CN107823652A - 一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途，长循环自组装复合纳米粒制剂，包括聚乙交酯丙交酯、两性阳离子材料、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇、磷脂、递送靶头聚合多肽H7K(R2)2及肝癌衍生生长因子小干扰RNA；粒径为50‑200 nm；其中，采用聚乙交酯丙交酯（PLGA）作为疏水性刚性内核，包裹HDGF siRNA，磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇（DSPE‑PEG）相互交叉分布在PLGA的表面，并对纳米粒表面进行多肽H7K(R2)2、聚乙二醇修饰。本发明可以制成溶液剂、冻干剂通过静脉注射方式给药。具有脑胶质瘤的靶向性，且制备工艺简单、反应条件温和、易于操作。

Description

一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途
技术领域
本发明属于药物制剂领域。具体涉及递送肝癌衍生生长因子小干扰RNA的长循环自组装复合纳米粒制剂，及其制备方法及应用。
技术背景
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，发生于神经外胚层，约占颅内肿瘤的30％-60％，其具有“发病率高、复发率高、死亡率高、治愈率低”的三高一低的特点。国际流行病学统计资料显示，胶质瘤的发病率居各种肿瘤的第9位。目前胶质瘤仍缺乏有效治疗且预后差，死亡率呈逐年上升趋势，快速侵袭性生长是造成这一状况的根本因素。临床上即便采取了最大程度切除肿瘤并联合放疗、化疗及免疫治疗等多种综合治疗措施，恶性胶质瘤患者的平均生存期也仅为15个月左右。因此抑制胶质瘤在脑内的侵袭对延长患者的生存期和提高患者生存质量具有重要的科学和社会意义。
由于神经胶质瘤的浸润性生长及特殊的脑部生长位置，化疗药物成了重要的手术辅助治疗药物。美国FDA先后批准可口服新药替莫唑胺(TMZ)和注射用药贝伐单抗作为治疗胶质瘤的标准药物，但由于TMZ极易产生耐药作用，而贝伐单抗毒性较大，会损伤生殖功能，故在临床上的应用都受到一定限制。基于此，基因治疗近年来成为了胶质瘤治疗的研究热点。
Rechard于1992年首次提出胶质瘤的“分子外科治疗”，即胶质瘤的基因治疗。目前研究最多的基因治疗方案有自杀基因、反义癌基因、抑癌基因、免疫基因、抗肿瘤血管基因治疗等。基因治疗的有效性在实验动物体内已得到证实，但还未正式应用到临床治疗胶质瘤。胶质瘤的发生发展复杂多变，涉及多个基因在不同阶段的不同参与，因此很多学者通过着眼于肿瘤分子水平的分子标志物来判定胶质瘤分级及发展程度，比如鼠类肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRas)，血小板衍生因子(Platelet derivedgrowth factor，PDGF)，视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Retinoblastoma，RB)，p53肿瘤抑制蛋白(Tumor suppressor gene，Tp53)，增殖细胞核抗原(Proliferating Cell NuclearAntigen，PCNA)，这些分子水平的改变直接对应了肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管生成等一系列生物学行为。通过分子水平的改变，对应改变不同的基因治疗靶点和治疗方式，所以找出有效的靶基因是基因治疗能达到理想效果的关键。
癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)是从人肝癌细胞系HuH-7培养液中分离出的一种酸性肝素结合蛋白。大量研究表明HDGF在包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤中高表达，表达水平与肿瘤分期、分级及肿瘤坏死程度成正相关，具有促进细胞增殖、促进血管生成等多种生理作用，与肿瘤预后密切相关，并可作为一个独立的预后检测因素。研究证实，以HDGF做为胶质瘤的治疗靶点，可以改善胶质瘤的预后，提高病人生存质量，是胶质瘤治疗的一个新策略。
