KR20170093970A

KR20170093970A - 항원 전달 시스템

Info

Publication number: KR20170093970A
Application number: KR1020177019331A
Authority: KR
Inventors: 캐틀린 씨. 브라운; 벤자민 제이. 움라우프
Original assignee: 에스알아이 인터내셔널
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2017-08-16
Also published as: IL252972A0; US10925960B2; EP3226840A4; EP3226840B1; CA2971408A1; JP2017538754A; JP6832278B2; EP3226840A1; US20170281752A1; CN107223051B; CA2971408C; AU2015364447B2; WO2016100748A1; AU2015364447A1; CN107223051A

Abstract

본 개시는 면역원성 사람 백혈구 항원 (HLA) 클래스 제한된 펩티드로 로딩되고, 표적 세포로의 리포솜의 결합 및 내재화를 매개하는 세포 표적화 펩티드로 표면 수식된 PEG화 스텔스 리포솜으로 필수적으로 이루어진 최소 항원 전달 시스템을 제공한다.

Description

항원 전달 시스템{Antigen Delivery System}

본 출원은 2014년 12월 17일에 출원된 일련 번호 62/093,285에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 암 연구소(National Cancer Institute)가 수여한 수혜 번호 R01CA164447 하 및 국립 과학 재단 대학원 연구 장학지원(National Science Foundation Graduate Research Fellowship)이 수여한 수혜 번호 146339 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

암 치료를 위한 세포-매개 (CM) 면역요법은 악성 성장에 대한 신체의 적응 면역 반응을 활성화하기 위해 고안된다 (1,2). 일반적으로, CM 반응의 목표는 종양에 대한 세포독성 T-세포 반응을 활성화하여 암 세포를 제거하는 것이다. 이러한 치료의 원리는 간단하지만, 종양 미소환경의 복잡성 (2,3) 뿐만 아니라 종양 항원에 대해 T 세포를 직접 활성화하려고 시도하는 방법 (4-6)을 연구하는 현재 연구는 종양에 대한 면역 반응의 생성과 관련된 어려움을 보여준다.

PD-1 억제제, 종양에 살아있는 바이러스 또는 바이러스 입자 주입, 및 차용 T-세포 요법을 비롯하여, 오늘날 여러 CM 암 면역요법이 존재한다 (1,6-8). 그러나, 효능, 안전성, 및/또는 비용에 관한 우려는 이러한 치료 상당수의 사용을 제한하였다. 이러한 우려를 해결하기 위해, 우리는 살아있는 바이러스, 바이러스 소단위, 또는 생물학적으로 유래된 물질을 사용하지 않고 암세포에 특이적으로 사람 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 제한된 면역원성 펩티드의 제시를 촉진하는 완전 합성, 최소 전달 시스템에 기반한 신규한 치료를 개발하는 것을 추구했다.

이러한 요구에 기초하여, 우리는 합성적으로 제조된 면역원성 HLA 클래스 I 제한된 펩티드를 캡슐화하는 중성, 스텔스 리포솜으로 이루어진 리포솜 기반 작용제를 개발했다. 또한, 리포솜은 암 세포에 특이적으로 축적되고 또한 HLA 클래스 I 분자 내 면역원성 펩티드의 제시를 촉진하는 표적화 펩티드를 외부 표면 상에 갖는다. 따라서, 이 치료는 종양에 특이적인 2차 CM 면역 반응을 일으키기 위해 고안된다.

본 발명은 암 세포에 특이적으로 면역원성 홍역 항원의 제시를 촉진하는 나노입자 전달 시스템을 제공한다. 전달 시스템은 바이러스 입자, 독소, 또는 생물학적으로 유래된 물질을 함유하지 않는다. 이러한 시스템으로의 치료는 암 세포에 대한 2차 면역 반응의 활성화를 촉진하고, 종양-관련 항원을 식별하거나 1차 면역 반응을 통해 면역 시스템을 단련할 필요를 회피한다. 전달 시스템은 세 부분 모듈식 비히클이고, 단지 스텔스 리포솜을 필요로 하며, 이는 그것의 외부 표면 상에 암-특이적 표적화 펩티드를 전시하고 면역원성 사람 백혈구 항원 클래스 1 제한된 펩티드를 캡슐화한다. 이러한 표적화된-나노입자는 주조직적합성 복합체 클래스 I 분자 내 펩티드의 제시를 촉진한다. 활성화는 표적화 펩티드, 과거 항원 노출에 의존하고, 신규한 자가포식-매개 메커니즘을 사용하여 제시를 촉진한다. 이러한 리포솜으로 치료한 결과 백신접종된 C57BL/6 마우스에서 공격적 LLC1 모델을 사용하는 종양 성장이 상당히 감소된다. 우리는 확장가능하고 생물학적으로 유래된 물질을 함유하지 않으며 효능있는 암 요법인 신규한 세포-매개 면역 요법에 대한 원칙의 증거(proof-of-principle)를 입증한다.

