CN109734780B - 一种穿膜肽及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种穿膜肽及其制备方法和用途。一种穿膜肽，所述穿膜肽的氨基酸序列为：Arg‑Arg‑Leu‑Ser‑Tyr‑Thr‑Lys‑Lys‑Lys‑Trp‑Trp‑Pro。该穿膜肽无生理毒性，可与红霉素以非共价作用相互结合，高效介导红霉素穿过血脑屏障。

Description

一种穿膜肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种穿膜肽及其制备方法和用途。
背景技术
红霉素为大环内酯类抗生素，对革兰阳性菌：葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、溶血性链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等有较强的抑制作用。红霉素的作用机制是与病菌核糖核蛋白体的50S亚单位相结合，从而抑制肽酰基转移酶，继而影响核糖核蛋白体的移位过程，抑制细菌蛋白质的合成，实现细菌抑制。尽管红霉素是当前一线的抗生素，但是其难以通过血脑屏障，严重影响了其在脑部疾病治疗中的应用。
发明内容
本发明提供一种穿膜肽，以解决现有技术中红霉素难以透过血脑屏障的问题。本发明还提供了所述穿膜肽的制备方法和应用。本发明进一步提供了一种包括红霉素和所述穿膜肽的红霉素复合物，该红霉素复合物的制备方法，以及所述红霉素复合物的用途。
本发明的穿膜肽采用如下技术方案：一种穿膜肽，所述穿膜肽的氨基酸序列为：Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Thr-Lys-Lys-Lys-Trp-Trp-Pro。
优选的，所述穿膜肽可介导红霉素透过血脑屏障。
如上所述的穿膜肽的制备方法，采用多肽固相合成法合成。
如上所述的穿膜肽在介导红霉素透过血脑屏障中的应用。
一种红霉素复合物，包括红霉素和穿膜肽，所述穿膜肽的氨基酸序列为：Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Thr-Lys-Lys-Lys-Trp-Trp-Pro。
优选的，所述红霉素与穿膜肽通过非共价键连接。
如上所述的红霉素复合物的制备方法，使红霉素与所述穿膜肽在生理盐水中共孵育。
优选的，使红霉素与所述穿膜肽在生理盐水中共孵育30min。
如上所述的红霉素复合物在制备抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的穿膜肽无生理毒性，可与红霉素以非共价作用相互结合，高效介导红霉素穿过血脑屏障。
所述穿膜肽可采用多肽固相合成技术来制备，技术成熟，便于生产和推广。
本发明的穿膜肽可用于制备红霉素与所述穿膜肽的复合物，进而起到扩大红霉素使用范围，使红霉素可用于治疗脑部疾病。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：穿膜肽合成
1)活化树脂：称取1500mg Fmoc-Pro wang Resin，加入25mL DMF浸泡10min，使其充分溶胀。
2)脱保护：抽滤除去浸泡树脂的DMF，加入含20％哌啶的25mL DMF溶液，氮气吹沸25min，然后抽滤除去，用25mL异丙醇和DMF交替洗涤树脂三次，而后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。
3)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取1.4mmol/g树脂的Fmoc-氨基酸，以910mgTBTU，0.45g HOBt和0.52ml DIEA的25mL DMF为反应液，室温下氮气吹沸反应3h。反应完毕后，用25mL异丙醇和DMF交替洗涤树脂三次。检测氨基。
4)重复步骤2)-3)过程：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽(依次为Pro、Trp、Trp、Lys、Lys、Lys、Thr、Tyr、Ser、Leu、Arg和Arg)。
5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按TFA(三氟乙酸)/phenol/超纯水/thioanisole/EDT/TIS(80/5/5/5/3/2)的比例(体积比)配成25mL混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2小时，除去树脂后滤液直接滴入冷冻乙醚中，6000r/min离心沉淀，冻干至恒重即得粗肽。
6)粗肽用HPLC纯化。质谱鉴定所制得的穿膜肽序列为Arg Arg Leu Ser Tyr ThrLys Lys Lys Trp Trp Pro(N端到C端)
实施例2：细胞毒性实验
1)取96孔板，每孔加入含有7×103个宫颈癌Hela细胞培养液，37℃，5％二氧化碳培养箱36小时，使细胞贴壁。
2)配置含1mM浓度的穿膜肽的培养基，以无穿膜肽的培养基为阴性对照孔(Control)，37℃，5％二氧化碳培养48h。
3)贴壁细胞每孔加入20μl MTT，继续孵育2h之后弃掉培养液，每孔加入150μlDMSO，震荡15min。
4)选择490nm波长，在酶标仪免疫检测仪上通过光吸收值计算细胞存活率。
表1.穿膜肽毒性测试
Figure BDA0001949472220000041
由表1可知，本发明的穿膜肽在高浓度(1mM)、长时间(48h)条件下对细胞未有明显伤害，穿膜肽无明显生理毒性。
实施实例3：介导红霉素递送实验
1)红霉素复合物的制备：加入含有5微克/毫升红霉素和0.1mM穿膜肽在生理盐水中共孵育30min；
2)验证所得到的红霉素复合物的性能：
实验组：在小鼠尾静脉注射0.1毫升步骤1)得到的红霉素复合物
对照组：在小鼠尾静脉注射0.1毫升仅含有5微克/毫升红霉素的生理盐水。
3)注射5min后杀小鼠取脑组织，脑组织冷冻后匀浆，使用甲醇对脑组织中的红霉素进行提取。
4)HPLC测定脑组织提取液红霉素浓度。以对照组含量为参比(100％)
表2.穿膜肽介导穿透血脑屏障测试
Figure BDA0001949472220000051
由表2可知，本发明的穿膜肽能够高效介导红霉素透过血脑屏障，其相应红霉素相对浓度较对照组提高100倍以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种穿膜肽及其制备方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Arg Leu Ser Tyr Thr Lys Lys Lys Trp Trp Pro
1 5 10

Claims (7)

1.一 种 穿 膜 肽 ， 其 特 征 在 于 ， 所 述 穿 膜 肽 的 氨 基 酸 序 列 为 ：
Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Thr-Lys- Lys - Lys -Trp-Trp-Pro。
2.一种如权利要求 1 所述的穿膜肽的制备方法，其特征在于，采用多肽固相合成法合成。
3.一种红霉素复合物，其特征在于，包括红霉素和穿膜肽，所述穿膜肽的氨基酸序列为：Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Thr-Lys- Lys - Lys -Trp-Trp-Pro。
4.根据权利要求 3 所述的红霉素复合物，其特征在于，所述红霉素与穿膜肽通过非共价键连接。
5.一种如权利要求 3 或4 所述的红霉素复合物的制备方法，其特征在于，使红霉素与所述穿膜肽在生理盐水中共孵育。
6.一种如权利 3 或 4 所述的红霉素复合物的制备方法，其特征在于，使红霉素与所述穿膜肽在生理盐水中共孵育 30min。
7.根据权利要求 3 所述的红霉素复合物在制备抗菌药物中的应用。
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