研究指出，小RNA干扰(RNAi)技术特异性下调HDGF可以显著抑制U87的恶性表型，包括U87细胞体外集落形成、迁移、侵袭以及体内肿瘤血管生成等。因此初步判定，特异性稳定下调U87、U251细胞HDGF的表达，可以抑制细胞的侵袭、迁移性生长及肿瘤血管生成，U251、U87细胞中的细胞周期素(CCND1)、c-myc癌基因和转化生长因子-β(TGF-β)均被下调。因此，HDGF小RNA干扰具有特异性抑制胶质瘤的作用。
但由于siRNA与一般化合物相比，具有分子量大、亲水性强，不稳定、荷负电且易于被核酸酶降解破坏的性质，目前，siRNA导入细胞的方法有：裸D NA注射法，磷酸钙介导、电转移法、阳离子脂质体法及病毒导入法等。但这些方法存在着:(1)靶向特异性差；(2)转染效率太低；(3)具有较强的免疫原性，容易被机体的免疫系统识别与清除的问题。因此制备需要一个安全有效的纳米载体系统高效递送HDGF小RNA到达肿瘤部位十分有必要。2012年(Biomaterals33(2012)2508-2520)，Ke-FuYu等采用薄膜水化法制备了紫杉醇(PTX)的pH敏感聚合物胶束，采用的原料是：PLGA-PEG-NHS(H7K(R2)2)、PLGA-PEG、琥珀酸酯(TPGS)，采用的油相和水相的溶剂是N-N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇，著者将其靶向右肢腋下的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)人乳腺癌细胞(MCF-7)；2015年，YangZhao等(Journal ofChinesePharmaceutical Science p660)，采用薄膜水化法制备了Coumarin-6-PSL-H7K(R2)2，采用的原料是DSPE-PEG-NHS(DSPE-PEG-H7K(R2)2)、二油脂磷脂酰乙酰胺(DOPE)、半琥珀酸胆固醇(CHEMS)，采用的油相和水相的溶剂分别是氯仿，乙醇，著者将其靶向U87恶性胶质瘤细胞探究靶头构像变化及用量，采用的靶头载药量是2.5％；2016年，Xuan Zhang等)(Journalof Controlled Release 222(2016)56–66)采用薄膜水化法制备了阿霉素的pH敏感脂质体，采用的原料是DSPE-PEG--NHS(H7K(R2)2)、DSPE-PEG、二油脂磷脂酰乙酰胺(DOPE)半琥珀酸胆固醇(CHEMS)，著者将其靶向C6皮下瘤，U87原位脑胶质瘤以递送抗肿瘤化疗药，采用的靶头载药量未明确给出,且采用的溶剂是氯仿，不够环保。
Zhu等研究人员设计开发的,小干扰RNA的长循环自组装复合纳米粒由聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇修饰的的脂质、两性阳离子材料、卵磷脂及iRNA组成，其采用的制备方法是：将聚乙交酯丙交酯、两性阳离子材料在丙酮中混合，后加入iRNA水溶液后匀速搅拌一定时间，形成聚乙交酯丙交酯/两性阳离子材料/iRNA固体内核丙酮有机相；将一定量聚乙二醇修饰的脂质、卵磷脂分散于水相，后一边搅拌一边将有机相缓慢滴加到水相，形成自组装核壳型纳米粒，所得纳米粒可以将iRNA靶向递送至非小细胞肺癌细胞，特异性沉默Prohibitin1蛋白，治疗小细胞肺癌(Proceedings of the National Academy ofSciences 2015；112:7779-7784.)。然而，HDGF的siRNA其主要的作用在于特异性抑制脑部胶质瘤，脑靶向递送iRNA，存在的重要难点是血脑屏障的存在。血脑屏障具有物质通过选择性阻碍作用，例如亲水性物质、大分子物质、与血浆蛋白结合物质不易透过血脑屏障，因此，采用现有的纳米粒制备技术制备的iRNA长循环自组装复合纳米粒无法有效的将iRNA递送进入脑肿瘤细胞，而起到治疗胶质瘤的作用。