본 발명은 면역원성 사람 백혈구 항원 (HLA) 클래스 1 제한된 펩티드로 로딩되고, 표적 세포로의 리포솜의 결합 및 내재화를 매개하는 세포 표적화 펩티드로 표면-수식된 PEG화 스텔스 리포솜으로 필수적으로 이루어진 최소 항원 전달 시스템을 제공한다. 따라서, 시스템은 3 개 이하의 열거된 성분: 스텔스 리포솜, 표적화 펩티드 및 HLA 클래스 1 제한된 펩티드로 이루어지거나 또는 필수적으로 이루어지고/거나 (시스템의 기본적이고 신규한 작동성 및 기능에 실질적으로 영향을 미칠 수 있는 임의의 추가적 성분 제외) 필요로 하거나, 기능적으로 의존하거나, 또는 포함한다.

시스템은 모듈식이고 대안적인 표적화 및/또는 면역원성 펩티드에 적용될 수 있다. 다양한 종류의 세포 표적화 펩티드가 해당 기술분야에 공지되어 있고, 다양한 세포 유형 중 어느 것의 표적화를 위한 적합한 펩티드가 예를 들면 본 명세서에 기재된 대로, 용이하게 선택되며, 바람직한 표적 세포는 병원성이고, 예를 들면 암세포이다. 유사하게, 다양한 종류의 면역원성 펩티드가 해당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 본 명세서에 기재된 대로, 대안적인 HLA 유형 및 면역/백신접종 의존성의 적합한 펩티드가 용이하게 선택된다. HLA 분류는 임상 실무에서 표준화되어 있고, 대체 면역된 (자연적으로 또는 백신접종) 집단은 용이하게 식별할 수 있으며; 예를 들어, 우리는 천연두 바이러스 (H-2Kd-제한된 우두-특이적 펩티드, A5275-83, VACV-A52)에서 유래한 항원을 유사하게 시험하고 입증했다.

예시적 실시양태에서, HLA 클래스 1 제한된 펩티드는 홍역 바이러스 적혈구응집소 펩티드 H250이고/거나 세포-표적화 펩티드는 H1299.3인 암 세포 표적화 펩티드이다.

본 발명은 또한 클래스-1 제한된 펩티드의 존재 하 리포솜을 형성하여 PEG화 스텔스 리포솜을 로딩하고/거나, 세포 표적화 펩티드를 표면에 접합시켜 HLA 클래스 제한된 펩티드로 로딩된 PEG화 스텔스 리포솜을 표면 수식하는 단계(들)을 포함하는, 대상 항원 전달 시스템의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 항원 전달 시스템을 그를 필요로 하는 숙주에 도입하고/거나 표적 세포의 결과적 면역 반응 또는 억제를 검출하는 단계(들)을 포함하는 대상 항원 전달 시스템의 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 열거된 실시양태의 모든 조합을, 각각을 힘들여 개별적으로 기술한 것 같이 구체적으로 제공한다.

본 개념의 입증(proof-of-concept) 연구에서, 우리는 홍역 적혈구응집소 단백질로부터 확인된 면역원성 HLA 클래스 1 제한된 펩티드인 H250 (1)을 캡슐화하는 리포솜을 합성했다. 리포솜은 외부 표면 상에 표적화 펩티드 H1299.3을 전시하는 것에 의해 암 세포에서 특이적으로 내재화하도록 고안된다 (10). H1299.3은 세포내이입이라는 정해진 메커니즘을 통해 암 세포에 우선적으로 내재화하는 암-특이적 표적화 펩티드를 선별할 수 있는 신규한 파지 디스플레이 기술을 사용하여 식별된 20머(mer), 암-특이적 표적화 펩티드이다. 이 펩티드는 리신 중심에서 이합체를 이루었고 파지 입자의 상황 외에서 완전히 기능적이다. H1299.3 펩티드는 세포내이입의 클라트린-의존성 메커니즘을 통해 정상 기관지 상피 세포 대조군 세포주와 비교시 비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주의 패널에 특이적으로 축적된다. 이 연구에서, 우리는 H1299.3이 CD8+-특이적 인터페론 (IFN)γ 분비에 의해 나타난 바와 같이 주조직적합성 복합체 (MHC) 및 HLA 클래스 I 분자 모두에서 면역원성 항원의 기능적 제시를 촉진한다는 것을 밝힌다. 또한, H1299.3 촉진 제시는 자가포식-의존성 메커니즘을 사용한다. 마지막으로, H250를 함유하는 H1299.3 표적화된 리포솜으로의 처리는 비히클 대조군으로의 처리와 비교시 백신접종된 C57BL/6 마우스에 이식된 피하 LLC1 종양의 성장 속도를 실질적으로 감소시켰다.

