CN113181137B - 一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法，首次将circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG‑b‑PEICA混合，然后透析、超滤，得到pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物。本发明用于靶向递送circRNA至肿瘤细胞并发挥作用，可抑制肿瘤生长，且生物安全性好。

Description

一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米药物，具体涉及一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法。
背景技术
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈部最常见也是危害最严重的恶性肿瘤之一,其发病原因不甚清楚。失调的基因是癌症的主要特征，尽管癌症的形成和发展主要依赖于癌基因的激活和抑癌基因的失活，但非编码RNA的异常改变对癌症的发生也起着至关重要的作用。特别是，越来越多的证据表明，环状RNA(circRNA)是一类新出现的原发性ncRNA，在多种癌症中异常，表明了circRNA在肿瘤发生中的重要作用，circRNAs调控着不同肿瘤类型的许多细胞功能，包括耐药、肿瘤生长和转移的调节因子、肿瘤的干细胞维持和血管生成的诱导，因此circRNAs具有巨大的潜在治疗靶点或诊断生物标志物，circRNA通过多种机制发挥调控功能，包括miRNA诱饵、RNA结合蛋白(RBP)支架和蛋白质翻译模板，为理解癌症的复杂发病机制提供了新的研究方向。
尽管各种功能性的circRNAs已被报道，其调控机制也已被广泛阐明，但开发有效的给药策略以提高其体外治疗效果的研究却很少。最近，纳米技术被证明在改善circRNA的靶向递送方面具有巨大的前景。在过去几十年中，纳米技术因其对药物递送的一些吸引人的特性以及纳米材料本身独特的治疗、诊断和成像性质而为癌症研究做出了巨大的贡献。特别是，一些NP系统已经被批准用于临床癌症治疗，更多的NP系统现在处于临床试验的不同阶段。此外，NP系统已显示出极大的潜力，以改善许多类型的抗癌策略，包括各种RNA疗法。然而，由于肿瘤的复杂性和异质性，如何有效、安全、系统地将circRNA导入肿瘤细胞仍然是一个巨大的挑战。为了有效地控制药物的释放，各种刺激反应的NP系统被开发出来。由于快速生长的肿瘤血管生成不规则，导致营养物质和氧气的快速缺乏，从而转向糖酵解代谢，从而导致肿瘤微环境中酸性代谢物的积累。
发明内容
本发明公开了一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法，用于靶向递送circRNA至肿瘤细胞并发挥作用，可抑制肿瘤生长，且生物安全性好。
本发明采用如下技术方案：
一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，其制备方法包括以下步骤，将circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA混合，然后透析、超滤，得到pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物。
本发明中，circRNA为circPCMTD1。PAMAM在缓冲液中，以酒石酸二琥珀酰亚胺酯为交联剂，交联得到交联PAMAM；进一步的，酒石酸二琥珀酰亚胺酯、PAMAM的摩尔比为(8～12)∶1，优选10∶1。将乌头酸(丙烯-1,2,3-三羧酸)与PEG-b-PEI在缓冲液中反应，然后透析、干燥，得到PEG-b-PEICA；进一步的，反应为20～40℃反应20～30小时。
本发明中，PEG-b-PEICA、交联PAMAM的摩尔比为(1.2～1.8)∶1，优选1.5∶1。circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA的混合体系中，N/P为(15～25)∶1，优选20∶1。
本发明中，circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA在缓冲液中混合时间为0.1～24小时；透析为缓冲液中透析1～3天，优选2天。
本发明中，缓冲液优选为PBS缓冲液。
本发明公开了上述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用；优选的，肿瘤为口腔鳞状细胞癌。
尽管各种功能性的circRNAs已被报道，其调控机制也已被广泛阐明，但开发有效的给药策略以提高其体外治疗效果的研究却很少。由于肿瘤的复杂性和异质性，如何有效、安全、系统地将circrna导入肿瘤细胞仍然是一个巨大的挑战。在本发明中，针对口腔鳞状细胞癌(OSCC)，首次公开了pH响应性纳米颗粒介导的circPCMTD1纳米药物，用于靶向递送和高效转运circPCMTD1过表达载体，可以显著抑制OSCC的生长和转移，解决了circRNA过表达载体由于其分子量过大和碱基残基引起的负表面电位，很难被癌细胞摄取的问题，在口腔鳞癌靶向治疗中具有巨大潜力。本发明克服了现有技术问题并探索circPCMTD1在口腔鳞癌治疗中的潜在应用，开发了一种pH响应性纳米颗粒(pNP)系统，用于口腔鳞癌的体内治疗。全身给药后，携带circPCMTD1过表达载体的pNP由于通透性和滞留效应增强，可在肿瘤部位积聚更多，并对弱酸性微环境作出快速反应，进一步穿透肿瘤和细胞摄取，从而产生circPCMTD1过表达载体的有效递送，是一种有前途的治疗策略。