发明内容
发明目的:为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种递送肝癌衍生生长因子小干扰RNA的长循环自组装复合纳米粒制剂，对纳米粒进行多肽H7K(R2)2修饰，使纳米粒具有特异性靶向肿瘤细胞，尤其是胶质瘤细胞的酸性微环境和穿膜肽作用，能安全、有效的将肝癌衍生生长因子小干扰RNA靶向递送到脑部肿瘤部位的纳米载体系统，有效抑制胶质瘤的迁移、侵袭等预后恶性表型，起到治疗脑胶质瘤的作用，为胶质瘤的临床治疗提供一种新剂型。
本发明的另一个目的在于提供一种递送肝癌衍生生长因子小干扰RNA的长循环自组装复合纳米粒制剂的制备方法，工艺简单、反应条件温和、易于操作。
本发明的再一个目的在于提供一种递送肝癌衍生生长因子小干扰RNA的长循环自组装复合纳米粒制剂的制备靶向脑肿瘤细胞的用途。
技术方案:为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种长循环自组装复合纳米粒制剂，包括聚乙交酯丙交酯、两性阳离子材料、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂、递送靶头聚合多肽H7K(R2)2及肝癌衍生生长因子小干扰RNA；粒径为50-200nm。
其中，采用聚乙交酯丙交酯(PLGA)作为疏水性刚性内核，包裹HDGF siRNA，磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)相互交叉分布在PLGA的表面，并对纳米粒表面进行多肽H7K(R2)2修饰。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇含量为1％～20％；
靶头聚合多肽H7K(R2)2含量为0.1％～5％；但用于递送RNAi至脑肿瘤细胞，因为U251原位脑胶质瘤(U251与U87相比侵袭性极强，则靶头聚合多肽H7K(R2)2的用量至关重要，用量少无法达到有效的穿膜效果，过多则可能影响粒子稳定性。
所述的聚乙交酯丙交酯含量10％～80％；聚乙交酯丙交酯嵌段的数均分子量Mn为1.5万～5.5万，其中，聚丙交酯：聚乙交酯的摩尔比为85:15～50:50，较佳地聚丙交酯：聚乙交酯的摩尔比为75:25，在该比例时所得纳米粒粒径最小。
两性阳离子材料含量为1％～30％；两性阳离子材料为聚乙烯亚胺-环氧烷类，具体而言，聚乙烯亚胺-环氧烷类两性阳离子材料是聚乙烯亚胺-环氧十二烷或者聚乙烯亚胺-环氧十四烷，因前者碳链更短，故毒性也更小，且所形成的粒子粒径更小，故前者效果更佳。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为乳酸/羟基乙酸共聚物-聚乙二醇。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇可以带有羟基、琥珀酰亚胺基团；其中，所述的聚乙二醇嵌段的数均分子量Mn为400～10000。
递送肝癌衍生生长因子siRNA含量为0.1nmol～2.5nmol；
磷脂含量为1％～10％；磷脂为大豆磷脂、卵磷脂。
复合纳米粒制剂的制备方法，步骤如下：
(1)将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和聚合多肽H7K(R2)2制备得到携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；
(2)将两性阳离子材料、递送肝癌衍生生长因子siRNA及聚乙交酯丙交酯制备形成聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物；
(3)将聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物与磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、及携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合，制备得到自组装复合纳米粒。