암 세포에 특이적으로 바이러스-항원을 제시하기 위한 표적화된 리포솜의 생성. 본 연구의 첫번째 목표는 항원성 화물을 암 세포에 특이적으로 전달하는데 적합한 합성 전달 시스템을 만드는 것이다. 비히클은 높은 탑재량을 수용해야 하고 면역원성 펩티드 화물을 수식 없이 보호할 필요가 있는데 HLA 클래스 I 분자의 제시가 아미노산 잔기의 크기 및 위치에 의해 제한되기 때문이다 (11). 따라서, 우리는 리포솜을 사용하기로 결정했다. 리포솜은 합성 물질로부터 용이하게 제조되고, 합성 펩티드로 용이하게 로딩되며, 표적화 리간드로의 수식을 잘 받아들인다 (12). 또한, 리포솜은 향상된 투과성 및 보유 효과를 토대로 종양에 수동적으로 축적되고, 이는 치료의 특이성을 잠재적으로 향상시킨다 (13). 우리는 합성적으로 제조된 9머 면역원성 펩티드인 H250을 대략 60 %의 로딩 효율로 캡슐화하는 100-nm 스텔스 리포솜을 제조했다. 말레이미드로 수식된 DSPE PEG2000은 리포솜에 티올 함유 표적화 리간드의 접합을 허용하기 위해 지질 제형물에 도입된다 (12).

H1299.3 표적화 리간드는 암에 특이적으로 축적되고 HLA 클래스 I 제시를 촉진한다. H250 면역원성 펩티드의 제시를 촉진하는 리포솜 제형물의 능력을 정량화하기 위하여, 먼저 우리는 H250이 HLA 클래스 I 분자의 틈에 존재하는지 결정하기 위한 시스템을 개발할 필요가 있었다. H250은 홍역 감염 후 HLA A*0201 분자에 존재하는 펩티드를 서열분석하여 확인된 면역원성 펩티드이다 (1). 따라서, 우리는 HLA A*02 양성인 익명의 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 확인했고, 기증자 PBMC를 자유 H250 펩티드와 함께 배양하고 IFNγ 분비를 측정하여 이들 기증자가 홍역에 대해 백신접종되었는지 결정했다. 우리는 2 명의 기증자가 HLA A*02 양성이고 홍역 바이러스에 대해 이전에 백신접종 되었음을 성공적으로 확인했다. 이들 2 명의 기증자인 D4 및 D9로부터의 PBMC는 HLA 클래스 1 제시를 촉진할 수 있는 암-특이적 표적화 펩티드를 식별하고 특성화하기 위해 추후의 분석에서 사용되었다. 유사하게, 항원-제시 세포로 사용할 적절한 암 세포주가 필요했다. 이를 위해서, 우리는 인간 NSCLC 세포주인 H1993을 사용했고, 우리는 이것이 HLA A*02 양성임을 확정했다.

다음으로, 우리는 세포의 외부 표면 상에 HLA 클래스 I 에서 표적화된 리포솜 제형물로부터 H250의 제시를 촉진할 수 있는 표적화 펩티드를 확인하기 위해 공지된 암-특이적 표적화 펩티드를 스크리닝했다. 우리 그룹과 다른 이들이 암 표적화 펩티드의 패널을 확인했고; 그로써, 우리는 H1993으로 내재화하는 3 가지 상이한 암-특이적 표적화 펩티드를 확인했으며 이는 이전에 H1299.2, H2009.1, 및 H1299.3으로 게재된 바 있다. 이들 펩티드 각각은 정상 기관지 상피 세포와 비교시 NSCLC 세포주에 특이적으로 내재화한다 (14). 펩티드는 표적화 펩티드 상의 단일 설프히드릴기가 리포솜 상에 존재하는 말레이미드에 마이클 첨가된 결과 티올-에스테르 결합에 의해 리포솜의 표면에 접합 되었다. H1993 세포로 내재화하지 않는 펩티드인 H460.1을 대조군으로 사용했다 (14).

