CN113318242A - 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途 - Google Patents

一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113318242A
CN113318242A CN202010131255.7A CN202010131255A CN113318242A CN 113318242 A CN113318242 A CN 113318242A CN 202010131255 A CN202010131255 A CN 202010131255A CN 113318242 A CN113318242 A CN 113318242A
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
polyethyleneimine
cell
nanoparticles
penetrating peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010131255.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113318242B (zh
Inventor
巩长旸
宋林江
吴秦洁
魏于全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by West China Hospital of Sichuan University filed Critical West China Hospital of Sichuan University
Priority to CN202010131255.7A priority Critical patent/CN113318242B/zh
Publication of CN113318242A publication Critical patent/CN113318242A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113318242B publication Critical patent/CN113318242B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明提供了一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途，属于医药领域。该基因载体是由一个阳离子内核和一个阴离子外壳通过静电相互作用制备而成；所述阳离子内核由肝素钠、聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺‑穿膜肽为原料制备而成；所述阴离子外壳由透明质酸、马来酰亚胺聚乙二醇氨基和半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物为原料制备而成；所述聚乙烯亚胺‑穿膜肽由聚乙烯亚胺、3‑马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯和穿膜肽为原料制备而成。该基因载体安全性好，又能高效复合基因，细胞摄取率高，溶酶体逃逸性能良好，可进入肿瘤组织深处进行治疗，转染效率高，在基因治疗领域具有良好的应用前景。

Description

一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途。
背景技术
基因治疗越来越受到人们的关注，它可以通过向靶细胞或组织传递基因药物，从而为众多诸如艾滋病和癌症等现有治疗方法效果差，甚至无法治疗的疾病提供一种高效的、有潜力的治疗方法。众多周知，由于裸露的DNA进入体内后容易被血液或体液当中的核酸酶快速降解、清除，所以裸露的DNA不适合直接用于体内治疗。因此，亟需一种既能很好的保护基因药物不被降解，同时又能高效的将基因药物传递到靶细胞或组织的基因载体。
目前广泛使用的基因载体主要分为病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体虽然具有高效的转染率，但是其固有的免疫原性与生物不安全性限制了其进一步地临床应用。近年来随着药剂学、材料学等多学科的迅速发展，大量合成材料及天然材料涌现，非病毒载体备受关注。阳离子聚合物、树状聚合物、脂质体和多肽等这些非病毒基因载体，不仅具有低的免疫原性、生物安全性高等性质，而且制备过程可操控性高，材料表面易修饰。因此非病毒载体被认为是一种具有潜力的基因治疗载体工具。
聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一种最常见的阳离子聚合物非病毒基因载体。它可以将带负电的基因包裹住，并形成纳米复合物，此复合物能够通过细胞内吞方式进入肿瘤细胞，经过溶酶体逃逸展现出较好的转染效率。然而，PEI的分子量大小影响着它转染效率与毒性之间的平衡。例如：分子量为25000的PEI转染效率很高的同时也具有较大的细胞毒性；相反，分子量为600的PEI虽然细胞毒性低，但是转染效率也很低。因此PEI的应用受到很大程度的限制。
通常将PEI嫁接在诸如透明质酸、肝素、壳聚糖或者海藻酸钠一类的阴离子天然聚合物上对其进行改性，得到的PEI-阴离子聚合物复合物虽然可以有效的克服PEI的一些缺点，比如大大降低其细胞的毒性。但是，改性后的PEI-阴离子聚合物复合物的通常转染效率较低，大约在40％，其转染效果总是不尽如人意，不能完全满足基因治疗的临床需求。因此，如何能够降低PEI毒性的同时确保其较高的转染效率，以满足临床使用需求，是如今研究非病毒基因载体的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途。
本发明提供了一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体，它是由一个阳离子内核和一个阴离子外壳通过静电相互作用制备而成；
其中，所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.01～1份，聚乙烯亚胺100～200份，聚乙烯亚胺-穿膜肽10～100份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100～200份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基100～200份，尿激酶型纤溶酶激活物1～10份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺300～600份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯50～100份，穿膜肽100～500份。
进一步地，
所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.01～1份，聚乙烯亚胺100～200份，聚乙烯亚胺-穿膜肽10～100份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100～200份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基100～200份，半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物1～10份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺300～600份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯50～100份，穿膜肽100～500份；