具体而言：聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物的制备方法是：将聚乙交酯丙交酯(PLGA)、PEI-C12的丙酮溶液加入到丙酮中，搅拌均匀后，加入DEPC水溶解的HDGF siRNA搅拌获得PEI-C12/HDGF siRNA类脂复合物。
纳米粒的制备过程是：将类脂复合物(丙酮相)加入到水相中，搅拌后，获得纳米粒，水相是大豆磷脂、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-H7K(R2)2的水溶液。
本申请制备长循环自组装复合纳米粒制剂首次将靶头H7K(R2)2应用到递送目的基因siRNAHDGF，靶向U251原位脑胶质瘤(U251与U87相比，其最明显特点是侵袭性极强)。可以制成溶液剂、冻干剂，通过静脉注射方式给药。具有能安全、有效的将肝癌衍生生长因子小干扰RNA靶向递送到脑部肿瘤部位的纳米载体系统，起到治疗脑胶质瘤的作用。
有益效果：
(1)对纳米粒进行多肽H7K(R2)2修饰，聚合多肽H7K(R2)2为具有pH响应性穿膜肽，使纳米粒具有特异性靶向肿瘤细胞，尤其是胶质瘤细胞的酸性微环境和穿膜肽作用。
(2)采用聚乙交酯丙交酯(PLGA)作为疏水性刚性内核，保证了纳米粒的结构稳定性，且对HDGF siRNA具有有效的保护作用；
(3)用聚乙二醇(PEG)修饰纳米粒子，增强了纳米粒的亲水性，保证其在体内的长循环作用(原理见图8所示)。
(4)磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)相互交叉分布在PLGA表面，磷脂降低了粒子生物毒性，又使粒子有效避免免疫系统降低RES对粒子的识别与清除，增加粒子半衰期。
总之，本发明获得的纳米粒子粒径适中，形态规整，产量高，通过静脉注射给药后，经血液循环途径，将HDGF siRNA直接靶向作用于肿瘤部位，由于材料的体积和安全性优势，在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长包裹HDGF siRNA的粒子在血液循环系统中的停留时间。
附图说明
图1为递送HDGF siRNA的长循环自组装复合纳米粒NPs、PSNPs的制备原料的种类的筛选(图1A为聚乙交酯丙交酯类型，图1B为采用不同材料实施例时最佳粒径大小展示，及粒子稳定性考察(图1C)，图1D为靶头含量筛选结果。
图2是有脑神经胶质瘤非靶向(A)、靶向(B)功能的包含HDGF siRNA自组装复合纳米粒的粒度检测结果-光强粒度多峰分布柱形图。
图3为脑神经胶质瘤非靶向(A)、靶向(B)功能的包含HDGF siRNA自组装复合纳米粒的透射电镜照片。
图4为实施例3的脑神经胶质瘤靶向功能的包含HDGF siRNA自组装复合纳米粒的血清稳定性试验结果。
图5为不同pH时胶质瘤细胞U251对纳米粒的摄取荧光图(图5A)及定量(图5B)。
图6为U251细胞经纳米粒转染后的划痕实验结果。
图7为BALB/c裸鼠原位胶质瘤模型尾静脉给药后生存曲线图及平均生存时间(MST)、中位生存时间情况。
图8是本申请制备方法的原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。需要指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1 聚乙烯亚胺-环氧十二烷的制备
将聚乙烯二胺(PEI)与环氧十二烷(O-C12)(均购自安耐吉化学)以1：7摩尔比在80-90℃氮气保护条件下搅拌反应48h，后通过二氧化硅色谱柱分离纯化，得到两性阳离子材料聚乙烯亚胺-环氧十二烷(PEI-C12)。
实施例2 携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-H7K(R2)2)的制备(参考文献：Biomaterials 2012；33:2508-2520.)