각 표적화 펩티드를 스크리닝하기 위해, H1993 세포를 H250을 함유하는 H1299.2, H2009.1, H460.1, 또는 H1299.3 표적화된 리포솜으로 3 시간 동안 처리했다. 이후 세포를 세척하여 비내재화/결합 리포솜을 제거한 후 72 시간 동안 기증자 PBMC와 공동배양했다. 세포 배양 상등액을 회수하고 T-세포 활성화의 척도로서 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 통해 IFNγ 분비에 대해 분석했다. 본 분석에서 양성 대조군으로 자유 H250 펩티드를 사용했다. H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜만이 IFNγ (Quench)의 상당한 증가를 일으켰고 H250를 함유하는 H1299.3 표적화된 리포솜 (H1299.3)과 비교했다. 처리된 H1993 세포를 상기 기재한 바와 같이 기증자 PBMC와 공동배양했다. 다시 한번, H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜만이 IFNγ 분비에서 상당한 증가를 일으켰다. 이러한 데이터는 제시가 H250 항원성 펩티드 및 H1299.3 표적화 펩티드 모두에 의존한다는 추가적 증거를 제공한다. 이러한 결과는 2번째 PBMC 기증자, D9를 사용했을 때 되풀이되었고, 이는 제시가 환자 특이적이 아님을 나타낸다. PBMC 배양액에서 CD8+ T 세포를 제거한 결과 두 인간 시료 모두에서 IFNγ 분비가 손실되었다. 이러한 데이터는 H250이 HLA 클래스 I 분자에 존재하고 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜이 홍역에 대해 이전에 백신접종된 개체에서 CD8+ 기억 T-세포 반응의 활성화를 촉진한다는 것을 나타낸다.

이 치료에 의해 생성되는 면역 반응을 더욱 특성화하기 위하여, 우리는 공동배양 상등액 내 분비된 TNFα의 수준을 정량화했다. 상기 언급된 데이터와 유사하게, 우리는 인간 기증자 둘 모두에서 빈 리포솜으로 처리된 H1993 세포에 비해 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리된 H1993 세포에서 TNFα 분비가 상당히 증가함을 관찰했다. CD8+을 제거하자, H250을 함유하는 H1299.3 표적화된 리포솜으로 H1993 세포를 처리 후 TNFα 분비의 감소가 관찰된다.

이들 연구의 폭을 넓히기 위해, 우리는 H1299.3 표적화 펩티드를 내재화하는 C57BL/6 마우스, 루이스 폐암종1 (LLC1)에서 유래된 쥐 폐암 세포주를 확인했다. 이후 우리는 H250의 확장 버전으로 C57BL/6 마우스를 백신접종하고 이어서 CD8+ T 세포의 공급원으로서 림프구를 회수하여 H250으로 로딩된 MHC 클래스 I를 인식하는 TCR을 갖는 쥐 CD8+ T 세포를 생성했다 (1). LLC1 세포를 대조군 또는 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리하고, 세척하고, 이후 인큐베이션했다. 림프구 풀에서 CD8+ T 세포를 제거한 결과 인간 데이터와 유사하게 IFNγ 분비가 상당히 손실되었다. 따라서, H1299.3-표적화된 리포솜 시스템은 MHC 및 HLA 클래스 I 분자 모두에서 기능적 제시를 위해 H250을 전달할 수 있다.