优选地，所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.05份，聚乙烯亚胺140份，聚乙烯亚胺-穿膜肽60份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基124份，半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物7.44份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺500份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯88.5份，穿膜肽457份。
进一步地，
所述聚乙烯亚胺的分子量为1800；
和/或，所述为穿膜肽Cys-TATs，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRRC。
进一步地，
所述肝素钠为活化了羧基的肝素钠；所述透明质酸为活化了羧基的透明质酸；
优选地，所述活化肝素钠羧基的方法为：将肝素钠溶于MES缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺，室温反应1～3小时，即可；
所述活化透明质酸羧基的方法为：将透明质酸溶于MES缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺，室温反应1～2小时，即可；
更优选地，所述肝素钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺的质量比为50：(30～50)：(25～50)；
所述透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺的质量比为100：(10～15)：(5～10)。
进一步地，所述阳离子内核的制备方法包括如下步骤：
将肝素钠加入含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的溶液中，反应，即得；
优选地，所述加入为搅拌速度为1200～3000rpm时滴加；
和/或，所述含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的溶液为含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的水溶液；
和/或，所述反应为室温反应10～12小时；
和/或，所述反应后需要透析，透析的步骤如下：用截留分子量为10000的再生纤维素透析袋在纯水中透析3～5天。
进一步地，所述阴离子外壳的制备方法包括如下步骤：
将马来酰亚胺聚乙二醇氨基加入透明质酸溶液中，反应，透析，将透析后的液体和半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物加入溶剂中，再次反应，即得；
优选地，所述反应为室温下反应12～24h；
和/或，所述透析为将反应液转入到截留分子量为3500的透析袋中，在纯水中透析3～5天；
和/或，所述溶剂为四氢呋喃和水的混合溶液；
和/或，所述再次反应为室温下反应24～48h；
和/或，所述再次反应后需要透析，透析的步骤如下：将上述反应液用截留分子量为3500的透析袋在纯水中透析3～5天；
更优选地，所述四氢呋喃和水的体积比为1:1。
进一步地，所述聚乙烯亚胺-穿膜肽的制备方法包括如下步骤：
将聚乙烯亚胺溶于溶剂中，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯，反应，除去溶剂；将剩余的残渣加入四氢呋喃和水的混合溶液中，加入穿膜肽，再次反应，即得；
优选地，所述反应为室温反应1～3小时；
和/或，所述溶剂为氯仿；
和/或，所述四氢呋喃和水的混合溶液中四氢呋喃和水的体积比为1：1；
和/或，所述再次反应为室温反应6～10小时；
和/或，所述再次反应后需要透析，透析的步骤如下：将反应液用截留分子量为1000的再生纤维素透析袋在纯水中透析3～5天。
本发明还提供了一种制备前述的肿瘤靶向多功能非病毒基因载体的方法，它包括如下步骤：
将前述阳离子内核和阴离子外壳在溶剂中混合后孵育，即得；
优选地，所述阳离子内核和阴离子外壳的质量比为1：(0.5～4)；
和/或，所述溶剂为水；
和/或，所述孵育为室温孵育25～30min；
更优选地，所述阳离子内核和阴离子外壳的质量比为1:3。
本发明还提供了前述的肿瘤靶向多功能非病毒基因载体在制备基因治疗的药物中的用途。
进一步地，所述药物是将基因与前述阳离子内核复合后，按照前述的方法将阳离子内核和阴离子外壳孵育即得；
优选地，所述复合为基因与阳离子内核在溶剂中混合后孵育；所述基因与阳离子内核的质量比为1：(5～20)；
更优选地，所述溶剂为水；和/或，所述孵育为室温孵育25～30min。
本发明中，室温是指25±5℃；过夜是指12±2h。
本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU是一种“核-壳”型的非病毒基因载体，由一个阳离子内核HPT和一个多功能的阴离子外壳HPU通过静电相互作用构成。该非病毒基因载体没有免疫原性，且基本无细胞毒性，具有良好的生物相容性，其带有负电荷，可以克服现有阳离子聚合物基因载体与血液中负电蛋白结合，造成溶血等强毒副作用的问题，能够通过静脉注射用于体内治疗，安全性好。同时，该基因载体能够高效的复合基因，且具有肿瘤双靶向，肿瘤细胞的摄取率高，该基因载体在肿瘤组织中的穿透深度大，可以有效进入肿瘤组织，从而进行有效治疗。并且，该基因载体具有良好的溶酶体逃逸性能，能快速地逃离溶酶体进而将基因递送至细胞核内发挥作用。此外，该基因载体具有良好的转染效率，其转染效率高达60％，明显优于现有技术中的PEI-阴离子聚合物复合物(转染效率大约在40％)。
总之，本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU无免疫原性，具有良好的生物相容性，安全性好；又能高效复合基因，细胞摄取率高，溶酶体逃逸性能良好；同时，其肿瘤穿透深度大，可进入肿瘤组织深处进行治疗，转染效率高于现有PEI-阴离子聚合物复合物。本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU克服了现有非病毒基因载体转染效率低等诸多问题，在基因治疗领域具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为PEI-TAT的合成反应路线图及核磁氢谱图：(A)PEI-TAT的合成反应路线图；(B)PEI和PEI-TAT的核磁氢谱图。
图2为HPT的合成反应路线图。
图3为HPU的合成反应路线图及核磁氢谱图：(A)HPU的合成反应路线图；(B)HA，Mal-PEG-NH2，uPA和HPU的核磁氢谱图。
图4为不同材料(HPTHPU纳米粒，HPT纳米粒，PEI 1.8K和PEI 25K)对MDA-MB-231细胞和HEK-293细胞的毒性评价：(A)MDA-MB-231细胞；(B)HEK-293细胞。
图5为HPT纳米粒的溶血评价结果，a-e分别为浓度是1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的HPT纳米粒组，f为生理盐水组，g为蒸馏水组：(A)溶血结果的直观观测图；(B)溶血率检测结果。
图6为琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果图；从左到右第1泳道是DNA Ladder，第2泳道是裸质粒pDNA，第3泳道到第9泳道分别为不同质量比(0.1:1、0.2:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1)的HPT/pDNA纳米粒，第10泳道是HPTHPU/pDNA纳米粒。