将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺(DSPE-PEG-NHS)(含琥珀酰亚胺基团的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)(上海纳洛捷生物科技有限公司)与聚合多肽H7K(R2)2(宁波康贝生化有限公司)以2：1摩尔比于室温下搅拌反应24h，后用透析法纯化，除去未反应的H7K(R2)2，透析袋截留分子量3500Da，产物为携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-H7K(R2)2)，冻干，-20℃密封保存。
实施例3制备方法
(1)、将聚乙交酯丙交酯(PLGA)、PEI-C12丙酮溶液加入到丙酮中，至终体积为1ml，搅拌后加入DEPC水溶解的HDGF siRNA，搅拌，使形成PEI-C12/HDGF siRNA类脂复合物。
(2)、将大豆磷脂、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-H7K(R2)2加入20ml超纯水溶液中600rpm搅拌30min。
(3)、将步骤(1)的丙酮相缓慢匀速滴加至步骤(2)的水相中，滴加时搅拌，自组装成复合纳米粒，后搅拌过夜，挥发水相中的乙醇、丙酮。
(4)、将步骤(3)中纳米粒溶液在4℃、7000rpm超滤离心，截留分子量为100,000。新鲜4℃预冷的PBS洗三次，浓缩至0.35ml，4℃保存备用。
用DSPE-PEG2000代替DSPE-PEG2000-H7K(R2)2制备非靶向载药纳米粒NPs作为对照组。NPs、PSNPs在不同pH缓冲液中的体外稳定性研究，如图1C所示证明制备所得纳米粒在体外37℃粒径基本稳定，经过较长时间(7天)粒径才发生响应pH，有较大改变。
PSNPs动态光散射测定纳米粒的粒径约为100nm，包封率为75％，载药量为282.4pmol/mg。光强粒度多峰分布柱形图如图2所示。透射电镜图如图3所示。
实施例4聚乙交酯丙交酯聚乙交酯的摩尔比的考察
其他因素不变，仅改变聚乙交酯丙交酯聚乙交酯的摩尔比，分别为85:15、75:25、50：50，考察聚乙交酯丙交酯聚乙交酯的摩尔比对结果的影响，结果聚乙交酯丙交酯为75:25时纳米粒粒径最小(图1A)，含量约为66％。
实施例5二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的种类对性能的考察
其他材料不变，仅改变二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的种类(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀)，考察对产物性能的影响，结果：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为羟基修饰最好，含量约为16％。
实施例6两性阳离子材料的考察
其他材料不变，仅改变两性阳离子材料的种类(聚乙烯亚胺-环氧十二烷或者聚乙烯亚胺-环氧十四烷)，考察对产物性能的影响，结果：两性阳离子材料为聚乙烯亚胺-环氧十二烷，含量约为13％。
实施例7磷脂种类的考察
其他材料不变，仅改变磷脂的种类(大豆磷脂、卵磷脂)，结果磷脂为大豆磷脂最好，含量约为4％。
以上考察归纳为表1。
表1
实施例9靶头用量的考察
其他材料不变，仅改变靶头用量(0.1-10％)，结果证实：靶头H7K(R2)2含量约为3％时粒径最小,5％时其次。(如图1D)。
实施例9纳米粒PSNPs的血清稳定性实验
受试品：采用实施例3的方法制备含siRNA阴性对照(用Cy3-siRNA代替HDGF siRNA制备的阴性对照)的靶向载药纳米粒PSNPs和非靶向载药纳米粒NPs，其中非靶向载药纳米粒NPs作为对照组(图2为两者的粒径分布图)。
精密量取裸Cy3-siRNA与负载等量Cy3-siRNA的纳米粒(Cy3-siRNA＝0.04nmol)，与血清按体积1：1混合，在37℃孵育(0h，6h，12h，24h)，后分别加入50U肝素钠溶液，涡旋混匀，12000g离心取上清，加200ul氯仿萃取siRNA,后加200ul异丙醇离心，弃上清。用75％乙醇100ul，4℃,7500rpm，5min离心洗两次沉淀，通风处晾干后加DEPC水溶解。于1％琼脂糖做凝胶阻滞实验，电压100mV，电流100mA，通电30min，紫外灯下观察。以裸Cy3-siRNA、NPs为对照组。
结果如下(图4)：裸siRNA 0h时出现较亮条带，6h及以后消失。包载siRNA的纳米粒PSNPs在0h、6h、12h都有明显条带，24小时亮度稍有降低，说明纳米粒PSNPs在血清中足够稳定，能够有效保护siRNA不被血清中的活性物质降解。
