JP2010533178A - カチオン性リポソーム媒介核酸送達を用いて免疫応答を引き起こす方法 - Google Patents
カチオン性リポソーム媒介核酸送達を用いて免疫応答を引き起こす方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、薬物送達、具体的には、カチオン性リポソームに基づくワクチンの分野におけるものである。態様において、本発明は、ウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する、または、ウイルス性疾患を治療または予防する、分子の送達に有用なリガンド-標的化 (例えば、抗体-または抗体フラグメント-標的化) リポソームを製造する方法を提供する。送達システムの特異性はターゲティングリガンドに由来する。
ワクチンは、高度に伝染性の感染性病原体に対する強力な武器であり、前世紀において感染性疾患の負荷を顕著に低減するのに役立った。しかし、感染性疾患によりもたらされる世界的な健康に対する脅威は低減しておらず、むしろ国家的および全世界的重要事項となっている。結核およびマラリアなどのウイルス性病原体の衝撃は、例えば、世界的規模で感じられ続けており、新たに現れた病原体、例えば、 HIV/AIDS、SARS-コロナウイルスおよび最近出現している感染爆発のインフルエンザ、即ち「鳥インフルエンザ」ウイルスは公衆衛生に対する新たな挑戦である。
一つの態様において、本発明は、リガンド-標的化 (ligand-targeted)(例えば、タンパク質/ペプチド-標的化、抗体-または抗体フラグメント-標的化) カチオン性リポソームを調製する方法を提供する。好適な態様において、かかる方法は、リガンド (例えば、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体、または抗体フラグメント)を調製する工程およびリガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程を含む。好適には、リガンドはカチオン性リポソームと直接的に結合(associate)/複合体化しているが、カチオン性リポソームに化学的に結合してはいない。別の態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。次いで、リガンド-標的化カチオン性リポソームを1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、および/または 1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子と混合して、リガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる。好適な態様において、抗体フラグメント、例えば、Fab フラグメント、または一本鎖 Fv フラグメント、例えば、抗-トランスフェリン 受容体 一本鎖 Fv (TfRscFv)が用いられる。さらなる態様において、方法はさらに、リガンド-標的化カチオン性リポソームとK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドとを混合する工程を含んでいてもよい。
特許または出願のファイルはカラーでなされた少なくとも1つの図を含む。カラー図を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより庁によって提供される。
一つの態様において、本発明の態様によるリガンド-標的化 (例えば、タンパク質/ペプチド、抗体または抗体フラグメント- 標的化) カチオン性リポソームまたはカチオン性ポリマー 複合体は、好適には、所望の複合体の成分が所定の比および所定の順序にて混合される簡便かつ効率的な非化学的結合方法によって作られる。さらなる態様において、リガンド-標的化カチオン性リポソームまたはカチオン性ポリマー複合体は、リガンドがカチオン性リポソームの表面に化学結合を介して化学的に結合する化学的結合方法によって作られうる。
一つの態様において、本発明は、哺乳類 (本明細書において用いる場合、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラット、マウス、チンパンジー、サル、類人猿などならびにヒト)におけるウイルス複製一次部位、例えばC型肝炎 ウイルス (HCV)による場合は肝臓、具体的には抗原提示細胞 (APC)にて、カチオン性リポソーム複合体を用いてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。一例として、HCVにおいて、T 細胞 応答が感染の際にウイルス複製部位 (肝臓)にてより迅速かつより有効であることが判明した。本発明はそれゆえ、HCVから回復した哺乳類において起こるT 細胞 プライミングを模倣する方法を提供し、かかる方法は、組換え プラスミド DNAを送達するカチオン性リポソーム、およびウイルスベクターを用いる(viral-vectored) 免疫を介してインビボで肝臓 (例えば、 クッパー 細胞、肝臓類洞上皮細胞、樹状細胞および肝細胞)に位置する細胞を標的化する免疫応答(例えば、予防 ワクチン)を誘発することによる。本発明はまた、慢性 (および急性) 病原体感染の予防および治療のための免疫治療薬として使用するためのワクチンを提供する。様々な リガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を体の正常細胞 (即ち、腫瘍ではない細胞)に送達する能力は予期せぬ驚くべき結果である。本発明の例示的な方法は哺乳類(例えば、ヒト)の治療に用いられているが、本発明の方法、リポソーム 製剤および組成物は、鳥類、魚類などを含むその他の動物の治療にも利用可能であることを理解すべきである。
サイトカインは、活性化刺激に応答して体内の細胞によって放出される小さいタンパク質(~25kDa)である。それらは自然および獲得免疫応答を調節する特定の受容体に結合することによって自己分泌および傍分泌の様式で応答を誘発する。それらは精製タンパク質 (Berzofsky J.A.、et al.、Immunological Reviews、170:151-172 (1999))または所望のサイトカイン産物を発現するDNA プラスミド(Toka F.N.、et al.、Immunological Reviews、199:100-112 (2004))のいずれかの共投与を介してワクチンの活性を向上させるために広く用いられている。これらアジュバントの遺伝子送達に関するほとんどの研究は投与の筋肉内または皮内 経路に焦点をあてたものであり、静脈内送達は徹底的には評価されていない (Toka参照)。CD4 細胞はそれらのサイトカイン 遺伝子転写および分泌に基づいて2つの主要なタイプに分けられる。Th1 細胞はそのIL-2 およびガンマインターフェロン (IFN-γ)の分泌によって特徴づけられるが、Th2 細胞はIL-4、IL-5、およびIL-10を産生する。アジュバントはTh1 またはTh2 方向のいずれかに向けられたT-細胞 応答を誘発し得、それはワクチンの結果に顕著な影響を有しうる。免疫を向上させ、有効な Th1-型応答を刺激するために、IL-2、IL-12またはIL-15を発現する核酸、例えば、プラスミドが好適には記載されるカチオン性リポソームに結合(associated)/カプセル封入される。
カチオン性リポソームに基づく C型肝炎 ウイルス (HCV) ワクチン接種および治療システムの調製および使用
HCV 再感染からの保護は、チンパンジーにおいて自然の感染によっては誘発されないという以前の教義(Farci P.、et al.、Science 258: 140 (1992); Prince A.M.、et al.、J. Infect. Dis.、165: 438-443 (1992))に反して、回復したヒトおよびチンパンジーにおいては、再感染は起こるもののメモリー免疫応答が存在し、それが再感染の際にウイルス複製の即時の制御および迅速なクリアランスを導くということがこのたび明らかとなった。HCVからの自然な回復の後、休止した HCV-特異的メモリー T 細胞が数十年間にわたり末梢血において検出することが出来、多くの場合、検出可能な HCV-抗体の非存在下で検出できる(Takaki A.、et al.、Nat. Med.、6:578-582 (2000))。HCV-特異的細胞免疫応答は、回復したチンパンジーにおいて実証されるように肝臓においても存続し、再感染の際の防御免疫を媒介する(例えば、Bassett S.E.、et al.、Hepatology、33:479-1487 (2001) を参照)。二次感染の持続時間は短く、初期感染と比較して血液および肝臓におけるウイルスタイターは低下しており、アラニン アミノトランスフェラーゼ レベル(ALT)によって示されるように肝臓の炎症も低下している(Bassset et al.)。ヒトにおいても以前の曝露の後に類似のメモリー応答が存在し、HCV 感染を迅速に制御し、排除することができるということが患者の研究から示されている(Mehta S.H.、et al.、Lancet、359:1478-1483 (2002))。明細書中に記載されるように、本発明は、APC、例えば限定されないが肝臓におけるAPCに効率的に送達される、HCV の非構造タンパク質に注目した、予防と治療の両方のためのT細胞に基づく ワクチンを提供する。肝臓はHCV 複製の一次部位であり、したがって、肝臓における免疫応答の誘発は、自然の感染の際に誘発される免疫応答を模倣し、攻撃の際に保護またはウイルスの迅速なクリアランスを導く。
1. 複合体形成
化学的結合による複合体形成
リポソーム表面に直接的に化学的に結合した抗体または抗体フラグメントを含むカチオン性免疫リポソームを調製するための例示的な 方法は、2001年10月1日出願の、その開示内容全体を引用により本明細書に含める米国特許出願番号09/914,046に開示されている。例えば、4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート-DOPE (MPB-DOPE) (Avanti Polar Lipids) は総脂質の5-8%モルにて上記に記載の7つのリポソーム製剤に含まれる。MPB-リポソームは当該技術分野において周知の方法によって調製される。例えば、Campbell MJ (Biotechniques 1995 Jun;18(6):1027-32)に記載のものから改変されたエタノール 注射 方法を本発明において用いることが出来る。簡単に説明すると、すべての脂質をエタノールに可溶化し、混合し、50-60℃のボルテックスしている 純水にハミルトンシリンジにて注入する。溶液をさらに10-15 分間ボルテックスする。終濃度は1-2mM 総脂質である。1M HEPES、pH7.5 (pH7.0-8.0)を終濃度10-20mMにて添加する。マレイミド基はpH >7の水溶液中では不安定であるので、リポソームは 水 (pH 5-6.5)中で調製すべきである。pH はscFv-SHとの結合の前に1M HEPES 緩衝剤、pH7.0-8.0を用いて7.0-8.0に調整するとよく、それによりポストコーティング 反応が促進される。
結合した TfRscFv-免疫リポソームはその免疫学的活性を保持している。cys-TfRscFv はリポプレックスに化学的に結合することができ(2001年10月1日出願の米国特許出願番号09/914,046参照)、ヒト 前立腺 腫瘍細胞をインビトロおよびインビボで効率的にトランスフェクトしうることが確立されている。様々な 化学的結合 方法を用いてリポソームに結合させるのは一本鎖 抗体フラグメントについての慣行である。cys-TfRscFvとカチオン性リポソーム (還元性基、例えば、 マレイミド DOPEまたはいずれかの還元性基を有する脂質を含まない)との、化学的結合ではなく単純な混合の結果、免疫学的に活性な複合体が形成されることも判定され、ここでリガンドはリンカーまたは化学的結合分子を使用せずにリポソームに直接的に結合しており、また、依然として腫瘍細胞に効率的に結合しトランスフェクトすることが判定された (例えば、そこに開示される組成および方法を含めてその開示内容を引用により本明細書に含める米国公開特許出願番号2003/0044407を参照)。
標的HCV抗原
ワクチン 研究に含めるHCV 抗原は NS3からNS5Bである。これらの配列は遺伝子型 1a H77 株に由来する。その開示内容全体を引用により本明細書に含めるMajor M.E., et al., Hepatitis C Viruses. In: Fields Virology, Knipe D.M. and Howley P.M. (eds.), Lippincott, Williams & Wilkins, pp. 1127-1161 (2001)参照。回復した動物におけるこの抗原のみに対するT-細胞 応答の増強の結果は、一過性の臨床的に有意でない感染である(以下を参照)。CMV プロモーターの制御下で抗原を発現するプラスミドについて、293-Tおよび Huh7.5 細胞を用いた。アデノウイルス ベクターについては、AD-293 細胞株を用いた。発現は特異的抗体を用いた蛍光免疫染色およびウェスタンブロッティングにより判定した。
ADEASY(登録商標) システムを用いてHCV遺伝子を発現するヒト アデノウイルス 血清型 5 組換え体が本発明に好適に用いられる(Stratagene、CA)。このベクターは E1およびE3 遺伝子の欠失により複製欠損とされたものである。目的遺伝子を大腸菌における組換えを介してアデノウイルス バックボーンに導入する。組換え プラスミドを次いでAD-293 細胞に形質転換し、ここで欠失したウイルスアセンブリー遺伝子が補完されてウイルス 粒子が作られる。アデノウイルスもまた、HCV 治療のための魅力的なウイルス ベクターである。というのはこのウイルスは肝臓において導入遺伝子を効率的に発現させることができたからである。
インターロイキン-12 (IL-12) はIFN-γ産生を誘発し、Th2 細胞よりもTh1細胞への分化を支持し、自然耐性と獲得免疫とを連結させる。DCおよび貪食細胞が感染の際に病原体に応答してIL-12を産生する。免疫を増強し、効率的な Th1-型応答を刺激するために、IL-12を発現する プラスミドをカチオン性免疫リポソーム 製剤に含める。マウスおよび ヒト IL-12の両方を発現するプラスミドを、マウスおよび霊長類研究の間の一貫性を達成するために調製した。
研究は、HCV 抗原を発現する組換え ベクターを用いるDNAプライム(prime)/アデノウイルス 追加免疫を含む。マウスに 0および4 週目に本明細書に開示するリポソーム複合体中の20-30 μg のDNAを接種し、組換え アデノウイルス (108 感染単位、皮下(s.c.))によって、10-12 週目に追加免疫する。この追加免疫の4週間後に、肝臓および脾臓をフローサイトメトリーにより分析して肝臓におけるT 細胞の特徴を決定する。T 細胞は肝細胞からフィコールグラジエントを用いて分離でき、標識化抗体を用いて特定の表面 マーカーについて染色する。対照として、PBS 処理マウス、非リガンド化(unliganded)リポソーム/DNA 複合体、空ベクターを担持する複合体、筋肉内 (i.m.) (1- 50 μg/マウス)、腹腔内(i.p.)、静脈内(i.v.)、および皮内 (i.d.) (1-50 μg/マウス) 注入された裸 DNA、およびi.m.またはi.d.にて複合体を接種されたマウスを含める。用量および時期を最適化し、6 ヶ月の期間にわたる肝臓におけるT 細胞の持続および復活を評価して 肝臓内 T 細胞数およびマーカーに基づき最良のシステムを判定する。トランスフェリン 受容体は樹状細胞上に発現し、複合体化した DNAは受容体-媒介エンドサイトーシスによって取り込まれるので、scL-HCVまたは scLHK-HCV 複合体のi.m. および/または i.d. 接種の結果は裸 プラスミド DNAよりも良好な全身的応答となると期待される。T 細胞集団は CD45RA、CD62L、CD27 およびCCR7の発現に基づいて同定されうる。IL-7Rαは短命なエフェクター 細胞と機能的なメモリー 細胞へと発達する細胞とを識別することが出来る有用なマーカーを提供する。これらマーカーを一次マウス研究において用いて長期免疫を確立する候補ワクチンの能力を分析する。チンパンジーにおけるHCV の排除の後に肝臓におけるメモリー CD8+ T 細胞の、排除の後6 ヶ月 の血液と比較して肝臓において~10-倍高いレベルの選択的保持の証拠がある。
1.インビトロでのヒト 肝細胞癌 (Hep3B) 細胞へのリポソーム複合体のターゲティング
Hep3B HCC 細胞(5 x 104)を24 ウェルディッシュに播き、哺乳類プロモーターの制御下でルシフェラーゼ 遺伝子を発現する上記のようなDNA プラスミド(0.05ug/ウェル) と複合体化したリポソームによりトランスフェクトした。scL-HCVについて用いた比は、0.33ug:10ug(14nmol):1ug (TfRscFv:LipA:DNA)であり、scLHK-HCVについては0.33ug:7nmol:1ug (TfRscFv:LipA-HoKC:DNA)であった。トランスフェクションの24時間後、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ アッセイ システム (Promega、Madison、WI)を用いて判定した。結果を図1に平均+ SD (n=3)として示す。効率的な トランスフェクションが抗-トランスフェリン 受容体 一本鎖 抗体フラグメント (sc)と複合体化したリポソームを用いた場合に得られ、sc/LipAおよびsc/LipA-HoKC 複合体についてそれぞれルシフェラーゼ 値は257,815 RLUおよび1,120,643 RLU であった(図1)。 これを非修飾リピドA (LipA) と複合体化したルシフェラーゼ プラスミドについてのルシフェラーゼ 値が 538.9 RLU/μg タンパク質であることと比較されたい。HoKC ペプチドをリポソーム複合体に組み込んだ場合のこの肝細胞株へのDNAのトランスフェクション 効率の上昇は、前立腺および膵臓細胞株を用いた以前の観察と一致する。
正常肝細胞は肝細胞癌細胞と同じレベルの受容体を有さず、それゆえ、TfRscFv (sc)、ガラクトース (GAL)およびL-37pA リガンドと結合した一連の脂質複合体を初代チンパンジー 肝細胞において比較した。5万の初代チンパンジー 肝細胞を24 ウェル プレートに播き、ルシフェラーゼレポーター遺伝子 (0.1μg DNA プラスミド/ウェル)を担持し、HoKC ペプチドを有するかまたは有さない複合体によりトランスフェクトした。sc/Lip-HoKC/DNA (レーン 1-3)およびsc/Lip/DNA (レーン 7-9) 複合体は上記に開示の単純な混合方法により調製した。即ち、TfRscFvを0.33ug sc:7nm Lip-HoKC および0.33ug sc:14nmol Lipの比にて適当なリポソーム (HoKCを有するかまたは有さない)と混合し、混合は、手による10回の穏やかな反転または20-30 PRMでの15-60 秒の回転により行い、室温で10-15 分間維持した。DNAを次いでsc/Lip-HoKCまたはsc/Lip 混合物 (1ug DNA:7nmol (Lip-HoKCについて) および1ug DNA:14nmol (Lipについて) の比)に添加し、溶液を手による10回の穏やかな反転または20-30 PRMでの15-60 秒の回転により混合し、室温で10-15 分間維持した。 非リガンド化(unliganded) 複合体も対照として同じ比にて調製し(レーン 4-6および10-12)、同じ手順にしたがった。L-37pA リガンド (レーン 19-21)を用いる複合体は、Lip-マレイミドを6.7% モル比にて含むリポソーム (A、D、またはG)にL-37pA リガンドを化学的に結合させることによって形成させた。Lip-Malを14:7 (nmol:nmol) (Lip:L-37pA) の比にてL-37pA と混合し、1.5mM HEPES 緩衝剤 (終濃度)を添加し、20-30RPMで3 時間 室温で回転させた。その後、DNAを1ug DNA:14nmol Lipの比にて添加し、上記のように混合し、室温で15 分間保持した。比較のために、異なる方法もGAL リガンドとの複合体の形成に用いた (レーン 13-18)。ここでは、DNAをなんらかの必要な水に添加し、上記のように混合する。リポソームA、D、またはG (HoKCを含むかまたは含まない)をなんらかの必要な水に添加し、上記のように混合する。2つの溶液を室温で15 分間保持し、次いで一緒に添加し、上記のように混合し、室温で15 分間保持し、カチオン性リポソーム/DNA コアを形成する。GAL リガンドは、以前にアニオン性 (ホスファチジルセリン:コレステロール) リポソームとモル比1:1:0.05 (PS:chol:GAL)にて結合していた。このPScholGAL 混合物を次いであらかじめ形成された カチオン性リポソーム/DNA 複合体に添加し、溶液を上記のように混合し、室温で15 分間保持し、カチオン性リポソーム/DNA コアをカプセル封入する。これら複合体についての成分の比は以下の通り: 7nmol:7nmol:1ug (PScholGAL:Lip-HoKC:DNA)および7nmol:14nmol:1ug (PScholGAL:Lip:DNA)。トランスフェクションの48時間後、ルシフェラーゼ活性を上記のようにルシフェラーゼ アッセイ システムを用いて判定した。図2は、初代チンパンジー 肝細胞におけるタンパク質1μgあたりのルシフェラーゼ RLUによって判定したトランスフェクション効率を示す。3つのすべての方法によって3つのすべてのリガンドを用いて形成された複合体は、これら初代チンパンジー 肝臓細胞をトランスフェクトすることができた。初代チンパンジー 肝細胞を用いることにより、使用した脂質にかかわりなく、scと複合体化したリポソームは、様々な方法を用いてGAL (15,509 RLU) またはL-37pA (19,662 RLU) と複合体化した最良のリポソームと比較してほぼ10-倍高いトランスフェクション効率 (~150,000 RLU) を与えた。期待されたように、正常 肝細胞上にはTf 受容体の数がより少ないと推測されるために、sc/リポソームの全体のトランスフェクション効率は同じ複合体を Hep3B 細胞において用いた場合と比較して16-倍まで低かった。しかし、HoKC ペプチドを含めると、TfRscFvを用いるトランスフェクションの効率が10-倍上昇した。 Hep3B 細胞を用いて以前に観察されたように、GALおよびL-27pA リガンドを用いる最良のトランスフェクション効率はHoKC ペプチドを GAL リガンドとともに含めた場合に観察された。したがって、これらの研究は、scLHK-DNA 複合体はDNAを正常 肝臓細胞内に送達することにおいて高度に効率的であったこと、およびその他のリガンドも正常 肝臓 肝細胞をトランスフェクトするための複合体において用いることが出来ることを示す。
インビトロ実験に続いて、非腫瘍担持 BALB/cマウスおよび特定のリポソーム複合体を用いてインビボで試験を行った。6から9週齢の動物に尾静脈を介して、400μlの上記に示す比にて上記のように調製したリポソーム複合体中の20-25μgのEGFPを発現するDNA プラスミドを、2-3回 24時間の期間にわたってi.v. 接種した。最後の接種の24-48 時間後、肝臓、脾臓、腎臓、肺および心臓からの組織切片を液体窒素で瞬間凍結し、-70℃で保存した。さらに、肝臓組織切片を組織学的 分析のためにホルマリンで固定した。ウェスタンブロット 分析のために、肝臓組織をプロテアーゼ インヒビターカクテル (Sigma)を含むT-PER 組織抽出試薬 (Pierce、Rockford、IL)を用いて抽出し、上清を細胞片を除くために遠心分離した後回収した。タンパク質濃度をBCA タンパク質 アッセイ 試薬キット (Pierce、Rockford、IL) を用いて評価し、40 μg の総タンパク質を、モノクローナル 抗-GFP 抗体 (BAbCo) およびECL ウェスタンブロットキット(Yu W., et al., Nucleic Acids Research, 32:e48 (2004))を用いて分析した。同じ膜を、ウェルあたり等量のタンパク質のローディングを確認するために抗-GAPDH 抗体で処理した。図3は、非処理マウス (UT)と比較した、リピドA (scLA)、リピドA およびHoKC (scLAHK)、リピドDおよびHoKC (scLDHK)、リピドG およびHoKC (scLGHK) と結合したTfRscFv リガンド (sc)、リピドAと結合したガラクトース (GalLA)およびリピドA と結合したL-37pA (L-37pALA)を接種した二連のマウス からの肝臓 抽出物のウェスタンブロットを示す。左側のレーンは、GFP およびGAPDHの両方についての陽性対照 (PC)を示す。すべてのリポソーム複合体は、接種されたマウスの肝臓においてGFPの発現をもたらした。リピドAを用いた場合HoKC ペプチドを含めることにより、マウスの肝臓へのDNAの送達が向上した(scLAとscLAHKとを比較されたい)。最高の発現レベルはscLGHK リポソーム複合体について観察されたが、これは2匹のマウスのうち1匹のみにおけるものであり、 scLAHK 複合体が、複数の(replicate)動物においてGFP タンパク質のより一貫して強力な発現をもたらすようであった。GalLAおよびL-37pALA 改変リポソームもGFPの発現をもたらしたが、より低いレベルであった。
当業者に周知の標準的クローニング方法を用いて、高発現プロモーター (pAG410) の制御下でHCVのNS3 からNS5B タンパク質を発現するDNA ベクターを構築した。これらHCV-特異的タンパク質を発現させるために用いたバックボーン ベクターは既に臨床用途についてFDAによって承認されており、現在、癌-特異的製剤を用いる患者におけるフェーズI 臨床試験にある。発現をインビトロで293T およびHuh7.5 (肝細胞) 細胞を用いて試験し、ウェスタンブロット (図4)と免疫蛍光法 (データ示さず) 分析との両方によってHCV 抗原を特異的に発現することが示された。6 ウェルディッシュ中の細胞を製造業者のプロトコールを用いてLipofectin (Invitrogen, CA)を用いてトランスフェクトした。48 時間後、細胞を特異的遺伝子発現について分析した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を、プロテアーゼ インヒビターカクテル (Sigma)を含む250 μlの M-PER 試薬 (Pierce、Rockford、IL)を用いて溶解した。80μgの総タンパク質を8-20% SDS-PAGE グラジエントゲル(Invitrogen)を用いるウェスタンブロットによって分析した。タンパク質をPVDF 膜にトランスファーし、1:500に希釈したNS5Bに対するモノクローナル抗体、または1:500に希釈した慢性 チンパンジー血清によってプローブした。タンパク質を、抗-ヒトまたは 抗-マウス IgG HRPO 結合体および化学発光 (West Pico system, Pierce, Rockford, IL)を用いて可視化した。図4は、pAGVec (空ベクター)によりトランスフェクトされた細胞と比較した、NS3、NS4B、NS5A および NS5Bについて観察された特異的バンドを示す。これら同じ抗原のそれぞれを個別に発現するアデノウイルス 組換え体も標準的 クローニング 方法を用いて構築した。これらウイルス ベクターのそれぞれからの発現もウェスタンブロット 分析によって確認した(データ示さず)。
ILが効率的な アジュバント 分子として作用するためには、それらは Th-1 T 細胞応答を効率的に刺激するために十分に高いレベルにて発現されなければならない。それらを高発現プロモーターの制御下に配置することは、これを達成する一つの手段である。このアプローチにより可能なILの発現の高いレベルを示すために、ヒト IL-2を高発現プロモーターの制御下にてpSCMV ベクターにクローニングした(その開示内容を引用により本明細書に含める、米国特許出願公開番号2007/0065432を参照)。インビボでの発現レベルを試験し、標準的 CMV プロモーターからのレベルと比較した。両方の場合において、プラスミドは、本明細書において記載されるように調製されたHoKC ペプチドを有さない標的化 リポソーム ナノ複合体によって送達された。PANC-1 ヒト 膵臓癌異種移植片腫瘍を、PANC-1 腫瘍 組織の皮下 接種により4-6 週齡雌性胸腺欠損 ヌードマウスにおいて誘発した。およそ3 週間後、腫瘍は平均して 400-700 mm3となり、動物に6日間にわたって比 (0.33ug:10ug:1ug (TfRscFv:Lip:DNA))を用いて上記のように単純な混合によって調製された、標準的 CMV プロモーターまたは高発現プロモーター (40 ug DNA/注射) のいずれかの制御下でIL-2についての遺伝子を担持するナノ免疫リポソーム複合体によるi.v. (尾静脈) 注射を6回与えた。マウスを最後の注射の24時間後に屠殺した。腫瘍および肺組織を採取し、液体窒素で瞬間凍結し、 hIL-2に対する市販の ポリクローナル抗体およびECL 検出を用いる標準的技術によるウェスタンブロット 分析によってhIL-2 タンパク質発現レベルについて分析した。図5に示すように、psCMV-hIL-2 プラスミドを担持する複合体を与えられた動物からの腫瘍はすべて、腫瘍における高レベルの発現を示した。一方、hIL-2遺伝子が標準的 CMV プロモーターの制御下にある腫瘍においてはhIL-2 発現は明らかではなかった。
scL-pAG410 複合体の全身的 投与の後の様々な 非腫瘍担持 マウス 組織におけるNS3からNS5Bをコードする遺伝子の存在を評価するための実験を行った。BALB/cマウス (3匹/群) に、scL (一本鎖 トランスフェリン 抗体-標的化カチオン性リポソーム)と複合体化したプラスミド pAG410 DNAまたは遊離 プラスミド DNA (25 ug/マウス/注射) としてのプラスミドpAG410 DNAのいずれかを、2回 (8時間間隔をあけて) i.v. 注入した。複合体は上記のように比 (0.33ug:10ug:1ug (TfRscFv:Lip:DNA))にて単純な混合によって調製した。一群のマウスには、同じ手法および同じ比にて調製した空の pSCMV ベクターを担持するscL を与えた。注射の48 時間後、動物を屠殺した。肝臓、肺、脾臓、および胸腺を収集し、液体N2で瞬間凍結した。サンプルの一部はPCRのためにDNeasy Extraction Kit (Qiagen)を用いてDNAを単離するために用いた。DNA PCR (1 ug DNA) を、NS3、NS5A および NS5B を増幅するプライマーを用い、Taq Gold ポリメラーゼを用いて別々の反応において行った。PCR 条件は以下の通りとした: 50ulの総体積中、6ng DNA、2 mM MgCl2; 0.2 mM 各 dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP; 300 nM 各プライマー; および 1.25 ユニットの AmpliTaq。増幅は反応混合物を94℃で10 分間、次いで 40サイクルの、94℃15 秒間および60℃ 30秒間、次いで60℃で7 分間インキュベートすることにより行った。図6は、肝臓におけるNS3遺伝子についてのPCRデータを示すが、シグナルの相違はNS5A およびNS5Bについて類似であった。複合体となった 、および、遊離pAG410を与えられたマウスの間ですべての臓器においてコピーレベルに有意差がある。肝臓 (図6)と同様に、肺、脾臓および胸腺において、scL-pAG410は強いPCRバンドを有し、一方、遊離 DNAによってはシグナルは検出されなかった。予測されたように、ベクター-処理マウスからはシグナルはなかった。したがって、複合体となったHCV プラスミド DNAのi.v. 送達の結果、肝臓およびその他の臓器において細胞による効率的な 取り込みが起こった。これらの結果は、正常肝臓およびその他の正常細胞に対するHCV 抗原の全身的送達のためのこのアプローチの可能性を確認し、かつ支持する。
マウスはHCVに感染しえない。しかし、誘発される T 細胞応答の効力を評価するため、HCVのNS3 タンパク質を発現する組換え ワクシニア ウイルス (rVV)を代替 ウイルス 攻撃 モデルとして用いた。このタイプのrVV モデルは当該技術分野において周知であり、 T 細胞応答のインビボ有効性を評価するために受け入れられている手段である。マウス (3匹/群)に0および4 週目に、上記のようにscLと複合体となった、または 遊離 プラスミド DNAとしての、HCV およびIL-12 プラスミド DNAをI.V. 接種した。TfRscFv/Lip/DNA 複合体は上記のように0.33ug:10ug:1ug (TfRscFv:Lip:DNA) の比を用いる単純な混合によって調製した。DNAを等モル量にて混合した (計 50ug/マウス/注射)。マウスを8 週目に、HCVのNS3 タンパク質を発現する106 プラーク形成単位 (pfu)の rVVによって攻撃した。攻撃の5日後に、卵巣をマウスから取り出し、PBS中でホモジナイズし、3ラウンドの凍結/融解および超音波処理に供した。タイター測定(titration)のために、卵巣抽出物(100ul)を100 ulのトリプシンおよび100 ulのPBSと合わせ、37℃で30 分間インキュベートした。希釈(10-1 から10-6までの10-倍)を2% FBS/EMEM中で行い、250 ulを、12-ウェルディッシュ中のBSC-1 細胞の二連のウェルの感染に用いた。感染後2日目に、培地を除き、細胞を固定し、クリスタルバイオレット (20% エタノール、20% ホルムアルデヒド、0.3% クリスタルバイオレット)で染色した。群 1にはPBSを与え、群 2にはscL 複合体となった pAG410およびIL-12 プラスミドを与え、群 3にはscL 複合体となった空ベクターおよびIL-12 プラスミドを与え、群 4 には裸 DNA としてのpAG410およびIL-12 プラスミドを与えた。図7は、各群におけるpfu/卵巣として表したrVV タイターを示す。黒丸は個々のマウスをあらわし、黒棒は群あたり平均タイターを示す。scL pAG410/IL-12 複合体による免疫の結果、スチューデントのT分布を用いて評価して、PBS 群と比較して高度に有意なウイルス タイターの低下が起こった(p= 0.002)。 平均タイターはGp 2では104 であるのに対してGp 1では106 であった。興味深いことに、scLと 複合体となったIL-12 ベクターと空の バックボーンベクターのマウスへの接種もまた、ウイルス タイターの有意な低下をもたらしたが(平均タイター2x105 pfu/卵巣)、 pAG410 プラスミドと組み合わせた場合にみられた低下ほどは程度は高くなかった。ウイルス複製に対するこの効果はscL を用いる送達の結果である。というのは裸 DNA としてのpAG410 およびIL-12(Gp 4)による免疫は、ウイルス タイターの有意な低下をもたらさなかったからである。このデータは、 scL 複合体となった DNAによる免疫がウイルス 攻撃に対して保護することが出来るT 細胞 応答の誘発をもたらすこと、およびこれら免疫応答は裸 DNAを用いて誘発されるものより優れていることを示す。このデータは、サイトカイン を発現する プラスミドのみのscL 送達でもウイルス複製を阻害する免疫応答を誘発することができることを示す。
scL 複合体となったDNAによる免疫が、肝臓指向性 ウイルスによる感染の際により良好な肝臓内 T 細胞 浸潤をもたらしたかどうかを評価するために、上記と同じ4 群(上記と同一の複合体により0および4週目に免疫したもの)を、免疫の8 週間後に、NS3、NS5AおよびNS5B HCV タンパク質を発現する非複製的アデノウイルス 組換え体の3x108 の感染性粒子によって、I.V. 攻撃した。攻撃の10日後、肝臓組織を収集し、ホルマリン-固定し、当該技術分野において周知の標準的 プロトコールを用いてパラフィンブロックにマウントした。切片を H&E 染色し、T-細胞浸潤について分析した。肝臓に浸潤する T-細胞の数を異なるマウス群において評価した。3匹マウス/群のそれぞれについて3つの視野をカウントした。各群についてのカウントを足して平均をとり、T 細胞数/ 視野 (fov)を求めた。データをスチューデントのT検定により分析した。scL pAG410/IL-12を与えたマウスにおける平均 T-細胞 浸潤は有意にPBSを与えたマウスにおけるものより高く、118.8 T 細胞/fov 対70.2 T 細胞/fov (p=0.000007)であった。これをscL-ベクター/IL-12を与えたマウスについての71.5 T-細胞/fovと比較する。裸 pAG410/IL-12を与えたマウスにおいても有意により高いレベルのT-細胞 浸潤、108.75 T-細胞/fov (p=0.001)がみられたが、 scL-pAG410/IL-12によるものよりも程度は低かった。これらの観察は、HCV 抗原を発現するscL 複合体となったプラスミドによる免疫は、組換え 肝臓指向性 ウイルスによる感染の際に肝臓におけるより良好なT-細胞 応答をもたらすことを示す。
シンドビス 発現 システムを用いて、発現 組換え ウイルスが、HCVのコア、E1E2、およびNS3 タンパク質を発現するように操作された。これらタンパク質は次いでニッケルカラムを用いる精製を容易にするためにヒスチジンタグ付加される。効率的な精製が行われ、特異性はマウス モノクローナルまたはウサギ ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット 分析により判定される。慢性期血清が、HCVのE1E2、NS3、およびNS5A タンパク質に対する高タイター抗体により感染したチンパンジーから同定された。この不活性化血清はいくつかのウェスタンブロットおよび免疫蛍光法 アッセイに用いられ、組換え DNAおよびウイルス ベクターからのHCV 抗原の発現の検出が成功している。Mikrogen (Germany) から市販されている、NS3、NS5AおよびNS5B タンパク質もまた、エリスポット、増殖 アッセイ、およびフローサイトメトリー 分析を用いるチンパンジーにおけるHCVに対するT 細胞 応答の検出に用いられた。一連の オーバーラップする 18 mer ペプチドもまた、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから得られ、これらはチンパンジー 末梢血 単核細胞(PBMC)を用いるエリスポット アッセイでの使用が成功している1a H77 遺伝子型配列に対応する。ほとんどのHCV 抗原である、コア、E1E2、NS2、NS3、NS5AおよびNS5Bに対する抗体について試験するためのELISAが開発された。最近の研究は、ELISAを用いて得られた抗-E1E2 タイターが、感染したチンパンジーにおける中和抗体タイターの良好な指標であることが判明したことを示している。ネスト化 およびリアルタイム PCR アッセイの両方が、血清中のHCV RNAを検出および定量するために開発された。これらのアッセイの感度および特異性が評価され、たった40 RNA コピー/mL程度でもネスト化 PCRを用いて検出可能であり、200 RNA コピー/mL (74 WHO IU/mL) 程度でもリアルタイム PCRを用いて検出可能である。これら試薬および検出システムはすべて、HCV 遺伝子型1a (HCV-H) 感染性 クローンから転写されたRNAを接種されたチンパンジーにおける感染の初期急性期の間に収集された血漿に由来するモノクローナル ウイルスに対して特異的である。
HCV 感染の経過を変化させる糖タンパク質-特異的または非構造 タンパク質-特異的 免疫応答のいずれかを誘発するワクチンの能力を調べた。これらの研究は、中和抗体 (nAb) とワクチンとの両方によって誘発される T 細胞がチンパンジー モデルにおけるHCV 感染を改変しうることを示す。
ワクチン 実験において使用するためのHCV E1E2 タンパク質を生産するための発現および精製 システムが開発された。ヒスチジンタグ付加されたE1E2 タンパク質をシンドビス 発現 システムを用いて発現させ、当該技術分野においてよく確立された方法であるGNL レクチンおよびニッケルカラムを用いて>80% 純度にまで精製した。特異性および純度を E1 およびE2に対するモノクローナル 抗体を用いるウェスタンブロットおよびSDS PAGEゲルの銀染色により評価した。2匹のチンパンジー、一方は未処理であり (Ch1601)、もう一方は急性 HCV 感染から回復したもの (Ch1587) を、筋肉内送達された25 μg のrE1E2 タンパク質により免疫し、100 チンパンジー 感染用量 (CID50) のクローン性(clonal)HCV (図8Aおよび8B)により攻撃した。攻撃の結果を、ワクチン接種されていない 対照 動物における感染と比較した。強力かつ特異的なT-細胞 増殖性 応答に加えて、両方の動物の免疫により、E2の超可変領域(HVR1)に対する抗体を含むE1E2に対する高い抗体 タイターが生じた。この領域は天然分離株においてもっとも可変性であることが示されており、また、nAb エピトープを提示すると考えられている。抗体を、ビオチン化 HVR1 ペプチドまたは E1E2を発現するワクシニア ウイルス 組換え体で感染したBSC-1 細胞から精製されたE1E2 タンパク質を用いて開発された全タンパク質 E1E2および HVR1 ペプチド ELISA アッセイを用いて測定した。両方のワクチン接種した動物においてウイルス血症 が3週間遅延した。Ch1601において、HCV RNA タイターは 5x104 コピー/ml未満に維持され、ALT レベルはわずかに上昇した。肝臓内 サイトカイン mRNA レベルの上昇は、HCV RNAの定量不可能な レベルまでの低下と一致した。この制御にもかかわらず、ウイルス血症は抗体 タイターが低下すると再び現れ、 動物は慢性的に感染した状態となり、この再発は免疫エスケープを伴わなかった。急性 HCV 感染から回復するチンパンジーはnAbを発達させない。一次感染において誘発された既存のメモリー T 細胞 応答に対してnAbを加えると、動物を再感染から保護することができる免疫応答が生じた。Ch1587において、ウイルス血症は 3週目の1つのサンプルにおいてのみ検出可能であり(<104 コピー/ml)、肝炎の証拠はなかった。
HCV NS 抗原である NS3、NS5AおよびNS5Bのみを含む本発明の方法を用いないワクチンを構築した。回復したチンパンジー (Ch1588)をNS3に対するDNA prime/rVV (組換え ワクシニア ウイルス) 追加免疫レジメンで免疫した。第2の回復したチンパンジー (Ch1606)をNS3、NS5AおよびNS5Bを含むワクチンで免疫した。チンパンジーを 100 CID50 のクローン性 HCVにより攻撃した。両方の動物において、T 細胞応答がワクチン接種の後に追加免疫された。両方の動物の攻撃の結果、無症候性の感染がもたらされ、注射後 (p.i.) 6 週目に1 (Ch1606)または2 (Ch1588) 週間のみ持続する低レベルウイルス血症が伴った(図9A-9C)。一方、ワクチン接種されていない 回復したチンパンジーはp.i. 1 週目にてウイルス血症を発症し、少なくとも14週目まで検出可能であった。
a)特異的T 細胞応答がi.v. リガンド-リポソーム ナノ複合体 (scL-HCV) ワクチン 戦略を用いて未処理 チンパンジーにおいて誘発され、攻撃後に増強される
明細書中に記載されるようなscL-HCV ナノ複合体を用いる未処理 チンパンジーにおけるワクチン研究を行った。免疫応答を開始させるための注射をscL-HCV 複合体を用いて0、4および8 週目に行い、次いで組換え アデノウイルス (rAd) 追加免疫 (16 週目)を行った。動物をワクチン接種するのに用いた複合体は、0.33ug:10ug:1ug (TfRscFv:Lip:DNA)の比にて、5% デキストロースを賦形剤として含め、チンパンジー重量に基づいておよそ0.164 mgDNA/Kg/注射にて作られた。調製した複合体をi.v. 注入のために250mlの 5% デキストロースバッグに注入し、動物に投与した。動物を32 週目 (追加免疫後16 週目)に攻撃した。ナノ複合体の注入およびアデノウイルス 追加免疫は良好に耐用され、いずれの動物においても有害な反応は起こらなかった。
HCV NS3、NS5AおよびNS5Bを含むワクチンを構築して、T 細胞 免疫治療薬 ワクチンが慢性的に HCV-感染したチンパンジーにおいて有効であるかどうかを判定した。裸 DNA prime (scL-HKではない) (i.m.)/組換え ワクシニア ウイルス (rVV) 追加免疫 レジメンを用いて慢性的に感染した チンパンジーを処置した。このチンパンジーは3 用量の裸 DNAをアジュバントとしてのCpG i.m.と組み合わせて送達するNS3、NS5AおよびNS5B ワクチンにより免疫された後、rVV 追加免疫されたものである。rVVの接種の後、末梢血におけるT 細胞応答は、NS3、NS5AおよびNS5Bについて12-20倍上昇した (図15)。しかし、HCV RNAおよび肝臓酵素のレベルには影響は無かった; RNA タイターは ~104 RNA コピー/mlのままであり、処置前レベルと同様であった。肝臓内 IFN-γ および TNF-α mRNAの分析の後、これらサイトカインのいずれの上昇もみられず、血液におけるT 細胞活性の上昇はHCV 複製部位における上昇をもたらさないことが示唆された。ウイルスを制御できないことは、肝臓においてT 細胞が機能できないことの結果である可能性がある。
動物を24 週目まで研究する。サンプル収集は最初の接種の4 週前に開始する;これらサンプルをベースラインおよび陰性対照として用いる。サンプリングを最後の接種の8 週後まで続けることにより、処置が陽性の応答を与えるかどうかを判定する時間を確保する。研究の間にわたり、肝臓組織診をNIRC SOPによって規定されるMenghini技術によって二週間に一回行い、血液を大腿静脈を介して以下に詳細に示す研究に使用するために毎週採取する。40mL の全血を偶数週(-4、-2、0、2週目など)に得て、5mLの血漿を奇数週(-3、-1、1週目など)に得る。プラスミドの安定性を判定するために、 1 mLの血液を投与前および最初の接種の15 分、1、3、8、24、48、および72時間後に収集する。その他のすべての血液採取および肝臓組織診は接種の前に得る。この出血スケジュールは、非-ヒト 霊長類における血液収集についてのNIRCによって作成されたガイドラインに基づいている。1ヶ月に90mLを収集し、これは許容可能な限界の範囲内である。血液をヘパリンを抗凝固剤として用いて採取する。血漿を5 mL および1 mL体積から2700 rpmで10 分間の遠心分離によって得る。血漿 サンプルを500ul アリコートに分けて-80℃で保存する。肝臓組織診の半分をホルマリンで固定し、半分を2mmの切片に切り分けて液体 N2で瞬間凍結する。
本発明者らのマウスにおける予備的研究は、カプセル封入が有意に肝臓にみられる核酸の量を上昇させ、血液中に検出されうる時間を延長させることを示す。これらの知見は、チンパンジーにおけるカプセル封入されたHCV NS3-NS5B プラスミドにより確認される。注射の後どれほど長い間 HCV DNAが循環中に存在するかを調べるために、1 mLの血液を、投与前および最初の注射の15 分、1、3、8、24、48、および72時間後に収集する。血漿を2つのアリコートに分けて-80℃で冷凍する。1つのアリコートをプラスミドの単離に用いる(High Pure PCR Template Preparation kit (Roche))。DNAを瞬間凍結した肝臓組織の1つの2mm の切片から単離する (DNeasy Extraction Kit (Qiagen))。陰性対照 サンプルは接種前に採取した同じ動物からの血漿および肝臓組織である。外来性 HCV プラスミドをPCRによって評価する。逆転写酵素の非存在下でのPCRの使用により、慢性感染に起因して存在するウイルス RNAからプラスミドを識別する。さらに、pSCMV バックボーンに位置する1つのプライマーとHCV インサートにおける1つのプライマーを用いる。したがって、外来性 DNAのみが増幅される。このアプローチはpSCMV ベクター中のその他のインサートでの使用が成功している (IND 体内分布研究についてp53)。定量するために、シグナル 標準を既知量のNS3-NS5B プラスミドを、感染していないチンパンジーからの血漿または肝臓組織に添加することにより調製し、 次いで抽出を行う。 FDAは用いられた動物からの多量のアーカイブしたサンプルを有している。スキャンしたゲルをIMAGEQUANT(登録商標) 画像分析 ソフトウェア (Molecular Dynamics)を用いて定量し、プラスミドの量を標準との比較により算出する。DNAを第2のアリコートの血漿、 および瞬間凍結した 肝臓組織の第2の切片から単離し、Stratagene DNA 抽出キットを用いるサザン分析に供する。接種の前に採取した血漿および肝臓組織を陰性対照として含める。ハイブリダイゼーションをGene Image Alkaline Phosphatase DNA Labeling and Detection System (Amersham)を用いて行う。上記のように、サザン分析による外来性 DNAの検出のためのプローブは、ベクターとインサートとの接合部をまたがる。このプローブはIDT, Inc. (Coralville, IA)により合成される。この方法はまた、組織における外来性 DNA の分析にも用いられた。標準を上記のように調製する。サンプルを次いでアガロースゲル、ブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって分析する。10-から 50-倍過剰のプローブを用いることにより、すべてのバンドの飽和を確証する。スキャンしたオートラジオグラフをIMAGEQUANT(登録商標) ソフトウェア (Molecular Dynamics) を用いて定量し、プラスミド DNA の量を標準との比較により算出する。この非放射方法の感度レベルが低すぎる場合は、γ32 P-ATP による5- 末端標識を用いてもよいし、またはネスト化 PCR を以前に記載されているようにして行ってもよい(Fernandez J.、et al.、J. Virol、78、9782-9789 (2004))。血液および肝臓におけるDNAを評価するために両方の方法を用いることにより、一つの方法が成功しなくても結果が確実に得られることになる。試験は三連で行い、それぞれの動物からの順次の血漿 サンプルにおけるプラスミド レベルを t-検定を用いて15 分において観察されたレベルと統計的に比較し、経時的な DNA 濃度における有意な低下を評価する。統計的比較は肝臓については行わない。というのはこの組織についての研究は、この臓器におけるDNA の存在を調べるためであって、経時的安定性を調べるためではないからである。
1.末梢血における免疫応答の評価
治療ワクチンを与えられた慢性的に HCV-感染したチンパンジーの末梢血における特異的T 細胞 活性の上昇は、肝臓におけるより高いT 細胞 活性および低下したウイルス タイターを必ずしも導くわけではない。したがって、これら動物の肝臓におけるT 細胞 浸潤およびサイトカイン 応答を分析することが必須である。しかし、末梢血が、誘発された免疫応答の程度および特異性を評価するための第一のソースとして用いられ得る。肝臓 組織診は貴重であり制限されており、より多くのT-細胞が末梢血から得られる。肝臓の研究は、末梢血における免疫応答の上昇が、肝臓におけるより大きいT-細胞 活性と相関しているかどうかを判定するために用いられる。PBMCを、当該技術分野において以前に記載されているように フィコールグラジエント 遠心分離を用いて2週間に1回得られる全血から単離する(Puig M., et al., Vaccine, 22, 991-1000 (2004))。血漿をグラジエントの頂点から取り出し、-80℃で 1mL および200uL アリコート中で保存する。およそ 108 のPBMCおよび15mLの血漿が40mLの全血から得られる。凍結細胞の1つの アリコート(107/mL)を融解し、AIM-V 培地 (Invitrogen)+ 2% ヒト AB 血清 (Biowhittaker)中で洗浄する。生細胞数を評価し、細胞をエリスポットにより試験する (Shoukry N.H.、et al. J. Exp. Med.、197、1645-1655 (2003))。各分析に用いる細胞の総数は、1つのアッセイにおいて試験する抗原の数に依存する。オーバーラップする ペプチドの完全なパネルを用いて(11 aaによりオーバーラップする18-mer、NIH Reagent Program)、1a ゲノムを包含させ、それに対応させる。これらのペプチドは、チンパンジーの感染に用いたウイルスおよび、scL-HCVまたはscLHK-HCVにおけるHCV プラスミドに用いた配列に対応する。サンプルをスクリーニングするための30-45のオーバーラップする ペプチドを含む10のペプチド プールを用いる。陰性 卵白アルブミン ペプチド 対照、陽性 フィトヘマグルチニン 対照および媒体対照を各アッセイに含める。サンプルを105 細胞/ウェルを用いて三連で試験する。サンプルを全ウイルス ゲノムをカバーするペプチドに対して試験する。ワクチンは抗原NS3-NS5Bに対する応答を刺激すると予測されるが、この刺激の結果、T ヘルパー 応答の上昇またはIL-2 産生の上昇が起こりえ、これはワクチンに含まれないウイルス抗原に対する応答の増強を導く。PBMCの前刺激およびIFNγ、IL4、IL2およびIL10を産生する細胞のエリスポット 分析を、1μg/ml の各個々のペプチドおよびヒト エリスポット試験キットにて96-ウェル プレートにおいて行う (U-Cytech、Netherlands) (Shoukry N.H.、et al. J. Exp. Med.、197、1645-1655 (2003)) 。特異的スポット形成単位(SFU)の数を、三連の試験ウェルの平均値から三連の対照 (抗原なし)の平均値を差し引くことによって計算する。T 細胞 増殖 アッセイを当該技術分野において以前に記載されているようにしてPBMCに対して96-ウェル プレート (105 細胞/ウェル、三連)を用いて行う (Puig M., et al., Vaccine, 22, 991-1000 (2004))。細胞を1ug/mL のタンパク質 (NS3、NS5AまたはNS5B) (Mikrogen、Germany) またはペプチドで刺激する。後の研究のために CD4+ およびCD8+ T 細胞を抗-ヒト CD4+ または CD8+ dynabeads (Dynal)を用いて全集団から枯渇させ (Puig M.、et al.、Hepatology、44、736-745 (2006)) 、特異的抗原を認識する特異的細胞タイプを判定するために試験する。これらの研究から得られるデータはHCV-特異的 T 細胞 応答の増強の最良の指標を与える。結果を各動物についてワクチン前およびワクチン後のサンプルの間で比較する。t-検定を用いてワクチン接種の後のSFUの有意な上昇を評価する。末梢血に対する研究の結果を、肝臓内 T 細胞 浸潤、サイトカイン 応答およびウイルス RNA レベルの変化の分析と合わせてこの治療戦略の有効性を判定する。
未処理 チンパンジーへのscL-HCVの接種後の血清 サイトカインの分析により、ワクチン接種した動物において多数の サイトカイン (ICAM-1、TGF-βおよびIFN-β)の変化が示されたが対照においては示されなかった。治療ワクチン接種後の血清 サイトカインのパネルにおける変化を調べ、処理前 サンプルおよび対照動物と比較する。サイトカインをワクチン接種前および後に採取した1-2mLの血漿についてTransSignal Human Cytokine Antibody Array kitを用いて分析する。感染していないチンパンジーからの正常血漿を陰性対照として含める。血清 サイトカインにみられる変化(種類とレベルとの両方)を肝臓におけるmRNA レベルにおいてみられたものと比較する。血清 サイトカインに対するこれらの研究をmRNAの肝臓内分析に加えて行う。mRNA 分析を定量し、統計的に分析し、肝臓におけるサイトカイン レベルの指標を提供する。末梢血における応答が肝臓において観察されたものを反映しているかを決定するためにこれらの分析を組み合わせることが重要である。サイトカインパターンにおける変化をメモリー T 細胞の持続と相関させる。正の相関は排除に関連する特異的T 細胞の存在を判定するより簡便な手段の開発に対する第一工程である。
a)肝臓に浸潤する T-細胞の存在についての試験
浸潤性T-細胞の証拠を組織学的 分析およびサイトカイン 応答によって肝臓において試験する。治療ワクチンを与えられた慢性的に感染した チンパンジーの末梢血におけるHCV-特異的 T 細胞 活性の上昇は、肝臓におけるより高いT 細胞 活性およびウイルス タイターの低下を必ずしも導くわけではない。したがって、これら動物の肝臓におけるT 細胞 浸潤およびサイトカイン 応答を分析することが重要である。
ホルマリン 固定し、パラフィン包埋した 組織を切片とし、以下の特異的タンパク質および 細胞 マーカーについて染色する: CD4; CD8; パーフォリン; IFN-γ; IL-2; CD45RA/ROおよびCCR-7。T 細胞 集団は CD45RAおよび CCR7 の発現に基づいて同定することができる(Campbell J.J.、et al.、Journal of Immunology、166、877-884 (2001); Sallusto F.、et al. Nature、401、708-712 (1999); Seder R.A. and Ahmed R.、Nature Immunology、4、835-842 (2003))。肝臓 切片の免疫組織学的分析を、各組織診について肝臓に存在するリンパ球の数、種類および位置を識別するために行う。切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給し、PBSで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を10mM クエン酸緩衝液 pH 6.0 で100℃で10 分間処理する。組織切片上の非特異的部位を 5%ミルクでブロッキングした後、 特異的抗体とともにインキュベーションする。感染の前(以前の保存サンプル)および処理前に同じ動物から得た肝臓組織診を、比較のために用いる。これらの研究は標識化ストレプトアビジン-ビオチン技術およびDABを用いて開発された製品により行う。6つの視野を処理前および処理後切片について分析し、陽性 細胞タイプを計数する。この 染色方法により、門脈または特定の肝臓細胞タイプと比較しての肝臓内の細胞の位置を評価する。統計分析をT 細胞 浸潤についてt-検定を用いて行う。
トータルRNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen、CA)を用いて瞬間凍結した 組織の一部から単離する。RNAをFirst Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia)を用いて逆転写し、当該技術分野において以前に記載されているように IFN-γ、IL2、CD3、CD8、およびCD4に対する特異的プライマー プローブセットを用いて サイトカイン mRNA レベルについてリアルタイム PCR により試験する(Major M.E.、et al. Hepatology、39、1709-1720 (2004))。これらサイトカインレベルを内因性 対照 (GAPDH)に対して正規化し、各動物について処理前 組織診におけるレベルと統計的に比較する (Thimme R.、et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A、99、15661-15668 (2002))。同時に凍結肝臓組織の小さい部分を用い、TransSignal Human Cytokine Antibody Array kit (Panomics)を用いて36のサイトカインのパネルのタンパク質 レベルを同時に分析する。
慢性的に感染した個体における肝臓に関連する治療ワクチンの効果の研究が特に重要である。ワクチンは肝臓における免疫応答の増強に起因してウイルス タイターの低下を導きうるが、それは肝炎を悪化させ、肝臓疾患を導く可能性がある。チンパンジーからの血清および肝臓組織を毒性の指標である肝臓-特異的 酵素および組織病理学的 変化について分析する。血漿のアリコート (2mL)を肝臓 機能に特異的な以下のマーカーのパネルについて民間試験所 (ANTECH Diagnostics)によって毎週試験する: 総ビリルビン、ALT、アルカリホスファターゼ (ALP)、血清 アルブミン、γ-グルタミルトランスフェラーゼ (GGT)およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)。接種の後<2 週間持続する正常範囲を超えるこれらマーカーのレベルの上昇は許容可能とみなす。正常範囲を超える持続的レベルは毒性を示す。これは肝臓 疾患に特異的なわずかな試験の1つであるため (McIntyre, N. and Rosalki, S. Biochemical investigations in the management of liver disease. In: Oxford Textbook of Clinical Hepatology McIntyre, Benhamou, Bircher, Rizzetto and Rodes (eds). Oxford University Press, 293-309. (1991))、処理前および処理後の ALT レベルを各動物について比較し、毒性を統計的に評価する。
scL-HCV または scLHK-HCV治療アプローチの免疫応答および成功の最初の試験は、血液におけるHCV RNA タイターの変化である。これらは院内のリアルタイム RT-PCR アッセイを用いて判定する (Major M.E.、et al.、J. Virol、73、3317-3325 (1999); Major M.E.、et al.、J. Virol、73、3317-3325 (1999))。トータルRNAを処理前および処理後出血からの200 uLの血清からTriZol (Invitrogen)および当該技術分野において以前に記載されているようにして行う(Major M.E.、et al.、J. Virol、73、3317-3325 (1999); Fernandez J.、et al.、J. Virol、78、9782-9789 (2004)) RT PCRを用いて単離する。RNAをレプリカウェル(n=4)に分け、RNA 濃度を 一連の HCV RNA 標準を用いて算出し、RNA コピー/mL血漿として表す。本発明者らはクリーンな制御された条件下でHCV 配列を増幅する経験を非常に多く有する(Major M.E.、et al.、J. Virol、73、3317-3325 (1999); Fernandez J.、et al.、J. Virol、78、9782-9789 (2004))。手順を汚染を避けるため別々の部屋で行い、すべての場合において指定されたピペットおよび試薬を用いる。すべての抽出において、感染していないチンパンジーからの陰性対照血漿を含め、抽出された RNAを RT-PCR アッセイにおいて用いる。処理前および処理後 RNA タイターを比較してタイターにおける統計的に有意な変化を判定する。肝臓よりもむしろ血漿をウイルス RNA タイターについて分析する。肝臓組織診は制限されており、血漿におけるタイターは肝臓におけるレベルの直接的な指標である。動物がウイルスの排除を示す場合のみ、肝臓を ウイルス RNA について、40 RNA コピー/mL程度さえ検出するより感度の高いネスト化 PCRにて試験する (Major M.E., et al. Hepatology, 39, 1709-1720 (2004), Puig M., et al.. J. Virol. Methods, 105, 253-263 (2002))。
免疫リポソームの鼻腔内(IN)投与
IN 経路を介するワクチン投与は、特定のタイプのウイルス、例えば、頭頸部の組織(これには鼻および喉が含まれる)に対して指向性を有するものに対して特に有用である。例としては呼吸器疾患を誘発するウイルスが挙げられ、呼吸器疾患にはインフルエンザのみならずSARSおよび鳥インフルエンザも含まれる。しかし、この経路はその他のタイプの ワクチンの送達にも同様に利用可能である。INにて与えられた場合に、scL 複合体が局所組織を標的化し、トランスフェクトする能力を比較するため、非腫瘍担持 BALB/cマウスに、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミド DNAをカプセル封入するscL ナノ免疫リポソーム複合体(scLLUC)、または等量の遊離の複合体化していない (裸) プラスミド DNA (LUC) (両方の処理について10 ug/マウス/用量)を与えるか、あるいは処理をしなかった (CTL)。実施例 1におけるように、0.33ug:10ug:1ug (TfRscFv:Lip:DNA)の比にて、5% デキストロースを賦形剤として用いて、単純な混合によりscLLUC 複合体を調製した。2回の用量を24 時間以内に投与した。最後の投与の48 時間後、動物にルシフェリン 基質 (ip 投与) を ~3mg/マウスにて注入し、動物全体を、IVIS 100 光学イメージング システム (Xenogen、Alameda CA) を用いて麻酔下で可視化した(図16A-16C)。現れたシグナルの強度は実際の測定においては色によって示される。赤色/黄色は最も高い強度であり、トランスフェクトされたルシフェラーゼ 遺伝子の最も高い発現レベルに対応し、一方、青色は最小の 発現を表し、緑色は中程度の発現である。これらの発現レベル(高/中程度/最小)をカラー表示の代わりに図16A-16Cおよび17A-17Cに示した。図16A-16C から、scL 複合体 (scLLUC)のIN 投与(パネル C) の結果、遊離の裸 DNA (LUC) (パネル B)と比較して鼻領域におけるトランスフェクション/発現のより高いレベルがもたらされたことが明らかである。パネル Aは非処理対照を表す。scL ナノ免疫リポソーム複合体と裸 DNA との両方がトランスフェクトされる組織に直接的に投与(局所送達)された場合に、scLナノ免疫リポソーム複合体が 裸 DNA (今回用いられたような)よりもかなり良好な結果をもたらしたということは、驚くべき予期せぬことである。
IVIS 100 光学イメージング システム (Xenogen、Alameda CA)を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミド DNAをカプセル封入するscL ナノ免疫リポソーム複合体(scLLUC) (上記のもの)、または等量の遊離の複合体化していない (裸) プラスミド DNA (LUC) (両方の処理について25ug/マウス/用量) をIV 尾静脈 注射を介して与えた、非腫瘍担持 BALB/cマウスまたは非処理マウス (CTL)を画像化した。2用量を24 時間以内に投与した。最後の投与の48 時間後、動物にルシフェリン 基質 (ip 投与)を~3mg/マウスにて注入し、動物全体を麻酔下で可視化した。図17A-17Cに示すように、尾部における注射部位を除いては裸 DNA (パネル B) を与えたマウス(LUC)においては シグナルはみられない(口での少量はおそらく注射部位でのなめる行為による)。一方、同じ量の プラスミド DNAを担持するscL 複合体の静脈内投与の後は(scLLUC) (パネル C)、動物のほぼ全体にわたって中程度から高レベルのシグナルがみられた。パネル Aは非処理対照を表す。リンパ節および肝臓が位置している位置ではより強度が高い。これはおそらく、 樹状細胞およびクッパー 細胞が実際にトランスフェリン 受容体を発現しており、そのため複合体を取り込むことができるという事実に起因する。しかし、正常の非腫瘍組織におけるこの高レベルの取り込みおよび発現は、予期せぬ驚くべきことである。
マウス モデルを用いるインビボでの肝細胞へのscL-HCVまたはscLHK-HCVの送達の最適化
リピドA を用いて製剤されたscLまたはscLHK をマウス研究において用いる。リポソーム複合体中の20から30 μgのDNAを24 時間かけて2-3回の接種により尾静脈を介して複数連のマウスにリポソーム複合体を介して送達する。リポソームの特定の細胞タイプへのエンドサイトーシスを追跡するために、ローダミン-DOPEで標識したリン脂質を総脂質の0.05 モルパーセントにて用いる (Avanti Polar Lipids, AL)。組織 サンプルをウェスタンブロット、組織学的 染色により分析し、細胞の高分解能 イメージングはHCV 特異的タンパク質の発現について注射の24-48 時間後にフローサイトメトリーによって行う。組織学的分析のために、組織をTissue-Tek培地中に瞬間凍結するか、またはホルマリン固定する。組織をクリオスタットまたはミクロトームを用いて切片とし、特異的タンパク質または細胞 マーカーについて染色する。パラフィン包埋し、ホルマリン 固定した組織について、切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給した後、PBSで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を10 mM クエン酸緩衝液 pH 6.0 によりマイクロ波で100℃で10 分間処理する。冷却および洗浄の後、内因性 ペルオキシダーゼ 活性のクエンチングを0.3% H2O2を用いて達成する。組織 切片上の非特異的部位を次いで5% ミルクまたは正常 血清でブロッキングした後、特異的抗体とともにインキュベーションする。
BALB/cマウスを用いて、持続的な肝臓酵素の上昇の非存在下での良好な免疫応答を達成するための最適 生物学的 用量 (OBD)を決定する。対照として、遊離の(複合体化していない) プラスミド、空ベクターを担持する改変リポソームおよびHCV遺伝子を欠く非組換え アデノウイルスを用いる。群あたり5匹の動物を用いる。最も高い投与用量は約 50 μgである。マウスの群に、1、5、10、20、および50 μg/注射を含むリポソーム/DNA 複合体(実施例 1に記載のように調製)を静脈内注射により与える。接種は0および4 週目に行い、次いで10 週目にアデノウイルス 追加免疫を行う。この追加免疫の4週後、肝臓および脾臓をフローサイトメトリーおよびインビトロ試験により分析し、上記のような免疫の際に誘発されたT 細胞の特徴および特異性を判定する。この実験を簡略化するために、対照動物には最も高い 用量の DNA およびアデノウイルスのみを与える。動物を肝臓 酵素および肝臓における組織学的 変化についてモニターする。OBD がいったん確立されたら、この用量を各注射について用いるが、注射の回数は4週間隔で1から5回まで変動させ、 次いで最後の注射の6 週後にアデノウイルス追加免疫を行う。4週間後に、肝臓および脾臓を最適 応答をもたらす注射回数を判定するために上記のように分析する。
米国において支配的なHCV 遺伝子型は1aであるが、ワクチン 開発においては2以上のHCV 遺伝子型からのウイルス エピトープの認識に取り組む必要がある。誘発された免疫応答の交差反応性を、遺伝子型1bおよび2aからのコンセンサス 配列に対応するオーバーラップする ペプチドを用いてマウスにおいて評価する。1a H77 ゲノム 配列に対応するオーバーラップする 18 mer ペプチドの完全なセットはNIH AIDS Research and Reference Reagent Programによって提供されている。この同じプログラムにより1b J4 遺伝子型に対応する類似のセットのオーバーラップする ペプチドが入手可能である。タイプ 2 ペプチドセットはMimotopes (Washington、NC)から購入した。患者集団において起こりうる交差反応性をよりよく評価するために、これら分析を上記のHLA-A2 トランスジェニック マウスを用いて行う。これらマウスはHLA-A2 MHC 分子を発現し、HLA-A2 エピトープを提示することが出来る。異なる遺伝子型を表すペプチド プールに対する応答をエリスポット アッセイを用いて評価し、免疫のために用いられる1a H77 配列に対応するペプチドと並行して行う。交差反応性が観察されなければ、三価のワクチンを3つのすべての遺伝子型に対応するDNA プラスミドを含むナノリポプレックスを用いて試験すべきであり、次いでそれぞれこれら3つの異なる遺伝子型に対応する3つのrAd を用いる追加免疫を行う。各個々の遺伝子型に対する免疫応答を評価し、個々の遺伝子型配列を単独で用いた場合に得られる応答と比較する。
scL-HCV またはscLHK-HCVのマウス LD10は上記のように判定されるOBDに基づく。OBDから出発して、徐々に増加する用量のプラスミド DNA (100 μgまで)を、5週間毎週1回注入する。複合体における成分の比は決められているので、プラスミド DNAの量を増やすことにより、複合体(実施例 1のように調製)中のTfRscFvおよびLipまたはLip-HKの量も上昇する。scL-HCV またはscLHK-HCVを、10 マウス/群の雄性および雌性 4-6 週齡 BALB/cマウスにi.v.、i.p.、i.m.またはi.d. 注入する。動物の重量を週に2回評価し、毒性 (例えば、消耗)の兆候について毎日モニターする。遊離 プラスミド DNAまたは非リガンド化 リポソーム-DNAを与えた動物を対照として用いる。短期毒性を評価するため、最後の注射の2日後にマウスの半数を屠殺する。残りの半分は最後の投与の2週後に屠殺して長期毒性を評価する。肝臓、性腺、肺、膵臓、腎臓、心臓、皮膚、脾臓、脳、腸、および骨髄を含む様々な臓器および組織を組織学的に調べる。肝臓酵素レベルも週ごとにモニターする(Antech Diagnostics)。臓器からの組織 サンプルを瞬間凍結し、DNA 抽出のために-70℃で保存する。PCR 分析をすべての組織サンプルについて行って接種後のすべての組織におけるscLHK-HCVの体内分布およびDNAの持続を評価する。HCV遺伝子に特異的なプライマーは入手可能である。
用量 応答 研究をアカゲザルにおいて scL-HCVまたはscLHK-HCV (実施例1のように調製)およびアデノウイルス 組換え体を用いて行う。特異的メモリー マーカーを担持する最良のHCV-特異的 T 細胞を誘発する免疫系および用量を、アカゲザル モデルにおける出発用量として用いる。アカゲザルにscL-HCVまたはscLHK-HCVを接種し、s.c. 送達により 1012 感染単位までの組換え アデノウイルスにより追加免疫する。提案されるワクチン接種 レジメンは0 および 3 ヶ月目のDNAプライムおよび追加免疫、次いで6 ヶ月目のアデノウイルスからなる。 対照群には空ベクター 遊離 プラスミド DNAと複合体化したscL-HCVまたはscLHKおよび非組換え アデノウイルスを接種する。
scL-HCVまたはscLHK-HCV/アデノウイルス ワクチンを慢性 チンパンジーにおいて治療ワクチンとして用いる。4匹の慢性的に感染した チンパンジーはすべて最初は遺伝子型 1a (H77 株)に対応する単一配列 モノクローン性ウイルスにより感染されている。これらの 動物は3.5-5年間慢性的に感染している。HCVはRNA ウイルスであり、それゆえゲノムは複製の際に突然変異を受ける。この同じモノクローン性ストックの接種後に持続的に感染している動物からのウイルスはおそらく免疫圧の結果として、感染のおよそ 6 ヶ月後には突然変異を蓄積している。感染の38 週後にCh6412から単離したウイルスについての配列データが準備された。完全なコード領域の分析により9 アミノ酸の変化が明らかとなり、そのなかの6つはNS3、NS5AおよびNS5B 領域に位置していた。循環しているウイルス ゲノムにおけるこれらの突然変異にもかかわらず、野生型配列をこれらの動物における治療ワクチンにおいて用いる。多数の よく保存されたエピトープに対応する野生型配列の使用は、ウイルス タイターの低減に有効である。主要エンドポイントとして、ウイルス RNA タイターの低下を、第二のエンドポイントしての処理前 レベルと比較して、各動物の血清において評価する。上昇した T 細胞 活性を肝臓において測定し、肝臓内 サイトカイン mRNA レベルの上昇も測定する。処理前 レベルと比較して、0.5 log10 を超えるRNA タイターの低下および2-倍を超えるT 細胞数またはサイトカイン mRNA レベルの上昇を、有意であるとみなす。2匹の動物には治療ワクチンを接種し、2匹の動物にはベクター 対照を接種する。
リンパ球を肝臓組織診から機械的ホモゲニゼーションによって単離し、次いで洗浄および計数を行う。細胞をCD4、CD8、CD45RA/CD45RO、CD95、CD62Lおよび CD28に対する抗体(BD Pharmingen)で染色し、数をフローサイトメトリーによって判定する。事象をFACS-Calibur (Becton Dickenson)を用いて獲得し、死細胞の排除のために7AAD (BD Pharmigen)を用いる分析のためにソフトウェアCellquest (Becton Dickenson)を用いる。マウスおよびアカゲザル研究について記載したように、テトラマーを処理したチンパンジーからの特異的T細胞の機能の研究に用いる。
トータルRNAを RNeasy Mini Kit (Qiagen、CA)を用いて瞬間凍結した組織から単離する。RNA をFirst Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia)を用いて逆転写し、リアルタイム PCRによって、IFN-γ、CD3、CD8、および CD4 についての特異的プライマー プローブセットを用いて(Perkin-Elmer Applied Biosystems, CA) サイトカイン mRNA レベルについて試験する。これらサイトカインのレベルを内因性対照 (GAPDH)に対して正規化し、それぞれの動物についての処理前組織診におけるレベルと比較する。サイトカイン mRNA レベルの2-倍を超える上昇または低下を有意であるとみなす。
ホルマリン固定した組織をミクロトームを用いて切片とし、アポトーシスの特異的タンパク質、細胞 マーカーまたはマーカーについて染色し、肝臓における細胞がワクチン接種の際に誘発されたHCV 抗原に特異的なCTLの作用に起因してアポトーシスを経ているかどうかを判定する。免疫組織学的 分析を肝臓切片に対して行って、各組織診について肝臓に存在するリンパ球の数、タイプおよび位置を識別する。切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給した後、PBSで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を10 mM クエン酸緩衝液 pH 6.0で マイクロ波で100℃で 10 分間処理する。組織切片上の非特異的部位を次いで5% ミルクまたは正常血清によりブロッキングした後、特異的抗体とともにインキュベーションする。感染の前に同じ動物から得られた肝臓組織診 (以前に保存されたサンプル) および処理後のものを比較のために用いる。
毒性学研究を低い (OBDまたはLD10より10x低い)および高い (OBDまたはLD10より10高い) 用量の実施例 1に記載のように調製されたこれらscL-DNAまたはscL-HK-DNA 複合体を用いて1つの対照群 (30匹のマウス)および 2つの処理群(それぞれ30匹のマウスであって、半数は雄性であり半数は雌性)について行う。複合体の注入を上記に決定した投与スケジュールにて1日目から開始する。各群からの10匹のマウスを最後の注射の2日後、3週間後および6週間後に屠殺する。体重および食餌摂取を毎日モニターする。対照および処理群についての臨床病理 (尿血液学、臨床化学、特に肝臓酵素)および組織病理学を評価する。以下の臓器を含める: 注射部位、脳、膵臓、鼠径リンパ節、骨髄 (組織およびスメア)、肝臓、腎臓、精巣/卵巣、脾臓、肺、心臓。
化学的結合によって調製されたナノ免疫リポソームによるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、1以上のインターロイキンをコードする抗原 遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上の プラスミド、を含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を個体に投与することを含む、ヒト (およびその他の哺乳類および動物)においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。様々な標的化リガンドを含む複合体はリポソームの表面に直接的に化学的に結合したものであり得、以下に記載のように実施例 1 において実質的に記載したように調製される:
単純な混合により調製されたナノ免疫リポソーム複合体によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ヒト(ならびにその他の哺乳類および動物)においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、個体に、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、1以上のインターロイキンをコードする抗原 遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上の プラスミドを含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を投与する工程を含む。リポソーム表面に化学的に結合していないが直接的に複合体化/結合した様々な ターゲティングリガンドを含む複合体は本質的に実施例 1に記載のようにして以下のように調製される:
{K[K(H)KKK]5-K(H)KKC} ペプチド (HoKC)を複合体に含める場合は、カチオン性 リポソーム 製剤A (DOTAP:DOPE、1:1 モル比)、B (DDAB:DOPE、1:1)、G (DOTAP:DOPE:コレステロール、1:1:1) およびH (DDAB:DOPE:コレステロール、1:1:1) (または上記のいずれかのリポソーム製剤)を上記のようにエタノール 注射 方法を用いて調製する。各リポソーム 製剤にはまた、MPB-DOPEを総脂質の5 モルパーセントにて含める。HoKC ペプチドは末端 システインを担持するため、MPB-DOPEをすべてのリポソーム組成物に含めることにより、ペプチドとリポソームとの結合を可能とする。Lip-HoKC リポソームをマレイミド基を担持するカチオン性リポソーム (Lip-MPB) とペプチドとの以下のようなカップリング反応を用いて調製する。0.1 mmol のシステイン上に遊離 チオール基を有するペプチドのアリコートを10 mM HEPES、pH 7.4溶液中の2 mmolのLip-MPBに添加し、室温で2時間回転させる(20-30 r.p.m.)。結果として得られるLip-HoKCの脂質濃度は1.4 mMである。
化学的結合によって調製された2つのナノ免疫リポソーム複合体の共注射によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ヒト(ならびにその他の哺乳類および動物)においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、個体にウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、1以上のインターロイキンをコードする 抗原 遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上の プラスミドを含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む。リポソームの表面に直接的に化学的に結合した様々な ターゲティング 薬剤を含む複合体は実施例 4において記載のように調製される。
単純な混合によって調製された2つのナノ免疫リポソーム複合体の共注射によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、個体に、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、1以上のインターロイキンをコードする抗原 遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上の プラスミドを含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を同時投与することを含む、ヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発方法も提供する。リポソームの表面(HoKC ペプチドを有するかまたは有さない) に化学的に結合していないが直接的に複合体化した様々な リガンドを含む複合体は実施例 5に記載のように調製される。抗原として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミド DNAは、実施例 5に記載のものと同一である。いずれかのインターロイキン、例えば、インターロイキン 2、インターロイキン 12 および/または インターロイキン 15をコードする遺伝子を含むプラスミド DNAを含む別々のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミド DNAに用いられたものと同一の手順および比を用いて調製される。
Claims (213)
- 哺乳類にリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む:
(a)カチオン性リポソーム;
(b)カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド;
(c)カチオン性リポソームに結合した1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および
(d)カチオン性リポソームに結合した1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、HIV ウイルス、SARS ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、エボラウイルス、B型肝炎ウイルスおよび天然痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである請求項 1の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、 HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項 1の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項 1の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、 鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項 1の方法。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項 1の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv 抗体フラグメントである請求項 1の方法。
- 該一本鎖 Fv 抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 7の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項 1の方法。
- 哺乳類にリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む:
(a)カチオン性リポソーム;
(b)カチオン性リポソームに化学的に結合したリガンド;
(c)カチオン性リポソームに結合した1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子; および
(d)カチオン性リポソームに結合した1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、HIV ウイルス、SARS ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、エボラウイルス、B型肝炎ウイルスおよび天然痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである請求項10の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項10の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23 からなる群から選択される請求項10の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介してボーラスとしてまたは注入として投与される請求項10の方法。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項10の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv 抗体フラグメントである請求項10の方法。
- 該一本鎖 Fv 抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 16の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項10の方法。
- 哺乳類にカチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む:
(a)カチオン性リポソーム;
(b)カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド;
(c)カチオン性リポソームに結合した1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子; および、
(d)カチオン性リポソームに結合した1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該ウイルス性疾患が、インフルエンザ、HIV、SARS、鳥インフルエンザ、エボラ、B型肝炎および天然痘からなる群から選択される請求項19の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項19の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項19の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項19の方法。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項19の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv 抗体フラグメントである請求項19の方法。
- 該一本鎖 Fv 抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 25の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項19の方法。
- 哺乳類にカチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む:
(a)カチオン性リポソーム;
(b)カチオン性リポソームに化学的に結合したリガンド;
(c)カチオン性リポソームに結合した1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
(d)カチオン性リポソームに結合した1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該ウイルス性疾患が、インフルエンザ、HIV、SARS、鳥インフルエンザ、エボラ、B型肝炎および天然痘からなる群から選択される請求項28の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項28の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項28の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項28の方法。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項28の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv 抗体フラグメントである請求項28の方法。
- 該一本鎖 Fv 抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 35の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合した K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む、請求項28の方法。
- 哺乳類に抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)-標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類の抗原提示細胞 (APC) に1以上の活性薬剤を送達する方法、ここで、抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)-標的化カチオン性免疫リポソーム複合体は、カチオン性リポソーム、TfRscFv、および1以上の活性薬剤を含み、TfRscFvはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。
- 該APCがプロフェッショナル APCである請求項37の方法。
- 該APCが非プロフェッショナル APCである請求項37の方法。
- 該活性薬剤が1以上の核酸分子を含む請求項37の方法。
- 該核酸分子が1以上のウイルスタンパク質をコードする請求項 40の方法。
- 該核酸分子が1以上のインターロイキンをコードする請求項 40の方法。
- 該核酸分子が1以上のウイルスタンパク質と1以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項 40の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項 41または請求項 43の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項 42または請求項 43の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項37の方法。
- 該APCが、肝臓、脾臓、リンパ節、腸および/または呼吸器に位置する請求項37の方法。
- カチオン性リポソーム、TfRscFv、および1以上の活性薬剤を含む抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)-標的化 カチオン性免疫リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、1以上の活性薬剤を哺乳類の抗原提示細胞(APC)に送達する方法であって、TfRscFvがカチオン性リポソームに化学的に結合している方法。
- 該APCがプロフェッショナル APCである請求項 48の方法。
- 該APCが非プロフェッショナル APCである請求項 48の方法。
- 該活性薬剤が1以上の核酸分子を含む請求項 48の方法。
- 核酸分子が1以上のウイルスタンパク質をコードする請求項 51の方法。
- 該核酸分子が1以上のインターロイキンをコードする請求項 51の方法。
- 該核酸分子が1以上のウイルスタンパク質と1以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項 51の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項 52または請求項 54の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項 53または請求項 54の方法。
- 該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項 48の方法。
- 該APCが、肝臓、脾臓、リンパ節、腸および/または呼吸器に位置する請求項 48の方法。
- 以下の方法によって調製されるリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している;および
(c)リガンド-標的化カチオン性リポソームを以下と混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項59の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項 60の方法。
- 該一本鎖 Fv 抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 61の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にてシステイン部分を含む請求項 60の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームと結合した K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項59の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項59の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて混合される請求項59の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて混合される請求項 66の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w) の範囲の比にて混合される請求項 67の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項59の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子; から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項59の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 60の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソーム が、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム)の間の重量比にて存在する請求項59の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および 該カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム)の間の重量比にて存在する請求項 72の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および 該カチオン性リポソームが約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム)の重量比にて存在する請求項 73の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項59の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項59の方法。
- 以下の方法によって調製されるリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している;および
(c)リガンド-標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項77の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項77の方法。
- 該一本鎖 Fv フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 79の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン 部分を含む請求項 78の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項77の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項77の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが、約 1:1 から約 1:100 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項77の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項84の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項85の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項77の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子;から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項77の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 88の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項77の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 90の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム)の重量比にて存在する請求項91の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項77の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項77の方法。
- 以下の方法によって調製されるリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程;および、
(c)リガンド-標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項95の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項95の方法。
- 該一本鎖 Fv フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項97の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン 部分を含む請求項96の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項95の方法。
- 該リガンドが、該化学的結合の前に該リガンド上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介して該カチオン性リポソームに化学的に結合する請求項95の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項95の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項95の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項103の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項104の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項95の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子;から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項95の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項107の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項108の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項109の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソーム が、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム) の重量比にて存在する請求項 110の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項95の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項95の方法。
- 以下の方法によって調製されるリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程;および、
(c)以下とリガンド-標的化カチオン性リポソームとを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項114の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項114の方法。
- 該一本鎖 Fv フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項114の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項 115の方法。
- 該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項114の方法。
- 該リガンドが、該化学的結合の前にリガンドの上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介してカチオン性リポソームに化学的に結合する請求項114の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項114の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項114の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 122の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 123の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項114の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子; から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項114の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 126の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項114の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 128の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソーム が、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム) の重量比にて存在する請求項 129の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項114の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項114の方法。
- 以下の工程を含む、リガンド-標的化 カチオン性免疫リポソーム複合体を調製する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している;および、
(c)リガンド-標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子;および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項133の方法。
- 該リガンドが 一本鎖 Fv フラグメントである請求項 134の方法。
- 該一本鎖 Fv フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 135の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項 134の方法。
- 該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドを混合する工程をさらに含む請求項133の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項133の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項133の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 140の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 141の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項133の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子;から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項133の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 144の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項133の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 146の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該リガンド-標的化カチオン性リポソーム が、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム) の重量比にて存在する請求項 147の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項133の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項133の方法。
- 以下の工程を含む、リガンド-標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を調製する方法:
(a)リガンドを調製する工程;
(b)リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド-標的化カチオン性リポソームを形成させる工程;および、
(c)リガンド-標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程:
1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子; および、
1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子。 - 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項151の方法。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項151の方法。
- 該一本鎖 Fv フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 153の方法。
- 該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項 152の方法。
- 該カチオン性リポソームに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドを混合する工程をさらに含む請求項151の方法。
- 該リガンドが、直接的結合の前にリガンド上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介してカチオン性リポソームに化学的に結合する請求項151の方法。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項151の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項151の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 159の方法。
- 該リガンドと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 160の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項151の方法。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子;から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項151の方法。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 163の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項151の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 165の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム)の重量比にて存在する請求項 166の方法。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項151の方法。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項151の方法。
- 請求項 129 または請求項 151の方法によって調製されるリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- カチオン性リポソーム、リガンド、1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、および1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子を含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している、リガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- カチオン性リポソーム、リガンド、1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、および1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子を含むリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している、リガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該核酸分子が該カチオン性リポソーム内にカプセル封入されている請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該核酸分子が該カチオン性リポソームの内側または外側単層に結合している請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 176のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約 1:1 から約 1:100 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約 1:10 から約 1:50 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 179のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約 1:20 から約 1:40 (w:w)の範囲の比にて存在する請求項 180のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子; から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 183のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム) の間の重量比にて存在する請求項 185のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソーム が、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム) の重量比にて存在する請求項 186のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 該複合体に結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。
- 請求項 171または請求項 172のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物。
- 1以上の抗菌薬、1以上の保存料、1以上の緩衝剤および1以上の界面活性剤からなる群から選択される1以上の賦形剤をさらに含む請求項 191の医薬組成物。
- 以下を含む医薬組成物:
カチオン性リポソーム、リガンドおよび1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子を含む第一のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第一のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体;および
カチオン性リポソーム、リガンドおよび1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子を含む第二のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第二のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。 - 以下を含む医薬組成物:
カチオン性リポソーム、リガンドおよび1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子を含む第一のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している第一のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体;および、
カチオン性リポソーム、リガンドおよび1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子を含む第二のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している第二のリガンド-標的化カチオン性リポソーム複合体。 - 該核酸分子が該カチオン性リポソーム内にカプセル封入されている請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該核酸分子が該カチオン性リポソームの内側または外側単層に結合している請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、L-37pA、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該リガンドが一本鎖 Fv フラグメントである請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該抗体フラグメントが抗-トランスフェリン受容体一本鎖 Fv (TfRscFv)である請求項 198の医薬組成物。
- 該第一および第二のカチオン性リポソームが1以上のカチオン性脂質と1以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約 1:1 から約 1:100 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約 1:10 から約 1:50 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項 201の医薬組成物。
- 該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約 1:20 から約 1:40 (w:w) の範囲の比にて存在する請求項202の医薬組成物。
- 該第一および第二のカチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウム ホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物; またはジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロマイドと ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン および/または コレステロールとの混合物を含む請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該核酸分子が、約 0.1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 10 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子;から、10 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 0.1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該核酸が、約 1 モルの1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、対、約 1 モルの1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項 205の医薬組成物。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームがそれぞれ、約 0.5:1 から約 1:40 (μg 全核酸:μg リポソーム)の間の重量比にて該第一および第二のカチオン性リポソーム中に存在する請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームがそれぞれ、約 1:5 から約 1:20 (μg 全核酸:μg リポソーム)の間の重量比にて該第一および第二のカチオン性リポソーム中に存在する請求項 207の医薬組成物。
- 該1以上のウイルスタンパク質をコードする1以上の核酸分子、該1以上のインターロイキンをコードする1以上の核酸分子、および該カチオン性リポソーム が、約 1:10 (μg 全核酸:μg リポソーム) の重量比にて存在する請求項 208の医薬組成物。
- 該1以上のウイルスタンパク質が、HIV ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、SARS ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該1以上のインターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-23からなる群から選択される請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 該複合体のそれぞれに結合したK[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (配列番号1) ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
- 1以上の抗菌薬、1以上の保存料、1以上の緩衝剤および1以上の界面活性剤からなる群から選択される1以上の賦形剤をさらに含む請求項 194または請求項 195の医薬組成物。
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