BR112021007418A2

BR112021007418A2 - moléculas quiméricas

Info

Publication number: BR112021007418A2
Application number: BR112021007418-0A
Authority: BR
Inventors: Jan KISIELOW; Franz Josef OBERMAIR; Manfred Kopf
Original assignee: ETH Zürich
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-08-10
Also published as: US20210324037A1; CN112930355A; MX2021004355A; JP2022505107A; WO2020079264A1; EA202191083A1; EP3867268A1; CA3115007A1; AU2019362400A1; KR20210081345A; IL282230A

Abstract

MOLÉCULAS QUIMÉRICA. A presente invenção refere-se a um método para detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígenos e de peptídeos especificamente reconhecidos por seus receptores de células T (TCRs). O método também permite a identificação de antígenos específicos de células T para intervenções in vivo e/ou in vitro, incluindo vacinação, indução de tolerância imunológica, bloqueio de TCRs e administração de toxina mediada por MHC, para teste de imunogenicidade e outros testes de reatividade de células T in vitro. A presente invenção também refere-se às moléculas quiméricas usadas nos referidos métodos.

Description

MOLÉCULAS QUIMÉRICAS

[001] A presente invenção refere-se a um método para detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígenos e de peptídeos especificamente reconhecidas por seus receptores de células T (TCRs). O método também permite a identificação de antígenos específicos de células T para intervenções in vivo e/ou in vitro, incluindo vacinação, indução de tolerância imunológica, bloqueio de TCRs e administração de toxina mediada por MHC, para teste de imunogenicidade e outros testes de reatividade de células T in vitro. A presente invenção também refere-se às moléculas quiméricas utilizadas nos referidos métodos.

[002] À medida que a medicina nas sociedades afluentes entra em uma nova era de personalização, a maioria das terapias e produtos médicos está sendo progressivamente adaptada para o paciente individual. No caso das imunoterapias, as especificidades antigênicas das células T entram em foco e sua identificação imparcial e eficiente torna-se de importância central.

[003] Em particular, o desenvolvimento de vacinas contra o câncer com base no antígeno tumoral específico (TSA) está entre os principais objetivos da medicina moderna.

[004] Os peptídeos tumorais específicos, chamados neoantígenos, estão presentes apenas nas células tumorais e totalmente ausentes do tecido normal. Esses peptídeos tumorais específicos são criados por alterações de DNA tumoral específico que resultam na formação de novas sequências de proteínas. Os peptídeos tumorais específicos são exibidos no contexto do MHC na superfície das células tumorais e assim chamados de células de apresentação do antígeno (APCs). APCs, tais como células dendríticas ou macrófagas, podem internalizar antígenos por fagocitose ou por endocitose mediados por receptor. As moléculas de MHC desempenham um papel importante na apresentação de antígenos celulares na forma de peptídeos lineares curtos para as células T. Eles interagem com os receptores de células T (TCRs) presentes na superfície das células T, o que leva à ativação das células T. O MHC consiste em cadeias alfa e beta, além de um peptídeo ligado a um sulco formado por essas cadeias. A estabilidade desse complexo é altamente dependente da ligação do peptídeo, de modo que as moléculas de MHC vazias são reguladas para baixo a partir da superfície da célula e degradadas. No entanto, moléculas de MHC vazias existem na superfície das células e podem se ligar a peptídeos extracelulares e apresentá-los às células T.

[005] Uma vez que os peptídeos tumorais específicos são apresentados na superfície da célula, a célula pode ser reconhecida e destruída pelo sistema imunológico. Assim, vacinas contendo peptídeos tumorais específicos podem estimular o sistema imunológico a detectar e destruir células cancerosas que apresentam essas moléculas em sua superfície.

[006] Receptores de células T (TCRs) se ligam a complexos de histocompatibilidade principais de peptídeo (pMHC) com baixa afinidade, representando um desafio considerável para a identificação direta de peptídeos cognatos de células T (epítopos). Várias abordagens diferentes foram desenvolvidas para resolver este problema, mas todas sofrem de uma grande deficiência: elas limitaram severamente o processamento paralelo e não permitem a triagem simultânea de muitos TCRs contra muitos epítopos. Os TCRs de interesse devem ser rastreados em relação às bibliotecas de epítopo, um por um. Vice-versa, encontrar TCRs reativos a epítopos de interesse, requer que os epítopos sejam rastreados contra bibliotecas de TCR, um por um.

[007] Há, portanto, uma necessidade de fornecer meios e métodos para detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígenos e os peptídeos especificamente reconhecidos por seus TCRs, e para a identificação de antígenos específicos de células T para intervenções in vivo e/ou in vitro. A presente invenção satisfaz agora esta necessidade na medida em que fornece tais meios e métodos, que são mais especificamente definidos nas reivindicações e nas seguintes modalidades da invenção. Modalidades da Invenção:

[008] A1. Uma molécula quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor.

[009] A2. A molécula quimérica da modalidade A1, em que o peptídeo ou uma parte do peptídeo pode ser apresentado por um complexo de histocompatibilidade principal.

[010] A3. A molécula quimérica da modalidade A1 ou A2, em que o peptídeo tem um comprimento de 6 a 200 resíduos de aminoácido.

[011] A4. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A3, em que o peptídeo tem um comprimento de 7 a 30 resíduos de aminoácido.

[012] A5. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A4, em que o peptídeo é um peptídeo aleatório.

[013] A6. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A5, em que o peptídeo é um peptídeo que é codificado por uma determinada molécula de DNA ou cDNA.

[014] A7. A molécula quimérica da modalidade A6, em que a molécula de DNA ou cDNA que codifica o peptídeo é obtida por fragmentação de uma molécula de DNA ou cDNA maior.

[015] A8. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A7, em que o peptídeo é derivado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno.

[016] A9. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A8, em que o peptídeo compreende um epítopo de um antígeno tumoral.

[017] A10. A molécula quimérica da modalidade A9, em que o antígeno tumoral é um neoantígeno.

[018] A11. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A10, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de identidade de sequência com um epítopo de um antígeno tumoral.

[019] A12. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A11, em que o peptídeo compreende um epítopo MHC de classe I quando a proteína correceptora é CD8.

[020] A13. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A12, em que o peptídeo compreende um epítopo MHC de classe II quando a proteína correceptora é CD4 ou LAG3.

[021] A14. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A13, em que a proteína correceptora CD4 é uma proteína correceptora CD4 humana, a proteína correceptora LAG3 é uma proteína correceptora LAG3 humana e a proteína correceptora CD8 é uma proteína correceptora CD8 humana.

[022] A15. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A14, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal do correceptor através de um ligante.

[023] A16. A molécula quimérica da modalidade A15, em que o ligante tem um comprimento entre 5 e 30 aminoácidos.

[024] A17. A molécula quimérica da modalidade A15 ou A16, em que pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácido no ligante são resíduos de glicina ou serina.

[025] A18. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A15 a A17, em que o ligante compreende a sequência de aminoácido (GGGGS)x, em que G é glicina, S é serina e x é o número de repetições, em que x pode ser qualquer número entre 1 e 5.

[026] A19. Um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades A1 a A18.

[027] A20. Uma biblioteca de polinucleotídeos compreendendo uma pluralidade de polinucleotídeos da modalidade A19.

[028] A21. A biblioteca de polinucleotídeos da modalidade A20, em que pelo menos dois polinucleotídeos da biblioteca codificam uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo diferente.

[029] A22. Uma célula compreendendo o polinucleotídeo da modalidade A19.

[030] A23. Um método para identificar simultaneamente receptores de células T específicos de antígenos e os peptídeos especificamente reconhecidos pelos referidos receptores de células T (TCRs), o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam a biblioteca de polinucleotídeos da modalidade A20 ou A21; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar o DNA das células T isoladas da etapa (c) para obter informação sobre as sequências de TCR e as sequências de peptídeos ligadas aos correceptores CD4, LAG-3 ou CD8 presentes nestas células T; e (e) identificar pares de receptor-peptídeo de células T cognatos com base nos dados de sequenciamento obtidos na etapa (d).

[031] A24. Um método para identificar, pelo menos, um receptor de células T específico de antígeno, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam um polinucleotídeo da modalidade A19; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar os locais de TCR de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um receptor de células T codificado pelos locais de TCR de, pelo menos, uma célula T para ser específica para o antígeno.

[032] A25. Um método para identificar, pelo menos, um antígeno específico de célula T, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T monoclonais de interesse que expressam um polinucleotídeo da modalidade A19 ou uma biblioteca de polinucleotídeos da modalidade A20 ou A21; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar a parte do polinucleotídeo que codifica o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um peptídeo codificado pelo polinucleotídeo compreendido em, pelo menos, uma célula T para ser um antígeno específico da célula T.

[033] A26. O método de qualquer uma das modalidades A23 a A25, em que a APC é uma APC autóloga ou heteróloga.

[034] A27. O método de qualquer uma das modalidades A23 a A26, em que a APC é uma célula ou linha celular autóloga ou heteróloga geneticamente modificada, expressando uma molécula de MHC mutada.

[035] A28. O método da modalidade A27, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe II compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a cadeia beta de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo.

[036] A29. O método da modalidade A27, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe I compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe I extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a microglobulina beta-2.

[037] A30. O método das modalidades A23 a A29, em que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo ou pela biblioteca de polinucleotídeos é CD8 se a molécula de MHC compreendida na APC for uma molécula de MHC de classe I.

[038] A31. O método das modalidades A23 a A29, em que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo é CD4 ou LAG-3 se a molécula de MHC expressa pela APC for uma molécula de MHC de classe II.

[039] A32. Um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) identificar, pelo menos, um receptor de célula T específico para antígeno e/ou, pelo menos, um antígeno específico de célula T com os métodos das modalidades A23 a A31;

(b) administrar ao indivíduo que sofre de câncer o, pelo menos, um receptor de célula T e/ou antígeno específico de célula T identificado na etapa (a).

[040] A33. O método da modalidade A32, em que o receptor de célula T específico do antígeno é administrado ao indivíduo por administração de genes mediada por vírus.

[041] A34. O método da modalidade A32, em que o antígeno específico da célula T é administrado ao indivíduo na forma de um peptídeo ou na forma de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo.

[042] A35. O método da modalidade A34, em que o peptídeo ou o polinucleotídeo que codifica o peptídeo está ligado a um composto que melhora a administração do peptídeo ou polinucleotídeo que codifica o peptídeo para uma APC.

[043] A presente invenção fornece pela primeira vez um método que permite a detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígeno e a identificação dos TCRs e seus epítopos cognatos.

[044] Desta maneira, em uma modalidade, a invenção refere-se a uma molécula quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor.

[045] Ou seja, a presente invenção refere-se a uma molécula quimérica que facilita a identificação de peptídeos que pode ser apresentada por uma molécula de MHC de modo que o peptídeo seja reconhecido por um receptor de célula T. Foi surpreendentemente descoberto que expressar um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção em uma célula T permite a formação de um complexo entre o peptídeo que está covalentemente ligado ao N-terminal do correceptor e um complexo de histocompatibilidade principal na superfície de uma célula de apresentação do antígeno (APC) que está localizada nas proximidades da célula T. Este complexo peptídeo-MHC pode, em seguida, ser reconhecido pelo receptor de célula T da mesma célula T, resultando na ativação desta célula T (ver Fig. 1A). Desta maneira, tanto o receptor de célula T quanto seu peptídeo antigênico cognato, que faz parte da molécula quimérica da presente invenção, são codificados pela mesma célula T, facilitando assim significativamente a identificação de pares de TCR-antígeno cognatos em comparação com métodos anteriores. Mesmo que tanto o TCR quanto o peptídeo antigênico estejam presentes na superfície da mesma célula T, a célula T só pode ser ativada pelo peptídeo antigênico, se o peptídeo antigênico tiver sofrido a formação de um complexo com uma molécula de MHC adequada na superfície de outras células.

[046] Foi demonstrado nos exemplos que as células T podem ser ativadas se um peptídeo antigênico cognato for ligado ao N-terminal do correceptor CD4 (FIGURAS 1C-E). Em contraste, nenhuma ativação foi observada quando um peptídeo antigênico não cognato foi ligado à proteína correceptora. Além disso, nenhuma ativação da célula T foi observada quando um peptídeo antigênico cognato foi ligado ao CD3, indicando que a ligação de um peptídeo antigênico ao N-terminal de um correceptor que interage diretamente com as moléculas de MHC, tal como o correceptor CD4, é necessário para a formação de um complexo peptídeo-MHC. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que a proteína correceptora é CD4.

[047] As moléculas quiméricas da presente invenção diferem significativamente das proteínas de fusão anteriores compreendendo certas partes de CD4. Al-Jaufy et al. (Infect Immun. 1995 Aug; 63 (8): 3073–3078), por exemplo, fundiram a subunidade A da toxina Shiga aos 180 aminoácidos N-terminais de CD4 (433 aminoácidos no total), que retêm a capacidade para ligar à glicoproteína 120 na superfície do HIV, para gerar uma proteína de fusão citotóxica para o tratamento do HIV. Breuer et al. (PLoS One. 2011; 6 (5): e20033.) nomearam um inibidor de proteína sintética contra o fator de patogenicidade do HIV-1 Nef compreendendo um motivo de 37 aminoácidos de CD4. Assim, ambos os documentos da técnica anterior referem-

se a proteínas solúveis compreendendo apenas um pequeno fragmento de CD4. As modalidades da presente invenção, por outro lado, estão relacionadas a proteínas correceptoras que são entendidas pelo versado na técnica como receptores de superfície celular que estão ancorados na membrana celular.

[048] Os correceptores CD4 e LAG3 compartilham aproximadamente 20% de identidade de sequência em seres humanos e ambos se ligam a moléculas de MHC de classe II para facilitar o reconhecimento do complexo peptídeo-MHC de classe II por um receptor de célula T. O correceptor CD8 desempenha um papel similar na interação entre um receptor de célula T e um complexo peptídeo-MHC compreendendo uma molécula de MHC de classe I. Assim, é plausível que os métodos da presente invenção também possam ser realizados com uma molécula quimérica compreendendo os correceptores LAG3 ou CD8.

[049] O peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode ser qualquer peptídeo. Conforme discutido acima, o peptídeo que está ligado à proteína correceptora é, de preferência, um peptídeo que tem o potencial de ser apresentado por uma molécula de MHC. Diz-se que um peptídeo tem o potencial de ser apresentado por um complexo de histocompatibilidade principal, se o peptídeo e o MHC formarem um complexo peptídeo-MHC que pode ser reconhecido por um receptor de célula T, em que o receptor de célula T pode ser qualquer receptor de célula T. Como aqui utilizado, o termo "complexo peptídeo-MHC" refere-se a uma molécula de MHC (MHC de classe I ou MHC de classe II) com um peptídeo ligado na bolsa de ligação de peptídeo reconhecida na técnica do MHC. Na presente invenção, todo o peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode estar envolvido na formação do complexo peptídeo-MHC. No entanto, a invenção também abrange peptídeos, em que apenas uma parte do peptídeo está envolvida na formação do complexo peptídeo-MHC. Desta maneira, em uma modalidade, a invenção refere-se a uma molécula quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG3 ou

CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor, em que o peptídeo ou uma parte do peptídeo pode ser apresentado por um complexo de histocompatibilidade principal.

[050] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo tem um comprimento de 6 a 200 resíduos de aminoácido.

[051] Ou seja, o peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode ser um peptídeo com um comprimento de 6 a 200 resíduos de aminoácido. Em particular, é preferido que pelo menos uma parte deste peptídeo possa estar envolvida na formação de um complexo peptídeo-MHC.

[052] Os peptídeos que são exibidos por moléculas de MHC de classe I, também aqui referidos como epítopos MHC de classe I ou peptídeos de MHC de classe I, normalmente têm um comprimento de 8 a 15 aminoácidos, com a maioria dos peptídeos tendo um comprimento de 9 aminoácidos. Os peptídeos que são apresentados por moléculas de MHC de classe II, também aqui referidos como epítopos MHC de classe II ou peptídeos de MHC de classe II, têm tipicamente um comprimento de 11 a 30 aminoácidos. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo tem um comprimento de 7 a 30 resíduos de aminoácido.

[053] Os peptídeos que estão ligados à proteína correceptora podem compreender outros aminoácidos ligados ao N- e/ou C-terminal de um epítopo MHC de classe I ou II sem afetar significativamente a ligação do epítopo MHC de classe I ou II a uma molécula de MHC. Assim, em uma modalidade alternativa, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo tem um comprimento de 30 a 50 resíduos de aminoácido.

[054] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo é um peptídeo aleatório.

[055] Ou seja, o peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode ter qualquer sequência de aminoácido. A molécula quimérica da invenção pode ser usada para a identificação de peptídeos que pode estimular um receptor de célula T quando ligado por uma molécula de MHC. Um "peptídeo aleatório", tal como aqui utilizado, pode ser um peptídeo com uma sequência de aminoácido aleatória que não compartilha qualquer identidade de sequência com peptídeos que são conhecidos por serem ligados por moléculas de MHC de classe I ou MHC de classe II.