H1299.3 촉진된 HLA 클래스 I 제시는 자가포식을 필요로 한다. H1299.3이 HLA 클래스 I 분자에서 H250의 제시를 촉진하는 메커니즘을 결정하기 위해, 우리는 H1299.3 펩티드의 세포하 축적을 특성화했다. 이전 데이터는 새롭게 확인된 H1299.3 펩티드가 램프(Lamp)-1과 공동위치하는 반면 (10) 다른 암-특이적 표적화 리간드 H1299.2 및 H2009.1은 핵주위 영역에 축적됨을 밝혔다 (14). 따라서, 우리는 세포하 소통 패턴이 H1299.3 촉진 제시에 결정적이라고 판단했다 (14). 이전 결과와 유사하게, H1299.3 및 램프-1은 H1993 및 LLC1 세포주 모두에서 공동위치하고 이는 살아있는 세포 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 의해 결정된 바이다. 그러나, 이들 데이터는 제시의 메커니즘에 대해 명확한 설명을 제공하지 않는다. 램프1은 리소좀 및 자가리소좀 모두에 대한 표지이고 (15) 이는 자가포식이 이 프로세스에서 역할할 가능성을 제기한다. 이 가설을 시험하기 위하여, 자가포식소체에 대한 표지인 GFP-LC3B 구축물을 함유하는 LLC1 및 H1993 세포를 사용하여 영상화 실험을 반복했다. 두 세포주 모두에서 LC3B 점과의 명확한 공동위치화가 관찰되었고 이는 H1299.3이 자가리소좀을 축적한다는 것을 나타낸다. 중요하게, H1299.3의 뒤섞인 서열 버전으로 해당하는 세포를 처리한 결과 유의미한 펩티드 내재화가 없었고 따라서 램프-1 또는 LC3B과 공동위치화가 없었다. 종합하면, 데이터는 자가포식소체에서 H1299.3 펩티드의 서열-의존적 공동위치화를 나타낸다.

H1299.3이 자가포식 소포에 축적되는 경우, 자가포식을 교란시키면 그 결과H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리 후 MHC 클래스 I 분자에서 H250 제시가 손실되어야 한다. 상기 제시된 인간 공동배양 분석과 유사한 방식으로 LLC1 세포를 억제제인 클로로퀸과 마우스 림프구의 존재 하 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리했다. 인간 데이터와 유사하게, H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리한 결과 대조군 클로르프로마진, 니스타틴, 및 보르트만닌과 비교시 IFNγ 분비에 상당한 증가가 있었다. 펩티드 소통이 일어나게 한 후, LLC1 세포를 고정시키고 상기 기재된 대로 림프구와 공동배양했다. 자가포식의 공지된 억제제, 예컨대 보르트만닌 및 클로로퀸으로 처리한 결과, 대조군과 비교시 IFNγ 분비가 상당히 감소했다. 클라트린-매개 세포내이입의 억제제인 클로르프로마진은 제시를 감소시켰다. 이것은 H1299.3 펩티드가 클라트린-매개 메커니즘을 통해 내재화되고, 펩티드의 세포 섭취가 클로르프로마진의 존재하 감소된다고 밝힌 우리의 과거 결과와 일치한다 (10). 콜레스테롤-의존성 세포내이입의 억제제인 니스타틴은 효과가 없었다.

H1299.3 촉진 제시에서 자가포식의 역할을 추가로 입증하기 위하여, LLC1 세포를 자가포식-관련 단백질 7 (ATG7)을 표적으로 하는 siRNA로 처리했다. siRNA에 의한 LLC1 세포에서의 ATG7-특이적 녹다운(knockdown)은 β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하여 웨스턴 블롯을 통해 정량화했다. ATG7-특이적 올리고로 처리한 결과 ATG7 단백질 수준이 ~80 % 감소했고 ATG7 수준의 최소 감소는 대조군 siRNA 헤어핀을 사용했을 때 관찰된다 (16). ATG7의 녹다운은 siRNA 미처리 LLC1 세포 또는 대조군 siRNA 처리 LLC1 세포와 비교시 H250을 함유하는 H1299.3 표적화 리포솜과 함께 인큐베이션한 LLC1 세포에서 IFNγ 분비를 상당히 감소시켰다. 우리는 ATG7 녹다운 분석을 H1993 세포에서 반복했다. LLC1 세포와 유사하게, 우리는 웨스턴 블롯을 통해 ATG7를 표적으로 하는 siRNA 올리고를 처리한 H1993 세포에서 ATG7 단백질 수준이 ~80 % 감소함을 관찰했다. 대조군 siRNA으로의 처리는 ATG7 수준에 영향을 미치지 않았다. H1993 세포에서 ATG7 녹다운 결과 대조군과 비교시 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리하고 D9 PBMC과 공동배양한 후 IFNγ 분비가 상당히 감소했다. 따라서, 현미경 및 표현형 데이터는 H1299.3이 자가포식-의존성 메커니즘을 통해 H250의 제시를 촉진한다는 것을 암시한다.