图7为不同纳米粒的粒径和电位表征结果：(A)不同纳米粒(HPT，HPT/pDNA，HPTHPU/pDNA)的粒径表征结果；(B)HPU粉末和HPT纳米粒按照不同质量比制备的HPTHPU/pDNA纳米粒的Zeta电位表征结果。
图8为不同纳米粒的透射电镜表征结果：(A)HPT；(B)HPT/pDNA，(C)HPTHPU/pDNA。
图9为流式细胞术检测MDA-MB-231细胞表面受体的表达情况：(A)CD44；(B)uPAR。
图10为细胞对不同纳米粒的摄取情况：(A)和(B)为MDA-MB-231细胞对包载YOYO-1标记的pDNA的不同纳米粒的摄取情况；(C)和(D)为用过量的HA或(和)uPA多肽预处理后，MDA-MB-231细胞对HPTHPU/pDNA纳米粒的摄取情况。
图11为不同纳米粒(PEI 25K，HPT，HPTHPU)的肿瘤球穿透深度评价。
图12为HPTHPU在MDA-MB-231细胞中的溶酶体逃逸能力评价结果。
图13为不同纳米粒材料(HPTHPU，HPT，PEI 25K，PEI 1.8K)在MDA-MB-231细胞中的转染效率评价；(A)细胞转染时荧光拍照，(B)流式细胞仪检测的细胞转染效率结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。主要材料如下：
聚乙烯亚胺：PEI，分子量为1800，购于西格玛奥德里奇有限公司；
聚乙烯亚胺：PEI，分子量为25000，购于西格玛奥德里奇有限公司；
3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯：购于成都蜀研生物；
穿膜肽Cys-TAT：氨基酸序列为YGRKKRRQRRRC(SEQ ID NO.1)，购于上海强耀生物有限公司；
EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，购于上海麦克林生化科技有限公司；
NHS：N羟基丁二酰亚胺，购于上海麦克林生化科技有限公司；
HA：透明质酸，购于华熙生物科技股份有限公司；
Mal-PEG-NH2：马来酰亚胺聚乙二醇氨基，购于北京键凯科技股份有限公司；
cys-uPA：半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物，购于上海强耀生物有限公司。
实施例1、本发明非病毒基因载体(HPTHPU纳米粒)的阳离子内核：肝素-PEI-TAT(HPT)纳米粒的制备
(1)PEI-TAT的合成方法如下：首先将分子量为1800的PEI(500mg,0.275mol,1.0eq)溶于10mL氯仿中，然后将3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(88.5mg,0.333mmol,1.2eq)加入到上述溶液中，室温反应3小时后，旋蒸去除反应溶剂氯仿。剩余的残渣用10mL四氢呋喃(THF)和水的混合溶液(THF和水的体积比为1:1)充分溶解后，再将穿膜肽Cys-TAT(457mg,0.275mmol,1.0eq)加入上述溶液中室温继续反应6小时。当反应结束后，将反应液用截留分子量为1000的再生纤维素透析袋在纯水中透析3天(每天换3次水)以除去剩余的有机溶剂与杂质。透析所得到的产物PEI-TAT水溶液经冷冻干燥得到PEI-TAT粉末。
取适量PEI-TAT粉末做核磁氢谱分析，结果如图1所示。由图1可知：与分子量为1800的PEI的核磁氢谱相比，PEI-TAT的核磁氢谱在1.52ppm和3.20ppm处有新的信号峰出现，而这些新的信号峰恰好是TAT(人免疫缺陷病毒的转录反式激活因子)的特征峰，由此说明PEI-TAT合成成功。穿膜肽Cys-TAT通过小分子linker 3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯与PEI反应生成PEI-TAT。
(2)HPT纳米粒的制备：将50mg肝素钠充分溶于100mL MES缓冲液(pH5.5,0.05M)中，然后分别加入30mg EDCI和25mg NHS室温搅拌反应3小时以充分活化肝素钠的羧基。将活化好的肝素钠溶液缓慢地滴加到以高速机械搅拌(1200rpm)着的15mL含PEI和PEI-TAT的混合溶液中(该混合溶液的制备方法是将140g的PEI和60g的PEI-TAT粉末溶于15mL的纯水溶剂中而得)，室温继续反应12小时后，用截留分子量为10000的再生纤维素透析袋在纯水中充分透析3天，每天换3次水，以除去未反应的杂质，得含HPT纳米粒的溶液。
图2为HPT纳米粒的合成反应路线图，HPT纳米粒的合成主要是利用酰胺化反应将肝素钠的羧基与PEI/PEI-TAT的伯氨基偶联生成HPT。本实验表明当PEI-TAT在PEI和PEI-TAT的混合溶液中的质量比低于30％时，HPT的转染效率相对较低(转染效率低于25％)；但当PEI-TAT在PEI和PEI-TAT的混合溶液中质量比高于50％时，制备得到HPT纳米粒的粒径偏大(粒径大于500nm)，PDI偏高(PDI值大于0.4)。因此，在PEI和PEI-TAT的混合溶液中PEI-TAT的质量比为30～50％时，制备的HPT纳米粒最佳，而PEI-TAT和PEI质量比为3:7时，成本更低。因此，PEI-TAT的混合溶液中最佳配制方法入步骤(2)所述：将140g的PEI和60g的PEI-TAT粉末溶于15mL的纯水溶剂。
本实验使用HPT纳米粒作为基因载体载质粒DNA(pDNA)，具体步骤如下：将步骤(2)制备得到的含HPT纳米粒的溶液与pDNA水溶液按照一定质量比(HPT纳米粒与pDNA的质量比为2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1)混合均匀后室温静置孵育25分钟，得到不同质量比的HPT/pDNA纳米粒。经过体外细胞转染实验发现，当HPT纳米粒与pDNA的质量比为20:1时，在MDA-MB-231细胞中的转染效率达到最高。当质量比继续升高时，转染效率并没有随之增加，而细胞毒性会增加。所以在本发明具体实施方式中，如果没有特别说明HPT纳米粒与pDNA的质量比，则HPT纳米粒与pDNA的质量比为20:1。
实施例2、本发明非病毒基因载体(HPTHPU纳米粒)的阴离子外壳：HA-PEG-uPA(HPU)的制备
将透明质酸(HA,100mg)，EDCI(14.2mg)和NHS(8.5mg)一起溶于30mL MES缓冲液(pH 5.5,0.05M)中，室温反应2h以充分活化HA上的羧基。然后将Mal-PEG-NH2(重均分子量为2000,124mg)加入到上述反应液中室温条件下继续反应24小时。随后将反应液转入到截留分子量为3500的透析袋中，再纯水中透析3天以出去未反应的杂质。透析完毕后，将透析袋内的液体与cys-uPA(7.44mg，0.0124069mmol)在10mL的THF和水的混合溶液(THF和水的体积比为1:1)体系中反应48h。最后将上述反应液用截留分子量为3500的透析袋在纯水中透析3天。透析袋内的液体经冷冻干燥得到HPU粉末。
取适量HPU粉末做核磁图谱分析，HPU的核磁图谱如图3所示。由图3的A可知：HPU由两步反应合成，第一步，将透明质酸的羧基活化后与Mal-PEG-NH2的氨基反应生成HA-PEG-Mal；第二部将cys-uPA多肽的巯基与HA-PEG-Mal的马来酰亚胺基团反应生成HA-PEG-uPA。相比于反应原料HA，Mal-PEG-NH2和cys-uPA(图3中表示为uPA)的核磁图谱，HPU的核磁图谱中明显能看到以上三种反应原料的特征氢的信号。由此证明，HPU被成功合成。
实施例3、本发明非病毒基因载体(HPTHPU纳米粒)使用时的制备方法(不载质粒DNA)
将实施例2制备得到的HPU粉末溶于水中，得到HPU水溶液。再将实施例1制备得到的含HPT纳米粒的溶液与HPU水溶液按照HPU粉末和HPT纳米粒的质量比3:1充分混合后室温孵育25min，得到HPTHPU纳米粒。
根据实施例3所述的制备方法，仅改变HPT纳米粒和HPU粉末的质量比，可得到HPT纳米粒和HPU粉末质量比不同的HPTHPU纳米粒。HPU粉末和HPT纳米粒的质量比还可以为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3.5:1、4:1。