实施例10不同pH条件下细胞对纳米粒PSNPs的摄取实验
(1)、制备包载siRNA阴性对照Cy3-siRNA的纳米粒PSNPs、NPs。
(2)、选取人源胶质瘤细胞系U251细胞株作为靶向实验细胞。将细胞铺在96孔板中，5000个/孔，培养24h。(细胞与培养基均为市购可得)
(3)、用前述制备的纳米粒分别在pH 6.5、pH 7.4孵育胶质瘤细胞6h，后弃去培养基，冷的PBS洗细胞两次，Hoechst 33258染色细胞核，用全波长酶标仪分别测定Cy3-siRNA与Hoechst 33258的荧光强度，计算相对摄取率。后用荧光显微镜观察(图5)。
结果如下：PSNPs在pH 6.5时的相对摄取率明显强于pH 7.4时的相对摄取率(p<0.05)；NPs在pH 6.5与pH 7.4时细胞相对摄取率无明显差异；pH 6.5时PSNPs与NPs也存在显著性差异(p<0.01)。表明携带靶头聚合多肽H7K(R2)2的纳米粒具有pH敏感性，能有效提高人源胶质瘤细胞系U251细胞株对siRNA的摄取率。
实施例11
实施例3制备的包载HDGF siRNA的纳米粒PSNPs对人源胶质瘤细胞迁移的作用。
采用细胞划痕实验评价方法：(1)、选取人源胶质瘤细胞系U251细胞株作为实验细胞。将细胞种在6孔板中，2×105个/孔，培养24h。
(2)、参照上述实施例制备包载HDGF siRNA的纳米粒PSNPs、NPs。用纳米粒孵育细胞6h后弃去，换为完全培养基继续培养48h。
(3)、用0.25％胰酶消化并收集细胞，用低血清培养基重悬计数，种在6孔板中，3×105个/孔，培养24h至细胞融合度至100％。用200ml枪头垂直板底划痕，选取固定位置，于不同时间点拍照(0h，12h，24h，48h)，统计数据。以没做处理的空白细胞组、裸HDGF siRNA、NPs组作为对照组。
结果如下(见图6)：空白组、裸HDGF siRNA组、NPs组、PSNPs组细胞相对迁移距离分别为1、0.976、0.798和0.671。统计学检验得出空白组与裸HDGF siRNA组无统计学差异，与NPs组、PSNPs组有统计学意义(p值分别为p<0.01、p<0.001)，PSNPs组与裸HDGF siRNA组、NPs组也有统计学意义(p值分别为p<0.001、p<0.05)。说明PSNPs组抑制胶质瘤细胞U251迁移的效果更加显著。进一步验证了具有主动靶向性的纳米粒能更好的被细胞摄取，发挥基因下调效果。
实施例12
实施例1制备的包载HDGF siRNA的纳米粒PSNPs对原位胶质瘤荷瘤小鼠存活率的作用。
方法：①随机挑选健康雄性BALB/c裸鼠4-5周龄(20g左右)20只，收集对数生长期U251细胞，用PBS洗两遍细胞，调节其浓度为1.0×105/μL的单细胞悬液，37℃恒温备用。用一次性无菌注射器腹腔注射4％水合氯醛(0.2mL/20g)麻醉裸鼠，将麻醉后的裸鼠固定于脑立体定位仪，头部用75％酒精消毒后，内毗连线与头部矢状中线交汇处纵向作1cm长头皮切口，暴露颅骨，洗耳球吹干头骨表面组织，前囟右旁开1.8mm处颅骨钻孔。25μL微量注射器吸取5μL上述细胞悬液后垂直进针穿刺脑膜和脑组织达纹状体处。于5min内将细胞悬液注完(1μL/min)，留针5min后，于10min内分两次缓慢拔出针管。碘酒擦拭手术野，用医用缝合线缝合后再次用碘酒擦拭，消毒切口，待其自然苏醒。
②按上述方法建立原位胶质瘤BALB/c裸鼠模型，并将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只，分别为生理盐水组、NPs(HDGF siRNA)组、PSNPs(HDGF siRNA)组、PSNPs(ScrambledsiRNA)组。于接种U251细胞14天后，四组分别静脉注射相应药物(以siRNA剂量为准，0.6mg/kg)，隔天给药，共给药四次。每天观察并记录各组荷瘤裸鼠的死亡时间，用SPSS 13.0软件对数据进行log-rank统计学分析，计算并比较各组的平均生存期及中位生存期，绘制生存曲线(图7)。
表2原位胶质瘤模型裸鼠生存时间统计学分析
log-rank分析中***、**、*分别表示P<0.001、P<0.01和P<0.05。