H250을 캡슐화하는 H1299.3-표적화된 리포솜은 생체 내에서 종양 부담을 감소시킨다. 다음으로 우리는 쥐 모델에서 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜을 사용하여 CM 면역요법으로서 이러한 플랫폼의 효능을 결정했다. C57BL/6 마우스를 H250에 대해 백신접종했고 이후 뒷 옆구리에 LLC1 세포를 피하 이식했다. LLC1 종양을 촉진할 수 있을 때까지 성장시켰고 (~150mm³) 이 시점에 마우스는 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜 또는 H250 면역원성 펩티드가 없는 비히클로 6 번 정맥내 (I.V.) 처리되었다. 우리는 3번째 처리 이후 처리된 그룹에서 LLC1 종양 성장 속도가 유의미하게 감소함을 관찰했다. 종양을 체외이식한 후, 우리는 종양 중량 및 부피의 > 2 배 감소를 관찰했다.

종양 효능 연구 동안, 그룹 간 동물 체중에 유의미한 차이는 관찰되지 않으며, 동물은 체중 손실을 나타내지 않는다. 종합하면, 이러한 데이터는 동물이 처리로부터 육안적인 독성을 겪지 않는다는 것을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 리포솜은 간을 통해 제거되므로 이는 간 독성의 가능성을 제기한다. 그렇기 때문에, 우리는 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜 또는 비히클 대조군으로 3 번 처리한 후 피하 LLC1 종양을 갖는 백신접종되지 않은 마우스에서 AST 및 ALT의 혈청 수준을 정량화했다. 모든 값은 정상 범위 내에 있고 이는 근소한 간 독성을 나타낸다. 또한, 간, 콩팥, 심장, 및 폐 조직을 수거하고, 절개하고, 및 H&E로 염색했다. 이들 기관의 절편으로부터 처리 또는 비히클 그룹에서 육안으로 비정상이 확인되지 않았다.

마지막으로, 시험관 내 데이터와 생체 내 데이터를 연관시키기 위하여, 종양을 절개하고 CD8+ 세포에 대해 염색했다. 비히클-처리된 종양과 비교시 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리된 종양에서 CD8+ 세포의 10 배 증가가 관찰되었고 CD8+ T-세포 반응을 입증하는 시험관 내 데이터와 일치한다. H1299.3-표적화된 리포솜이 생체 내에서 H250을 전달한다는 것을 추가로 뒷받침하기 위해서, 피하 LLC1 종양을 갖고 백신접종되지 않은 마우스를 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜 또는 비히클 대조군으로 3 번 처리했다. 이후 이들 마우스의 종양 및 간 조직을 수거하고 종양 세포 및 간세포의 단일 세포 현탁액을 제조했다. 이들 1차 세포를 백신접종된 C57BL/6 마우스 유래 림프구를 사용하는 상기 약술한 공동배양 분석에서 항원-제시 세포 (APC)로서 직접 사용했다. H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜을 처리한 종양 세포는 비히클-처리된 종양 세포와 비교시 IFNγ 분비의 상당한 증가를 유도했다. 따라서, H1299.3 리포솜 제형물은 종양에 H250을 전달할 수 있고 H250 펩티드는 생체 내에서 종양 상의 MHC 클래스 I 분자에 제시된다. 그에 비해, 간세포를 APC로 사용시, 양쪽 그룹에서 IFNγ 분비 수준이 다르지 않았다. 따라서, 리포솜이 간에 축적되더라도, H250은 MHC 클래스 I에 제시되지 않고 이는 간 세포에 대해 생성된 CM 면역 반응의 결여로 측정된 바이다. 요컨대, 이들 데이터는, H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로의 처리는 비독성이고 H1299.3은 생체 내에서 종양에 우선적으로 H250의 제시를 촉진할 수 있음을 암시한다.

우리는 암 세포에서 HLA 클래스 1 제한된 면역원성 펩티드의 제시를 촉진하여 종양에 대한 2차 면역 반응을 일으키는 최소 전달 시스템의 개발에 기초하여 신규한 암 면역요법을 제시한다. 이러한 접근법은 암 백신 개발에서 주요한 장애물인, 종양-관련 항원을 식별하거나 종양에 대한 1차 면역 반응을 일으킬 필요를 회피한다. 면역조절제와는 달리, 우리의 리포솜 전달 접근법에 의해 일어난 면역 반응은 항원 특이적이고 면역 반응의 전반적이고 일반적인 활성화를 수반하지 않는다. 이것은 자가면역 및 표적을 벗어난 영향에 관한 문제를 최소화한다. 또한 이 프로토콜은 현재의 바이러스-기반 면역요법과 다른데, 바이러스 제품 또는 살아있는 바이러스가 사용되지 않아서 이러한 유형의 요법과 관련된 안전 우려를 줄이기 때문이다. 우리의 접근법의 잠재적 단점은 바이러스 감염으로 발생하는 염증성 상태를 일으킬 가능성이 낮아서, 잠재적으로 면역 반응의 효력을 감소시킨다는 것이다. 부분적으로, 이러한 문제는 면역 반응을 일으키기 위해 염증성 투입을 더 적게 필요로 하는 2차 면역 반응을 사용하여 완화된다. 또한, 종양 미소환경은 염증성 상태를 나타내고 이 경우에 우리의 요법이 사이토카인 투입을 위해 이 상태를 이용할 수 있다는 증거가 존재한다 (3).

