁蛋白通过长链PEG偶联于脂质体表面，富有精氨酸残基短肽CPP通过短链PEG偶联于脂质体表面。

3.按权利2所述给药系统的组成，其特征在于所述长链聚乙二醇分子量为2000Da～5000Da，优选3400Da。短链聚乙二醇分子量为0Da～2000Da，优选2000Da。

4.按权利要求1所述的给药系统，其特征在于：磷脂选自天然、半合成、全合成磷脂及其衍生物。优选的方案是所述磷脂选自但并不限于下述的大豆卵磷脂(SPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、多烯磷脂酰胆碱、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂(HSPC)、氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、全合成磷脂，如C3至C30的各种合成磷脂，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(钠盐DSPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(钠盐DPPG)、L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(钠盐DMPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、双二硬脂酰磷脂酰甘油(钠盐)、双二棕榈酰磷脂酰甘油(钠盐)、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(钠盐)、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰有酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱。

5.按权利要求1中所述的给药系统，其特征在于，包括胆固醇及其衍生物(如胆固醇半琥珀酸酯)和谷甾醇。

6.按权利要求1中所述的给药系统，所装载药物为抗肿瘤药物，包括蒽醌类抗生素盐酸阿霉素、阿霉素、表阿霉素、柔红霉素，铂类药物，如卡铂、草酸铂、依铂、乙酸铂、顺铂，环磷酰胺、放线菌素、博来霉素、正定霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡氮芥(BCNU)、甲基-CCNU、鬼臼乙叉苷、依托泊苷、干扰素、喜树碱及各种衍生物、苯芥胆甾醇、紫杉酚(Taxol)及其衍生物、多西他赛及其衍生物、长春碱、长春新碱、长春瑞滨及其衍生物、三苯氧胺、哌酰硫烷、四环三萜类化合物等。

7.一种治疗脑肿瘤的双重修饰脂质体的制备方法，其特征在于：称取适量的大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物用CHCl₃充分溶解，在25～35℃水浴下旋转蒸发至形成均匀的脂质薄膜。加入pH4.0酸性缓冲液，涡旋震荡，置于室温下超声。随后加入碱性溶液调节外水相pH至7.5～7.8，形成具有pH梯度的空白脂质体溶液。然后加入抗肿瘤药物水溶液，充分搅拌。加入适量巯基化转铁蛋白，室温下孵育12h～24h，该溶液依次过0.8、0.45、0.22μm滤膜除菌得静脉注射液。

8.一种治疗脑肿瘤的双重修饰脂质体的优化处方：

磷脂与胆固醇的比例为1∶1～1∶2(重量比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物比例为100∶4～100∶8(摩尔比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-CPP复合物比例为100∶4(摩尔比)，

磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物比例为100∶8(摩尔比)，

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物与巯基化转铁蛋白比例为4∶1～8∶1(摩尔比).

抗肿瘤药物与脂材比例为1∶10～1∶50(重量比)。