实施例4、本发明非病毒基因载体(HPTHPU纳米粒)使用时的制备(载质粒DNA)
将实施例1制备的含HPT纳米粒的溶液与质粒DNA(pDNA)水溶液按照HPT纳米粒与pDNA的质量比为20:1混合均匀后室温静置孵育25分钟，得到HPT/pDNA纳米粒。
将实施例2制备得到的HPU粉末溶于水中，得到HPU水溶液。再将HPU水溶液与HPT/pDNA纳米粒按照HPU粉末与HPT纳米粒质量比3:1充分混合后室温孵育25min，得到HPTHPU/pDNA纳米粒。
根据实施例4所述的制备方法，改变HPT纳米粒与pDNA的质量比和/或HPT纳米粒和HPU粉末的质量比，可得到不同的HPTHPU/pDNA纳米粒。HPT纳米粒与pDNA的质量比还可以为2:1、5:1、10:1、30:1、40:1；HPU粉末和HPT纳米粒的质量比还可以为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3.5:1、4:1。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明非病毒基因载体材料的体外细胞毒性评价
1、试验方法
对实施例1制备的HPT纳米粒和实施例3制备的不载质粒DNA的HPTHPU纳米粒进行体外细胞毒性评价。细胞毒性评价采用MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)方法进行评价。
将处于生长对数期的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人胚肾细胞(HEK-293)消化，并分别以4000个/孔的密度接种于96孔板中，培养12小时后细胞完全贴壁。用完全培养基稀释HPT纳米粒和HPTHPU纳米粒后，将其加入到96孔板中形成一定浓度梯度(0，5，10，20，40，60，80，120μg/mL)，每孔做6个复孔，同时以分子量为25000的PEI(PEI 25K)和分子量为1800的PEI(PEI 1.8K)作为对照。继续培养48小时后，将20mL的MTT溶液(5mg/mL)加入到每孔中。将细胞在孵箱中继续培养4小时后，取出，吸净孔中培养基后加入150μL DMSO。DMSO会溶解细胞生成的甲基臜，然后将孔板置于酶标仪上检测每孔570nm波长的吸光度(OD570)。将各复孔OD值平均计算得到每个材料浓度细胞的相对生长活力。
2、试验结果
细胞毒性是评价基因载体材料是否可以用于体内治疗的一个重要指标。本试验例采用MTT法检测HPTHPU纳米粒、HPT纳米粒、PEI 25K和PEI 1.8K的细胞毒性，结果如图4所示。由图4可知：在MDA-MB-231和HEK-293细胞中，当PEI 25K的浓度由0增加到20μg/mL时，细胞活力的下降趋势非常明显，说明PEI 25K对这两种细胞具有极强的毒性。虽然PEI 1.8K的毒性比PEI 25K低一些，但是材料浓度为120μg/mL时细胞活力只有30％左右，细胞毒性依然较大。相比于PEI 25K和PEI 1.8K，HPT纳米粒的细胞毒性有所降低，当HPT纳米粒的浓度在20μg/mL时，两种细胞的活力都保持在95％以上。对于HPTHPU纳米粒来说，当其浓度达到最高的120μg/mL时，两种细胞的活力都保持在85％以上。说明本发明制备的非病毒基因载体材料具有良好的细胞相容性，对细胞毒性非常低，可用于体内治疗。
试验例2、本发明非病毒基因载体材料的溶血实验
1、试验方法
本试验例利用兔血中的红细胞来评价实施例1制备得到的HPT纳米粒的溶血率。首先将2.5mL不同浓度(1，0.8，0.6，0.4，0.2mg/mL，溶剂为生理盐水)的HPT纳米粒溶液与2.5mL红细胞混悬液(浓度为2％，使用生理盐水配制)轻轻地充分混匀。将上述混合物在37℃孵育3小时后，3000rpm室温离心5min。取上清液测545nm处的吸光度值(OD545)，每组平行做3次试验。蒸馏水和生理盐水分别作为本实验中的阳性对照与阴性对照。溶血率按照下述公式计算：
Figure BDA0002395828840000101
2、试验结果
阳离子非病毒基因载体与血液相容性是评价其体内应用安全性的一个重要指标。本发明HPT纳米粒的溶血试验结果如图5所示。由图5可知：即使HPT纳米粒的浓度在最高的1mg/mL，其溶血率也只有1.03±0.45％，证明HPT纳米粒几乎没有发生溶血现象，同时也说明了HPT纳米粒具有良好的血液相容性。
试验例3、本发明非病毒基因载体载基因的研究
1、本发明非病毒基因载体对质粒DNA的包裹效果
将实施例1制备得到的HPT纳米粒与质粒DNA(pDNA)水溶液混合，其中，HPT纳米粒和pDNA质粒的质量比分别为0.1:1、0.2:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1，混合均匀后室温静置孵育25min，得不同质量比的HPT/pDNA纳米粒。
按照实施例4的制备方法，制备得到HPU粉末、HPT纳米粒和pDNA的质量比为60:20:1的HPTHPU/pDNA纳米粒。
取适量上述的HPT/pDNA纳米粒和HPTHPU/pDNA纳米粒进行琼脂糖凝胶电泳实验：各组纳米粒分别与6×DNA loading buffer(Thermo Scientific)按照相同的比例混匀，然后加入到含Gelview的1％琼脂糖凝胶的样品孔中，以TAE buffer为电泳介质，在100V电压条件下进行电泳40min。电泳完毕后取出凝胶进行成像拍照分析，电泳结果如图6所示。
由图6可知：当HPT与质粒DNA的质量比大于5:1时，质粒DNA的条带完全消失，说明质粒DNA在凝胶电泳中的运动完全被阻滞。从侧面说明用较少的HPT(含有氮)就可以包裹质粒DNA(含有磷)，因此HTP在较低的N/P(氮磷比)下就可以很好地复合DNA，即HPT具有高效的DNA复合能力。而HPTHPU/pDNA纳米粒与HPT/pDNA纳米粒(HPT与pDNA质量比为20:1)相同，质粒DNA条带也完全消失，说明质粒DNA在凝胶电泳中的运动完全被阻滞，HPTHPU/pDNA纳米粒也能够高效复合质粒DNA。
2、本发明非病毒基因载体载基因后的性质
将实施例1制备的HPT纳米粒与质粒DNA(pDNA)以质量比为15:1的条件下，充分混匀后室温孵育25min得到HPT/pDNA纳米粒，随后将实施例2制备得到的HPU粉末溶于水中，得到HPU水溶液，将HPU水溶液以不同质量比(HPU粉末和HPT纳米粒的质量比为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1)与HPT/pDNA纳米粒混合均匀后室温继续孵育25min得到HPTHPU/pDNA纳米粒。
用NanoZS ZEN 3600测定所得的HPT/pDNA纳米粒和HPTHPU/pDNA纳米粒的Zeta电位；并用NanoZS ZEN 3600测定实施例1制备的HPT纳米粒、以及上述所得的HPT/pDNA纳米粒和HPTHPU/pDNA纳米粒(HPU粉末和HPT纳米粒的质量比为3:1)的粒径；并用透射电镜(JEM-100CX，Japan)对实施例1制备的HPT纳米粒、以及上述所得的HPT/pDNA纳米粒和HPTHPU/pDNA纳米粒(HPU粉末和HPT纳米粒的质量比为3:1)的外貌进行观察拍照，结果如图7和图8所示。
图7为粒径和Zeta电位结果图，由图7可知：HPT纳米粒的粒径为162.5±3.1nm。HPT纳米粒与pDNA孵育后形成一个更加紧实的、粒径稍小的纳米粒(151.4±2.6nm)。而HPT/pDNA纳米粒与HPU孵育形成HPTHPU/pDNA纳米粒后，粒径略有增大，为168.4±2.6nm。同时，随着HPU比例的增加，HPTHPU/pDNA纳米粒的Zeta电位由正翻转为负。当HPU粉末和HPT纳米粒质量比为3:1时，HPTHPU/pDNA纳米粒的Zeta电位(-14.4±1.8mV)和粒径(168.4±2.6nm)都比较适中，因此，HPU粉末和HPT纳米粒质量比为3:1为制备HPTHPU/pDNA纳米粒的最佳比例。