HLA 클래스 I 제시를 촉진하기 위해 전달 리간드를 사용하는 것은 클래스 I 제한된 면역원성 펩티드에 융합된 콜레라 또는 시가(Shiga) 독소를 사용하여 이전에 성취된 적이 있다 (17-19). 그러나, 이들 독소는 세포에 무차별적으로 축적되고 암세포에 특이적으로 표적화되지 않는다. H1299.3은 암 세포에 선택적으로 축적되고 정상 인간 기관지 상피 세포에 제한된 결합을 보이므로 잠재적으로 더 큰 치료법 범위를 제공한다 (20, 21).

더욱이, 콜레라 또는 시가 독소를 제조하기 위해 생물학적 합성이 필요하고 독소-캐리어의 면역원성에 대한 우려가 남는다. 또한, 이 연구는 표적화 작용제가 세포 표면에 합텐을 전달하여 항체 모집을 일으키는 합텐 페인팅(hapten painting) 또는 항체-모집 전략과 다르다. 본 원고에 제시된 요법은 세포 표면 상에 합텐을 고정화시켜 항체-의존성 세포적 세포독성을 일으키기보다는 오히려 내재화 메커니즘을 통해 암 세포에 HLA 클래스 I 제한된 항원을 특이적으로 제시하여 T 세포를 직접적으로 활성화시키도록 고안된다 (22, 23).

H1299.3은 면역원성 펩티드의 제시를 촉진하기 위해 자가포식-의존성 메커니즘을 사용한다. 이전 데이터와 결합하면, H1299.3은 클라트린-매개 세포내이입을 통해 내재화하고 리소좀 또는 자가리소좀에 소통하는 것으로 보인다. 자가포식은 고전적 클래스 II 제시에 수반되는 것으로 이해되지만 클래스 I 항원 제시에서 그것의 역할은 아직 판명되는 중이다. 여기에서 우리 데이터는 최근 보고와 함께 자가포식이 클래스 I 제시에도 참여할 수 있다는 것을 나타낸다 (24,25). 우리는 H250 펩티드가 자가리소좀의 내용물과 함께 세포질로 재활용되어 돌아가고 그로써 TAP에 의한 ER로의 수송 및 잇따른 제시를 가능하게 한다는 가설을 세웠다 (15,26).

복수개의 세포하 위치는 세포질, 소포체, 및 분비 네트워크를 포함하는 HLA 클래스 I 경로에 반영된다. 중요하게, 앞서 언급한 콜레라 독소 B 제시 전략은 골지 분비 네트워크를 사용한다 (20, 27). 이것은 복수개의 세포하 위치로 소통하는 리간드가 이 CM 면역요법에 사용하기에 적합할 수 있음을 암시한다. 그러나, 우리의 데이터는 면역원성 펩티드가 유효하기 위해서 HLA 클래스 1 제시 경로에 공급될 필요가 있음을 나타낸다. 적당한 예로, H1993 세포에 결합하고 내재화되는 다른 NSCLC-표적화 펩티드는 제시를 촉진하지 않았다 (14).

이들 펩티드는 핵주위 구획에 축적되고 격리된채 남고; 따라서 항원성 펩티드의 세포내 전달은 반드시 항원의 제시를 일으키지는 않는다. 본 치료는 종양에 대해 더 급속하고 잠재적으로 효능있는 면역 반응을 허용하는 2차 면역 반응을 끌어내기 위해 고안된 것이다. 그러나, 그것은 또한 요법이 HLA 유형 및 백신접종 상태 모두에 종속적인 것이 필요하게 만든다 (1,28). HLA 분류는 임상 실무에서 표준화되어 있으나, 상이한 HLA 유형에 결합하는 면역원성 펩티드를 확인할 필요가 있을 것이다. 또한, 미국인의 ~95 %가 홍역에 대해 백신접종을 받았지만 많은 환자의 경우 그것은 수년 전이었을 수 있고 이는 효능있는 치료를 위해 홍역 바이러스에 대한 면역 반응을 정량화할 필요를 암시한다 (29) 본 치료가 여러 변수에 종속적이지만, 그것은 또한 본질적으로 모듈식이며, 대안적인 표적화 및/또는 면역원성 펩티드에 적용될 수 있다.