[056] Alternativamente, o peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode compartilhar identidade de sequência com peptídeos ou proteínas que foram previamente descritos. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo é um peptídeo que é codificado por uma determinada molécula de DNA ou cDNA.

[057] Ou seja, a molécula quimérica da invenção pode ser usada para a identificação de peptídeos antigênicos previamente desconhecidos. Por exemplo, uma molécula de DNA ou cDNA que codifica um peptídeo pode ser clonada em um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora de modo que um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção seja obtido. O mesmo pode, em seguida, ser testado com os métodos da invenção se o peptídeo que está ligado à proteína correceptora pode sofrer a formação de um complexo peptídeo-MHC de modo que a célula T que expressa o polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica seja ativada.

[058] A molécula de DNA ou cDNA pode ser obtida de qualquer fonte. Em particular, o DNA pode ser obtido a partir de uma célula de apresentação do antígeno ou o cDNA pode ser obtido por transcrição reversa de RNA obtido a partir de uma célula de apresentação do antígeno. A célula de apresentação do antígeno pode ser uma célula tumoral que foi obtida em uma biópsia. Alternativamente, a célula de apresentação do antígeno pode ser uma célula que foi infectada com um patógeno.

Alternativamente, a molécula de DNA ou cDNA pode ser uma molécula de DNA ou cDNA que codifica um peptídeo ou proteína que deve ser administrado a um indivíduo. O desenvolvimento de drogas ou outros peptídeos ou proteínas que são administrados a indivíduos geralmente envolve testes de imunogenicidade para garantir que a administração do composto a um indivíduo não resulte em reações imunogênicas indesejadas. Desta maneira, a molécula de DNA ou cDNA que codifica um peptídeo ou proteína, ou uma fração da referida molécula de DNA ou cDNA, pode ser clonada em um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora para obter um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção.

[059] Alternativamente, a molécula de DNA ou cDNA pode ser obtida diretamente de um patógeno e clonada em um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora para obter um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção. Um patógeno, tal como aqui utilizado, refere-se de preferência, a um patógeno viral ou bacteriano.

[060] O termo "determinada molécula de DNA ou cDNA" refere-se a qualquer molécula de DNA ou cDNA que foi direta ou indiretamente obtida de uma célula ou patógeno. Por exemplo, uma molécula de DNA pode ser obtida diretamente de uma célula ou patógeno através do isolamento do DNA a partir da referida célula ou patógeno. Uma molécula de cDNA pode ser obtida diretamente de uma célula ou patógeno através do isolamento do RNA e da transcrição reversa do RNA em cDNA. No entanto, as moléculas de DNA também podem ser obtidas indiretamente, por exemplo, através das sínteses químicas de sequências de polinucleotídeo projetadas computacionalmente. As sequências de polinucleotídeo projetadas computacionalmente podem ser com base, por exemplo, em dados de sequenciamento de exoma de células individuais ou de dados de sequenciamento de peptídeo, em particular, de sequenciamento de peptídeos que foram isolados da superfície de células de apresentação do antígeno. Alternativamente, as sequências de polinucleotídeo projetadas computacionalmente podem ser com base em dados genômicos de patógenos.

[061] A molécula de DNA ou cDNA pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade particular, o método refere-se à molécula quimérica da invenção, em que a molécula de DNA ou cDNA que codifica o peptídeo é obtida por fragmentação de uma molécula de DNA ou cDNA maior.

[062] Isto é, o peptídeo pode ser codificado por uma molécula de DNA ou cDNA que foi obtida por fragmentação de uma molécula de DNA ou cDNA maior.

[063] A fragmentação de uma molécula de DNA ou cDNA pode ser alcançada de uma maneira direcionada ou não direcionada, por exemplo, usando endonucleases. No entanto, a fragmentação de moléculas de DNA ou cDNA também pode ser alcançada por cisalhamento aleatório dessas moléculas. Alternativamente, um fragmento de uma molécula de DNA ou cDNA conhecido também pode ser obtida por métodos de clonagem molecular, por exemplo, por PCR. O versado na técnica está ciente dos métodos de combinação de um fragmento de DNA ou cDNA com um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora de modo que um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção seja obtido.

[064] Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo é derivado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno.

[065] A molécula quimérica da invenção pode ser usada para a identificação de tumor previamente desconhecido ou antígenos associados a patógenos. Diz-se que um peptídeo é derivado de uma célula tumoral, se o peptídeo compreender uma sequência de aminoácido que partilha a identidade de sequência com um peptídeo ou proteína que é sintetizado em uma célula tumoral. Diz-se que um peptídeo é derivado de uma célula que foi infectada com um patógeno, se o peptídeo compreender uma sequência de aminoácido que compartilha identidade de sequência com um peptídeo ou proteína que é sintetizado em uma célula que foi infectada com um patógeno. O peptídeo que é derivado de uma célula tumoral ou uma célula que foi infectada com um patógeno pode compartilhar identidade de sequência com qualquer peptídeo ou fração de uma proteína que pode ser encontrado nessas células.

[066] Em certas modalidades, o peptídeo que está ligado à proteína correceptora da invenção pode compreender a sequência de aminoácido de um peptídeo que foi previamente descrito para ser apresentado por uma molécula de MHC I ou MHC II. Uma molécula quimérica compreendendo um peptídeo que é conhecido por ser apresentado por uma molécula de MHC de classe I ou II pode permitir a identificação de receptores de células T que são eficientemente estimulados por este peptídeo. O peptídeo que é conhecido por ser apresentado por um peptídeo de MHC de classe I ou II pode ser um peptídeo que é derivado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno.

[067] Em certas modalidades, a molécula quimérica da invenção é usada para a identificação de receptores de células T tumorais específicas. Por exemplo, um peptídeo que é conhecido por ser apresentado na superfície das células tumorais de um indivíduo por uma molécula de MHC pode ser ligado a uma proteína correceptora para identificar receptores de células T que reconhecem especificamente este epítopo. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo compreende um epítopo de um antígeno tumoral. Diz-se que um peptídeo compreende um epítopo de um antígeno tumoral, se o peptídeo compreender uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de um epítopo de um antígeno tumoral.

[068] O termo "antígeno tumoral", tal como aqui utilizado, pode ser um antígeno associado ao tumor ou um antígeno tumoral específico e indica uma molécula (por exemplo, uma proteína ou peptídeo) que é expressa por uma célula tumoral e (a) difere qualitativamente de sua contraparte expressa em células normais,

ou (b) é expressa em um nível mais alto em células tumorais do que em células normais. Assim, um antígeno tumoral pode diferir (por exemplo, por um ou mais resíduos de aminoácido onde a molécula é uma proteína) ou pode ser idêntico a sua contraparte expressa em células normais. Alguns antígenos tumorais não são expressos por células normais, ou são expressos em um nível, pelo menos, cerca de duas vezes maior (por exemplo, cerca de duas vezes, três vezes, cinco vezes, dez vezes, 20 vezes, 40 vezes, 100 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes, 5.000 vezes ou 15.000 vezes maior) em uma célula tumoral do que na contraparte normal da célula tumoral.

[069] Em certas modalidades, um antígeno tumoral é uma proteína imunogênica expressa em ou sobre uma célula neoplásica ou tumoral, tal como uma célula cancerosa ou tumor maligno. Em certas modalidades, um antígeno tumoral é uma proteína não específica, mutante, superexpressa ou expressa de forma anormal, que pode estar presente em uma célula neoplásica ou tumoral e em uma célula ou tecido normal. Em certas modalidades, um antígeno tumoral é um antígeno tumoral específico que é restrito às células tumorais. Em certas modalidades, um antígeno tumoral é um antígeno específico do câncer que é restrito às células cancerosas.

[070] Em certas modalidades, um antígeno tumoral pode exibir um, dois, três ou mais, incluindo todas, as seguintes características: superexpresso/acumulado (ou seja, expresso por tecido normal e neoplásico, mas altamente expresso em neoplasia), oncofetal (ou seja, geralmente expresso apenas em tecidos fetais e em células somáticas cancerosas), oncoviral ou oncogênico viral (ou seja, codificado por vírus de transformação tumorigênico), câncer-testículo (ou seja, expresso apenas por células cancerosas e tecidos reprodutivos adultos, por exemplo, o testículo), linhagem restrita (ou seja, expressa amplamente por um único histótipo de câncer), mutada (ou seja, expressa apenas no tecido neoplásico como um resultado de mutação genética ou alteração na transcrição), pós-tradução alterada (por exemplo, alterações associadas ao tumor na glicosilação), ou idiotípico (ou seja, desenvolvido a partir de expansões clonais malignas de linfócitos B ou T).

[071] Em certas modalidades, o antígeno tumoral inclui antígenos de doenças neoplásicas, incluindo leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfocítica aguda; leucemia mieloide aguda; leucemia mieloide aguda (adulto/infantil); carcinoma adrenocortical; cânceres relacionados à AIDS; linfoma relacionado à AIDS; câncer anal; câncer de apêndice; astrocitomas; tumor de teratóide/rabdoide atípico; carcinoma basocelular; câncer do duto biliar extra-hepático (colangiocarcinoma); câncer de bexiga; osteossarcoma ósseo/histiocitoma fibroso maligno; câncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebelar (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/tumor cerebral de glioma maligno; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais; tumor cerebral, glioma hipotalâmico e de via visual; glioma do tronco cerebral; câncer de mama; adenomas/carcinoides brônquicos; tumor brônquico; linfoma de Burkitt; câncer infantil; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma de adulto, local primário desconhecido; carcinoma de primário desconhecido; tumor embrionário do sistema nervoso central; linfoma do sistema nervoso central primário; câncer cervical; carcinoma adrenocortical infantil; cânceres infantis; astrocitoma cerebral infantil; cordoma infantil; leucemia linfocítica crônica; leucemia mieloide crônica; leucemia mieloide crônica; distúrbios mieloproliferativos crônicos; câncer de colo; câncer colorretal; craniofaringioma; linfoma de células T cutâneo; tumor de pequenas células redondas desmoplásico; enfisema; câncer do endométrio; ependimoblastoma; ependimoma; câncer de esôfago; sarcoma de ewing na família de tumores Ewing; tumor de células germinativas extracraniano; tumor de células germinativas extragonadal; câncer do duto biliar extra-hepático; câncer de vesícula biliar; câncer gástrico (estômago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor estromal gastrointestinal; tumor de células germinativas: tumor trofoblástico gestacional extracraniano, extragonadal ou ovariano; tumor trofoblástico gestacional de local primário desconhecido; glioma; glioma do tronco cerebral; glioma hipotalâmico e da via visual infantil; leucemia de células pilosas; câncer de cabeça e pescoço; câncer de coração; câncer hepatocelular (fígado); linfoma de Hodgkin; câncer hipofaríngeo; glioma hipotalâmico e da via visual; melanoma intraocular; carcinoma de células das ilhotas (pâncreas endócrino); sarcoma de Kaposi; câncer de rim (câncer de células renais); histiocitose de células de Langerhans; câncer de laringe; câncer de lábio e de cavidade oral; lipossarcoma; câncer de fígado (primário); câncer de pulmão de células não pequenas; câncer de pulmão de células pequenas; linfoma do sistema nervoso central primário; macroglobulinemia de Waldenstrom; câncer de mama masculino; histiocitoma fibroso maligno do osso/osteossarcoma; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; melanoma intraocular (olho); câncer de células de merkel; carcinoma de pele de células de merkel; mesotelioma; mesotelioma maligno adulto; câncer de pescoço escamoso metastático com oculto primário; câncer de boca; síndrome de neoplasia endócrina múltipla; mieloma múltiplo/neoplasma de células plasmáticas; micose fungóide, síndromes mielodisplásicas; doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas; leucemia mieloide crônica; leucemia mieloide aguda em adultos; leucemia mieloide aguda infantil; mieloma múltiplo (câncer da medula óssea); distúrbios mieloproliferativos crônicos; câncer de cavidade nasal e seios paranasais; carcinoma nasofaringeal; neuroblastoma de câncer de pulmão de células não pequenas; linfoma de não- hodgkin; oligodendroglioma; câncer oral; câncer de cavidade oral; câncer orofaríngeo; osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno do osso; câncer de ovário; câncer epitelial de ovário (tumor epitelial-estromal de superfície); tumor de células germinativas de ovário; tumor de baixo potencial maligno de ovário; câncer de pâncreas; câncer pancreático, célula das ilhotas; papilomatose; câncer dos seios paranasais e da cavidade nasal; câncer de paratireóide; câncer de pênis; câncer de faringe;

feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores do parênquima pineal de diferenciação intermediária; pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais; tumor pituitário; adenoma hipofisário; neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiplo; blastoma pleuropulmonar; linfoma do sistema nervoso central primário; câncer de próstata; câncer retal; carcinoma de células renais (câncer de rim); pelve renal e ureter, câncer de células transicionais; carcinoma do trato respiratório envolvendo o gene NUT no cromossomo 15; retinoblastoma; rabdomiossarcoma infantil; câncer de glândula salivar; sarcoma, família de tumores Ewing; síndrome de Sezary; câncer de pele (melanoma); câncer de pele (não melanoma); câncer de pulmão de pequenas células; sarcoma de tecido mole de câncer de intestino delgado; sarcoma de tecidos moles; tumor da medula espinhal; carcinoma de células escamosas; câncer de pescoço escamoso com oculto primário, metastático; câncer de estômago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; linfoma de células T, cutâneo (Micose Fungoide e síndrome de Sezary); câncer de testículo; câncer de garganta; timoma; timoma e carcinoma tímico; câncer de tireoide; câncer de tireoide infantil; câncer de células transicionais da pelve renal e ureter; câncer uretral; câncer uterino endometrial; sarcoma uterino; câncer vaginal; câncer vulvar; e tumor Wilms.

[072] Em certas modalidades, o antígeno tumoral inclui antígenos virais oncogênicos, antígenos de câncer de testículo, antígenos oncofetais, antígenos de diferenciação de tecidos, antígenos de proteínas mutantes, neoantígenos, adipofilina, AIM-2, ALDHlAl, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclin Dl, DKKI, ENAH (hMcna), Ga733 (EpCAM), EphA3, EZH2, FGF5, glipican-3, G250/MN/CAIX, HER- 2/neu, IDOl, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterase intestinal, alfa-fetoproteína, Kallikrein 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53 (não mutante), PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernin 1, SOXIO, STEAP1 (seis antígenos epiteliais de transmembrana da próstata 1), survivin, Telomerase, VEGF, WT1, EGF-R, CEA, CD20, CD33, CD52, glicoproteína 100 (proteína GP100 ou gp 100), MEL ANA/MART 1, MART2, NY-ESO-l, p53, MAGE Al, MAGE A3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, CDK4, alfa-actinin-4, ARTC1, BCR-ABL, proteína de fusão BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP- 5, CASP-8, beta-catenin, Cdc27, CDK4, CDK 2A, CLPP, COA-1, proteína de fusão dek-can, EFTUD2, fator de alongamento 2, ETV6-AML, proteína de fusão ETV6- AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusão LDLR-fucosiltransferaseAS, NFYC, OGT, OS -9, proteína de fusão pml-RARalpha, PRDX5, PTPR, H-ras, K-ras (oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten V-Ki-ras2), N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SSX, SSX2, SYT-SSX1 ou proteína de fusão SSX2, TGF-betaRII, triosefosfato isomerase, ormdm-2, LMP2, HPV E6/E7, EGFRvlll (variante do fator de crescimento epidérmico III), Idiotipo, GD2, gangliosídeo G2), Ras-mutante, p53 (mutante), Proteinase3 (PR1), Tirosinase, PSA, hTERT, pontos de corte de translocação de sarcoma, EphA2, fosfatase ácida prostática PAP, neo-PAP, ML-IAP, AFP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógeno, Ciclina Bl, ácido polissiálico, MYCN, TRP2, TRP2-Int2, GD3, Fucosil GM1, Mesotelin, PSCA, sLe (a), cyplBl, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, SART3, STn, Anidrase Carbônico IX, OY-TES1, proteína 17 do esperma, LCK, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumain, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, para antígeno relacionado 1, TRP1 , CA-125, CA19-9, Calretinin, antígeno de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), CD 19, CD34, CD99, CD117, Cromogranin, Citoqueratin, Desmin, proteína acídica fibrilar glial (GFAP), proteína fluida da doença cística grosseira (GCDFP-15), antígeno HMB-45, Myo-Dl, actina do músculo específica (MSA), neurofilamento, enolase do neurônio específica (NSE), fosfatase alcalina placentária, sinaptose, tireoglobulina, fator de transcrição da tireoide-1, forma dimérica da isoenzima piruvato quinase do tipo M2 (tumor M2-PK),

BAGE BAGE-1, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE- 4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-SAR-35, SPANXB1, SPA17, SSX, SYCP1, TPTE, Carboidrato/gangliosídeo GM2 (antígeno oncofetal-imunogênico- 1 OFA-I-1), GM3, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA 50, CAM 43, CEA, EBNA, EF2, antígeno do vírus Epstein-Barr, HLA-A2, HLA-A11, HSP70-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosin classe I, GnTV, Herv-K-mel, LAGE-1, LAGE-2, (proteína de esperma) SP17, SCP-1, P15 (58), Hom/Mel-40, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL- RAR, TSP-180, P185erbB2, pl80erbB-3, c-met , nm-23Hl, TAG-72, TAG-72-4, CA-72- 4, CAM 17.1, NuMa, 13-catenin, P16, TAGE, CT7, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68/KP1, CO-029, HTgp-175, M344, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TLP, TPS, CD22, CD27, CD30, CD70, proteína, TARP (proteína da estrutura de leitura alternativa do receptor gama de células T), Trp-p8, integrin ανβ3 (CD61), galactin ou Ral-B, CD123, CLL-1, CD38, CS- 1, CD138 e RORl.

[073] Em certas modalidades, o antígeno tumoral inclui antígenos virais oncogênicos, em que os antígenos virais oncogênicos são antígenos do papilomavírus humano (HPV), antígenos do herpes-vírus associado ao sarcoma de Kaposi, como antígeno nuclear associado à latência, antígenos do vírus Epstein-Barr, tal como EBV- EA, EBV-MA ou EBV-VCA, antígenos de poliomavírus de células de Merkel, tal como antígeno T de MCV, ou antígenos de vírus linfotrópico T humano, tal como antígeno Tax de HTLV-1.

[074] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno associado ao tumor ou um antígeno tumoral específico.

[075] Em certas modalidades, o antígeno tumoral é um neoantígeno. Um "neoantígeno", como aqui utilizado, significa um antígeno que surge por mutação em uma célula tumoral e esse antígeno não é geralmente expresso em células ou tecidos normais. Sem estar limitado pela teoria, porque os tecidos saudáveis geralmente não possuem esses antígenos, os neoantígenos representam um alvo preferido. Além disso, sem estar limitado pela teoria, no contexto da presente invenção, uma vez que as células T que reconhecem o neoantígeno podem não ter sofrido seleção tímica negativa, tais células podem ter alta avidez ao antígeno e montar uma forte resposta imunológica contra tumores, embora sem o risco de induzir a destruição do tecido normal e danos autoimunes. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere- se à molécula quimérica da invenção, em que o antígeno tumoral é um neoantígeno.

[076] Em certas modalidades, o antígeno tumoral pode ser um antígeno ortólogo, por exemplo, um mamífero (ou seja, primata não humano, porco, cão, gato ou cavalo) para um antígeno tumoral humano.

[077] O termo "epítopo", tal como aqui utilizado, refere-se à porção de um antígeno que faz contato com uma imunoglobulina particular, tal como um receptor de células T.

[078] A molécula quimérica da invenção também pode ser usada para identificar variantes mutadas de epítopos de antígenos tumorais conhecidos que são eficientemente reconhecidos por um receptor de células T. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de identidade de sequência com um epítopo de um antígeno tumoral.

[079] Ou seja, a molécula quimérica da invenção pode ser usada para identificar peptídeos antigênicos mutados que são reconhecidos por uma molécula de MHC e resultam em ativação mais ou menos eficiente de uma célula T em comparação com suas contrapartes não mutadas. Na presente invenção, é preferido que as moléculas quiméricas sejam codificadas por um polinucleotídeo que é expresso em uma célula. O versado na técnica está ciente dos métodos para introduzir mutações em sequências de DNA que codificam um peptídeo aleatoriamente ou de forma direcionada, de modo que um peptídeo mutado seja obtido.

[080] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo compreende um epítopo MHC de classe I quando a proteína correceptora é CD8.

[081] Ou seja, o correceptor CD8 facilita a ligação de um receptor de células T a um complexo peptídeo-MHC de classe I. Assim, é preferido que o peptídeo que está ligado ao correceptor CD8 compreenda um epítopo MHC de classe I.

[082] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o epítopo é um epítopo MHC de classe II quando a proteína correceptora é CD4 ou LAG3.

[083] Ou seja, o correceptor CD4 e LAG3 facilita a ligação de um receptor de células T a um complexo peptídeo-MHC de classe II. Assim, é preferido que o peptídeo que está ligado ao correceptor CD4 ou LAG3 compreenda um epítopo MHC de classe II.

[084] Nos casos em que um peptídeo ainda não foi identificado para ser apresentado por uma molécula de MHC, o peptídeo pode ser ligado a qualquer correceptor, isto é, CD4, CD8 ou LAG3.

[085] As proteínas correceptoras da molécula quimérica podem ser derivadas de qualquer mamífero. No entanto, é preferido que o correceptor seja derivado do mesmo organismo que a célula T em que se destina a ser sintetizado. Por exemplo, se é destinada a identificar um par de peptídeo antigênico cognato - receptor de célula T em um ser humano, é preferido que a molécula quimérica compreenda uma proteína correceptora humana. A proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 é, em particular, proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 de comprimento total.

[086] Na presente invenção, é preferido que a proteína correceptora seja uma proteína correceptora humana. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que a proteína correceptora CD4 é uma proteína correceptora CD4 humana, a proteína correceptora LAG3 é uma proteína correceptora LAG3 humana ou a proteína correceptora CD8 é uma proteína correceptora CD8 humana.

[087] Ou seja, em certas modalidades, a molécula quimérica compreende uma proteína correceptora CD4 humana, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal de CD4. Em outras modalidades, a molécula quimérica compreende uma proteína correceptora LAG3 humana, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal de LAG3. Em outras modalidades, a molécula quimérica compreende uma proteína correceptora CD8 humana, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal da cadeia CD8-alfa ou da cadeia CD8-beta. No caso do peptídeo estar ligado ao N-terminal da cadeia CD8-beta, é preferível que a célula também sintetize uma cadeia CD8-alfa não modificada. Desta maneira, as moléculas quiméricas compreendendo a proteína correceptora CD4, CD8 ou LAG3 humana são, de preferência, sintetizadas em células humanas, em particular, células T humanas.

[088] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma molécula quimérica da invenção, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal do correceptor através de um ligante.

[089] Ou seja, a molécula quimérica pode compreender um ligante entre o correceptor e o peptídeo para otimizar o reconhecimento entre o peptídeo, o receptor de células T e a molécula de MHC na APC.

[090] O ligante pode ter qualquer comprimento que permita a interação eficiente do peptídeo com o TCR e a molécula de MHC na APC. Em particular, o ligante pode ter um comprimento entre 5 e 30 resíduos de aminoácido. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma molécula quimérica, em que o ligante tem um comprimento entre 5 e 30 aminoácidos.

[091] Para permitir que o peptídeo interaja eficientemente com o TCR e a molécula de MHC na APC, é preferido que o ligante seja um ligante flexível. O versado na técnica está ciente dos ligantes com um alto grau de flexibilidade. Por exemplo, os ligantes com uma alta porcentagem de resíduos de glicina ou serina são conhecidos por terem um alto grau de flexibilidade. Assim, em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma molécula quimérica da invenção, em que pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácido no ligante são resíduos de glicina ou serina.

[092] A sequência de ligante GGGGS, consistindo em quatro resíduos de glicina e um resíduo de serina C-terminal é frequentemente usada na técnica como um ligante de peptídeo flexível para amarrar um primeiro polipeptídeo a um segundo polipeptídeo. Assim, o ligante da invenção de preferência, compreende um ou mais motivos com a sequência GGGGS. Desta maneira, em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma molécula quimérica da invenção, em que o ligante compreende a sequência de aminoácido (GGGGS)x, em que G é glicina, S é serina e x é o número de repetições, em que x pode seja qualquer número entre 1 e 5.

[093] Assim, em certas modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido GGGGS uma vez. Em outras modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido GGGGS duas vezes. Em outras modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido GGGGS três vezes. Em outras modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido GGGGS quatro vezes. Em outras modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido GGGGS cinco vezes. Se o ligante compreender a sequência de aminoácido GGGGS mais de uma vez, as sequências de amino GGGGS podem ser contíguas ou podem ser interrompidas por um ou mais outros aminoácidos.

[094] É mostrado nos exemplos que a maior ativação de células T pode ser observada se o peptídeo for ligado ao correceptor com um ligante consistindo em 12 ou 15 aminoácidos (FIGURA 1 C e D). Assim, em modalidades preferidas, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o ligante tem um comprimento de 12 a 15 resíduos de aminoácido. Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o ligante compreende a sequência GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO. 1). Em uma modalidade ainda mais preferida, a invenção refere-se à molécula quimérica da invenção, em que o ligante compreende a sequência GSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO. 2).

[095] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma molécula quimérica da invenção.

[096] Na presente invenção, pretende-se que a molécula quimérica da invenção seja sintetizada em uma célula através da expressão de um polinucleotídeo que codifica a referida molécula quimérica. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção pode ainda compreender um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal que direciona a molécula quimérica para a superfície celular.

[097] O termo "polinucleotídeo", tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de nucleotídeos conectada por ligações fosfodiéster. Um polinucleotídeo desta invenção pode ser uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou molécula de ácido ribonucleico (RNA) na forma de filamento simples ou duplo. As bases de nucleotídeos são indicadas aqui por um código de uma única letra: adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), inosina (I) e uracila (U). Um polinucleotídeo desta invenção pode ser preparado usando técnicas padrão bem conhecidas por um versado na técnica. Este termo não deve ser interpretado como limitante no que diz respeito ao comprimento de um polímero e abrange análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como, nucleotídeos que são modificados nas porções de açúcar e/ou fosfato. Este termo também abrange ácidos nucleicos contendo resíduos de estrutura principal modificados ou ligações, que podem ser sintéticos ou de ocorrência natural, e que têm propriedades de ligação similares àquelas de ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência.

[098] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma biblioteca de polinucleotídeos compreendendo uma pluralidade de polinucleotídeos da invenção.

[099] A invenção ainda abrange uma biblioteca de polinucleotídeos. A biblioteca de polinucleotídeos da invenção compreende uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam moléculas quiméricas da invenção. Por exemplo, a biblioteca de polinucleotídeos pode compreender dois ou mais polinucleotídeos que codificam uma molécula quimérica da invenção. Em certas modalidades, a biblioteca de polinucleotídeos pode compreender pelo menos 100, pelo menos 1.000, pelo menos 10.000, pelo menos 100.000, pelo menos 1.000.000 ou pelo menos 10.000.000 polinucleotídeos que codificam uma molécula quimérica da invenção.

[0100] Em certas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca de polinucleotídeos são compreendidos em um polinucleotídeo maior. Em certas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca de polinucleotídeos são compreendidos em polinucleotídeos circulares, tais como vetores de DNA ou RNA. Em certas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca de polinucleotídeos são compreendidos em vetores virais que podem ser usados para administração de genes mediada por vírus.

[0101] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à biblioteca de polinucleotídeos da invenção, em que pelo menos dois polinucleotídeos da biblioteca codificam uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo diferente.

[0102] Ou seja, a biblioteca de polinucleotídeos da invenção pode ser usada para a identificação de peptídeos antigênicos que podem induzir uma resposta de células T. É preferido que os polinucleotídeos da biblioteca codifiquem uma proteína correceptora idêntica mas difiram na região do polinucleotídeo que codifica o peptídeo. Ou seja, em certas modalidades, a biblioteca da invenção compreende pelo menos dois polinucleotídeos, em que cada um desses polinucleotídeos codifica a proteína CD4 correceptora ligada a um peptídeo com uma sequência de aminoácido diferente. Em outras modalidades, a biblioteca da invenção compreende, pelo menos, dois polinucleotídeos, em que cada um desses polinucleotídeos codifica a proteína correceptora CD8 ligada a um peptídeo com uma sequência de aminoácido diferente. Em outras modalidades, a biblioteca da invenção compreende, pelo menos, dois polinucleotídeos, em que cada polinucleotídeo codifica a proteína correceptora LAG3 ligada a um peptídeo com uma sequência de aminoácido diferente.

[0103] Os peptídeos que são codificados na biblioteca de polinucleotídeos da invenção podem ter qualquer sequência de aminoácido. Por exemplo, os peptídeos podem ter identidade de sequência com um peptídeo antigênico conhecido, por exemplo, um peptídeo antigênico derivado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada por um patógeno. Neste caso, a biblioteca de polinucleotídeos pode ser obtida através da introdução de mutações aleatórias ou direcionadas em um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora e um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido de um peptídeo antigênico conhecido. Em particular, as mutações podem ser introduzidas exclusivamente na parte do polinucleotídeo que codifica o peptídeo antigênico.

[0104] Em certas modalidades, a biblioteca de polinucleotídeos da invenção pode ser usada para identificar peptídeos antigênicos previamente desconhecidos. Por exemplo, uma biblioteca de polinucleotídeos pode ser gerada isolando mRNAs de uma célula, em particular uma célula de apresentação do antígeno, e transcrevendo reversamente os mRNAs em cDNA. O cDNA pode, em seguida, ser clonado em uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam uma proteína correceptora para obter uma biblioteca de polinucleotídeos da invenção. Em particular, os cDNAs podem ser fragmentados antes da etapa de clonagem e os fragmentos resultantes podem ser clonados na pluralidade de polinucleotídeos que codificam a proteína correceptora.

Em certas modalidades, o mRNA é isolado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno. O versado na técnica está ciente dos métodos para isolamento de RNA, transcrição reversa e clonagem molecular.

[0105] Em outras modalidades, a biblioteca de polinucleotídeos pode ser gerada com base em dados de sequenciamento de exoma. O versado na técnica está ciente dos métodos para sequenciar o exoma de uma célula. Os dados do exoma podem ser obtidos de qualquer célula. Em certas modalidades, os dados do exoma são obtidos de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno. Os dados do exoma obtidos podem, em seguida, ser processados por métodos de bioinformática para prever uma infinidade de fragmentos de DNA de tamanho predeterminado que cobrem partes ou, de preferência, todo o exoma de uma célula. Os fragmentos de DNA previstos podem ter qualquer tamanho. No entanto, é preferido que os fragmentos de DNA previstos tenham um tamanho de 30 a 300 pares de bases, mais de preferência, 60 a 150 pares de bases, mais de preferência, 75 a 105 pares de bases. Os fragmentos de DNA previstos podem, em seguida, ser sintetizados quimicamente e clonados em uma pluralidade de polipeptídeos que codificam um correceptor para obter a biblioteca de polinucleotídeos da invenção.

[0106] Em certas modalidades, os peptídeos que são apresentados na superfície de uma APC podem ser isolados da APC e sua sequência pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, em particular, por espectrometria de massa. Os polinucleotídeos que codificam esses peptídeos isolados podem, em seguida, ser gerados, por exemplo, por síntese química, e clonados em uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam uma proteína correceptora para gerar a biblioteca de polipeptídeos da invenção. Tal biblioteca pode, por exemplo, ser usada para identificar quais dos peptídeos que foram isolados da superfície celular podem ser reconhecidos por um receptor de células T em geral e, especificamente, por qual receptor de células T.

[0107] Como mencionado acima, a biblioteca de polinucleotídeos compreende, de preferência, pelo menos dois polinucleotídeos que codificam uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo diferente. No entanto, é ainda mais preferido que pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 10.000, pelo menos 100.000 ou pelo menos 1.000.000 de polinucleotídeos da biblioteca codificam uma proteína correceptora idêntica, mas diferem na sequência do peptídeo ligado à proteína correceptora.

[0108] O versado na técnica está ciente dos métodos para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos de acordo com a invenção. Por exemplo, a biblioteca de acordo com a invenção pode ser gerada por clonagem molecular. Por exemplo, uma pluralidade de vetores de DNA idênticos compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora e, opcionalmente, um ligante e um peptídeo de sinal podem primeiro ser digeridos com uma ou mais enzimas de restrição. Em uma segunda etapa, uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam peptídeos com diferentes sequências de aminoácidos pode ser digerida com enzimas de restrição compatíveis e ligada no vetor que codifica a proteína correceptora. De preferência, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo é introduzido no vetor a montante dos polinucleotídeos que codificam a proteína correceptora e o ligante e a jusante do polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal, de modo que o peptídeo será ligado ao N-terminal da proteína correceptora. Alternativamente, os polinucleotídeos que estão incluídos na biblioteca da invenção podem ser projetados computacionalmente e sintetizados por sínteses químicas de DNA.

[0109] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma célula compreendendo o polinucleotídeo da invenção.

[0110] Ou seja, a invenção abrange qualquer célula compreendendo um polinucleotídeo da invenção. De preferência, a célula compreendendo o polinucleotídeo da invenção é uma célula T.

[0111] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um método para identificar simultaneamente receptores de células T específicos de antígenos e os peptídeos especificamente reconhecidos pelos referidos receptores de células T (TCRs), o método que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam a biblioteca de polinucleotídeos da invenção; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar o DNA das células T isoladas da etapa (c) para obter informação sobre as sequências de TCR e as sequências de peptídeo ligadas aos correceptores CD4, LAG-3 ou CD8 presentes nestas células T; e (e) identificar pares de receptor-peptídeo de células T cognatos com base nos dados de sequenciamento obtidos na etapa (d).

[0112] Isto é, o método da invenção pode ser usado para a identificação simultânea de pares de receptor-peptídeo de células T cognatos. Os métodos anteriores para a identificação de pares de TCR-peptídeo cognatos têm a desvantagem de apenas permitirem a triagem de múltiplos receptores de células T contra um único peptídeo antigênico de cada vez, resultando assim em tempo e custo de abordagem de triagem intensiva. O método da presente invenção, por outro lado, tem a vantagem de que as células que expressam um polinucleotídeo que codifica uma molécula quimérica da invenção compreendem a informação genética do receptor de células T e o peptídeo antigênico que estimula o receptor de células T. Assim, o método da invenção permite rastrear uma população de células T policlonais contra uma pluralidade de peptídeos em uma única experiência e enriquecer e identificar as células T que sintetizam pares de TCR-peptídeo cognatos. Desta maneira, o método da invenção pode facilitar significativamente a identificação de peptídeos antigênicos previamente desconhecidos e dos receptores de células T que reconhecem esses peptídeos.

[0113] Para isso, em uma primeira etapa, uma biblioteca de polinucleotídeos que codifica a molécula quimérica da invenção é introduzida em uma população de células T policlonais. O versado na técnica está ciente dos métodos para a introdução de polinucleotídeos em células T. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula T por transfecção ou transdução viral. Pretende-se que as células T na população de células T sejam transfectadas ou transduzidas com a biblioteca de polinucleotídeos de modo que cada célula T não obtenha mais do que um polinucleotídeo que codifica a molécula quimérica da invenção. Diz-se que as células T policlonais expressam a biblioteca de polinucleotídeos da invenção, se as células T produzirem quantidades detectáveis da molécula quimérica da invenção. De preferência, pelo menos, duas das células T na população policlonal de células T expressam um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo com uma sequência de aminoácido diferente.

[0114] O termo "população", tal como aqui utilizado, refere-se a mais de uma célula do mesmo tipo de célula. Uma "população de células T policlonais", tal como aqui utilizada, refere-se a uma população de células T, em que pelo menos duas das células T compreendidas na população compreendem um receptor de célula T diferente. A população de células T policlonais pode ser de qualquer fonte. Por exemplo, a população de células T policlonais pode ser obtida de um indivíduo. O versado na técnica está ciente dos métodos para isolar células T de uma amostra que foi obtida de um indivíduo, tal como sangue, baço, nódulos linfáticos ou tecido tumoral ou de qualquer outra fonte adequada. A presente invenção também abrange populações de células T policlonais que foram obtidas por engenharia genética. Por exemplo, uma população de células negativas TCR pode ser transfectada ou transduzida com uma biblioteca que codifica uma pluralidade de receptores de células T de modo que uma população de células T policlonais seja obtida.

[0115] Em particular, hibridomas de células T CD4 ou CD8-negativas podem ser utilizados, particularmente hibridomas de células T CD4 ou CD8-negativas que transportam um repórter fluorescente. No entanto, este não é um pré-requisito, pois as células CD4+ também podem ser usadas (Figura 2). Um repórter fluorescente adequado para a ativação de células T é, por exemplo, o repórter fluorescente nur77, repórter fluorescente NFAT ou qualquer outra molécula repórter adequada (por exemplo, CD69).

[0116] Em uma segunda etapa, as células T policlonais que expressam a biblioteca de polinucleotídeos da invenção são cultivadas na presença de uma célula de apresentação do antígeno que compreende um complexo de histocompatibilidade principal em sua superfície celular. Como mencionado acima, a molécula de MHC na superfície da APC é necessária para a formação de um complexo de peptídeo-MHC com o peptídeo que está compreendido na molécula da invenção, de modo que o complexo de peptídeo-MHC possa estimular o receptor de células T na superfície celular das células T.

[0117] O termo "célula de apresentação do antígeno", tal como aqui utilizado, refere-se amplamente a qualquer célula que compreende um complexo de histocompatibilidade principal em sua superfície celular. Assim, a célula de apresentação do antígeno pode ser a própria célula T. Em certas modalidades, a célula de apresentação do antígeno é uma célula dendrítica primária derivada da medula óssea (BMDC). É preferido que a molécula de MHC compreendida na superfície da APC seja uma molécula de MHC de classe I ou uma molécula de MHC de classe II. No caso da molécula de MHC ser uma molécula de MHC de classe I, é preferido que as células T expressem um polinucleotídeo que codifica uma molécula quimérica compreendendo o correceptor CD8. No caso da molécula de MHC ser uma molécula de MHC de classe II, é preferido que as células T expressem um polinucleotídeo que codifica uma molécula quimérica compreendendo o correceptor CD4 ou LAG3.

[0118] O termo "colocar em contato", tal como aqui utilizado, refere-se ao ato de reunir dois ou mais componentes, tais como as células T e as APCs, por dissolução, mistura, suspensão, combinação, suspensão em pasta fluida ou agitação. Diz-se que as células T que expressam um polinucleotídeo da invenção está em contato com uma APC, se as duas células estiverem suficientemente próximas de modo que o peptídeo ligado ao correceptor da célula T possa formar um complexo de peptídeo-MHC com a molécula de MHC compreendida na superfície da APC. De preferência, as células são colocadas em contato em uma solução, tal como um meio de cultura de células. As células podem ser colocadas em contato por qualquer período de tempo que seja suficiente para uma célula T ser ativada. Em certas modalidades, as células T são colocadas em contato com APCs durante várias horas ou dias, de modo que as células T na cultura que são ativadas ao colocar em contato com uma APC proliferam e podem ser enriquecidas. Assim, em certas modalidades, o termo " colocar em contato " é usado alternadamente com o termo "cocultura". Ou seja, o colocar em contato uma população de células T que sintetizam a molécula quimérica da invenção com uma APC pode ser alcançado por cocultura das células em meio líquido por um período de tempo definido. De preferência, a cocultura leva à ativação de células T que expressam um par de TCR-peptídeo cognato e, assim, resulta na proliferação e enriquecimento dessas células T.

[0119] Em uma quarta etapa, as células T que foram ativadas ao colocar em contato com uma APC são isoladas. Como mostrado no Exemplo 1, apenas as células T que sintetizam uma molécula quimérica compreendendo um peptídeo antigênico que é reconhecido por seu receptor de células T são ativadas na presença de uma APC. Assim, o colocar em contato com uma APC leva apenas à ativação e proliferação de células T que expressam um peptídeo antigênico cognato. Essas células T podem, em seguida, ser isoladas das células T que não foram ativadas na presença da APC para determinar os pares de TCR-peptídeo cognatos das células T isoladas. O versado na técnica está ciente dos métodos para isolar células T ativadas e enriquecidas.

[0120] Por exemplo, células T ativadas e enriquecidas podem ser identificadas por citometria de fluxo, como classificação FACS, através da expressão de marcadores de ativação, tais como CD69, CD44 ou CD25 e/ou proteínas repórter, tal como GFP, mCherry, mTomato, dsRed ou outros marcadores de ativação adequados ou proteínas repórter, impulsionados por, por exemplo, promotores compreendendo sequência de ligação NFAT ou Nur77.

[0121] Em particular, a ativação pode ser medida por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0122] FACS refere-se a um método de separação de uma população de células em uma ou mais subpopulações com base na presença, ausência ou nível de um ou mais polipeptídeos específicos expressos pelas células. FACS depende de propriedades ópticas, incluindo fluorescência, de células individuais para classificar as células em subpopulações. Os classificadores de células adequados para realizar um método aqui descrito são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Classificadores de células exemplares incluem classificador MoFlo (DakoCytomation, Fori Collins, Colorado), FACSAria™, FACSArray™, FACS Vantage™, BD™ LSR II e FACSCaiibur™ (BD Biosciences, San Jose, Califórnia) e outros classificadores de células equivalentes produzidos por outros fornecedores comerciais, tais como Sony, Bio-Rad e Beckman Coulter.

[0123] Alternativamente, as células T compreendendo peptídeos eficientemente apresentados pelo MHC podem ser enriquecidas por classificação de células com base em MACS.

[0124] "MACS" refere-se a um método de separação de uma população de células em uma ou mais subpopulações com base na presença, ausência ou nível de um ou mais polipeptídeos selecionáveis por MACS expressos pelas células. MACS depende das propriedades de suscetibilidade magnética de células individuais marcadas para classificar as células em subpopulações. Para MACS, grânulos magnéticos (tais como aqueles disponíveis em Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Alemanha; 130-048-402) podem ser usados como marcadores. Os classificadores de células MACS adequados para realizar um método aqui descrito são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Classificadores de células MACS exemplares incluem o separador autoMACS Pro (Miltenyi Biotec).

[0125] A classificação resulta em uma população de células não fluorescentes e, pelo menos, uma população de células fluorescentes, dependendo de quantos marcadores fluorescentes foram usados. A presença de, pelo menos, uma população de células com células fluorescentes é indicativa de que, pelo menos, um peptídeo candidato é eficientemente apresentado por APCs. Assim, a FACS permite a classificação da população de células para produzir uma população de células enriquecida em células T compreendendo peptídeos apresentados de forma eficiente pelo MHC.

[0126] Em uma quarta etapa, o DNA de células T isoladas é sequenciado. Conforme descrito acima, as células T que são ativadas e enriquecidas na presença de uma APC compreendem um par de TCR-peptídeo cognato. Assim, o sequenciamento das células T ativadas que foram isoladas na etapa anterior fornece informações sobre qual peptídeo ativa qual receptor de célula T.

[0127] A sequência dos TCRs e os peptídeos cognatos correspondentes podem ser obtidos por sequenciamento de RNA/DNA de célula única de tal população de células T enriquecidas.

[0128] Os métodos de isolamento e sequenciamento de DNA são conhecidos daqueles versados na técnica.

[0129] Em geral, o objetivo é separar o DNA presente no núcleo da célula de outros componentes celulares. O isolamento do DNA geralmente começa com a lise ou decomposição das células. Este processo é essencial para a destruição das estruturas proteicas e permite a liberação de ácidos nucléicos do núcleo. A lise é realizada em uma solução salina, contendo detergentes para desnaturar proteínas ou proteases (enzimas que digerem proteínas), tal como a Proteinase K ou, em alguns casos, ambas. Isso resulta na decomposição das células e na dissolução das membranas. Os métodos de isolamento de DNA incluem, mas não são limitados a fenol: extração de clorofórmio, alta precipitação de sal, desnaturação alcalina, cromatografia em coluna de troca iônica, ligação de resina e ligação de grânulo paramagnético.

[0130] Os métodos de geração de cDNA são conhecidos daqueles versado na técnica. Em geral, o objetivo é converter o RNA isolado presente nas células em DNA, assim chamado cópia de DNA, a fim de utilizá-lo como molde para a reação em cadeia da polimerase (PCR). O isolamento do RNA geralmente começa com a lise ou decomposição das células. Este processo é essencial para a destruição das estruturas das proteínas e permite a liberação de ácidos nucléicos das mesmas. A lise é geralmente realizada em solução contendo fenol (por exemplo, TRIzolTM). Isso resulta na decomposição das células e na dissolução das membranas e permite a separação do RNA de outros componentes celulares. O RNA isolado é, em seguida, convertido em cDNA por transcriptase reversa (por exemplo, SuperscriptTM, GoscriptTM).

[0131] A sequência dos peptídeos candidatos transportados pelas células T ativadas (que se liga aos complexos MHC apresentados na superfície da célula de apresentação do antígeno) é, em seguida, amplificada por PCR e pode ser sequenciada por qualquer método conhecido na técnica.

[0132] A sequência dos peptídeos candidatos pode ser determinada por PCR digital. A reação em cadeia da polimerase digital (PCR digital, DigitalPCR, dPCR ou dePCR) é um refinamento dos métodos de reação em cadeia da polimerase convencionais que podem ser usados para quantificar diretamente e amplificar clonalmente ácidos nucleicos, incluindo DNA, cDNA ou RNA.

[0133] O sequenciamento também pode ser realizado usando microfluídicos. Os microfluídicos envolvem dispositivos em escala micro que manipulam pequenos volumes de fluidos. Como os microfluídicos podem controlar e dispensar de forma precisa e reproduzível pequenos volumes de fluido, em particular, volumes menores que 1 μl, a aplicação de microfluídicos fornece economia de custo significativa. O uso da tecnologia microfluídica reduz os tempos de ciclo, encurta o tempo para resultados e aumenta o rendimento. Além disso, a incorporação da tecnologia microfluídica melhora a integração e automação do sistema. As reações microfluídicas são geralmente conduzidas em microgotículas.

[0134] O sequenciamento também pode ser realizado usando a tecnologia de sequenciamento de Segunda Geração (ou Próxima Geração ou Next-Gen), Terceira Geração (ou Next-Next-Gen) ou Quarta Geração (ou N3-Gen), incluindo, mas não limitado a pirossequenciamento, sequenciamento por ligação, sequenciamento de única molécula, sequência por sínteses (SBS), clonal paralelo maciço, SBS de única molécula paralela maciça, única molécula paralela maciça em tempo real, tecnologia de nanoporos em tempo real de única molécula paralela maciça. Morozova e Marra fornecem uma revisão de algumas dessas tecnologias em Genomics, 92: 255 (2008).

[0135] Antes, após ou simultaneamente com o sequenciamento, os ácidos nucleicos podem ser amplificados. Exemplos ilustrativos não limitativos de técnicas de amplificação de ácido nucleico incluem, mas não são limitados à reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT- PCR), amplificação mediada por transcrição (TMA), reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação por deslocamento de filamento (SDA) e amplificação com base em sequência de ácido nucleico (NASBA). Aqueles versados na técnica reconhecerão que certas técnicas de amplificação (por exemplo, PCR) requerem que o RNA seja transcrito reversamente para DNA antes da amplificação (por exemplo, RT-PCR),

enquanto outras técnicas de amplificação amplificam diretamente o RNA (por exemplo, TMA e NASBA).

[0136] Em uma etapa final, os pares TCR-peptídeo cognatos das células T ativadas e enriquecidas são identificados por meio da análise e sequenciamento dos dados. O versado na técnica está ciente das ferramentas de bioinformática para analisar dados de sequenciamento. Assim, com o método descrito acima, será possível identificar múltiplos pares de TCR-peptídeo cognatos em um único experimento.

[0137] Em certas modalidades, o método de acordo com a invenção pode ser usado para a identificação de peptídeos antigênicos previamente desconhecidos. Para isso, uma biblioteca de polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora ligada a um peptídeo, em que pelo menos dois polipeptídeos da biblioteca codificam peptídeos com diferentes sequências de aminoácidos, pode ser introduzida em uma população de células T policlonais.

[0138] Em certas modalidades, os peptídeos na biblioteca podem ser codificados por DNA aleatório ou moléculas de cDNA. O DNA aleatório ou moléculas de cDNA podem, por exemplo, ser obtidos a partir de uma célula, em particular, uma célula de apresentação do antígeno, tal como uma célula tumoral ou uma célula que foi infectada com um patógeno, como descrito acima. Além disso, as moléculas de DNA aleatórias podem ser moléculas de DNA ou fragmentos de moléculas de DNA que codificam um peptídeo ou proteína para teste de imunogenicidade.

[0139] Em outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam o peptídeo da biblioteca podem ser obtidos por sínteses químicas. Por exemplo, as sequências dos polinucleotídeos que codificam os peptídeos da biblioteca podem ser projetadas computacionalmente com base em dados de exoma, conforme descrito acima. Alternativamente, as sequências dos polinucleotídeos que codificam os peptídeos da biblioteca podem ser concebidas com base na sequência de peptídeos que foram isolados de uma célula de apresentação do antígeno como descrito acima.

[0140] A biblioteca de polinucleotídeos pode ser introduzida em qualquer população de células T. Em particular, a população de células T pode ser uma população de células T que foi obtida do mesmo indivíduo que as moléculas de DNA ou cDNA que codificam os peptídeos da biblioteca.

[0141] Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para a identificação de antígenos tumorais anteriormente desconhecidos. Neste caso, é preferido que a informação da sequência dos peptídeos que são codificados na biblioteca de polinucleotídeos seja obtida a partir de uma célula tumoral. Para identificar os receptores de células T que se ligam especificamente a esses peptídeos, é ainda preferido que a biblioteca de polinucleotídeos seja rastreada contra células T monoclonais ou policlonais que foram obtidas de um indivíduo, em particular, um indivíduo que sofre de câncer, em particular, o mesmo indivíduo da célula tumoral que foi usada para a geração da biblioteca de polinucleotídeos que foi obtido.

[0142] Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para a identificação de antígenos associados a patógenos anteriormente desconhecidos. Neste caso, é preferido que a informação da sequência dos peptídeos que são codificados na biblioteca de polinucleotídeos seja obtida a partir de uma célula que foi infectada com um patógeno. Para identificar os receptores de células T que se ligam especificamente a estes peptídeos, é ainda preferido que a biblioteca de polinucleotídeos seja rastreada contra células T monoclonais ou policlonais que foram obtidas de um indivíduo, em particular, um indivíduo que sofre de uma doença infecciosa. De preferência, a célula que é usada para a geração da biblioteca e a população de células T monoclonais ou policlonais foram obtidas de indivíduos que sofrem da mesma doença infecciosa, mais de preferência, do mesmo indivíduo.

[0143] Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados para a identificação de peptídeos antigênicos que estão envolvidos no início e progressão de doenças autoimunes. As doenças autoimunes podem ser causadas por células T patogênicas que são ativadas por antígenos que estão presentes nas células saudáveis. Assim, a identificação de peptídeos antigênicos que são frequentemente reconhecidos por células T patogênicas pode facilitar o desenvolvimento de agentes que bloqueiam esse reconhecimento, tais como agentes de ligação que se ligam aos peptídeos antigênicos e impedem o reconhecimento por uma célula T patogênica. Desta maneira, o método da invenção pode ser usado para identificar peptídeos antigênicos que podem ser reconhecidos por células T patogênicas. Para isso, uma biblioteca de polinucleotídeo pode ser rastreada contra uma população monoclonal ou policlonal de células T patogênicas. É preferido que a população monoclonal ou policlonal de células T patogênicas seja obtida de um paciente que sofre de uma doença autoimune. Alternativamente, os polinucleotídeos que codificam um ou mais receptores de células T patogênicos conhecidos podem ser introduzidos em células T não patogênicas para obter uma população de células T patogênicas. O termo "célula T patogênica", tal como aqui utilizado, refere-se a uma célula T que responde a um autoantígeno durante o início ou progressão de uma doença autoimune.

[0144] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um método para identificar, pelo menos, um receptor de célula T específico de antígeno, o método que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam um polinucleotídeo da invenção; (b) colocar em contato as células T da etapa a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar os loci de TCR de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um receptor de células T codificado pelos loci de TCR de, pelo menos, uma célula T para ser específica de antígeno.

[0145] Em vez de rastrear vários receptores de células T contra vários peptídeos antigênicos simultaneamente, as moléculas quiméricas da invenção também podem ser usadas para a identificação de receptores de células T que são estimulados por um antígeno específico. Para isso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína correceptora ligada a um peptídeo específico é expresso em uma população de células T policlonais.

[0146] Desta maneira, o método da invenção pode ser usado para a identificação de receptores de células T com alta especificidade para um alvo antigênico conhecido. Por exemplo, o alvo antigênico conhecido pode ser um peptídeo antigênico que foi determinado para estar presente na superfície de uma célula de apresentação do antígeno de um indivíduo. Em particular, o peptídeo antigênico pode ser um peptídeo derivado de patógeno que é apresentado por uma molécula de MHC na superfície de uma célula que foi infectada com o patógeno. Alternativamente, o peptídeo antigênico pode ser um peptídeo que é especificamente apresentado por uma molécula de MHC na superfície de uma célula tumoral, mas não na superfície de uma célula saudável. Ao anexar um peptídeo a um correceptor que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido dos peptídeos antigênicos que são apresentados na célula infectada ou na célula tumoral, é possível identificar os receptores de células T com uma alta especificidade para esses peptídeos antigênicos.

[0147] Os receptores de células T específicos de antígenos que podem ser identificados com o método da invenção podem ser receptores de células T de ocorrência natural. Por exemplo, em certas modalidades, a população de células T policlonais pode ser isolada de um indivíduo. Em certas modalidades, a população de células T policlonais pode ser isolada de um indivíduo que foi determinado a compreender células infectadas ou células tumorais que exibem os peptídeos antigênicos em suas superfícies celulares.

[0148] Alternativamente, a população de células T policlonais pode ser obtida por engenharia genética. Por exemplo, a população de células T policlonais pode ser obtida pela introdução de uma biblioteca de receptores de células T em uma população de células T, em particular, células T negativas para TCR. Em certas modalidades, a biblioteca de receptores de células T pode ser gerada com base na sequência de um receptor de células T que já mostra um certo grau de ligação ao peptídeo antigênico que é apresentado por uma molécula de MHC na superfície de uma APC. Ou seja, a biblioteca pode ser gerada pela introdução de mutações aleatórias ou direcionadas na sequência de DNA que codifica o receptor de células T, com o objetivo de identificar uma variante mutada do receptor de células T que é estimulada pelo peptídeo antigênico de forma mais eficiente.

[0149] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um método para identificar, pelo meno,s um antígeno específico de células T, o método que compreende as etapas de: (a) fornecer células T monoclonais de interesse que expressam um polinucleotídeo da invenção ou uma biblioteca de polinucleotídeos da invenção; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar a parte do polinucleotídeo que codifica o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um peptídeo codificado pelo polinucleotídeo compreendido em, pelo menos, uma célula T para ser um antígeno específico da célula T.

[0150] Isto é, em certas modalidades, a molécula quimérica da invenção é usada para identificar peptídeos que estimulam de forma eficiente um receptor de célula T específico. Para isso, uma população de células T monoclonais pode ser rastreada contra a biblioteca de polinucleotídeos da invenção. Uma população de células T monoclonais é um grupo de mais de uma célula T, em que essencialmente todas as células T na população sintetizam um receptor de célula T idêntico. Desta maneira, o método da invenção pode ser usado para identificar peptídeos de uma biblioteca de peptídeos que estimulam eficientemente um receptor de célula T específico. Por exemplo, a biblioteca de peptídeos pode ser codificada pela biblioteca de polinucleotídeos da invenção, em que pelo menos dois polinucleotídeos da biblioteca codificam uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo com uma sequência de aminoácidos diferente.

[0151] Em certas modalidades, os peptídeos que estão ligados à proteína correceptora podem diferir em sua sequência de aminoácidos por compreenderem, pelo menos, dois peptídeos antigênicos diferentes que são conhecidos por serem apresentados por uma molécula de MHC. Em particular, os peptídeos antigênicos podem ser peptídeos que são derivados de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno.

[0152] Em outras modalidades, os peptídeos que estão ligados à proteína correceptora podem diferir em sua sequência de aminoácidos por serem variantes mutadas de um peptídeo antigênico conhecido. Ou seja, o método da invenção pode ser usado para identificar variantes mutadas de peptídeo antigênico conhecido que resultam na estimulação melhorada do receptor de células T cognato. Por exemplo, mutações aleatórias ou direcionadas podem ser introduzidas em um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácido de um peptídeo antigênico conhecido para identificar peptídeos que resultam em uma estimulação mais eficiente de um receptor de células T conhecido.

[0153] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a APC é uma APC autóloga ou heteróloga.

[0154] Ou seja, a APC que é colocada em contato com as células T nos métodos da invenção pode ser uma APC autóloga ou heteróloga. Uma "APC autóloga", conforme aqui utilizada, é uma APC que foi obtida do mesmo indivíduo que as células T com as quais a APC é colocada em contato. Uma "APC heteróloga", conforme aqui utilizada, é uma APC que foi obtida de um indivíduo diferente como as células T com as quais a APC é colocada em contato.

[0155] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a APC é uma linhagem celular ou célula heteróloga ou autóloga geneticamente modificada que expressa uma molécula de MHC mutada.

[0156] A APC autóloga ou heteróloga que é colocada em contato com as células T nos métodos da invenção pode ser uma APC geneticamente modificada que expressa uma molécula de MHC mutada.

[0157] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe II compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a cadeia beta de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo.

[0158] Ou seja, a molécula de MHC de classe II mutada pode compreender uma cadeia alfa de MHC de classe II e o domínio extracelular de uma cadeia beta de MHC de classe II fundida a um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo. Alternativamente, a molécula de MHC de classe II mutada pode compreender uma cadeia beta de MHC de classe II e o domínio extracelular de uma cadeia alfa de MHC de classe II fundida a um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo. Alternativamente, a molécula de MHC de classe II mutada pode compreender o domínio extracelular de uma cadeia alfa de MHC de classe II fundida com um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo e o domínio extracelular da cadeia beta de MHC de classe II fundida com um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo.

[0159] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe I compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe I extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a microglobulina beta-2.

[0160] Ou seja, um domínio extracelular de uma molécula de MHC de classe I ou II é dito ser fundido a um domínio de transmembrana nativo, se o domínio extracelular da molécula de MHC de classe I ou classe II estiver covalentemente ligado a um domínio de transmembrana de uma molécula de MHC diferente de classe I ou classe II, respectivamente. Um domínio extracelular de uma molécula de MHC de classe I ou II é dito ser fundido a um domínio de transmembrana heterólogo, se o domínio extracelular da molécula de MHC de classe I ou II estiver covalentemente ligado a um domínio de transmembrana de qualquer outra proteína de transmembrana, em particular, qualquer outra proteína de transmembrana de mamífero. O versado na técnica está ciente dos métodos para fundir o domínio extracelular de uma primeira proteína com o domínio de transmembrana de uma segunda proteína.

[0161] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo ou a biblioteca de polinucleotídeos é CD8, e em que a molécula de MHC compreendida na APC é uma molécula de MHC de classe I.

[0162] Ou seja, a proteína correceptora CD8 é conhecida por facilitar a ligação entre os complexos peptídeo-MHC de classe I e um TCR cognato. Assim, é preferido na presente invenção que o polinucleotídeo ou a biblioteca de polinucleotídeos que é introduzida nas células T codifique a proteína correceptora CD8 se as células resultantes forem colocadas em contato com uma APC que compreende uma molécula de MHC de classe I.

[0163] As moléculas de MHC de classe I são expressas na superfície das células em todos os vertebrados com mandíbula e são responsáveis por exibir antígenos às células T. Os genes que codificam as moléculas de MHC são encontrados na região de MHC do genoma dos vertebrados, embora a composição do gene e a disposição genômica variem amplamente.

[0164] Em seres humanos, esses genes são referidos como genes do antígeno leucocitário humano (HLA). Os genes HLA mais intensamente estudados são os nove chamados genes de MHC clássicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA 1, HLA-DPB 1, HLA-DQA 1, HLA-DQB 1, HLA-DRA e HLA-DRB 1. Em seres humanos, o MHC é dividido em três regiões: Classes I, II e III. Os genes A, B e C pertencem ao MHC de classe I, enquanto os seis genes D pertencem à classe II.

[0165] As moléculas de proteína de MHC de classe I são heterodímeros compreendendo duas cadeias de polipeptídeo: uma cadeia altamente polimórfica (compreendendo 3 domínios: a1, a2 e a3) e uma P2-microglobulina associada não covalentemente. As moléculas de proteína de MHC de classe I humanas podem ser referidas na técnica como "moléculas de HLA" ou "moléculas de proteína de HLA".

[0166] Desta maneira, o termo "molécula de MHC de classe I", como aqui utilizado, inclui todas as moléculas de MHC de classe I de mamíferos, incluindo seres humanos e não humanos. De preferência, a molécula de MHC de classe I é uma molécula de MHC de classe I humana (molécula de proteína de HLA).

[0167] As moléculas de MHC de classe I são responsáveis pela ligação e apresentação de antígenos na superfície celular e, portanto, existem com ou sem antígeno ligado. Desta maneira, o termo molécula de MHC de classe I refere-se à molécula de MHC de classe I sozinha ou quando ligada a um antígeno.

[0168] A molécula de MHC de classe I pode ser uma molécula de HLA. De preferência, a molécula de HLA é um produto do gene HLA-A. O gene HLA-A é polialélico e, como tal, existe uma variedade de diferenças na cadeia da proteína codificada na população.

[0169] De preferência, a molécula de HLA ligada à primeira porção de acordo com a invenção é um produto do gene HLA-A2. HLA-A2 é um sorotipo HLA dentro do grupo de sorotipo HLA-A'A' e é codificado pelo grupo alelo H LA-A 02 incluindo os produtos do gene HLA-A0201, HLA-A0202, HLA-A0203, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207 e HLA-A021 1. O HLA-A2 é muito comum na população Caucasiana (40- 50%) e fornece um alvo celular ideal para a primeira porção porque será adequado para uso em muitas combinações de doador e receptor. Essa abordagem seria adequada para cerca de um quarto de todos os casos de transplante na população Caucasiana. Desta maneira, qualquer membro do grupo alelo HLA-A2 é abrangido pelo termo 'HLA-A2'.

[0170] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo é CD4 ou LAG-3, e em que a molécula de MHC expressa pela APC é uma molécula de MHC de classe II.

[0171] É ainda preferido que o polinucleotídeo ou a biblioteca de polinucleotídeos que é introduzida nas células T codifique as proteínas correceptoras CD4 ou LAG3 se as células resultantes forem colocadas em contato com uma APC que compreende uma molécula de MHC de classe II.

[0172] A molécula de MHC de classe II é composta por duas cadeias de polipeptídeo que abrangem a membrana, α e β, de tamanho similar (cerca de 30000 Da). Cada cadeia consiste em dois domínios, onde α1 e β1 formam um sulco de ligação de peptídeo de 9 bolsas, onde as bolsas 1, 4, 6 e 9 são consideradas as principais bolsas de ligação de peptídeo. O α2 e β2, como o α2 e β2m nas moléculas de MHC de classe I, têm sequência de aminoácidos e semelhanças estruturais com domínios constantes de imunoglobulina. Em contraste com os complexos de MHC de classe I, onde as extremidades do peptídeo antigênico estão enterradas, as extremidades do peptídeo em complexos de MHC de classe II não estão. HLA-DR, DQ e DP são as moléculas de classe II humanas, H-2A, M e E são as dos camundongos.

[0173] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer ou uma doença infecciosa, o método que compreende as etapas de: (a) identificar, pelo menos, um receptor de célula T específico de antígeno e/ou pelo menos um antígeno específico de célula T com os métodos da invenção; (b) administrar ao indivíduo que sofre de câncer ou de uma doença infecciosa o, pelo menos, um receptor de célula T e/ou antígeno específico de célula T identificado na etapa (a).

[0174] Ou seja, o método da invenção pode ser usado para identificar peptídeos antigênicos ou receptores de células T específicos de antígenos que podem ser usados no tratamento de um indivíduo que sofre de câncer ou de uma doença infecciosa. Por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados para identificar receptores de células T de ocorrência natural ou modificados que são eficientemente estimulados por um peptídeo antigênico que é apresentado por moléculas de MHC nas células tumorais do indivíduo ou em células que foram infectadas com um patógeno. Neste caso, o receptor de células T específico de antígeno identificado pode ser administrado ao indivíduo que sofre de câncer para atacar as células tumorais nesse indivíduo ou ao indivíduo que sofre de uma doença infecciosa para atacar células que foram infectadas com o patógeno.

[0175] Alternativamente, os métodos da invenção podem ser usados para identificar peptídeos antigênicos previamente desconhecidos. Em particular, os métodos da invenção podem ser usados para identificar peptídeos antigênicos previamente desconhecidos que são expressos por uma APC, em particular, por uma célula tumoral ou por uma célula que foi infectada com um patógeno.

[0176] Os métodos da invenção podem ainda ser usados para determinar se um peptídeo antigênico recentemente identificado é reconhecido por uma célula T, em particular, uma célula T que foi obtida do mesmo indivíduo que a célula tumoral ou a célula infectada. Se um par TCR-peptídeo cognato previamente desconhecido for identificado em um indivíduo que sofre de câncer ou uma doença infecciosa usando os métodos da invenção, o referido indivíduo pode ser tratado com o peptídeo antigênico ou seu receptor de células T cognato.

[0177] Em certas modalidades, é preferido que as células T monoclonais ou policlonais que foram utilizadas para a identificação do peptídeo antigênico e/ou o receptor de células T específico de antígeno tenham sido obtidas do paciente que sofre de câncer ou de uma doença infecciosa. Em outras modalidades, é preferido que a biblioteca de polinucleotídeos que é introduzida nas células T compreenda sequências de polinucleotídeo que foram obtidas a partir de APCs do indivíduo que sofre de câncer ou de uma doença infecciosa, em particular, de células tumorais do indivíduo que sofre de câncer ou de células que foram infectadas com o patógeno.

[0178] Os cânceres que podem ser tratados com o método da invenção incluem tumores que não são vascularizados, ou ainda não substancialmente vascularizados, bem como, tumores vascularizados. Os cânceres podem compreender tumores não sólidos (tais como, tumores hematológicos, por exemplo, leucemias e linfomas) ou podem compreender tumores sólidos. Os tipos de cânceres a serem tratados com os linfócitos da invenção incluem, mas não são limitados a, carcinoma, blastoma e sarcoma, e certas leucemias ou malignidades linfoides, tumores benignos e malignos e malignidades, por exemplo, sarcomas, carcinomas e melanomas. Tumores/cânceres adultos e tumores/cânceres pediátricos também estão incluídos.

[0179] Os cânceres hematológicos são cânceres do sangue ou da medula óssea. Exemplos de cânceres hematológicos (ou hematogênicos) incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogênica aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (tais como,

leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mielogênea crônica, e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma de não- Hodgkin (formas indolentes e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

[0180] Os tumores sólidos são massas anormais de tecido que geralmente não contêm cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados para o tipo de células que os formam (tais como, sarcomas, carcinomas e linfomas). Exemplos de tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfóide, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireoide, carcinoma de glândula sebácea feocromocitomas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma da bexiga, melanoma e tumores do SNC (tais como um glioma (como glioma do tronco cerebral e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, craniofariogioma de Schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais).

[0181] Na presente invenção, a doença infecciosa pode ser causada por qualquer patógeno. Em certas modalidades, a doença infecciosa é causada por um patógeno viral. Em certas modalidades, o patógeno viral citomegalovírus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), adenovírus, poliomavírus, vírus de Varizella-Zoster (VZV), herpes-vírus humano (HHV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou vírus da influenza.

[0182] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que o receptor de célula T específico de antígeno é administrado ao indivíduo para administração de genes mediada por vírus.

[0183] Um receptor de células T de ocorrência natural ou modificado que foi identificado com os métodos da invenção para ligar de forma eficiente um antígeno que é apresentado na superfície de uma célula tumoral que foi obtida de um indivíduo que sofre de câncer ou na superfície de uma célula infectada de patógeno que foi obtida de um indivíduo pode ser administrada a esse indivíduo por qualquer via. Por exemplo, o receptor de células T pode ser administrado ao indivíduo para administração de genes mediada por vírus. Para isso, é preferível que uma população de células T seja primeiro isolada do indivíduo. Os genes que codificam o TCR específico de antígeno são introduzidos na população de células T para administração de genes mediada por vírus e as células T que receberam os genes e sintetizaram o receptor de células T específico de antígeno são, em seguida, reintroduzidas no indivíduo. O versado na técnica está ciente dos métodos e vetores virais adequados para a administração de genes mediada por vírus. Em particular, vetores com base em vírus lentivirais ou adeno-associados podem ser usados para a administração de genes de TCR a uma célula T.

[0184] Alternativamente, o receptor de célula T específico de antígeno pode ser um receptor de célula T específico de antígeno solúvel que é administrado diretamente ao indivíduo. Em uma modalidade particular, o receptor de células T específico de antígeno solúvel é conjugado a outra molécula, tal como um composto farmacêutico.

[0185] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que o antígeno específico da célula T é administrado ao indivíduo na forma de um peptídeo ou na forma de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo.

[0186] Um peptídeo antigênico que foi identificado com os métodos da invenção pode ser administrado a um indivíduo que sofre de câncer ou uma doença infecciosa de qualquer forma. Ou seja, o peptídeo antigênico pode ser administrado ao indivíduo na forma de um peptídeo, de modo que o peptídeo seja absorvido e apresentado por uma célula de apresentação do antígeno que, por sua vez, pode resultar na ativação de células T específicas de antígeno. Alternativamente, o peptídeo antigênico também pode ser administrado ao indivíduo na forma de um peptídeo maior ou proteína compreendendo o peptídeo antigênico. O peptídeo ou proteína maior pode, em seguida, ser absorvido por uma célula de apresentação do antígeno e processado, de modo que o peptídeo antigênico seja apresentado por um MHC na superfície da célula de apresentação do antígeno. Alternativamente, o peptídeo antigênico pode ser administrado ao indivíduo na forma de um polinucleotídeo, que pode ser absorvido por uma APC de modo que o peptídeo antigênico seja expresso e apresentado pela APC. Em certas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo específico de antígeno é uma molécula de DNA. Em outras modalidades, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo específico de antígeno é uma molécula de RNA, em particular, uma molécula de mRNA. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende outros elementos reguladores ou sequências de codificação.

[0187] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se ao método da invenção, em que o peptídeo ou o polinucleotídeo que codifica o peptídeo está ligado a um composto que melhora a administração do peptídeo ou polinucleotídeo que codifica o peptídeo para uma APC.

[0188] O peptídeo ou o polinucleotídeo que codifica o peptídeo pode ser ligado a qualquer composto que facilite a administração do peptídeo ou o polinucleotídeo à APC. Ou seja, o peptídeo ou polinucleotídeo pode ser ligado, por exemplo, a uma porção de direcionamento que direciona o peptídeo ou polinucleotídeo para a APC.

[0189] O termo "administração", tal como aqui utilizado para se referir à administração de um material TCR da invenção ou peptídeo antigênico a um indivíduo, não está limitado a qualquer via particular, mas sim refere-se a qualquer via aceita como apropriada pela comunidade médica. O termo "indivíduo", conforme aqui utilizado, denota qualquer animal, de preferência, um mamífero, e mais de preferência, um ser humano. Exemplos de indivíduos incluem seres humanos, primatas não humanos, roedores, porquinhos-da-índia, coelhos, ovelhas, porcos, cabras, vacas, cavalos, cães e gatos. Na presente invenção, o termo "indivíduo" é usado alternadamente com o termo "paciente".

[0190] O termo "tratar", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer melhora de uma doença ou distúrbio, tal como câncer ou uma doença infecciosa, que ocorre em um indivíduo tratado em comparação com um indivíduo não tratado. Tal melhoria pode ser uma prevenção de um agravamento ou progressão da referida doença ou distúrbio. Além disso, essa melhoria também pode ser uma melhoria ou cura da doença ou distúrbio ou dos sintomas que a acompanham. Será entendido que um tratamento pode não ter sucesso para 100% dos indivíduos a serem tratados. O termo, no entanto, requer que o tratamento seja bem-sucedido para uma porção estatisticamente significativa dos indivíduos (por exemplo, uma coorte em um estudo clínico). Se uma porção é estatisticamente significativa pode ser determinada sem mais delongas pelo versado na técnica usando várias ferramentas de avaliação estatística bem conhecidas, por exemplo, determinação de intervalos de confiança, determinação do valor p, teste t de Student, teste de Mann-Whitney, etc. Os detalhes são encontrados em Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Os intervalos de confiança preferidos são de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Os valores p são, de preferência, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001.

[0191] B1. Uma molécula quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor.

[0192] B2. A molécula quimérica da modalidade B1, em que o peptídeo está ligado ao N-terminal do correceptor através de um ligante.

[0193] B3. A molécula quimérica da modalidade B1 ou modalidade B2, em que o peptídeo é codificado por uma determinada molécula de cDNA ou DNA.

[0194] B4. A molécula quimérica da modalidade B3, em que o cDNA ou DNA é derivado da molécula de cDNA ou DNA fragmentada.

[0195] B5. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1 a B4, em que o peptídeo é um peptídeo aleatório.

[0196] B6. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1 a B5, em que o peptídeo é derivado de uma biblioteca de peptídeos.

[0197] B7. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1 a B6, em que o peptídeo tem entre 6 a 200 resíduos de aminoácido.

[0198] B8. A molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B7, em que o peptídeo é codificado por um DNA compreendendo um SNP presente em um DNA de tumor.

[0199] B9. Um constructo de DNA quimérico compreendendo um DNA que codifica a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B8.

[0200] B10. Uma biblioteca de moléculas quiméricas compreendendo uma ou mais das moléculas definidas em qualquer uma das modalidades B1-B8.

[0201] B11. Método para detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígeno e os peptídeos especificamente reconhecidos por seus receptores de células T (TCRs), que compreende a) fornecer células T policlonais de interesse superexpressando um constructo de DNA quimérico que codifica a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B8. b) cultivar as células T superexpressando o constructo de DNA quimérico da etapa a) na presença de células de apresentação do antígeno (APC) que expressam o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) compreendendo um sulco de ligação de peptídeo de modo que um complexo seja formado entre o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e ao sulco de ligação de peptídeo de MHC, que após o reconhecimento pelo TCR, leva à ativação das células T; c) isolar as células T ativadas e expandidas na etapa de cocultura b); e opcionalmente d) sequenciar o DNA das células T isoladas para obter informações sobre as sequências de TCR e sequências de peptídeo ligadas aos correceptores CD4, LAG-3 ou CD8 presentes nessas células T.

[0202] B12. O método da modalidade B11, em que a célula T ativada compreende um TCR, que reconhece o complexo de peptídeo MHC formado na etapa b).

[0203] B13. Um método para identificação de sequências de TCR específicas de antígeno, que compreende a) fornecer células T policlonais de interesse superexpressando um constructo de DNA quimérico que codifica a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B8; b) cultivar as células T superexpressando o constructo de DNA quimérico da etapa a) na presença de células de apresentação do antígeno (APC) que expressam o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) compreendendo um sulco de ligação de peptídeo de modo que um complexo seja formado entre o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e ao sulco de ligação de peptídeo de MHC, que após o reconhecimento pelo TCR, leva à ativação das células T; c) identificar e classificar células T ativadas e expandidas na etapa de cocultura b) através da expressão de marcadores de ativação ou proteínas repórter; d) sequenciar os loci de TCR das células T identificadas e classificadas na etapa c).

[0204] B14. Um método para a identificação de antígenos específicos de células T, que compreende a) fornecer células T monoclonais de interesse superexpressando um constructo de DNA quimérico que codifica a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B8; b) cultivar as células T superexpressando o constructo de DNA quimérico da etapa a) na presença de células de apresentação do antígeno (APC) que expressam o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) compreendendo um sulco de ligação de peptídeo de modo que um complexo seja formado entre o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e ao sulco de ligação de peptídeo de MHC, que após o reconhecimento pelo TCR, leva à ativação das células T; c) identificar e classificar as células T ativadas na cocultura da etapa b) através da expressão de marcadores de ativação ou proteínas repórter; d) isolar DNA/RNA presente nas células T identificadas e classificadas na etapa c); e) amplificar (por PCR ou rtPCR) o fragmento que codifica o correceptor quimérico; e f) sequenciar a parte que codifica o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8.

[0205] B15. O método de qualquer uma das modalidades B11 a B14, em que a APC é uma APC autóloga.

[0206] B16. O método de qualquer uma das modalidades B11 a B14, em que a APC é uma APC heteróloga.

[0207] B17. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades B11 a B14, em que a APC é uma linhagem celular ou célula autóloga ou heteróloga geneticamente modificada, superexpressando uma molécula de MHC mutada.

[0208] B18. O método de qualquer uma das modalidades B11 a B17, em que na etapa a) os constructos de DNA quimérico, superexpressos nas células T de interesse, codificam uma biblioteca de peptídeo.

[0209] B19. O método da modalidade B18, em que a biblioteca de peptídeo é uma biblioteca conforme definida na modalidade B10.

[0210] B20. O método de qualquer uma das modalidades B11-B19, em que o correceptor é CD8 e a molécula de MHC é uma molécula de MHC de classe I.

[0211] B21. O método de qualquer uma das modalidades B11-B19, em que o correceptor é CD4, ou LAG-3, e a molécula de MHC é uma molécula de MHC de classe II.

[0212] B22. O método de qualquer uma das modalidades B17 a B21, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe II compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a cadeia beta de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo.

[0213] B23. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades B17 a B21, em que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe I, compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe I extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a microglobulina beta-2.

[0214] A presente invenção fornece métodos para detectar e enriquecer simultaneamente células T específicas de antígeno e os peptídeos especificamente reconhecidos por seus receptores de células T (TCRs), e para a identificação de antígenos específicos de células T para intervenções in vivo e/ou in vitro, incluindo vacinação, indução de tolerância imunológica, bloqueio de TCRs e administração de toxina mediada por MHC, para testes de imunogenicidade e outros testes de reatividade de células T in vitro. A presente invenção também refere-se às moléculas quiméricas utilizadas nos referidos métodos.

[0215] Em particular, o método compreende as etapas de a) fornecer células T policlonais ou monoclonais de interesse superexpressando um constructo de DNA quimérico compreendendo a molécula quimérica de qualquer uma das modalidades B1-B4; b) cultivar as células T superexpressando o constructo de DNA quimérico da etapa a) na presença de uma célula de apresentação do antígeno (APC) que expressa o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) compreendendo um sulco de ligação de peptídeo de modo que um complexo seja formado entre o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e ao sulco de ligação de peptídeo de MHC, que após o reconhecimento pelo TCR, leva à ativação das células T; c) isolar células T ativadas na cocultura da etapa b), particularmente por citometria de fluxo e classificação de FACS das células T através da expressão de marcadores de ativação, tais como CD69, CD44 ou CD25 ou proteínas repórter, tais como GFP, mCherry, mTomato, dsRed, etc.; e d) isolar DNA/RNA presente nas células T identificadas e classificadas na etapa c); e) amplificar (por PCR ou rtPCR) o fragmento que codifica o correceptor quimérico, e f) sequenciar a parte que codifica o peptídeo ligado ao N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8.

[0216] Em várias modalidades específicas da invenção, as células T ativadas na cocultura da etapa b) podem ser isoladas por citometria de fluxo e classificação de FACS das células T através da expressão de marcadores de ativação, tais como, por exemplo, CD69, CD44 ou CD25 e/ou proteínas repórter, tais como, por exemplo, GFP, mCherry, mTomato, dsRed ou outros marcadores de ativação adequados ou proteínas repórter.

[0217] Os métodos conhecidos na técnica são severamente limitados no que diz respeito ao processamento paralelo, uma vez que não permitem a triagem simultânea de muitos TCRs contra muitos epítopos. Os TCRs de interesse devem ser rastreados em relação às bibliotecas de epítopos, um por um. Vice-versa, encontrar TCRs reativos a epítopos de interesse, requer que os epítopos sejam rastreados contra bibliotecas de TCR um por um.

[0218] A presente invenção fornece pela primeira vez um método que permite a detecção e enriquecimento simultâneos de células T específicas de antígeno e a identificação dos TCRs e seus epítopos cognatos.

[0219] Isto é alcançado através da expressão de moléculas quiméricas compreendendo as proteínas correceptoras CD4, LAG-3 ou CD8 e uma biblioteca de peptídeos ligada ao N-terminal destes correceptores nas células T de interesse. Também podem ser utilizadas linhagens de células T negativas de TCR superexpressando bibliotecas de TCRs.

[0220] Em particular, uma célula T de interesse pode ser uma célula T isolada de sangue, baço, nódulos linfáticos ou tecido tumoral ou de qualquer outra fonte adequada.

[0221] Em particular, as moléculas quiméricas descritas acima estão compreendidas em um vetor de expressão recombinante.

[0222] As proteínas correceptoras CD4, LAG-3 ou CD8 são, em particular, proteínas correceptoras CD4, LAG-3 ou CD8 de comprimento total.

[0223] A amarração do peptídeo ao N-terminal dos correceptores CD4, LAG- 3 ou CD8 pode ser efetuada pelo uso de uma molécula ligante.

[0224] Em particular, a molécula ligante compreende entre cerca de 5 a 30 aminoácidos.

[0225] As moléculas ligantes adequadas são (G4S)1, (G4S)2, (G4S)3, (G4S)5, etc.

[0226] Em particular, um ligante GS pode ser usado variando de 5 a 28 aminoácidos.

[0227] O peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor é em particular (i) um peptídeo aleatório; (ii) um peptídeo derivado de uma determinada molécula de cDNA ou DNA; (iii) um peptídeo codificado por uma molécula de cDNA ou DNA fragmentada.

[0228] As moléculas de cDNA ou DNA fragmentadas podem ser geradas por divisão aleatória ou digestão de cDNA ou DNA derivado de biópsias de tecido, células ou patógenos de interesse.

[0229] Por exemplo, o peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor pode ser codificado por uma molécula de DNA ou uma molécula de DNA fragmentada compreendendo um SNP presente em um DNA de tumor.

[0230] Outros peptídeos que podem ser usados no constructo quimérico são, por exemplo, sem estar limitado a: - TSA obtido por sequenciamento de exoma usado para identificar TSAs que estão exclusivamente presentes em um tumor; - um peptídeo específico de tumor que transporta mutações derivadas de tumor individual, tal como uma variante de nucleotídeo único (SNV). SNV incluindo várias mutações de p53, KRAS e BRAF; - um antígeno que causa uma resposta imunológica, por exemplo, os peptídeos podem ser derivados de patógenos; - um composto em teste de imunogenicidade;

- uma biblioteca de peptídeos candidatos, em que a biblioteca compreende formas mutantes de peptídeos nativos.

[0231] Em particular, uma biblioteca de peptídeos candidatos pode ser usada nos métodos descritos aqui, em que a biblioteca compreende peptídeos gerados por separação aleatória ou digestão de cDNA ou DNA derivado de células ou patógenos de interesse. Essa biblioteca cobriria todos os peptídeos presentes em tais células.

[0232] A molécula quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor são expressos em células T de interesse.

[0233] Em particular, vetores de expressão recombinantes podem ser usados, os quais são constructos de DNA replicáveis compreendendo um conjunto de (1) agente tendo um papel regulador na expressão do gene, por exemplo, promotores, operadores ou intensificadores, operativamente ligados a (2) uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína desejada (tal como o CD4, Lag-3 ou CD8 com peptídeos amarrados) que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e terminação de transcrição e tradução apropriadas. A escolha do promotor e de outros elementos reguladores geralmente varia de acordo com a linhagem celular repórter pretendida. Os vetores de expressão são frequentemente na forma de "plasmídeos" que referem-se a laços de DNA de filamento duplo circular que, em sua forma de vetor, não estão ligados ao cromossomo.

[0234] Vetores de expressão de eucariotas, replicando-se epissomaticamente, tal como pCEP4 ou BKV, ou outros vetores derivados de vírus, tais como retrovírus, por exemplo, pMY, pMX, pSIR, adenovírus, por exemplo, pAd e similares podem ser empregados. Nos vetores de expressão, os elementos reguladores que controlam a transcrição ou tradução podem ser geralmente derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de inseto. A capacidade de replicação,

geralmente conferida por uma origem de replicação (por exemplo, origem latente do vírus Epstein Barr de replicação de DNA), e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes podem ser incorporados adicionalmente. Os vetores de expressão contendo elementos reguladores de vírus eucarióticos são tipicamente usados em vetores de expressão eucarióticos, por exemplo, vetores SV40, vetores de vírus do papiloma e vetores derivados do vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo- 5, baculovírus pDSVE e qualquer outro vetor que permite a expressão de proteínas sob a direção do promotor CMV, promotor inicial SV40, promotor posterior SV40, promotor de metalotioneína, promotor do vírus do tumor mamário murino, promotor do vírus do sarcoma de Rous, promotor de poliedrina ou outros promotores que se mostraram eficazes para a expressão em células eucarióticas.

[0235] Um "promotor" é definido como uma matriz de sequências de controle de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Tal como aqui utilizado, um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias perto do local de início da transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui, opcionalmente, elementos intensificadores ou repressores distais, que podem estar localizados em até vários milhares de pares de bases a partir do local de início da transcrição. Os promotores para uso em células hospedeiras eucarióticas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos ilustrativos de tais promotores incluem, mas não são limitados a, promotores do vírus Simian 40 (SV40), promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como o promotor de repetição de terminal longo do HIV (LTR), promotores de vírus Moloney, promotores de ALV, promotores de citomegalovírus (CMV), tais como o promotor precoce imediato de CMV, promotor de vírus Epstein Barr (EBV), promotor de vírus de sarcoma Raus (RSV), bem como, promotores de genes humanos, tais como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana e metalotioneína humana. Ainda outros exemplos de promotores adequados incluem o promotor CAG (um promotor híbrido compreendendo um intensificador de CMV, um promotor de β-actina de galinha e um aceitador de união de β-globina de coelho e sequência de poli(A)).

[0236] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor ou matriz de locais de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controle de expressão direciona a transcrição do ácido nucleico correspondendo à segunda sequência.

[0237] A molécula de DNA quimérica compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor como aqui descrito, particularmente a molécula de DNA quimérica compreendida em um vetor de expressão, pode ser introduzida em células T de interesse por transdução da molécula de DNA quimérica, particularmente o vetor de expressão compreendendo a molécula de DNA quimérica, na célula hospedeira usando técnicas padrão conhecidas na área. Os métodos adequados são, por exemplo, descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989). Para produzir pseudorretrovírus para transdução, linhagens de células de empacotamento que expressam constantemente as proteínas retrovirais GAG, POL e ENV (como, por exemplo, a linhagem celular Phoenix), são transitoriamente transfectadas com constructos contendo o genoma viral composto de LTRs, sinais de empacotamento e os genes de interesse (neste caso, o peptídeo carregando cadeias de MHC). Alternativamente, linhagens celulares adequadas, como HEK, 3T3 ou outras, são transfectadas transitoriamente com uma mistura de vetores que codificam separadamente as proteínas retrovirais GAG, POL e ENV e o genoma viral composto de LTRs, sinais de empacotamento e genes de interesse. Essas estratégias comumente usadas garantem a produção de pseudorretrovírus defeituosos, que são capazes de infectar células alvo e introduzir os genes de interesse em seu DNA genômico. No entanto, as células alvo infectadas não são capazes de produzir retrovírus porque os pseudorretrovírus não carregam os genes gag, pol e env em seu genoma.

[0238] Alternativamente, a molécula de DNA quimérica, particularmente o vetor de expressão compreendendo a molécula de DNA quimérica, pode ser introduzida nas células T de interesse por transfecção com reagentes à base de lipídios, fosfato de cálcio, polímeros catiônicos ou DEAE-dextrano, ou por eletroporação.

[0239] As células T que podem ser utilizadas no método aqui descrito são, por exemplo, sem estarem limitadas a células T isoladas de sangue, baço, nódulos linfáticos ou tecido tumoral.

[0240] Em particular, hibridomas de células T CD4 ou CD8-negativas podem ser utilizados, particularmente hibridomas de células T CD4 ou CD8-negativas que transportam um repórter fluorescente. No entanto, este não é um pré-requisito, pois as células CD4+ também podem ser usadas (Figura 2).

[0241] Um repórter fluorescente adequado para a ativação de células T é, por exemplo, o repórter fluorescente nur77, o repórter fluorescente NFAT ou qualquer outra molécula repórter adequada.

[0242] A expressão eficiente do constructo de fusão compreendendo a proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e o peptídeo ligado ao N-terminal da proteína correceptora na superfície celular pode ser determinada por coloração de anticorpo específica CD4, LAG-3 ou CD8. O anticorpo pode ser conjugado diretamente a um marcador detectável. Alternativamente, um anticorpo secundário, conjugado a um marcador detectável e específico para o primeiro anticorpo, pode ser colocado em contato com as células. Marcadores detectáveis adequados para uso incluem qualquer composto detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Marcadores úteis na presente invenção incluem biotina, grânulos magnéticos (por exemplo, Dynabeads™), marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, texas vermelho, rodamina, proteína fluorescente verde, dansil, umbeliferona, PE, APC, CY5, Cy7, PerCP, corantes Alexa e similares), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina e outros) e marcadores colorimétricos, tais como grânulos de ouro coloidal ou vidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Uma variedade de marcadores fluorescentes adequados é ainda descrita em, por exemplo, The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition.

[0243] Quando as células T que superexpressam a molécula quimérica, conforme definido aqui, são cultivadas na presença de células de apresentação do antígeno autólogo (APCs), os peptídeos ligados ao N-terminal da proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 são inseridos nos sulcos das moléculas de MHC expressas na superfície das APCs de modo que possam ser apresentados às células T.

[0244] Se os peptídeos são reconhecidos pelo TCR, as células T são ativadas e proliferam.

[0245] Desta maneira, a transfecção (por transdução retroviral ou eletroporação) de um constructo compreendendo a molécula quimérica como aqui descrito que codifica um determinado peptídeo em células T policlonais leva exclusivamente à proliferação e enriquecimento de células T compreendendo TCRs específicos para esse peptídeo.

[0246] Os constructos usados para transdução podem codificar não apenas um único peptídeo, mas uma biblioteca de peptídeos.

[0247] A transfecção (por transdução retroviral ou eletroporação) de constructos que codificam uma biblioteca de peptídeos em células T policlonais leva exclusivamente à proliferação e enriquecimento de células T que transportam peptídeos, que são especificamente reconhecidos por seus TCRs.

[0248] Como os peptídeos estimulantes estão ligados ao N-terminal da proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 e são, portanto, compreendidos nas células T, após tempo suficiente para que apenas as células T carregando seus peptídeos cognatos sejam deixadas em cultura.

[0249] As células T ativadas e enriquecidas podem ser identificadas por citometria de fluxo e classificação de FACS por meio da expressão de marcadores de ativação, tais como CD69, CD44 ou CD25 e/ou proteínas repórter, tais como GFP, mCherry, mTomato, dsRed ou outros marcadores de ativação adequados de proteínas repórter conduzidas por, por exemplo, promotores de NFAT ou Nur77.

[0250] Em particular, a ativação pode ser medida por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0251] FACS refere-se a um método de separação de uma população de células em uma ou mais subpopulações com base na presença, ausência ou nível de um ou mais polipeptídeos específicos expressos pelas células. FACS depende de propriedades ópticas, incluindo fluorescência, de células individuais para classificar as células em subpopulações. Os classificadores de células adequados para realizar um método aqui descrito são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Classificadores de células exemplares incluem classificador MoFlo (DakoCytomation, Fori Collins, Colorado), FACSAria™, FACSArray™, FACS Vantage™, BD™ LSR II e FACSCaiibur™ (BD Biosciences, San Jose, Califórnia) e outros classificadores de células equivalentes produzidos por outros fornecedores comerciais, tais como Sony, Bio-Rad e Beckman Coulter.

[0252] Alternativamente, as células T compreendendo peptídeos eficientemente apresentados pelo MHC podem ser enriquecidas por classificação de células com base em MACS.

[0253] "MACS" refere-se a um método de separação de uma população de células em uma ou mais subpopulações com base na presença, ausência ou nível de um ou mais polipeptídeos selecionáveis por MACS expressos pelas células. O MACS depende das propriedades de suscetibilidade magnética de células individuais marcadas de modo a classificar as células em subpopulações. Para MACS, grânulos magnéticos (tais como aqueles disponíveis em Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach, Alemanha; 130-048-402) podem ser usados como marcadores. Os classificadores de células MACS adequados para realizar um método aqui descrito são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Classificadores de células MACS exemplares incluem o separador autoMACS Pro (Miltenyi Biotec).

[0254] A classificação resulta em uma população de células não fluorescentes e, pelo menos, uma população de células fluorescentes, dependendo de quantos marcadores fluorescentes foram usados. A presença de, pelo menos, uma população de células com células fluorescentes é indicativa de que, pelo menos, um peptídeo candidato é eficientemente apresentado por APCs. Assim, a FACS permite a classificação da população de células para produzir uma população de células enriquecida em células T compreendendo peptídeos apresentados de forma eficiente pelo MHC.

[0255] A sequência dos TCRs e os peptídeos cognatos correspondentes podem ser obtidos por sequenciamento de RNA/DNA de célula única de tal população de células T enriquecidas.

[0256] Os métodos de isolamento e sequenciamento de DNA são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0257] Em geral, o objetivo é separar o DNA presente no núcleo da célula de outros componentes celulares. O isolamento do DNA geralmente começa com a lise ou decomposição das células. Este processo é essencial para a destruição das estruturas proteicas e permite a liberação de ácidos nucléicos do núcleo. A lise é realizada em solução salina, contendo detergentes para desnaturar proteínas ou proteases (enzimas que digerem proteínas), tal como a Proteinase K ou, em alguns casos, ambas. Isso resulta na decomposição das células e na dissolução das membranas. Os métodos de isolamento de DNA incluem, mas não são limitados a fenol: extração de clorofórmio, alta precipitação de sal, desnaturação alcalina, cromatografia em coluna de troca iônica, ligação de resina e ligação de grânulo paramagnético.

[0258] Métodos de geração de cDNA conhecidos por aqueles versados na técnica. Em geral, o objetivo é converter o RNA isolado presente nas células em DNA, denominado cópia-DNA, a fim de utilizá-lo como molde para a reação em cadeia da polimerase (PCR). O isolamento do RNA geralmente começa com a lise ou decomposição das células. Este processo é essencial para a destruição das estruturas das proteínas e permite a liberação de ácidos nucléicos das mesmas. A lise é geralmente realizada em solução contendo fenol (por exemplo, TRIzolTM). Isso resulta na decomposição das células e na dissolução das membranas e permite a separação do RNA de outros componentes celulares. O RNA isolado é, em seguida, convertido em cDNA por transcriptase reversa (por exemplo, SuperscriptTM, GoscriptTM).

[0259] A sequência dos peptídeos candidatos transportados pelas células T ativadas (que se ligam aos complexos MHC apresentados na superfície da célula de apresentação do antígeno) é, em seguida, amplificada por PCR e pode ser sequenciada por qualquer método conhecido na técnica.

[0260] A sequência dos peptídeos candidatos pode ser determinada por PCR digital. A reação em cadeia da polimerase digital (PCR digital, DigitalPCR, dPCR ou dePCR) é um refinamento dos métodos de reação em cadeia da polimerase convencionais que podem ser usados para quantificar diretamente e amplificar clonalmente ácidos nucleicos incluindo DNA, cDNA ou RNA.

[0261] O sequenciamento também pode ser realizado usando microfluídicos. Microfluídicos envolvem dispositivos em escala micro que manipulam pequenos volumes de fluidos. Como os microfluídicos podem controlar e dispensar de forma precisa e reproduzível pequenos volumes de fluido, em particular, volumes menores que 1 μl, a aplicação de microfluídicos fornece economia de custo significativa. O uso da tecnologia microfluídica reduz os tempos de ciclo, encurta o tempo para resultados e aumenta o rendimento. Além disso, a incorporação da tecnologia microfluídica melhora a integração e automação do sistema. As reações microfluídicas são geralmente conduzidas em microgotículas.

[0262] O sequenciamento também pode ser realizado usando a tecnologia de sequenciamento de Segunda Geração (ou Próxima Geração ou Next-Gen), Terceira Geração (ou Next-Next-Gen) ou Quarta Geração (ou N3-Gen), incluindo, mas não limitado a pirossequenciamento, sequenciamento por ligação, sequenciamento de única molécula, sequência por síntese (SBS), clonal paralelo maciço, SBS de única molécula paralela maciça, única molécula paralela maciça em tempo real, tecnologia de nanoporos em tempo real de única molécula paralela maciça. Morozova e Marra fornecem uma revisão de algumas dessas tecnologias em Genomics, 92: 255 (2008).

[0263] Antes, após ou simultaneamente com o sequenciamento, os ácidos nucleicos podem ser amplificados. Exemplos não limitativos ilustrativos de técnicas de amplificação de ácido nucleico incluem, mas não são limitados à reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT- PCR), amplificação mediada por transcrição (TMA), reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação por deslocamento de filamento (SDA) e amplificação com base em sequência de ácido nucleico (NASBA). Aqueles versados na técnica reconhecerão que certas técnicas de amplificação (por exemplo, PCR) requerem que o RNA seja transcrito reversamente para DNA antes da amplificação (por exemplo, RT-PCR), enquanto outras técnicas de amplificação amplificam diretamente o RNA (por exemplo, TMA e NASBA).

[0264] O peptídeo identificado e enriquecido no método conforme descrito aqui pode ser usado em intervenções in vivo, tais como vacinação, indução de tolerância imunológica, bloqueio de TCRs e administração de toxina mediada por MHC para teste de imunogenicidade e outros testes de reatividade de células T in vitro.

[0265] Em uma modalidade, a vacina é uma vacina contra o câncer com base em antígeno específico de tumor (TSA).

[0266] O termo "vacinação" ou equivalentes são bem compreendidos na técnica. Por exemplo, o termo vacinação pode ser entendido como um processo que aumenta a reação imune de um indivíduo ao antígeno e, portanto, a capacidade de resistir ou superar uma doença.

[0267] Uma "vacina" deve ser entendida como significando uma composição para gerar imunidade para a profilaxia e/ou tratamento de doenças (por exemplo, câncer). Desta maneira, as vacinas são medicamentos que contêm antígenos e são destinadas a serem usadas em seres humanos ou animais para gerar defesa específica e substância protetora por vacinação. O termo "vacina contra o câncer com base em TSA" refere-se a uma vacina contendo uma amostra agrupada de antígenos específicos de tumor, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou mais peptídeos específicos de tumor.

[0268] Mutações derivadas de tumor recorrentes podem servir como antígenos específicos de tumor públicos, permitindo o desenvolvimento de vacinas contra o câncer com base em TSA aplicáveis a coortes de pacientes mais amplas. Desta maneira, o método da presente invenção pode ser usado para identificar pacientes que apresentam eficientemente estes TSAs comuns/públicos ao sistema imunológico e potencialmente levam a respostas imunológicas eficientes. No entanto, muitas mutações derivadas de tumor parecem derivar de alterações específicas do paciente. Assim, o método da presente invenção também pode ser utilizado para identificar peptídeos candidatos específicos do paciente para vacinas personalizadas.

[0269] Como aqui utilizado, "tolerância imunológica" refere-se a uma redução na reatividade imunológica de um hospedeiro em relação a um antígeno ou antígenos específicos. Os antígenos compreendem determinantes imunológicos que, na ausência de tolerância, causam uma resposta imunológica indesejada. A tolerância imunológica pode ser induzida para prevenir ou melhorar a rejeição do transplante, autoimunidade, reação alérgica ou outra resposta imunológica indesejável.

[0270] "Bloqueio de TCRs" refere-se a qualquer agente que inclui um complexo de peptídeo-MHC ou anticorpo específico de p-MHC que bloqueia as interações TCR-MHC naturais. "Administração de toxina mediada por MHC" refere-se a métodos que ligam covalentemente agentes tóxicos (proteínas ou outros) a tetrâmeros de peptídeo-MHC ou outros multímeros de MHC a fim de administrar a referida toxina na célula para causar a morte da célula.

[0271] O termo "teste de imunogenicidade", tal como aqui utilizado, refere-se à medição das respostas imunológicas potenciais a bioterapêuticos. Os bioterapêuticos podem desencadear uma resposta imunológica que pode impactar sua segurança e eficácia. O teste de imunogenicidade é empregado para monitorar e avaliar as respostas humorais (anticorpos) ou celulares (células T) durante os estudos clínicos e pré-clínicos. Normalmente, o teste de imunogenicidade de um bioterapêutico envolve a medição de anticorpos gerados especificamente contra o bioterapêutico. Com o método da presente invenção é possível identificar peptídeos que são apresentados de forma eficiente por moléculas de MHC e são reconhecidos por células T, de modo que podem potencialmente desencadear uma resposta imunológica. Isso pode ajudar a fornecer uma imagem mais completa do perfil imunogênico geral de um composto.

[0272] O termo "reatividade de células T", conforme aqui utilizado, refere-se à capacidade de uma substância de extrair a ativação de células T. Mais especificamente, "reatividade de células T" significa a capacidade de um peptídeo para induzir a proliferação ou produção de citocinas de células T.

[0273] Os métodos da presente invenção também podem ser aplicados à triagem de alto rendimento. A tecnologia de triagem de alto rendimento (HTS) é comumente usada para definir o processamento rápido de células em uma grande escala. Em certas modalidades, uma pluralidade de telas pode ser executada em paralelo com diferentes bibliotecas de peptídeos candidatos. Sistemas de triagem de alto rendimento estão disponíveis comercialmente e normalmente automatizam todos os procedimentos, incluindo toda a amostra e pipetagem de reagente, dispensação de líquido, incubações temporizadas e leituras finais da microplaca em detectores apropriados para o ensaio. Esses sistemas configuráveis fornecem alto rendimento e inicialização rápida, bem como, um alto grau de flexibilidade e personalização.

[0274] Pelo termo "peptídeo" conforme aqui utilizado, pretende-se significar, pelo menos, dois aminoácidos ligados covalentemente. Geralmente, os peptídeos ligados ao N-terminal do correceptor podem variar de 7 aminoácidos a 30 aminoácidos ou mais, particularmente de 15 a 24 aminoácidos de comprimento, particularmente de 7 a 10 aminoácidos de comprimento.

[0275] O termo "antígeno", tal como aqui utilizado, refere-se a todo, ou partes, de um peptídeo ou proteína, capaz de desencadear uma resposta imunológica contra si mesmo ou porções dos mesmos. Esta resposta imunológica pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas.

[0276] O termo "biblioteca" ou equivalentes, conforme aqui utilizado, significa uma pluralidade de moléculas. No caso de peptídeos a serem ligados à proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8, a biblioteca fornece uma população de peptídeos suficientemente estruturalmente diversa para efetuar uma faixa probabilisticamente suficiente de respostas celulares para fornecer uma ou mais células exibindo uma resposta desejada. Em uma modalidade preferida, pelo menos 7, de preferência, pelo menos 50, mais de preferência, pelo menos 200 e mais de preferência, pelo menos 1000 peptídeos são analisados simultaneamente no método da invenção. As bibliotecas podem ser projetadas para maximizar o tamanho e a diversidade da biblioteca.

[0277] O termo "recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos no todo. O ácido nucleico recombinante é originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação do ácido nucleico, por exemplo, usando polimerases e endonucleases, em uma forma normalmente não encontrada na natureza. Desta maneira, a ligação operacional de diferentes sequências é alcançada. Assim, um ácido nucleico isolado, em uma forma linear, ou um vetor de expressão formado in vitro pela ligação de moléculas de DNA que não estão normalmente unidas, são ambos considerados recombinantes para os fins desta invenção. Entende-se que uma vez que um ácido nucleico recombinante é feito e reintroduzido em uma célula hospedeira ou organismo, ele se replicará de forma não recombinante, isto é, usando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira em vez de manipulações in vitro; no entanto, tais ácidos nucleicos, uma vez produzidos de forma recombinante, embora subsequentemente replicados de forma não recombinante, ainda são considerados recombinantes para os fins da invenção. Da mesma forma, uma proteína recombinante, tal como o complexo MHC-peptídeo da invenção, é uma proteína feita usando técnicas recombinantes, isto é, através da expressão de um ácido nucleico recombinante como descrito acima.

[0278] O termo "heterólogo", quando usado com referência a porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são normalmente encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, tendo duas ou mais sequências, por exemplo, de genes não relacionados dispostos para fazer um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Da mesma forma, uma proteína heteróloga frequentemente refere-se a duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[0279] O termo "câncer", conforme aqui utilizado, é definido como doença caracterizada pelo crescimento rápido e descontrolado de células aberrantes. As células cancerosas podem se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres incluem, mas não são limitados a câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pele, câncer de pâncreas, câncer colorretal, câncer renal, câncer de fígado, câncer cerebral, linfoma, leucemia, câncer de pulmão e similares.

[0280] Além disso, nas reivindicações, a palavra "compreendendo" não exclui outros elementos ou etapas, e os artigos indefinidos "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0281] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

[0282] As modalidades específicas da presente invenção são adicionalmente ilustradas pelos seguintes exemplos. No entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada aos detalhes específicos desses exemplos. Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas usadas na presente invenção para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para a sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem apreciar, à luz da presente invenção, que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado parecido ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

[0283] A figura fornecida abaixo ilustra a estrutura dos receptores quiméricos e fornece uma prova de conceito em camundongos. O método de acordo com a invenção e como aqui descrito identifica epítopos naturais de células T de uma maneira imparcial e eficiente. É uma promessa para pesquisas básicas e aplicações clínicas, permitindo a identificação personalizada multidimensional e de alto rendimento de antígenos de células T em pacientes.

[0284] Figura 1: Prova de conceito para PEP4. a) São mostrados: a estrutura do receptor PEP4 quimérico e um esquema de sua interação com o MHC, levando ao reconhecimento do complexo peptídeo-MHC pelo TCR. b) Hibridomas de células T CD4-negativas, transportando um repórter fluorescente nur77, foram derivados de células T Smarta2 (específicas para gp61) ou células T 2D2 (específicas para NFM) e transduzidos com um constructo que codifica GFP e PEP4 transportando peptídeo gp61 (PEP4gp61iresGFP). PEP4gp61 foi eficientemente expresso na superfície celular conforme medido por coloração de anticorpo específico para CD4 mostrado no gráfico de pontos. c, d) O hibridoma Smarta2 foi transduzido com gp61 ligado a CD4 ou CD3 com um ligante GS variando de 12 a 28 aminoácidos e cultivado com BMDCs de C57BL/6 (c, d) ou BALB/c (d). e) Os hibridomas Smarta2 e 2D2 foram transduzidos com constructos que codificam receptores PEP4 transportando gp61, peptídeos OVA ou NFM e GFP e cultivados com BMDCs de C57BL/6. c, d, e) Ativação (sinal repórter nur77) foi medida por FACS. Os peptídeos foram reconhecidos de uma forma específica e restrita ao MHC e apenas aqueles ligados ao CD4, mas não ao CD3, puderam ser apresentados de forma eficiente pelo MHC. f) Células T CD4+ Smarta2 ou B6 foram estimuladas com anti-CD3/CD28 durante 24h, transduzidas com PEP4gp61iresGFP, tomadas de anti-CD3/CD28 e 48h pós-infecção cocultivadas com BMDCs B6 durante vários dias. O gráfico mostra a fração de células positivas GFP (expressando PEP4gp61) normalizadas para a eficiência de transdução. O dia 2 de cocultura corresponde ao dia 4 após a transdução. As células T Smarta2, mas não as células T policlonais B6, transportando PEP4gp61 foram progressivamente enriquecidas em cultura, enquanto não foi o caso para células transduzidas com o peptídeo de controle invNFM.

[0285] Figura 2: Prova de conceito para células CD4-positivas. As células de hibridoma CD4+ Sm2 foram infectadas com pMY-CD4gp61iresGFP ou pMY- CD4OVAiresGFP. Dois dias depois, as células foram cocultivadas durante 9h com BMDCs B6 (n = 4 cavidades). Após coloração com anticorpos anti-TCR, anti-CD4 e anti-CD69, a ativação das células de hibridoma Sm2 foi medida através da expressão de CD69 determinada por análises de FACS. Os gráficos de pontos em A) mostram a expressão de TCR, CD4 e GFP em células transduzidas, histograma em B) expressão de CD69 em células TCR+ CD4+ GFP+ transportando células PEP4-gp61 ou PEP4- OVA ou TCR+ CD4+ GFP- da transdução gp61, C) mostra o resumo da expressão de CD69 (MFI). Os resultados do teste T são indicados, ** = 0,0019. **** < 0,0001.

Exemplo 1 Materiais e Métodos Células

[0286] As células T CD4+ foram isoladas de camundongos C57BL/6J, Smarta e 2D2 por FACS. Citometria de fluxo

[0287] Foram utilizados os seguintes anticorpos: bloco Fc (anti-CD16/CD32;

2.4G2; caseiro); CD4-APC (GK1.5), CD4-PE (GK1.5). As células foram analisadas em FACSCanto II ou LSRFortessa (BD Bioscience) e os dados foram analisados no software FlowJo (Tree Star). Geração de hibridoma

[0288] As células T selecionadas foram ativadas com anticorpos anti-CD3ε e anti-CD28 ligados a plástico na presença de camundongo IL-2 durante 2-3 dias. Números iguais de células T ativadas e o parceiro de fusão TCRα-β- BW5147 foram fundidos usando PEG-1500 e plaqueados na diluição limite na presença de 100 mM de hipoxantina, 400 nM de aminopterin e 16 mM de timidina (HAT). Clonagem dos constructos PEP4 e PEP3

[0289] Fragmentos de DNA que codificam os peptídeos gp61 ou NFM foram inseridos entre o peptídeo líder e o ligante GS (variando de 12 a 28 aminoácidos) conectados ao resto das moléculas CD4 ou CD3 de comprimento total e clonados no vetor retroviral pMYsiresGFP. Transdução retroviral de linhagens celulares repórteres e timócitos classificados

[0290] Os sobrenadantes contendo retrovírus foram produzidos na linhagem celular de empacotamento ecotrópico Phoenix e usados para infectar linhagens celulares repórteres e células classificadas ativadas com anti-CD3/CD28 durante 24h. Para a transdução com nur77-repórter e constructos PEP4, as variantes de CD4- dos hibridomas foram selecionadas. Estimulação de hibridomas PEP4+ e PEP3+ com células dendríticas derivadas da medula óssea

[0291] As células GFP+ foram cocultivadas com um excesso > 3 vezes de células dendríticas derivadas da medula óssea durante 8-12h e a ativação do repórter foi medida sem FACS.

[0292] Os resultados são mostrados nas figuras. Ou seja, uma prova de conceito é mostrada com base em PEP4. Especificamente, uma estrutura do receptor PEP4 quimérico e um esquema de sua interação com o MHC, levando ao reconhecimento do complexo peptídeo-MHC pelo TCR, são mostrados na parte a). Como pode ser visto na parte b) da figura, os hibridomas de células T CD4-negativas, carregando um repórter fluorescente nur77, foram derivados de células T Smarta2 (específicas de gp61) ou células T 2D2 (específicas de NFM) e transduzidos com um constructo que codifica GFP e PEP4 carregando o peptídeo gp61 (PEP4gp61iresGFP). PEP4gp61 foi eficientemente expresso na superfície celular conforme medido por coloração de anticorpo específico para CD4 mostrada no gráfico de pontos. O hibridoma Smarta2 foi transduzido com gp61 ligado a CD4 ou CD3 com um ligante GS variando de 12 a 28 aminoácidos e cultivado com BMDCs de C57BL/6 (c, d) ou BALB/c (d). Os hibridomas Smarta2 e 2D2 foram transduzidos com constructos que codificam receptores PEP4 transportando gp61, peptídeos OVA ou NFM e GFP e cultivados com BMDCs de C57BL/6. c, d, e) Ativação (sinal repórter nur77) foi medida por FACS.

[0293] Como é evidente, os peptídeos foram reconhecidos de uma maneira específica e restrita ao MHC e apenas aqueles ligados ao CD4, mas não ao CD3, puderam ser eficientemente apresentados pelo MHC. Além disso, células T CD4+ Smarta2 ou B6 foram estimuladas com anti-CD3/CD28 durante 24h, transduzidas com PEP4gp61iresGFP, tomadas de anti-CD3/CD28 e 48h pós-infecção, cocultivadas com

BMDCs B6 durante vários dias (parte f). O gráfico mostra a fração de células GFP- positivas (expressando PEP4gp61) normalizadas para a eficiência de transdução.

O dia 2 de cocultura corresponde ao dia 4 após a transdução.

As células T Smarta2, mas não as células T policlonais B6, transportando PEP4gp61 foram progressivamente enriquecidas em cultura, enquanto não foi o caso para células transduzidas com o peptídeo de controle invNFM.

Desta maneira, foi surpreendentemente e inesperadamente demonstrado que uma molécula quimérica compreendendo o correceptor CD4, LAG3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor pode ser empregada para identificar antígenos específicos de células T, como reivindicada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula quimérica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína correceptora CD4, LAG3 ou CD8 e um peptídeo ligado ao N-terminal do correceptor.

2. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo ou uma parte do peptídeo pode ser apresentado por um complexo de histocompatibilidade principal.

3. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo tem um comprimento de 6 a 200 resíduos de aminoácido.

4. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo tem um comprimento de 7 a 30 resíduos de aminoácido.

5. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo é um peptídeo aleatório.

6. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo é um peptídeo que é codificado por uma determinada molécula de DNA ou cDNA.

7. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a molécula de DNA ou cDNA que codifica o peptídeo é obtida por fragmentação de uma molécula de DNA ou cDNA maior.

8. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo é derivado de uma célula tumoral ou de uma célula que foi infectada com um patógeno.

9. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo compreende um epítopo de um antígeno tumoral.

10. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno tumoral é um neoantígeno.

11. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácido com, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de identidade de sequência com um epítopo de um antígeno tumoral.

12. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo compreende um epítopo MHC de classe I quando a proteína correceptora é CD8.

13. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo compreende um epítopo MHC de classe II quando a proteína correceptora é CD4 ou LAG3.

14. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína correceptora CD4 é uma proteína correceptora CD4 humana, a proteína correceptora LAG3 é uma proteína correceptora LAG3 humana e a proteína correceptora CD8 é uma proteína correceptora CD8 humana.

15. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo está ligado ao N-terminal do correceptor através de um ligante.

16. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante tem um comprimento entre 5 e 30 aminoácidos.

17. Molécula quimérica, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácido no ligante são resíduos de glicina ou serina.

18. Molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante compreende a sequência de aminoácido (GGGGS)x, em que G é glicina, S é serina e x é o número de repetições, em que x pode ser qualquer número entre 1 e 5.

19. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de codificar a molécula quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20. Biblioteca de polinucleotídeos, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma pluralidade de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 19.

21. Biblioteca de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que, pelo menos, dois polinucleotídeos da biblioteca codificam uma proteína correceptora idêntica ligada a um peptídeo diferente.

22. Célula, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 19.

23. Método para identificar simultaneamente receptores de células T específicos de antígeno e os peptídeos especificamente reconhecidos pelos ditos receptores de células T (TCRs), o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam a biblioteca de polinucleotídeos da reivindicação 20 ou 21; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células que apresentam antígenos (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar o DNA das células T isoladas da etapa (c) para obter informação sobre as sequências TCR e as sequências de peptídeos ligadas aos correceptores CD4, LAG -3 ou CD8 presentes nestas células T; e

(e) identificar pares de receptor-peptídeo de células T cognatos com base nos dados de sequenciamento obtidos na etapa (d).

24. Método para identificar, pelo menos, um receptor de células T específico de antígeno, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T policlonais de interesse que expressam um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 19; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células que apresentam antígenos (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar os locais de TCR de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um receptor de células T codificado pelos locais de TCR da, pelo menos, uma célula T para ser específica do antígeno.

25. Método para identificar, pelo menos, um antígeno específico de células T, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer células T monoclonais de interesse que expressam um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 19 ou uma biblioteca de polinucleotídeos de acordo com a reivindicação 20 ou 21; (b) colocar em contato as células T da etapa (a) com células de apresentação do antígeno (APC) compreendendo um complexo de histocompatibilidade principal (MHC); (c) isolar, pelo menos, uma célula T que é ativada quando em contato com as APCs na etapa (b); (d) sequenciar a parte do polinucleotídeo que codifica o peptídeo ligado ao

N-terminal de uma proteína correceptora CD4, LAG-3 ou CD8 de, pelo menos, uma célula T isolada na etapa (c); e (e) identificar, pelo menos, um peptídeo codificado pelo polinucleotídeo compreendido em, pelo menos, uma célula T para ser um antígeno específico de célula T.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a APC é uma APC autóloga ou heteróloga.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a APC é uma célula autóloga ou heteróloga geneticamente modificada ou linhagem celular, que expressa uma molécula de MHC mutada.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe II compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a cadeia beta de MHC de classe II extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de MHC mutada é uma molécula de MHC de classe I compreendendo a cadeia alfa de MHC de classe I extracelular e um domínio de transmembrana nativo ou heterólogo, bem como, a microglobulina beta-2.

30. Método, de acordo com as reivindicações 23 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo ou a biblioteca de polinucleotídeos é CD8 se a molécula de MHC compreendida na APC for uma molécula de MHC de classe I.

31. Método, de acordo com as reivindicações 23 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína correceptora codificada pelo polinucleotídeo é CD4 ou LAG-3 se a molécula de MHC expressa pela APC for uma molécula de MHC de classe

II.

32. Método para tratar um indivíduo que sofre de câncer, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) identificar, pelo menos, um receptor de células T específico de antígeno e/ou, pelo menos, um antígeno específico de célula T com os métodos de acordo com as reivindicações 23 a 31; (b) administrar ao indivíduo que sofre de câncer o, pelo menos, um receptor de célula T e/ou antígeno específico de célula T identificado na etapa (a).

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor de células T específico de antígeno é administrado ao indivíduo por administração de genes mediada por vírus.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno específico de célula T é administrado ao indivíduo na forma de um peptídeo ou na forma de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo ou o polinucleotídeo que codifica o peptídeo é ligado a um composto que melhora a administração do peptídeo ou polinucleotídeo que codifica o peptídeo a uma APC.