图8为各纳米粒的透射电镜图。由图8可知：HPT纳米粒、HPT/pDNA纳米粒与HPTHPU/pDNA纳米粒都呈现出较为规整的圆形形态特征。同时也明显能看出透射电镜中HPT纳米粒、HPT/pDNA纳米粒与HPTHPU/pDNA纳米粒的粒径大小明显小于经动态光散射(DLS)方法测得的粒径。主要原因是，动态光散射方法测得的是纳米粒水溶液的粒径大小，即水和粒径大小；而透射电镜测得的是固态纳米粒的大小。水和纳米粒呈蓬松状态，而干态纳米粒处于固缩状态。所以同一个样品，动态光散射方法测的粒径大小要大于透射电镜的结果。
试验例4、细胞摄取分析
1、试验方法
在细胞摄取实验之前，先用FITC-anti-CD44和APC-anti-uPAR来检测MDA-MB-231细胞膜表面CD44和uPAR受体的表达水平。具体操作如下：收集细胞后，用预冷的PBS洗涤两次，加入适量抗体，在冰上孵育30min。孵育完毕后，4℃1200rpm离心3min。用400μL PBS重悬细胞，上机检测。用FITC-或APC-标记的IgG 2a抗体作为同型对照。
本试验用流式细胞术来检测HPTHPU/基因复合物纳米粒的细胞摄取率。首先将处于生长对数期的MDA-MB-231细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，培养12小时使细胞完全贴壁。用DMEM双无培养基置换掉孔板里的完全培养基后，将包载了2μg YOYO-1标记的pDNA质粒的纳米粒(包载pDNA的基因载体材料为PEI 25K，HPT纳米粒，HPTH纳米粒，HPTHPU纳米粒)加入到6孔板中。在细胞孵箱中孵育6小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞2-3次。收集细胞，用流式细胞仪检测细胞对不同纳米粒的摄取效率。在靶向受体封闭实验中，细胞提前用10mg/mL的HA或/和40mM的uPA多肽处理1h以封闭MDA-MB-231细胞表面的CD44受体或/和uPAR受体。每组实验平行做3个复孔。
包载2μg YOYO-1标记的pDNA质粒的纳米粒的制备方法：先将pDNA质粒用YOYO-1标记然后与不同的材料：PEI 25K(PEI 25K:pDNA＝2:1)、HTP纳米粒(HPT:pDNA＝20:1)、HPTH纳米粒(HA:HPT:pDNA＝60：20：1)、HPTHPU纳米粒(HPU:HPT:pDNA＝60:20:1)共同孵育形成。孵育条件为室温孵育25min。
具体的，HPT纳米粒为实施例1制备的HPT纳米粒，HPT纳米粒复合质粒DNA的方法如实施例1所述，得HPT/pDNA纳米粒。
HPTH纳米粒复合质粒DNA的方法为：先按照实施例1所述的方法制备HPT/pDNA纳米粒，然后将透明质酸钠(HA)水溶液与HPT/pDNA纳米粒混合均匀(HA与HPT的质量比为3:1)，室温孵育20min，即得。
HPTHPU纳米粒复合质粒DNA的方法如实施例4所述。
2、试验结果
配体-受体介导的细胞内吞方式是细胞摄取的一种重要方式。因此细胞表面受体的表达水平对配体-受体介导的细胞内吞具有重要的影响。首先利用流式细胞术检测了MDA-MB-231细胞膜表面的CD44受体和uPAR的表达水平。如图9所示，MDA-MB-231细胞表面CD44和uPAR的表达量几乎为100％。
在随后的细胞摄取实验中，先将pDNA质粒用YOYO-1标记然后与不同的材料共同孵育形成不同纳米粒，最后将各纳米粒与MDA-MB-231细胞作用。如图10所示，相比于PEI 25K，HPT纳米粒具有较高的细胞摄取率。HPT纳米粒本身的强正电荷可以和细胞膜表面带负电的多糖相互作用而入胞，同时HPT表面的TAT多肽可以促进HPT的穿膜进而入胞。然而，HPTH纳米粒表现出比HPT纳米粒更好的细胞摄取率。虽然HPTH纳米粒的表面的负电荷不能促进以正负电荷介导的细胞内吞方式，但是HPTH纳米粒表面的HA却可以和MDA-MB-231细胞特异性表达的CD44受体相互作用，以配体-受体介导的方式增加细胞摄取率。而具有最高细胞摄取率的HPTHPU纳米粒不仅可以通过HA与CD44之间的配体-受体相互作用，而且还可以通过uPA与uPAR之间的作用增加细摄取率。HPTHPU纳米粒对于MDA-MB-231细胞具有双靶向性。
为了进一步验证HPTHPU纳米粒的双靶向性。设计了MDA-MB-231细胞表面受体竞争性实验来验证HPTHPU中HA与uPA是否通过与细胞表面的CD44受体和uPAR相互作用而增加细胞摄取率。如图10所示，当提前用HA或uPA多肽处理MDA-MB-231后，HPTHPU的细胞摄取率都有一定程度的降低。若同时用HA和uPA多肽处理细胞后，HPTHPU的细胞摄取率随之下降。说明HPTHPU纳米粒具有双靶向性。
试验例5、3D肿瘤球穿透深度实验
1、试验方法
本实验在体外利用3D肿瘤球的模型来模拟检测HPTHPU纳米粒的肿瘤穿透深度。具体实验过程如下：将3000个MDA-MB-231细胞接种在预先铺有60μL低熔点琼脂糖凝胶(2％，w/v)的96孔板中。持续培养5-7天后形成肿瘤球。然后用HPTHPU/YOYO-1-pDNA纳米粒与肿瘤球共孵育6h。最后用PBS轻轻地洗涤1-2遍后用共聚焦显微镜检测。HPTHPU/YOYO-1-pDNA纳米粒是复合了YOYO-1标记的pDNA质粒的HPTHPU纳米粒，其制备方法同试验例4，其中，HPU粉末、HPT纳米粒和、YOYO-1标记的pDNA质量比为60:20:1。
2、试验结果
对于实体瘤来说，药物的肿瘤渗透能力一直是困扰肿瘤治疗的一大难题。肿瘤基因治疗也是如此，一个好的基因载体必须具有将目的基因运送至肿瘤组织深处的能力。据报道，3D肿瘤球可以用来作为一种肿瘤组织模型来评价药物的渗透能力。因此，本实验在体外利用3D肿瘤球模型来评价HPTHPU纳米粒的肿瘤穿透深度能力。将pDNA质粒用YOYO-1标记后，按照试验例4所述方法与不同基因载体材料复合，得到不同的纳米粒。不同基因载体材料为PEI 25K(PEI 25K:pDNA＝2:1)、HTP纳米粒(HPT:pDNA＝20:1)和HPTHPU纳米粒(HPU:HPT:pDNA＝60:20:1)。然后将各纳米粒与肿瘤球作用并检测。如图11所示，相比于PEI 25K，可以看到HPT纳米粒在不同的肿瘤深度都具有较强的绿色荧光，说明HPT纳米粒具有较好的肿瘤穿透深度。而相比于HPT处理组，HPTHPU则具有更强的肿瘤球穿透效应，说明HA和uPA的存在可以通过配体-受体介导的方式进一步增强肿瘤球渗透能力。
试验例6、溶酶体逃逸实验
1、试验方法
本实验采用激光共聚焦显微镜来观察HPTHPU/基因复合物纳米粒进入细胞后的运动情况。首先将处于生长对数期的MDA-MB-231细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，培养12小时使细胞完全贴壁。用YOYO-1按照说明书操作方法将pDNA质粒标记。按照试验例5所述方法制备HPTHPU/YOYO-1-pDNA纳米粒。将HPTHPU/YOYO-1-pDNA纳米粒加入6孔板的各孔中。在加入后的特定时间点(0.5h、2h、4h和6h)吸出每孔中的培养基，用预冷的PBS将细胞洗两次后，分别用Lyso-Tracker Red和DAPI标记细胞的溶酶体和细胞核。之后再将细胞用冷的PBS洗两次，用4％多聚甲醛固定细胞。最后用共聚焦显微镜对细胞进行观察拍照。
2、试验结果
溶酶体中不仅为酸性条件，而且还含有大量能够降解基因分子的核酸酶等，若基因长时间停留在溶酶体中将会被溶酶体中恶劣的条件所降解或分解。因此，溶酶体逃逸性能将是评价基因载体优劣的一个重要指标。由于阳离子聚合物PEI中大量氨基的“质子海绵效应”，所以PEI一般呈现出良好的溶酶体逃逸效应。因此，在此实验中考察了HPTHPU纳米粒是否还保留了良好的溶酶体逃逸性能。将用YOYO-1标记了的pDNA质粒包载到HPTHPU中，然后用Lyso-Tracker Red标记溶酶体，最后用DAPI标记细胞核，以此来观察HPTHPU/YOYO-1-pDNA纳米粒被细胞摄取后在细胞内定位变化的过程。如图12所示，在0.5小时的时候，纳米粒刚刚进入细胞且停留在细胞膜边缘部位；2小时后，纳米粒开始进入溶酶体；4小时后，一部分纳米粒开始逃离溶酶体并进入细胞核中；6小时后，可以明显地看到大部分纳米粒逃离出溶酶体且进入到细胞核中。由此说明，HPTHPU纳米粒依然具有良好的溶酶体逃逸性能。