백신접종된 마우스를 H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜으로 처리한 결과 H250이 없는 H1299.3-표적화된 리포솜과 비교시 LLC1 피하 종양 성장이 유의미하게 감소했다. 이것은 공격적인 암 계통인바 효능있는 요법의 강한 잠재성을 나타낸다. H250을 함유하는 H1299.3-표적화된 리포솜을 처리한 마우스에서 유래한 APC를 사용하여 증가된 종양 절편 내 CD8+ T 세포의 존재 및 CD8+ T 세포의 생체 외 활성화는 이 치료가 생체 내에서 LLC1 종양 세포에 대한 세포독성 T-세포 반응을 일으키는 것에 의해 작용한다는 것을 암시하고 제시된 시험관 내 쥐 및 인간 데이터와 일치한다. Th1-유사 반응을 일으키고 침투하는 CD8+의 수준을 증가시키는 다른 CM 요법은 동물 및 인간 실험 모두에서 효능이 입증되었다 (4,6,7,30). 따라서, 여기에 제시된 요법은 현재 CM 요법과 비교시 더 안전하고 비용-효율적인 방식으로 유사한 이로운 면역 활성화를 달성한다.

결론적으로, 본 연구는 거짓감염된 암 세포를 생성하는 최소 전달 플랫폼의 개발에 기반한 신규한 암 면역요법을 제시한다. 우리는 면역원성 펩티드를 함유하는 표적화 리포솜이 HLA 클래스 1 분자에서 제시를 촉진할 수 있고, 본 치료가 신규한 암 면역요법으로서 효능이 있을 수 있다는 원칙의 증거를 입증한다.

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본 발명은 열거된 특정 및 바람직한 실시양태의 모든 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태가 설명적인 목적일 뿐이고 그것에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 해당 기술분야의 숙련자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 발간물, 특허, 및 특허 출원은, 그 안의 인용을 비롯하여, 모든 목적을 위해 그들의 전체로서 여기에 참조로 인용된다.

Claims

면역원성 사람 백혈구 항원 (HLA) 클래스 제한된 펩티드로 로딩되고, 표적 세포로의 리포솜의 결합 및 내재화를 매개하는 세포 표적화 펩티드로 표면-수식된 PEG화 스텔스 리포솜으로 필수적으로 이루어진 최소 항원 전달 시스템.
제1항에 있어서, HLA 클래스 1 제한된 펩티드는 홍역 바이러스 적혈구응집소 펩티드 H250인 시스템.
제1항에 있어서, 세포-표적화 펩티드는 H1299.3인 암 세포 표적화 펩티드인 시스템.
제1항에 있어서, HLA 클래스 1 제한된 펩티드는 홍역 바이러스 적혈구응집소 펩티드 H250이고, 및 세포-표적화 펩티드는 H1299.3인 암 세포 표적화 펩티드인 시스템.
세포 표적화 펩티드를 표면에 접합시켜 HLA 클래스 제한된 펩티드로 로딩된 PEG화 스텔스 리포솜을 표면 수식하는 단계(들)을 포함하는 제1항에 따른 항원 전달 시스템의 제조 방법.
HLA 클래스 제한된 펩티드의 존재 하 리포솜을 형성하여 PEG화 스텔스 리포솜을 로딩하고;
세포 표적화 펩티드를 표면에 접합시켜 HLA 클래스 제한된 펩티드로 로딩된 PEG화 스텔스 리포솜을 표면 수식하는 단계(들)을 포함하는 제1항에 따른 항원 전달 시스템의 제조 방법.
항원 전달 시스템을 그를 필요로 하는 숙주에 도입하는 단계(들)을 포함하는 제1항에 따른 항원 전달 시스템의 사용 방법.
항원 전달 시스템을 그를 필요로 하는 숙주에 도입하고,
표적 세포의 결과적 면역 반응 또는 억제를 검출하는 단계(들)을 포함하는 제1항에 따른 항원 전달 시스템의 사용 방법.