结果如下：原位胶质瘤裸鼠的生存时间考察结果如图6和表2所示，经鼻给药后，生理盐水组的中位生存期为19天，PSNPs(Scrambled siR)组为20天(p>0.05)，两者没有统计学差异；NPs(HDGF siR)为25天，PSNPs(HDGF siR)组为36天，这两组与生理盐水组相比有显著统计学差异(p值均小于0.01)，裸鼠生存期明显延长，说明HDGF siRNA具有抑制肿瘤的作用；PSNPs(HDGF siR)组NPs(HDGF siR)组对比(p<0.01)裸鼠生存期延长说明经聚合多肽H7K(R2)2修饰后，纳米粒的脑靶向性显著提高；另外，PSNPs(HDGF siR)组裸鼠生存期明显长于PSNPs(Scrambled siR)组，验证了HDGF siRNA能抑制肿瘤生长的结果。由此结果表明构建的PSNPs(HDGF siRNA)纳米粒为胶质瘤临床治疗提供了一个很有潜力的治疗策略。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种长循环自组装复合纳米粒制剂，其特征在于：包括聚乙交酯丙交酯、两性阳离子材料、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂、递送靶头聚合多肽H7K(R2)2及肝癌衍生生长因子小干扰RNA；粒径为50-200 nm；
其中，采用聚乙交酯丙交酯（PLGA）作为疏水性刚性内核，包裹HDGF siRNA，磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）相互交叉分布在PLGA的表面，并对纳米粒表面进行多肽H7K(R2)2、聚乙二醇修饰。
2.权利要求1所述的长循环自组装复合纳米粒制剂，其特征在于：
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇含量为1%~20%；
靶头聚合多肽H7K(R2)2含量为0.1%~10%；
两性阳离子材料含量为1%~30%；
递送肝癌衍生生长因子siRNA含量为0.1nmol~2.5nmol；
磷脂含量为1%~10%。
3.权利要求1所述的长循环自组装复合纳米粒制剂，其特征在于：
所述的聚乙交酯丙交酯含量10%~80%；聚乙交酯丙交酯嵌段的数均分子量Mn为1.5万~5.5万，其中，聚丙交酯：聚乙交酯的摩尔比为85:15~50:50；
两性阳离子材料为聚乙烯亚胺-环氧烷类；磷脂为大豆磷脂、卵磷脂；
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为乳酸/羟基乙酸共聚物-聚乙二醇；其中，所述的聚乙二醇嵌段的数均分子量Mn为400~10000。
4.权利要求3所述的长循环自组装复合纳米粒制剂，其特征在于：聚乙烯亚胺-环氧烷类两性阳离子材料是聚乙烯亚胺-环氧十二烷或者聚乙烯亚胺-环氧十四烷。
5.权利要求3所述的长循环自组装复合纳米粒制剂，其特征在于：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇带有羟基、琥珀酰亚胺基团。
6.权利要求1所述的长循环自组装复合纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和聚合多肽H7K(R2)2制备得到携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；
（2）将两性阳离子材料、递送肝癌衍生生长因子siRNA及聚乙交酯丙交酯制备形成聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物；
（3）将聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物与磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、及携带递送靶头聚合多肽H7K(R2)2的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合，制备得到自组装复合纳米粒。
7.权利要求6所述的长循环自组装复合纳米粒制剂的制备方法，其特征在于步骤（2）聚乙交酯丙交酯包裹HDGF siRNA的类脂复合物的制备方法是：将聚乙交酯丙交酯 、 PEI-C12的丙酮溶液加入到丙酮中，搅拌均匀后，加入DEPC水溶解的HDGF siRNA搅拌获得PEI-C12/HDGF siRNA类脂复合物。
8.权利要求6所述的长循环自组装复合纳米粒制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）纳米粒的制备过程是：将含有类脂复合物的丙酮相加入到水相中，搅拌后，获得纳米粒，水相是大豆磷脂、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-H7K(R2)2的水溶液。
9.一种具有脑神经胶质瘤的靶向制剂，包括权利要求1所述的长循环自组装复合纳米制剂以及药学上可接受的载体。
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