试验例7、体外细胞转染实验
1、试验方法
将处于生长对数期的MDA-MB-231细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，培养12小时使细胞完全贴壁。将原有的培养基换成既不含血清也不含抗生素的DMEM双无培养基后，将HPT/pGFP纳米粒和HPTHPU/pGFP纳米粒分别加入到6孔板的孔中，平行做3个复孔。培养6个小时后，将孔内培养基吸出换成正常的完全培养基继续培养24小时。同时将PEI 25K、PEI 1.8K和pGFP形成的纳米粒加入6孔板中作为对照。实验结束后，用预冷的PBS清洗细胞1-2次，然后在荧光倒置显微镜上观察绿色荧光蛋白的表达情况并拍照。拍照结束后，用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，用预冷的PBS洗涤2-3次后用流式细胞仪定量检测细胞中绿色荧光蛋白的表达量，即各材料的转染效率。
HPT/pGFP纳米粒是HPT纳米粒与质粒基因pGFP复合后得到的纳米粒，HPT纳米粒与质粒基因pGFP复合的方法同实施例1，仅仅将pDNA替换为质粒基因pGFP。HPTHPU/pGFP纳米粒是HPTHPU纳米粒与质粒基因pGFP复合后得到的纳米粒，HPTHPU纳米粒与质粒基因pGFP复合的方法同实施例4，仅仅将pDNA替换为质粒基因pGFP。
2、试验结果
试验选取了相对较难转染的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231来检验本发明非病毒基因载体的体外细胞转染效率。首先，将基因载体材料与能够编码绿色荧光蛋白的质粒基因pGFP复合到一起形成纳米粒，然后进行细胞转染，最后根据细胞表达绿色荧光蛋白的多少来评价材料的细胞转染效率。实验表明，HPT在细胞中的转染效率随着HPT与pGFP的质量比的增加而升高。当HPT/pGFP的范围在15:1-20:1时，转染效率达到峰值。若HPT/pGFP的比例继续增加时，细胞毒性增加的同时转染效率也出现下降趋势。所以，从节省HPT材料的角度出发，选用15:1作为后续实验的最佳转染比例。即HPT/pGFP纳米粒中HPT纳米粒与质粒基因pGFP的质量比为15:1；HPTHPU/pGFP纳米粒中HPU粉末、HPT纳米粒与质粒基因pGFP的质量比为45:15:1。
如图13所示，HPT在MDA-MB-231细胞中的转染效率为51.7±2.9％，其转染效率明显高于PEI 25K转染效率(38.3±2.7％，P<0.005，该转染效率为PEI 25K的最佳转染效率)。当在HPT表面包裹一层多功能阴离子聚合物HPU时，HPTHPU的转染效率(59.8±2.6％)略高于HPT(P<0.01)，且明显高于PEI 25K(P<0.001)。说明本发明非病毒基因载体具有良好的转染效率，优于现有技术中的PEI-阴离子聚合物复合物。
本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU是一种“核-壳”型的非病毒基因载体，由一个阳离子内核HPT和一个多功能的阴离子外壳HPU通过静电相互作用构成。该非病毒基因载体没有免疫原性，且基本无细胞毒性，具有良好的生物相容性，其带有负电荷，可以克服现有阳离子聚合物基因载体与血液中负电蛋白结合，造成溶血等强毒副作用的问题，能够通过静脉注射用于体内治疗，安全性好。同时，该基因载体能够高效的复合基因，且具有肿瘤双靶向，肿瘤细胞的摄取率高，该基因载体在肿瘤组织中的穿透深度大，可以有效进入肿瘤组织，从而进行有效治疗。并且，该基因载体具有良好的溶酶体逃逸性能，能快速地逃离溶酶体进而将基因递送至细胞核内发挥作用。此外，该基因载体具有良好的转染效率，其转染效率高达60％，明显优于现有技术中的PEI-阴离子聚合物复合物(转染效率大约在40％)。
总之，本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU无免疫原性，具有良好的生物相容性，安全性好；又能高效复合基因，细胞摄取率高，溶酶体逃逸性能良好；同时，其肿瘤穿透深度大，可进入肿瘤组织深处进行治疗，转染效率高于现有PEI-阴离子聚合物复合物。本发明肿瘤靶向多功能非病毒基因载体HPTHPU克服了现有非病毒基因载体转染效率低等诸多问题，在基因治疗领域具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途
<130> GYKH1094-2020P018725CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（穿膜肽Cys-TAT）
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys
1 5 10

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体，其特征在于：它是由一个阳离子内核和一个阴离子外壳通过静电相互作用制备而成；
其中，所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.01～1份，聚乙烯亚胺100～200份，聚乙烯亚胺-穿膜肽10～100份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100～200份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基100～200份，尿激酶型纤溶酶激活物1～10份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺300～600份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯50～100份，穿膜肽100～500份。
2.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于：
所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.01～1份，聚乙烯亚胺100～200份，聚乙烯亚胺-穿膜肽10～100份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100～200份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基100～200份，半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物1～10份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺300～600份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯50～100份，穿膜肽100～500份；
优选地，所述阳离子内核由如下重量配比的原料制备而成：肝素钠0.05份，聚乙烯亚胺140份，聚乙烯亚胺-穿膜肽60份；
所述阴离子外壳由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸100份，马来酰亚胺聚乙二醇氨基124份，半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物7.44份；