附图说明
图1为包裹circPCMTD1过表达载体的纳米颗粒的合成与表征。A)pH响应性纳米颗粒包裹circPCMTD1过表达载体(pNP-circPCMTD1)的示意图。B)pH7.4 PBS溶液中pNP-circPCMTD1的TEM图像。C)pNP-circPCMTD1的尺寸分布。D)pNP-circPCMTD1的Zeta电位。E)pH6.5或pH7.4时口腔鳞状细胞癌细胞中pNP和cIRPCMTD1过度表达载体的细胞内分布(红色：Cy5标记的pH响应纳米颗粒(Cy5-pNP)，绿色：GFP标记的cIRPCMTD1过度表达载体(GFP-OE-cIRPCMTD1))。F)在pH6.5、pH7.4和wt(wt：未转染pNP-circPCMTD1，红色：Cy5标记的pH响应性纳米颗粒(Cy5-pNP)，青色：Cy3标记的circPCMTD1探针(Cy3-circPCMTD1))下，观察circPCMTD1和pNP在OSCC细胞中的表达水平和细胞内分布。G)在pH6.5、pH7.4和wt(wt:未转染pNP-circPCMTD1)下检测OSCC细胞的circPCMTD1表达。条形图表示三个独立实验值的平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01。
图2为纳米颗粒的合成与表征。A)用质子核磁共振(HNMR)分析了pNP的结构。B)用DLS分析了PAMAM的粒径。C)用质子核磁共振(HNMR)分析了npNP的结构。D)采用动态光散射法对npNP-circPCMTD1的粒径进行了分析。E)npNP-circPCMTD1的Zeta电位。
图3为pH响应NP-circPCMTD1抑制OSCC致瘤性。A)SCC-15荷瘤小鼠主要器官和肿瘤细胞内注射Cy5-NP-circPCMTD1(Cy5-pNP-circPCMTD1)或Cy5非pH响应NP-circPCMTD1(Cy5-npNP-circPCMTD1)后24小时内Cy5-NP-circPCMTD1生物分布的荧光图像(n＝3)。B)检测主要器官和肿瘤细胞Cy5-pNP-circPCMTD1和Cy5-npNP-circPCMTD1的荧光强度。C)SCC-15荷瘤小鼠肿瘤接种及不同处理的示意图。D)SCC-15荷瘤小鼠经PBS全身治疗后肿瘤图像、E)肿瘤重量、F)和肿瘤体积增长曲线，circPCMTD1过表达阴性对照(OE-NC)、circPCMTD1过表达载体(OE-CIPCMTD1)、非pH响应NP-CIPCMTD1(npNP-circPCMTD1)或pH响应NP-circPCMTD1(pNP-circPCMTD1)。G)对收集的异种移植瘤，分别进行了Ki-67、AKT和磷酸化AKT(Ser473)的H&E染色和免疫组化染色。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图4为pNP-circPCMTD1抑制OSCC增殖、迁移和侵袭。A)CCK-8检测显示，pH6.5时pNP-circPCMTD1系统对SCC-15和SCC-25细胞增殖的抑制作用更强。B)菌落形成实验显示，pH6.5时pNP-circPCMTD1系统对SCC-15和SCC-25细胞增殖抑制作用更强。C)在pH6.5时，pNP-circPCMTD1系统对SCC-15和SCC-25的细胞迁移抑制作用更强。D)transwell实验显示，pH6.5时pNP-circPCMTD1系统对SCC-15和SCC-25的细胞迁移和侵袭有较强的抑制作用。
图5为pNP和npNP的安全性评价。A)不同转染试剂对HOK的细胞毒性。B)pNP和npNP对HOK的细胞毒性。C)pNP和npNP对SCC-15细胞毒性的研究。D)肿瘤图像，E)肿瘤生长曲线，F)肿瘤重量，F)经PBS、PNP治疗后SCC-15异种移植小鼠的重量。
图6为pNP-circPCMTD1和npNP-circPCMTD1的药代动力学。
图7为纳米颗粒在体内毒性，主要器官的HE染色(每组n＝5)。在心脏、肝脏、脾脏、肺或肾组织中未发现明显毒性。
图8为CircPCMTD1在体内抑制OSCC生长和转移。A)肿瘤图像，B)肿瘤生长曲线，C)用circPCMTD1过表达载体(OE-circPCMTD1)或circPCMTD1过表达抑制阴性对照(OE-NC)治疗后SCC-15异种移植瘤的肿瘤重量。D)HE和免疫组化染色显示经OE-circPCMTD1或OE-NC(每组5只)治疗后的SCC-15异种移植瘤的Ki-67、磷酸化Akt和Akt表达。E)生物发光图像、F)显微照片、G)和H&E染色显示经OE-circPCMTD1或OE-NC治疗后的Luc-SCC-15转移瘤具有肺转移能力。H)显示肺转移结节的数目。条形图表示三个独立实验值的平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01。
图9为CircPCMTD1通过靶向miR-411-5p/DUSP1轴调控PI3K/Akt信号通路抑制口腔鳞癌的生长和转移。A)肿瘤图像，B)肿瘤生长曲线，C)用circPCMTD1过表达载体(OE-circPCMTD1)、circPCMTD1过表达载体+miR-411-5p模拟物(OE-circPCMTD1+miR-411-5p模拟物)或circPCMTD1过表达抑制阴性对照物(OE-NC)治疗后的SCC-15异种移植肿瘤的肿瘤重量。D)生物发光图像、E)H&E染色、F)和肺转移结节数显示OE-circPCMTD1、OE-circPCMTD1+miR-411-5p模拟物或OE-NC治疗后Luc-SCC-15转移瘤的肺转移能力。G)westernblot检测各组肿瘤下游PI3K/Akt信号的抑制情况。条形图表示三个独立实验值的平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；**P<0.001。
具体实施方式
本发明的原料都是现有市售或者公开报道的产品。具体制备方法以及测试方法都是本领域常规方法。
细胞培养：SCC-25、SCC-9、Cal-27和SCC-15购自美国标准培养物保藏中心(ATCC)。人口腔角质形成细胞(HOK)购自中国科学院科学。Cal-27在DMEM培养基中培养，SCC-25、SCC-9和SCC-15在DMEM/F12培养基中培养。细胞用含10％胎牛血清的培养基在37℃、5％CO2下生长，并按照标准方案培养。
Circ PCMTD 1定位于Chr13:51860845-51861246，总长度402bp，由一个外显子环化形成。本发明的circRNA过表达载体的构建为常规方法，可以参考现有circPCMTD1硕士论文，比如将circPCMTD1序列连接到pLCDH-ciR载体(Geneseed Biotechnology Co.，China)上，获得circPCMTD1的环状转录本，从而构建了circPCMTD1过表达载体，其为现有技术。具体的，为了在体外通过非线性剪接产生circPCMTD1转录物，构建了circPCMTD1过表达载体：合成circPCMTD1线性序列并将其添加到pLCDH-ciR载体(中国广州基因种子生物技术有限公司)中以循环转录，前圆框包含内源性flBiotec基因组序列和EcoRI限制性内切酶位点，后圆框包含部分反向上游序列和BamHI位点；在293T细胞系中扩增了编码cDNA的cDNA。结果，扩增片段被克隆到两个阅读框之间的载体中，模拟载体被证实在两个圆形阅读框之间含有无义序列，没有circPCMTD1编码的cDNA，直接测序验证了载体构建的正确。
MiR-411-5p模拟物和MiR-411-5p抑制剂购自ribobiotechnology Co.(中国广州)，circPCMTD1-siRNAs和siRNA阴性对照均购自RiboBio。序列如下：
Oligonucleotides Sequence(5’-3’)
circPCMTD1-si1 TGGGCTTAATTTTAGGATT
circPCMTD1-si2 GGCTTAATTTTAGGATTAA
mimics-NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
miR-411-5p mimics UAGUAGACCGUAUAGCGUACG
inhibitor-NC CAGUACUUUUGUGUAGUACAA
miR-411-5p inhibitor CGUACGCUAUACGGUCUACUA
细胞在6孔板中培养至50％-60％的细胞密度，并通过lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)转染circPCMTD1过表达载体、miR-411-5p抑制剂、miR-411-5p模拟物和siRNA；具体为常规方法。
RNA提取和实时荧光定量qPCR：根据标准方案，用TRIzol试剂(美国生命技术公司)从OSCC标本和细胞样品中提取总RNA。用PrimeScript-RT试剂盒(Takara-Biotechnology，China)反转录RNA。在瑞士罗氏公司的LightCycler480系统中，使用PCRMaster Mix(TakaraBiotechnology，中国)进行实时定量PCR。以β-actin或U6为内参基因，用2-ΔΔCt法计算circPCMTD1或miR-411-5p的相对表达。引物序列如下：
Figure GDA0003129989450000061
Western blot分析：将细胞样品在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Blue LoadingBuffer Pack(Cell Signaling Technology,USA)中进行溶解。将等效蛋白样品加入浓度为10％的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，之后经聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)杂交，然后与特异性原代抗体进行孵育。抗体来源于Cell Signaling Technology，分别为：DUSP1(1:1000，#48625)、磷酸PI3K(1:1000、#4228)、PI3K(1:1000、#4257)、磷酸AKT(1:1000、#4060)、AKT(1:1000、#4691)和GAPDH(1:1000，#5174)。从Cell Signaling Technology中购买过氧化物酶结合抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(1:2000，#7074S)或抗兔IgG(1:2000，#7076S)二次抗体。用SignalFireTM ECL Reagent(Thermo Fisher Scientific,USA)inImageQuantLAS4000系统(Fujifilm,Japan)观察免疫反应带。
CCK-8分析：将3×103个细胞种植在96孔板中。将CCK-8溶液按照10％的比例混合到培养基中(混合溶液中为1:9)。将CCK-8混合液与细胞在37℃下孵育1小时，在450nm处测定吸光度。
克隆形成试验：将1×103细胞分别种植在6孔板中，培养1周。用4％甲醛固定细胞，用0.1％结晶紫染色。用显微镜(日本奥林巴斯)采集克隆点个数，并用ImageJ软件进行评分。
5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EDU)掺入分析：5×105细胞，种入6孔板内培养一天。用4％甲醛固定细胞，并用EDU试剂盒(中国核糖生物公司)进行培养。用荧光显微镜(日本奥林巴斯)观察DAPI阳性细胞(蓝色细胞)和EDU阳性细胞(红细胞)，用ImageJ软件对其进行评分。
细胞划痕分析：将5×105细胞分别放置在6孔板中，培养至融合度90％，在常规无血清培养下，用移液管尖在细胞间形成线性划痕。用显微镜(日本奥林巴斯)观察划痕愈合情况，分别在0小时和24小时采集图像后用ImageJ软件进行图像分析。
细胞Transwell实验：2在24孔板(美国科宁)上腔内放置含有或不含基质凝胶的Transwell小室(美国康宁)，将104个细胞放置在小室上腔中。培养24h后，4％多聚甲醛固定细胞，0.1％结晶紫染色。用显微镜(日本奥林巴斯)采集上腔底部细胞，并用ImageJ软件进行评分。
核/细胞质分离：细胞用PARISTM Kit(Thermo Fisher,USA)孵育，用离心法分离细胞核/细胞质组分，并在细胞裂解缓冲液中进行溶解液。2×溶解结合液与上清液和溶解液混合。混合溶液通过滤芯过滤。用qPCR法检测细胞核和细胞质RNA。
荧光原位杂交：Cy3标记的circPCMTD1探针是从genemarma(中国上海)采购的。。细胞在四氢嘧啶试剂盒(中国Genemarma)中，用circPCMTD1探针和荧光剂进行培养。所有图像均用共焦显微镜(Carl Zeiss AG,Germany)进行可视化。探针序列如下：
Figure GDA0003129989450000071
RNApulldown：室温下，将寡头探针或circPCMTD1探针(中国Genemarma)与链球菌亲和素磁珠(Millipore,USA)进行孵育。1×107细胞在4℃下裂解，并用探针包衣珠孵育一夜。根据制造商的说明，RNA由RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)纯化。
RNA免疫共沉淀法：将miR-411-5p模拟物或mimics-NC转染HEK-293T细胞48h。用溶解液(Millipore,USA)对转染细胞进行裂解。将IgG(Millipore,USA)或抗AGO2抗体(Millipore,USA)与磁珠孵育，然后在4℃下用抗体涂层的beads孵育细胞过夜，根据制造商的说明，用EZ Magna RIP试剂盒(Millipore,USA)纯化RNA。
荧光素酶报告基因实验：将2×104细胞放置于24孔板中培养24小时。用载体(WT或突变株)和miRNA模拟物转染细胞，用双荧光素酶报告法(Promega,USA)进行溶解酶和孵育，并通过肾素荧光素酶的内部控制，对其相对荧光素酶活性进行规范化。
免疫组化(IHC)、苏木紫(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色：实验按现有技术描述进行。抗体来源于Cell Signaling Technology，为：磷酸AKT(1:100，#4060)、AKT(1:300、#4691)和Ki-67(1:500，#9027)。所有的图像都是用显微镜(Nikon,Japan)进行可视化的。
pNP、npNP的安全性评价及临床应用：6孔板中，细胞培养至50％～60％细胞密度/孔，分别用5μL脂质体3000、5μL脂质体2000、10μg/ml NP处理，无试剂组作为阴性对照，共培养24h，将CCK-8溶液与培养基(1:9体积比)混合。将CCK-8混合溶液与细胞在37℃培养1小时。在450nm处测量吸光度。
pNP、npNP治疗肿瘤的效果：小鼠静脉注射1)PBS、2)npNP或3)pNP，剂量110μg每只小鼠，每3天1次，共4次，肿瘤生长至100mm3。在30天的时间内，在设定的时间点观察小鼠的肿瘤重量和体积。
circPCMTD1过表达载体、pNP的解离:在激光共聚焦培养皿中，每孔放置2×104个细胞。加入Cy5-pNP-circPCMTD1，在不同pH条件(ph7.4和6.5)下孵育24小时。DAPI染色，共聚焦显微镜观察。
pNP-circPCMTD1的体外释药性能：将2×104个细胞/孔，置于激光共聚焦培养皿中。加入Cy5-pNP-circPCMTD1，在pH7.4和pH6.5条件下培养24小时。用circPCMTD1探针和荧光原位杂交试剂盒(GenePharma，China)孵育细胞，用DAPI染色，共聚焦显微镜观察。
pNP-circPCMTD1和npNP-circPCMTD1的生物分布评价：肿瘤生长至100mm3后，给小鼠静脉注射200μL Cy5-pNP-circPCMTD1或Cy5-npNP-circPCMTD1溶液。npNP-circPCMTD1和pNP-circPCMTD1的剂量均为200μL NPs溶液(0.5mg/mL)。24小时后用IVIS Lumina III成像系统(perkineller，USA)观察小鼠。用匀浆器将这些组织匀浆到相同重量。用酶标仪检测Cy5-pNP-circPCMTD1和Cy5-npNP-circPCMTD1在各器官的荧光强度。
pNP-circPCMTD1和npNP-circPCMTD1的药代动力学：健康SD小鼠随机分为两组(n＝3)，分别静脉注射Cy5-pNP-circPCMTD1或Cy5-npNP-circPCMTD1，每只小鼠5μgcircPCMTD1过表达载体剂量。以预定的时间间隔获取眼眶静脉血(100μL)，并离心血液以获得血清。用酶标仪测定血清中Cy5-pNP-circPCMTD1或Cy5-npNP-circPCMTD1的荧光强度。
体内中NPs浓度：通过circPCMTD1过表达载体的剂量测定NPs的剂量。在本发明中，circPCMTD1过表达载体在每只小鼠中的剂量为5μg，因此计算NPs的剂量为(m(circPCMTD1过表达载体)+mPAMAM+mPEG5k-PEICA33k＝5μg+63.62μg+38.64μg)，mPAMAM＝5/350*20*14215/64＝63.62μg，mPEG5k-PEICA33k＝5/350*20*1.5*38300/426＝38.64μg)。简单地说，每次每只小鼠的NPs剂量约为110μg溶于200μL PBS(约500μg/mL)中。
动物实验：BALB/c裸鼠(3周～4周，雌性)购自中山大学实验动物中心(中国广州)。所有动物实验均经中山大学动物保护与使用委员会批准。将转染circPCMTD1过表达载体或空载体的1×107细胞皮下注射到小鼠体内(n＝5)。每周测量肿瘤重量和肿瘤体积(TV＝长×宽2×0.5)。五周后，老鼠被安乐死。取肿瘤标本进行H&E和IHC染色。将带有萤火虫荧光素酶的5×106细胞静脉注射到小鼠体内，用生物发光成像技术观察转移性肿瘤的生长，然后腹腔注射荧光素酶溶液(150mg/kg)，并用IVIS Lumina III成像系统(PerkinElmer，USA)进行评价。在抑瘤实验中，将小鼠随机分为5组(n＝5)，当肿瘤生长到100mm3时，给小鼠静脉注射1)PBS，2)circPCMTD1过表达阴性对照(OE-NC)，3)circPCMTD1过表达载体(OE-circPCMTD1)，4)npNP-circPCMTD1或5)pNP-circPCMTD1，剂量为5μg circPCMTD1每只小鼠过表达载体剂量，每三天一次，共四次。在30天的时间点观察小鼠的肿瘤重量和大小，然后处死动物，准备H&E和IHC染色。取主要器官进行H&E染色。
统计分析：实验以平均值±标准差表示至少三次。采用pss-20.0和Graphpad-Prism-5软件进行统计分析。采用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验分析不同组OSCC患者的总生存率。采用双尾学生测验和单因素方差分析对不同治疗组的侵袭、迁移、集落形成、肿瘤生长和细胞活性进行分析。进行事后测试以测试组间的差异。在所有病例中，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例
将乌头酸(aconitic acid)、PEG5k-b-PEI33k加入PBS缓冲液(pH 8)中，30℃反应24小时，然后装入透析袋(MW 1000)中，用PB缓冲液(pH 7.4,10mM)透析2天，再于-50℃干燥，得到PEG-b-PEICA，利用D2O进行1H NMR。
将PAMAM(P860783，聚酰胺-胺，树枝状聚合物，10wt％)与交联剂DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)以摩尔比1∶10加入PBS缓冲液(pH 8)中，常规搅拌2小时，然后加入circPCMTD1过表达载体、PEG-b-PEICA，其中，N/P比为20∶1，PEG-b-PEICA/PAMAM(COOH/NH2)的摩尔比为1.5:1，常规搅拌10小时，然后装入透析袋(MW1000)中，用PBS缓冲液(pH 8)透析2天，然后超滤，得到pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，称为pNP-circPCMTD1，用于以下测试与动物实验；然后以0.1mg/mL分散在PBS(pH 7.4)中，进行粒径测试，见图1B、C。
将PAMAM更换为Cy5标记的PAMAM，根据上述方法，得到Cy5标记的pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，称为Cy5-NP。
用交联PAMAM核和非pH响应性聚乙二醇嵌段聚天冬氨酸(PEG5k-b-PAsp80)壳构建非pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，称为npNP-circPCMTD1。
利用交联PAMAM与PEG-b-PEICA组装成不带RNA的pH响应性纳米颗粒(pNP)；用交联PAMAM核和非pH响应性聚乙二醇嵌段聚天冬氨酸(PEG-b-PAsp)壳构建不带RNA的非pH响应性纳米颗粒(npNP)。
Z电位测试结果见图1D。图1E为pH6.5或pH7.4时OSCC细胞中pNP和circPCMTD1过表达载体的细胞内分布(红色：Cy5标记的pH响应纳米颗粒(Cy5-pNP)，绿色：GFP标记的circPCMTD1过表达载体(GFP-OE-circPCMTD1))。图1F为在pH6.5、pH7.4和wt(wt：未转染pNP-circPCMTD1，红色：Cy5标记的pH响应性纳米颗粒(Cy5-pNP)，青色：Cy3标记的circPCMTD1探针(Cy3-circPCMTD1))时，circPCMTD1和pNP在OSCC细胞中的表达水平和细胞内分布。图1G为在pH6.5、pH7.4和wt(wt:未转染pNP-circPCMTD1)下检测OSCC细胞的circPCMTD1表达，条形图表示三个独立实验值的平均值±SD。*P<0.05；**P<0.01。
由于circPCMTD1可以通过PI3K/Akt信号通路抑制口腔鳞癌的生长和转移，因此系统性地导入circRNA过表达载体上调circPCMTD1的表达可能是一种很有希望的抑制肿瘤发生的策略。然而，RNA的传递很容易受到血清核酸酶的干扰，并且很难集中在肿瘤组织中。因此，有必要设计一种有效的载体，将circRNA过表达载体特异、稳定地传递到癌细胞中。本发明构建了一个pH响应纳米颗粒(pNP)系统，该系统由pH响应的聚乙二醇嵌段聚乙基乌头酸(PEG-b-PEICA)组成，该体系由开环反应获得(图2A)，以及一种DST交联聚酰胺(PAMAM)树状大分子，封装了circPCMTD1过表达载体(图1A)。在DLS结果中，粒径从约3nm快速增加到90nm表明交联PAMAM NP的成功构建(图2B)。在PBS溶液中充分稳定后，利用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)鉴定了载circPCMTD1过表达载体(pNP-circPCMTD1)的pNP系统的理化性质。这些结果表明，pNP可以均匀分散在PBS溶液中，具有明确的球形形状，平均粒径约为120nm(PDI＝0.306)。采用Zeta电位分析评价了pNP-circPCMTD1的pH响应特性。如图所示，pH7.4时pNP-circPCMTD1的zeta电位为-9.2±1.5mV，这表明pNP-circPCMTD1具有中性zeta电位，可使健康组织和器官中的细胞内化最小化。相反，在pH6.5条件下观察到的两小时内的快速电荷转换表明，pNP-circPCMTD1在弱酸条件下可能相对容易被癌细胞摄取。同时，用交联PAMAM核和非pH响应性聚乙二醇嵌段聚天冬氨酸(PEG-b-PAsp)壳构建非pH响应性纳米粒子(npNP)(图2C-E)。
作为对比：将上述PEG-b-PEICA/PAMAM(COOH/NH2)的摩尔比为1.5:1调整为PEG-b-PEICA/PAMAM(COOH/NH2)的摩尔比为2:1，其余不变，得到pNP-circPCMTD1在pH6.5条件下，0.5h后的zeta电位为8.1mv。或者，将PAMAM与交联剂DST的摩尔比1∶10调整为摩尔比1∶15，其余不变，得到pNP-circPCMTD1在pH6.5条件下，0.5h后的zeta电位为9.2mv。
进一步证实在酸性环境下，通过pNP-circPCMTD1传递系统，可以更有效地在细胞中传递和过表达circPCMTD1。在pH6.5和pH7.4时，评价了GFP-circPCMTD1过表达载体GFP-OE-circPCMTD1和Cy5-pNP的细胞内分布。在pH6.5条件下，用Cy5-pNP处理后，细胞质中出现明显的绿色和红色荧光。结果表明，pH7.4组细胞中存在弱绿色和红色荧光，提示在酸性环境下，pNP-circPCMTD1系统能更有效地将环PCMTD1过表达载体传递给细胞。绿色荧光在整个细胞质中分布较多，红荧光集中在细胞质部分，说明circPCMTD1过表达载体可从pNP-circPCMTD1系统中释放。荧光原位杂交检测circPCMTD1的表达水平和细胞内分布。
进一步研究了pNP-circPCMTD1体内的生物分布。将Cy5标记的pNP-circPCMTD1(Cy5-pNP-circPCMTD1)静脉注射到BALB/c裸鼠体内，观察其在SCC-15异种移植瘤中的生物分布，并于24小时后取主要器官和肿瘤进行生物分布定量。如图3A所示，与Cy5-npNP-circPCMTD1组相比，Cy5-pNP-circPCMTD1组肿瘤的荧光强度更高；进一步量化pNP-circPCMTD1和npNP-circPCMTD1在体内的生物分布，取肿瘤和重要器官匀浆，检测各组织的荧光强度。pNP-circPCMTD1组在肿瘤中显示出更高的荧光信号，并且pNP-circPCMTD1的生物分布显示NP在肿瘤中的累积比npNP-circPCMTD1高出约5倍(图3B)。通过静脉注射Cy5-pNP-circPCMTD1和Cy5-npNP-circPCMTD1进一步评估了健康小鼠(n＝3)中的药代动力学。结果显示，pNP-circPCMTD1的半衰期约为3.4±0.3小时，npNP-circPCMTD1的半衰期约为4.1±0.9小时，表明NP在血液中表现出长循环性能(图6)。接下来研究了pNP-circPCMTD1是否能在体内增强OSCC的治疗效果。将pNP-circPCMTD1以每只小鼠5μg circPCMTD1过表达载体剂量静脉注射到SCC-15异种移植瘤中，每三天一次，共四次(n＝5)(图3C)。在30天内，与用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、OE-NC、OE-circPCMTD1或npNP-circPCMTD1组治疗的小鼠相比，pNP-circPCMTD1组的肿瘤显著抑制(图3D)。如图3E-F所示，数据显示OE-circPCMTD1组的肿瘤重量和体积大约是pNP-circPCMTD1组的四倍，提示pNP-circPCMTD1组较OE-circPCMTD1组更有效地抑制肿瘤生长，H&E和免疫组化染色显示pNP-circPCMTD1组增殖能力(Ki-67)最低，磷酸化Akt(Ser473)表达最低，说明pNP-circPCMTD1系统是最有效的治疗方法抑制口腔鳞状细胞癌生长(图3G)。此外，H&E染色在肺、脾、肾、肝和心脏等主要器官中未显示明显的组织病理学异常，表明NP-invivo未引起明显毒性(图7)。总之，这些结果证实pNP-circPCMTD1系统对肿瘤具有良好的治疗作用。
为了证实pH6.5和pH7.4条件下pNP介导的circPCMTD1在体外的作用，pNP-circPCMTD1分别与SCC-25和SCC-15细胞孵育。将circPCMTD1过表达载体与SCC-25和SCC-15细胞作为阴性对照(NC-circPCMTD1)直接孵育。CCK-8分析显示，pH6.5时，pNP-circPCMTD1系统更能抑制SCC-25和SCC-15细胞的增殖(图4A)。集落形成试验显示，在pH6.5条件下，pNP-circPCMTD1形成的SCC-25和SCC-15细胞集落更小且更少(图4B)。还测量了0小时和24小时的划痕面积，发现pH6.5时pNP-circPCMTD1的划痕愈合率显著降低(图4C)。Transwell分析显示，pH6.5时pNP-circPCMTD1对SCC-25和SCC-15细胞的迁移和侵袭有更大的抑制作用(图4D)。
为了验证pNP和npNP的安全性，对pNP和npNP在体外和体内的细胞毒性进行了评价。发现，脂质体3000和脂质体2000对正常口腔细胞(人口腔角质形成细胞HOK)具有较高的细胞毒性(分别为70.97％和60.98％)；而在pH 7.4时，细胞活力在90％以上(图5A)。有趣的是，即使浓度高达500μg/ml(图5B-C)，HOK和OSCC细胞的细胞存活率在80％以上，说明pNP和npNP在细胞中毒性最小。进一步研究了pNP和npNP在体内的抗肿瘤作用，与对照组(PBS)比较，pNP和npNP治疗的小鼠的肿瘤生长不能明显抑制，说明pNP和npNP在体内的安全性良好(图5D-F)。
CircPCMTD1抑制OSCC生长和转移。为验证体内circPCMTD1对肿瘤生长和转移的作用，将转染circPCMTD1过表达载体(OE-circPCMTD1组)或circPCMTD1抑制剂载体(OE-NC组)的SCC-15细胞注入5只BALB/c裸鼠体内。与OE-NC组相比，OE-circPCMTD1组(每组5只小鼠)的肿瘤重量和体积显著降低(图8A-C)。同时，H&E和免疫组化染色显示，OE-circmtd1组Ki-67和磷酸化Akt(Ser473)表达水平降低。因此，这些结果提示上调的环PCMTD1抑制OSCC体内的肿瘤生长(图8D)。进一步建立肿瘤转移模型。与OE-NC组相比，OE-circPCMTD1组BALB/c裸鼠肺生物发光较弱。为观察BALB/c裸鼠是否有肿瘤转移，于4周后进一步解剖BALB/c裸鼠肺组织。OE-circPCMTD1组BALB/c裸鼠肺转移结节数较少(图8F)。肺的H&E染色也支持上调的环PCMTD1可以有效地减轻转移性肿瘤负担(图8G-H)。结果表明，circPCMTD1在体内抑制OSCC肿瘤的生长和转移。
为进一步评价circPCMTD1在体内的作用机制，分别在5只BALB/c裸鼠体内皮下注射稳定的circPCMTD1过表达载体，并与miR-411-5p模型进行比较。与OE-NC组相比，OE-circPCMTD1组肿瘤重量和体积明显下降。然而，在miR-411-5p-mimics转染后，肿瘤重量和体积的降低得到了一定程度的抑制(图9A-C)。OE-circPCMTD1组BALB/c裸鼠肺生物发光较弱，但OE-circPCMTD1+miR-411-5p模拟组BALB/c裸鼠肺生物发光明显增强(图9D)。H&E染色发现，上调的circPCMTD1可有效减轻转移性肿瘤负担，但miR-411-5p-mimics转染后转移瘤负担有一定程度的增加(图9E-F)。随后对肿瘤中的蛋白质进行western印迹实验，发现OE-circPCMTD1组PI3K/Akt磷酸化水平降低，而miR-411-5p-mimics转染后，它们被解救(图9G)。这些数据表明，circPCMTD1通过靶向miR-411-5p/DUSP1轴，调控PI3K/Akt信号通路，抑制OSCC肿瘤的生长和转移。
这些结果表明pNP-circPCMTD1能有效抑制口腔鳞癌的增殖、迁移和侵袭。尽管人们对OSCC调控机制进行了大量的研究，但各种功能性的circRNAs在临床上却很难被有效靶向。在此，本发明开发了有效的给药策略以提高其体内治疗效果。具体公开了一种高效的对pH值敏感的NP系统，该系统对pH值的变化有很强的反应，与口腔鳞状细胞癌微环境中pH值的细微变化匹配，从而使circPCMTD1过表达载体能够在口腔鳞状细胞癌微环境中有效地导入肿瘤细胞。由于pNP-circPCMTD1系统的高效传递，可以释放更多的circPCMTD1过表达载体，从而导致circPCMTD1在细胞质中的过表达。这些结果表明pNP-circPCMTD1系统在circPCMTD1治疗中有很大的应用潜力。与NC-circPCMTD1组相比，pNP-circPCMTD1系统在体外对口腔鳞癌的增殖、迁移和侵袭有明显的抑制作用。重要的是，pNP-circPCMTD1系统具有许多优点，包括良好的生物安全性和体内高肿瘤积累。在异种移植模型中，进一步发现该系统确实能更好地抑制口腔鳞癌的生长，并且没有显示出明显的毒性。综上所述，pNP-circPCMTD1系统在体内可增强circPCMTD1的治疗效果。
序列表
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物及其制备方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggcttaat tttaggatt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcttaattt taggattaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaguagaccg uauagcguac g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caguacuuuu guguaguaca a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cguacgcuau acggucuacu a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccacttgtc agcaccttgc 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggcttccaa tattgcactt gatt 24
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactccagc tgggtagtag accgtatag 29
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggtgtcgtg gagtcg 16
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcctcgcct ttgccgatcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acatgccgga gccgttgtcg 20
<210> 15
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cuguacuugu uccaacucaa gugcuauacu ugguagauca ga 42
<210> 16
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uccaaaaaua aauuaauccu aaaauuaagc ccaccau 37

Claims (5)

1.一种pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，其特征在于，所述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物的制备方法包括以下步骤，PAMAM在缓冲液中，以酒石酸二琥珀酰亚胺酯为交联剂，交联得到交联PAMAM；将乌头酸与PEG-b-PEI在缓冲液中反应，然后透析、干燥，得到PEG-b-PEICA；将circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA混合，然后透析、超滤，得到pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物；PEG-b-PEICA、交联PAMAM的摩尔比为（1.2～1.8）∶1；circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA的混合体系中，N/P为（15～25）∶1；circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA在缓冲液中混合时间为0.1～24小时；透析为缓冲液中透析1～3天。
2.根据权利要求1所述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，其特征在于，circRNA为circPCMTD1。
3.根据权利要求1所述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物，其特征在于，PEG-b-PEICA、交联PAMAM的摩尔比为1.5∶1；circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA的混合体系中，N/P为20∶1。
4.权利要求1所述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将circRNA过表达载体与交联PAMAM、PEG-b-PEICA混合，然后透析、超滤，得到pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物。
5.权利要求1所述pH响应性纳米颗粒介导的RNA纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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