所述聚乙烯亚胺-穿膜肽由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺500份，3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯88.5份，穿膜肽457份。
3.根据权利要求1或2所述的非病毒基因载体，其特征在于：
所述聚乙烯亚胺的分子量为1800；
和/或，所述为穿膜肽Cys-TATs，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRRC。
4.根据权利要求1或2所述的非病毒基因载体，其特征在于：
所述肝素钠为活化了羧基的肝素钠；所述透明质酸为活化了羧基的透明质酸；
优选地，所述活化肝素钠羧基的方法为：将肝素钠溶于MES缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺，室温反应1～3小时，即可；
所述活化透明质酸羧基的方法为：将透明质酸溶于MES缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺，室温反应1～2小时，即可；
更优选地，所述肝素钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺的质量比为50：(30～50)：(25～50)；
所述透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基丁二酰亚胺的质量比为100：(10～15)：(5～10)。
5.根据权利要求1或2所述的非病毒基因载体，其特征在于：所述阳离子内核的制备方法包括如下步骤：
将肝素钠加入含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的溶液中，反应，即得；
优选地，所述加入为搅拌速度为1200～3000rpm时滴加；
和/或，所述含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的溶液为含聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺-穿膜肽的水溶液；
和/或，所述反应为室温反应10～12小时；
和/或，所述反应后需要透析，透析的步骤如下：用截留分子量为10000的再生纤维素透析袋在纯水中透析3～5天。
6.根据权利要求1或2所述的非病毒基因载体，其特征在于：所述阴离子外壳的制备方法包括如下步骤：
将马来酰亚胺聚乙二醇氨基加入透明质酸溶液中，反应，透析，将透析后的液体和半胱氨酸标记的尿激酶型纤溶酶激活物加入溶剂中，再次反应，即得；
优选地，所述反应为室温下反应12～24h；
和/或，所述透析为将反应液转入到截留分子量为3500的透析袋中，在纯水中透析3～5天；
和/或，所述溶剂为四氢呋喃和水的混合溶液；
和/或，所述再次反应为室温下反应24～48h；
和/或，所述再次反应后需要透析，透析的步骤如下：将上述反应液用截留分子量为3500的透析袋在纯水中透析3～5天；
更优选地，所述四氢呋喃和水的体积比为1:1。
7.根据权利要求1或2所述的非病毒基因载体，其特征在于：所述聚乙烯亚胺-穿膜肽的制备方法包括如下步骤：
将聚乙烯亚胺溶于溶剂中，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯，反应，除去溶剂；将剩余的残渣加入四氢呋喃和水的混合溶液中，加入穿膜肽，再次反应，即得；
优选地，所述反应为室温反应1～3小时；
和/或，所述溶剂为氯仿；
和/或，所述四氢呋喃和水的混合溶液中四氢呋喃和水的体积比为1：1；
和/或，所述再次反应为室温反应6～10小时；
和/或，所述再次反应后需要透析，透析的步骤如下：将反应液用截留分子量为1000的再生纤维素透析袋在纯水中透析3～5天。
8.一种制备权利要求1～7任一项所述的肿瘤靶向多功能非病毒基因载体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将权利要求1～7任一项所述阳离子内核和阴离子外壳在溶剂中混合后孵育，即得；
优选地，所述阳离子内核和阴离子外壳的质量比为1：(0.5～4)；
和/或，所述溶剂为水；
和/或，所述孵育为室温孵育25～30min；
更优选地，所述阳离子内核和阴离子外壳的质量比为1:3。
9.权利要求1～7任一项所述的肿瘤靶向多功能非病毒基因载体在制备基因治疗的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物是将基因与权利要求1～7任一项所述阳离子内核复合后，按照权利要求8所述的方法将阳离子内核和阴离子外壳孵育即得；
优选地，所述复合为基因与阳离子内核在溶剂中混合后孵育；所述基因与阳离子内核的质量比为1：(5～20)；
更优选地，所述溶剂为水；和/或，所述孵育为室温孵育25～30min。
CN202010131255.7A 2020-02-28 2020-02-28 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途 Active CN113318242B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010131255.7A CN113318242B (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010131255.7A CN113318242B (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113318242A true CN113318242A (zh) 2021-08-31
CN113318242B CN113318242B (zh) 2023-03-10

Family

ID=77413407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010131255.7A Active CN113318242B (zh) 2020-02-28 2020-02-28 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113318242B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030254A1 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2015038892A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN106755027A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 四川大学华西医院 一种用于基因传递的非病毒基因载体及其制备方法和用途
CN107823652A (zh) * 2017-09-20 2018-03-23 南京医科大学 一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途
CN108653747A (zh) * 2017-03-29 2018-10-16 中国科学院上海药物研究所 一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用
CN112386711A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 四川大学华西医院 一种多功能外壳材料pmtph及其制备方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030254A1 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2015038892A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN106755027A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 四川大学华西医院 一种用于基因传递的非病毒基因载体及其制备方法和用途
CN108653747A (zh) * 2017-03-29 2018-10-16 中国科学院上海药物研究所 一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用
CN107823652A (zh) * 2017-09-20 2018-03-23 南京医科大学 一种长循环自组装复合纳米制剂、其制备方法及其用途
CN112386711A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 四川大学华西医院 一种多功能外壳材料pmtph及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, LING等: "Polymeric Nanocarriers for Non-Viral Gene Delivery", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL NANOTECHNOLOGY》 *
LING ZHANG ET AL.: "Gene therapy for C-26 colon cancer using heparin-polyethyleneimine nanoparticle-mediated survivin T34A", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
孙逊等: "阳离子脂质体-DNA复合物与脂质-鱼精蛋白-DNA复合物体外细胞转染率比较", 《生物医学工程学杂志》 *
朱青: "两亲性壳聚糖连接低分子量聚乙烯亚胺为骨架的肿瘤靶向转基因载体的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *
王甜甜: "聚乙烯亚胺和透明质酸的DNA纳米载体的制备与性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *
胡英: "微针介导的基于多重靶向于树突状细胞的抗肿瘤DNA疫苗纳米传递系统研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113318242B (zh) 2023-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. A facile surface modification strategy for fabrication of fluorescent silica nanoparticles with the aggregation-induced emission dye through surface-initiated cationic ring opening polymerization
Jia et al. A γ-cyclodextrin-based metal–organic framework embedded with graphene quantum dots and modified with PEGMA via SI-ATRP for anticancer drug delivery and therapy
Wei et al. Dendrimer‐Stabilized gold nanostars as a multifunctional theranostic nanoplatform for CT imaging, photothermal therapy, and gene silencing of tumors
CN106822036B (zh) 特异靶向多肽自组装纳米载体、载药纳米颗粒及制备方法
EP2276475B1 (en) Biodegradable nanoshells for delivery of therapeutic and/or imaging molecules
Park et al. Multi-modal transfection agent based on monodisperse magnetic nanoparticles for stem cell gene delivery and tracking
Han et al. Functionalization and optimization-strategy of graphene oxide-based nanomaterials for gene and drug delivery
Hu et al. Redox-sensitive folate-conjugated polymeric nanoparticles for combined chemotherapy and photothermal therapy against breast cancer
CN106265514B (zh) 一种盐酸阿霉素磁性纳米粒及其制备方法
CN106890343B (zh) 一种靶向型多肽纳米基因载体复合物
Wang et al. Synthesis and self-assembly of diblock glycopolypeptide analogues PMAgala-b-PBLG as multifunctional biomaterials for protein recognition, drug delivery and hepatoma cell targeting
AU2015205350B2 (en) Magnetic nanoparticles functionalized with cathecol, production and use thereof
Cai et al. Triggered disassembly of hierarchically assembled onion-like micelles into the pristine core–shell micelles via a small change in pH
US9504761B2 (en) Stabilized chitosan-based nanoparticles and methods for making the same
CN111228520A (zh) 一种细胞膜包覆的超小四氧化三铁纳米团簇及其制备和应用
CN104815333B (zh) 一种聚离子胶束纳米粒子的制备方法及其应用
Gao et al. Polyethyleneimine functionalized polymer microsphere: a novel delivery vector for cells
Wan et al. Rapid preparation of hyperbranched β-CD functionalized hydroxyapatite based on host-guest reaction for cell imaging and drug delivery
CN113318242B (zh) 一种肿瘤靶向多功能非病毒基因载体及其制备方法和用途
CN111484622B (zh) 两亲性聚氟化物，其制备方法及用途
CN113105625B (zh) 一种琥珀酸维生素e修饰的聚乙烯亚胺衍生物、制备方法及其应用
CN115043932A (zh) 一种纳米蛋白降解工具、应用及其制备方法
CN112843244A (zh) 一种尺寸可变的智能化载药纳米簇系统及其制备方法和应用
CN106755027B (zh) 一种用于基因传递的非病毒基因载体及其制备方法和用途
CN114984248B (zh) 一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant