CN107614014B - 亲和配体及其相关方法 - Google Patents

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Abstract

公开了可用于温和洗脱亲和色谱的亲和配体，包括对免疫球蛋白M、A和E有特异性的亲和配体，以及鉴定和使用这类亲和配体的方法。

Description

亲和配体及其相关方法
发明领域
本发明涉及亲和配体，如抗体亲和配体，以及使用、鉴定和制备亲和配体的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月28日提交的美国临时专利申请号62/167,387的优先权，该申请通过引用全文纳入本文。
关于通过EFS-WEB以文本文件形式提交的序列表
序列表的正式文本通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子化提交，文件名1010896_ST25.txt，2016年5月26日生成，大小103,855字节，与说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书一部分且通过引用全文纳入本文。
背景技术
亲和色谱是基于亲和配体与其靶标之间，如抗体和抗原之间的高特异性相互作用分离生物化学混合物的方法。与所需靶标选择性相互作用的亲和配体被固定在固体支持物上以产生可以柱形式使用的亲和基质。亲和色谱可用于多种应用，包括从细胞游离提取物或细胞培养上清的蛋白质纯化、核酸纯化、和从血液纯化。
发明内容
本发明提供了生成亲和配体的方法，这类亲和配体的用途，和特异性亲和配体。
在一方面，提供了特异性结合靶分子的亲和配体，其中该亲和配体与靶分子的特异性结合强度在包括(i)约4.0至约5.5的pH或(ii)约1-2M MgCl2的缓冲液条件下降低。
在一些情况中，缓冲液条件可具有约4.0至约5.0的pH。在一些情况中，缓冲液条件可具有约4.0的pH。在一些情况中，缓冲液条件可具有约5.0的pH。在一些情况中，缓冲液条件可包括2M MgCl2。在一些情况中，缓冲液条件可包括2M MgCl2和相对中性的pH。
在一些情况中，靶分子可以是免疫球蛋白。在一些情况中，靶分子可以是选自下组的免疫球蛋白：免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、或免疫球蛋白E(IgE)。
在一些情况中，亲和配体可以是免疫球蛋白。例如，在一些情况中，亲和配体可以是重组Fab片段或Fab片段衍生物。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图1A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgE抗体。在一些情况中，亲和配体可以是具有选自图1B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgE抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图2A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgA抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图2B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgA抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图3A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgM抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图3B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgM抗体。
在一些情况中，亲和配体可连接至固体支持物。在一些情况中，固体支持物可以是珠或样品板。在一些情况中，珠可以是琼脂糖珠，聚苯乙烯珠、聚甲基丙烯酸酯珠，聚丙烯酰胺珠，磁珠，或顺磁珠。
在另一个方面中，提供了分离靶分子的方法，该方法包括以下步骤：提供连接至亲和配体的固体支持物；使固体支持物与含靶分子的样品接触；用洗涤缓冲液洗涤固体支持物以去除样品的未结合组分；并用包含(i)约4.0至约5.5的pH或(ii)约1-2M MgCl2的洗脱缓冲液从固体支持物上洗脱结合的靶分子。
在一些情况中，洗脱缓冲液可包括约4.0至约5.5的pH和相对低的盐浓度。在一些情况中，洗脱缓冲液可包括1M至2M MgCl2和相对中性的pH。在一些情况中，洗脱缓冲液可包括约1M至2M MgCl2和约6.0至8.0的pH。在一些情况中，洗脱可以是用包含(i)约4.0至约5.5的pH或(ii)约1-2M MgCl2的洗脱缓冲液的单步洗脱。在一些情况中，洗脱可以是用包含(i)约4.0至约5.5的pH或(ii)约1-2M MgCl2的多个洗脱缓冲液的多步洗脱，其中多个洗脱缓冲液依次施加在固体支持物上，其中具有较高盐浓度的洗脱缓冲液在具有较低盐浓度的洗脱缓冲液之后施加并且具有较低pH的洗脱缓冲液在具有较高pH的洗脱缓冲液之后施加。在一些情况中，洗脱可以是在洗脱时间期间用具有线性增加的盐浓度梯度的洗脱缓冲液的梯度洗脱，其中最大盐浓度是约1-2M MgCl2。在一些情况中，洗脱可以是在洗脱时间期间用具有线性降低的pH梯度的洗脱缓冲液的梯度洗脱，其中最小pH是约4.0。在一些情况中，洗涤缓冲液可具有6.0-8.0的pH。在一些情况中，洗涤缓冲液可具有相对低的盐浓度。
在一些情况中，亲和配体可以是免疫球蛋白。在一些情况中，靶分子可以是免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、或免疫球蛋白E(IgE)。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图1A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgE抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图1B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgE抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图2A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgA抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图2B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgA抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图3A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgM抗体。在一些情况中，亲和配体可以是包含选自图3B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的抗IgM抗体。
在另一个方面，提供了选择亲和配体的方法，该亲和配体在中性缓冲液条件下特异性结合至靶分子并在温和洗脱条件下具有降低的对靶分子的结合强度，该方法包括以下步骤：表达天然亲和配体文库以产生多种亲和配体；提供连接至靶标的固体支持物；使固体支持物与多种亲和配体接触；用洗涤缓冲液洗涤固体支持物以去除未结合的亲和配体，其中洗涤缓冲液包含中性缓冲液条件；用包含(i)约4.0至约5.5的pH或(ii)约1-2M MgCl2的洗脱缓冲液接触固体支持物；并且在洗脱缓冲液中鉴定从固体支持物显著解离的亲和配体。
在一些情况中，亲和配体文库可能没有针对有利于在温和洗脱条件下对靶分子的降低的结合强度的特性进行预选。在一些情况中，多种亲和配体可由多个核酸序列编码。在一些情况中，多个核酸序列包括与其可操作连接的异源启动子。在一些情况中，多种亲和配体可在多个噬菌体上表达。
在一些情况中，洗脱缓冲液可具有约4.0至约5.5的pH和相对低盐浓度。在一些情况中，洗脱缓冲液可包括1M至2M MgCl2并可具有相对中性的pH。在一些情况中，洗脱缓冲液可包括约1M至2M MgCl2并可具有约6.0至8.0的pH。在一些情况中，洗涤缓冲液可具有6.0-8.0的pH。在一些情况中，洗涤缓冲液可具有相对低的盐浓度。
在一些情况中，靶标可以是免疫球蛋白。在一些情况中，靶标可以是免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、或免疫球蛋白E(IgE)。
在一些情况中，多种亲和配体可以是多种抗体或其衍生物。在一些情况中，多种亲和配体可以是多种抗体或其衍生物。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图1A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图1B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图2A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图2B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图3A所示的任何序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。在一些情况中，鉴定的亲和配体可以由包含编码选自图3B所示的任何序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列的核酸序列的多核苷酸编码。
在另一方面，提供了包含上述的亲和配体的试剂盒。
将从本申请的其他部分的综述中理解其他方法和组合物也是本发明的部分。
附图简要说明
图1A和图1B分别显示了按照一些实施例的抗IgE抗体的重链和轻链CDR序列。
图2A和图2B分别显示了按照一些实施例的抗IgA抗体的重链和轻链CDR序列。
图3A和图3B分别显示了按照一些实施例的抗IgM抗体的重链和轻链CDR序列。
图4A-4I显示了按照一些实施例的抗IgM抗体的重链和轻链序列。
图5显示了按照一个实施例测量结合和洗脱靶分子的第一组抗IgM抗体亲和配体的ELISA结果。
图6显示了按照一个实施例测量结合和洗脱靶分子的第二组抗IgM抗体亲和配体的ELISA结果。
图7显示了按照一个实施例测量结合和洗脱靶分子的第一组抗IgA抗体亲和配体的ELISA结果。
图8显示了按照一个实施例测量结合和洗脱靶分子的第二组抗IgA抗体亲和配体的ELISA结果。也显示了对照N1-CD33-6Xhis和BSA。
图9显示了按照一个实施例测量对靶分子的结合特异性的一组抗IgE抗体亲和配体的ELISA结果。
图10显示了按照一个实施例从亲和配体柱纯化的AbD18705 hIgM靶分子的洗脱概况。左边的亲和柱使用抗IgM抗体配体AbD20775.2，并且右边的亲和柱使用抗IgM抗体配体AbD20771.2。在各图的底部显示收集的分级分离部分(A#)。
图11显示了按照一个实施例纯化的AbD18705 hIgM靶分子洗脱分级分离部分的SDS-PAGE分析。左侧凝胶显示从所示的分级分离部分纯化的AbD18705 hIgM(在还原和在氧化条件下显示的各分级分离部分)。在右侧凝胶中纯化的人IgM(产品编号OBT1524)显示为对照，同样在还原和在氧化条件下。
图12显示了按照一个实施例针对在图10中鉴定的纯化的AbD18705hIGM靶分子洗脱分级分离部分的尺寸排阻色谱的重叠图。
图13显示了显示按照一个实施例评价纯化的AbD18705 hIgM靶分子(“His-GFP”)对其抗原GFP的活性和特异性的ELISA的结果的图。也显示了对照GST，N1-CD33-6Xhis和BSA。
定义
“亲和配体”或“配体”是指组合物(例如，抗体或非抗体蛋白质)，其特异性结合特定物质，如蛋白质、蛋白质复合物、或具有限定结构的有机化合物。
本文所用术语“固体支持物”指可固定试剂(如抗体或抗原)的固体惰性表面或主体，所述试剂在本文所述任何结合反应中具有反应活性。本文所用术语“固定”指分子基础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间、在任意施加的条件下都不会移开或去偶联。这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键或者任意其他共价或非共价键实现。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”是指免疫球蛋白、其复合物或片段形式。该术语可包括但不限于：源自人或其它细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外产生的抗体及其片段。“抗体”也可包括复合形式，其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也可包括非四级抗体结构(如驼科和驼科衍生物)。“抗体”也可以包括抗体片段，如Fab(片段抗原结合)、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组成，其保留抗原结合功能。另外，术语“抗体”包括免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物、和偶联物，其中分子极大保留了对它们的表位的结合亲和性。另外，例如，可通过连接至化学或肽部分或可检测标签部分来修饰“抗体”。
术语“互补决定区”或“CDR”(也称为“高变区”或“HVR”)是指决定免疫球蛋白对表位的特异性结合的免疫球蛋白高变结构域。抗体的重链和轻链的可变区各自一般含有3个CDR。具有不同特异性的抗体具有不同的CDR，而具有完全相同的特异性的抗体可能有相同的CDR。
“恒定区”是指抗体的重链和轻链中的区域，其具有与抗体的重链和轻链的N’末端可变区相比相对较低的变异性。在重链上，恒定区在相同同种型的所有抗体中一般相同，并在不同同种型的抗体中不同。有2种初始类型的轻链(κ和λ)，各自具有不同的恒定区。
“中性缓冲液”或“中性缓冲液条件”是指具有接近生理pH的缓冲液。这类缓冲液/条件允许蛋白质结合至亲和柱而不导致明显的蛋白质变性或聚集。中性缓冲液或中性缓冲液条件可允许亲和配体与靶分子之间的接近最优相互作用。中性缓冲液条件或中性缓冲液一般具有约6.0至8.0的pH。
“温和洗脱条件”或“温和洗脱缓冲液”是指缓冲液，其中特异性结合至靶分子的亲和配体与靶分子解离(如在亲和基质上)而不导致明显蛋白质变性或靶分子聚集。这与通常应用于靶分子洗脱的严苛条件相反，如低pH(例如，约pH2至3.5)。这类温和洗脱缓冲液可包括相对高pH(pH≥4.0)或相对高的盐或离子强度。
“生理pH”是指人类血液的pH，其为约7.4。pH7.0至pH7.8的范围内的pH可以被认为是接近生理pH。
出于表达亲和配体的目的，“天然表达文库”是指表达大量重组蛋白质、多肽或肽(在其结合结构域中具有特异性或结构的大多样性)的表达文库。天然文库是从先前未经过针对靶标亲和性增加的选择的合成或天然配体库中生成的文库。从编码多种亲和配体或至少多种靶标结合区域的多个核酸序列生成天然表达文库。
“相对中性pH”是指约pH6.0至8.0的pH。
“固体支持物”是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的材料或材料组。在一些实施方式中，固体支持物采用以下形式：薄膜或膜、柱、瓶、盘、纤维、编织纤维、成形聚合物、颗粒、和微颗粒，包括但不限于微球。固体支持物可形成自，例如，天然材料，如玻璃和胶原，或合成材料，如丙烯酰胺，纤维素，硝酸纤维素，硅橡胶，聚苯乙烯，聚乙烯乙酸乙烯酯，聚丙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚乙烯，聚硅酸盐，聚环氧乙烷，聚碳酸酯，特富龙，碳氟化合物，尼龙，聚酐，聚乙醇酸，聚乳酸，聚原酸酯，聚富马酸丙酯，糖胺聚糖，和聚氨基酸的惰性固体支持物。在一些情况中，一些在运载体表面上天然存在的官能团(例如，羧酸(-COOH)，游离胺(-NH2)，和巯基(-SH))可用于肽连接。在没有这类官能团是天然可得的情况中，所需的官能团，如羧酸基团，或已知是结合相互作用的伴侣的部分(如，能够结合生物素的亲和素)可连接至这类固体支持物。在一些实施方式中，固体支持物是羧化胶乳或磁性微球。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合反应，其中结合对的2个成员(例如，抗体和包含抗体的靶标表位的分子)以比膜对异质混合物(例如，杂交瘤培养上清或蛋白质的其他混合物)的其他组分的亲和性高至少10倍的亲和性互相结合。
术语“可变区”是指抗体的重链和轻链各自的N’末端区，其与抗体的重链和轻链的恒定区相比有相对较多的变异性。可变区含有CDR。
发明详述
已经发现可以鉴定亲和配体(如抗体)用于靶分子(例如免疫球蛋白M，A或E)的免疫亲和纯化，使得可以使用温和的条件来洗脱亲和配体特异性结合的靶分子，从而避免先前使用的苛刻洗脱条件。本公开的某些实施例和特征涉及鉴定对于温和洗脱免疫亲和色谱特别有用的亲和配体，例如抗体的方法。当连接到固体支持物上时，这类配体允许使用温和洗脱条件一步纯化靶分子。使用温和洗脱条件避免了在这种类型的色谱中使用的典型的苛刻洗脱条件，其可能导致靶分子变性或聚集(如低pH，例如，pH3.0)。所述的方法利用体外富集方法以允许选择可使用温和洗脱条件的亲和配体。这类配体的选择通过第一结合步骤在允许在标准/中性缓冲液条件(例如中性pH和/或低盐)下结合的条件下进行，随后是使用温和洗脱条件进行的后续洗脱步骤。所述的方法允许特异性选择和富集，并最终分离具有所需特性的亲和配体。如此，使用所述的方法可以更快速且高效地生成感兴趣的亲和配体。
本公开的某些实施例和特征涉及亲和配体，例如抗体，其显示在中性条件下特异性结合靶标，并在温和洗脱条件下释放靶标的性质。可以使用上述方法选择这些亲和配体。描述了对人免疫球蛋白M(IgM)，人免疫球蛋白A(IgA)，和人免疫球蛋白E(IgE)有特异性的亲和配体的示例。
本公开的某些实施例和特征涉及使用这类亲和配体以使用温和洗脱条件纯化靶标的方法。亲和配体可以连接到固体支持物上作为亲和纯化柱使用。例如，使用允许在温和洗脱条件下洗脱靶标的亲和配体产生的亲和柱，可以成功地纯化对苛刻洗脱条件(例如pH3.0)敏感的一些靶标。例如，这类亲和配体可用于分离IgM、IgA或IgE分子，因为当使用苛刻洗脱条件进行亲和纯化时，这些分子可能对变性敏感。一旦已经使用本公开中描述的方法分离了亲和配体，则可以相应地纯化对变性敏感的其他分子。
I.亲和配体
本文描述了亲和配体组合物，其特异性结合靶标并且可以使用温和洗脱条件从其洗脱靶标。如下面进一步描述，亲和配体可以是抗体，抗体样分子或其他亲和结合分子。为了便于描述，本公开有时将描述亲和配体在抗体亲和配体的情况下的实施例和特征。然而，本公开不限于作为抗体的亲和配体。
亲和配体可选自多种不同类型的蛋白质或非蛋白质组合物。在某些情况下，亲和配体是抗体，抗体样分子或衍生自下面II部分所述天然表达文库的任何其他亲和结合分子。例如，抗体可以是单克隆抗体，Fab片段，F(ab′)2，Fv，scFv，Fd，dAb，Fc片段，VHH或保留抗原结合功能的其它片段。在一些实施例中，亲和配体可以是具有异源恒定和可变结构域的重组抗体；例如，由重组蛋白质表达文库产生。在一些情况中，亲和配体可以是重组Fab片段。例如，Fab片段可具有一个重链的可变结构域和第一恒定结构域(Fd链)加上一个完整轻链(L链)。Fd和L链通过强非共价相互作用连接，并可以通过二硫键共价连接。编码重组Fab片段的多核苷酸序列可被亚克隆到含有异源启动子的表达载体中以驱动重组Fab片段的表达。Fab片段可以是单价的，二价的或多价的。在一些情况下，Fab片段是单价的。在一些实施例中，亲和配体是单链可变(scFv)片段或二价scFv片段(双抗体)。ScFv片段通常具有一个VH和一个VL链，其表达为通过肽接头连接的单个多肽。多肽接头稳定了VH和VL链之间的相互作用。编码重组scFv片段的多核苷酸序列可被亚克隆到含有异源启动子的表达载体中以驱动重组scFv片段的表达。在一些情况下，亲和配体可以是以与抗体或其保留抗原结合功能的片段相似的方式特异性结合靶标的重组抗体或蛋白质。亲和配体可以是含有至少三个互补决定区(CDR)的重组蛋白，所述互补决定区引起亲和配体与靶标的特异性结合；例如，三个重链CDR，并且在一些实施例中，包含六个CDR(三个重链和三个轻链)。在一些情况下，抗体可以是重链可变结构域(VHH)抗体或纳米抗体(单体可变结构域抗体)。VHH或纳米抗体可以由单一多肽编码。
在一些实施例中，亲和配体是驼科抗体或驼科纳米抗体。驼科抗体是来自骆驼和单峰骆驼(Camelus bactrianus和Camelus dromaderius)科的哺乳动物科的某些IgG抗体，包括新世界成员，例如缺乏轻链的美洲驼种(例如，美洲驼马(Lama paccos)，羊驼(Lamaglama)和小羊驼(Lama vicugna))。参见，例如，国际申请WO 94/04678。驼科抗体的小单可变结构域(VHH)可以用作被称为“驼科纳米抗体”的低分子量抗体衍生蛋白质的基础，所述“驼科纳米抗体”对靶标具有高亲和性。参见美国专利号5,759,808；也参见Stijlemans，B.等，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin，M.等，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger，M.等，2003Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等，2002Int J Cancer 89：456-62；和Lauwereys，M.等，1998EMBO J 17：3512-3520。驼科抗体和抗体片段的工程改造文库可商购获得。
在一些情况下，亲和配体可以是以与抗体类似的方式特异性结合靶标的化合物或非抗体蛋白质。这些“抗体模拟物”中的某些使用非免疫球蛋白支架作为抗体可变区的替代蛋白质框架。例如，亲和配体可以是单体，其是使用纤连蛋白III型结构域(FN3)的支架的小抗体模拟物。FN3支架以一个有效的框架发挥作用，其上可以移接特定构建功能的环。例如，亲和配体可以利用人纤连蛋白的第十个FN3单元作为支架。它很小，是单体的，没有二硫键。基于FN3的抗原结合分子可以使用本领域中描述的方法来制备。例如，参见Koide等，J.Mol.Biol.284：1141-1151，1998；Koide等，Proc.Natl Acad.Sci.USA99：1253-1258，2002；和Batori等，Protein Eng.15：1015-20，2002，以及美国专利号6,818,418和7,115,396。在另一个实施例中，亲和配体可以是单个多肽链结合分子，其含有通过肽接头连接的抗体的重链可变区和轻链可变区的抗原结合位点，并将折叠成与两个肽抗体类似的结构。参见，例如，美国专利号5,260,203。而且，亲和配体可以是含有细胞色素b562的一个或多个环的衍生序列的重组蛋白，基于对靶标的结合特异性选择所述序列。参见，例如，Ku等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(14)：6552-6556(1995)。在另一个实施例中，亲和配体可以是基于脂质运载蛋白支架的抗体模拟物，其中脂质运载蛋白的一个或多个高变环被随机化并针对与靶标的特异性结合选择。参见，例如，Beste等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(5)：1898-1903(1999)。这种抗体模拟物的一个示例是
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它是小的单链肽，通常在160和180个残基之间。另外，该亲和配体可以是使用杯芳烃的刚性非肽有机支架的合成抗体模拟物，所述杯芳烃连接有用作结合位点的多个可变肽环。参见，例如，美国专利号5,770,380。在一些实施例中，亲和配体可以是抗体样结合拟肽。参见，例如，Murali等，Cell.Mol.Biol.49(2)：209-216(2003)。而且，在一些实施例中，亲和配体可包括衍生自一个或多个A结构域的支架。例如，亲和配体可以包括多个A结构域，每个A结构域独立地与靶标的不同表位结合。这类亲和配体可以使用例如Gliemann等，Biol.Chem.379：951-964，1998；Koduri等，Biochemistry40：12801-12807，2001和Silverman等，Nat Biotechnol.23：1556-61，2005所述的方法生成。用作配体的其它示例性非抗体支架包括DARP素，粘合素(affimer)，胱氨酸结微小蛋白，亲和素(affilins)，以及肽或非蛋白质基支架如适体。
在一些情况下，亲和配体可包含亲和标签或部分。亲和标签或部分可用于纯化亲和配体或连接至固体支持物。例如，亲和配体可以包括
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肽，6x-组氨酸(6XHis)肽等中的至少一种。在一些情况下，亲和配体被化学修饰以促进配体与固体支持物的连接。
一方面，亲和配体在中性缓冲液条件下特异性结合其靶标。中性缓冲液条件可以包括接近生理pH或相对中性pH的pH，例如，约6.0、6.2、6.5、6.8、7.1、7.3、7.5、7.8、7.9、8.1的pH或者约6.0至约8.0的pH。在一些情况下，中性缓冲液条件还包含相对低的盐浓度和/或离子强度。例如，盐浓度可以是接近生理盐浓度。在一些情况下，中性缓冲液条件包括接近生理离子强度。在一些情况下，中性缓冲液条件可以用于洗涤缓冲液。在这类情况下，洗涤缓冲液可具有稍高的盐浓度或离子强度以改善严格性并减少非靶标与亲和配体的非特异性结合。在一些情况下，中性缓冲液条件不包括盐。在某些情况下，中性缓冲液条件可包括去污剂以减少非靶标与亲和配体的非特异性结合。在一些情况下，中性缓冲液条件包含缓冲剂。在一个实施例中，中性洗涤缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在另一个实施例中，中性洗涤缓冲液可以是含有约0.05-1.0％吐温-20(例如0.1％)的PBS。可考虑其他溶液和去污剂。
另一方面，在温和洗脱条件下，亲和配体与其靶标的特异性结合减少，使得亲和配体和靶标基本上彼此解离。一方面，温和洗脱条件可以包括约4.0至约5.5的pH。另一方面，温和洗脱条件可以包含约1-2M MgCl2。
在一个方面，温和洗脱条件可以包括约4.0至约5.5的pH。例如，温和洗脱条件可以包括至少约4.0但小于或等于约5.5的pH。温和洗脱条件可包括大于或等于约4.0的pH，约4.5的pH，约5.0的pH或约5.5的pH，或约4.0至约5.5的任何pH。当pH在约4.0至5.5的范围内时，洗脱缓冲液还可包含相对低的盐浓度。在一些情况下，洗脱缓冲液可含有与生理盐条件相对相似的盐条件。在一些情况下，盐浓度可以是25mM，50mM，100mM，125mM，150mM，175mM，200mM，225mM或250mM。在一个实施例中，洗脱缓冲液可以包含约150mM NaCl。在一些情况下，温和洗脱条件包括接近生理离子强度。在一些情况下，洗脱缓冲液还可包含缓冲剂。示例性缓冲剂包括柠檬酸盐、乙酸钠和磷酸钠缓冲盐水(PBS)。在一个实施例中，洗脱缓冲液可含有100mM柠檬酸盐缓冲液。在另一个实施例中，洗脱缓冲液可含有100mM乙酸钠。在另一个实施例中，洗脱缓冲液可含有1X PBS。在一个实施例中，洗脱缓冲液可含有150mM NaCl和100mM柠檬酸盐缓冲液。
另一方面，温和洗脱条件可以包括约1M至2M MgCl2的盐浓度。例如，盐浓度可以是约0.8M，约1M，约1.2M，约1.4M，约1.6M，约1.8M，约2M或约2.2M。在一个实施例中，温和洗脱条件包括2M MgCl2。在一些情况下，温和洗脱条件还可包括相对中性pH，或接近生理pH，或约6.8至约7.9的pH，或约6.0至约8.0的pH，或具有这些范围的任何pH。例如，当温和洗脱条件包括约1M至2M的MgCl2的盐浓度时，pH可以是约6.0，约6.2，约6.4，约6.6，约6.8，约7.0，约7.2，约7.4，约7.6，约7.8或约8.0。在一些情况下，洗脱缓冲液还可包含缓冲剂。示例性缓冲剂包括柠檬酸盐、乙酸钠和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。缓冲剂可具有足够的浓度以提供pH缓冲。在一个实施例中，洗脱缓冲液可含有100mM柠檬酸盐。在另一个实施例中，洗脱缓冲液可含有100mM乙酸钠。在另一个实施例中，洗脱缓冲液可含有1X PBS。
可以理解的是，在温和洗脱条件包括在约4.0至5.5范围内的pH的情况下，中性缓冲液条件通常具有约中性pH或接近生理pH的较高pH。还应理解的是，在温和洗脱条件包含约1M至2M MgCl2的情况下，中性缓冲液条件通常具有较低盐浓度或离子强度。
一个方面，亲和配体特异性结合靶分子的靶表位。靶表位可以是靶分子的一部分，例如蛋白质，核酸或其他生物分子。例如，靶标可以是对苛刻缓冲液条件(包括低pH(例如pH3.0))敏感的蛋白质或其它分子。在一些情况下，靶标可能在苛刻缓冲液条件下变性，解离成单个的亚基，或与辅因子解离。在一些实施例中，靶分子可以是免疫球蛋白(抗体)，例如免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白A(IgA)，或免疫球蛋白E(IgE)。在一些情况下，亲和配体可以是特异性结合IgG，IgM，IgA或IgE的Fab片段。
例如，亲和配体可以是分别与具有图1A和图1B中所示的任何重链和轻链CDR序列的IgE特异性结合的Fab片段。在一些情况下，IgE特异性抗体可以包含如图1A或图1B所示的CDR1，CDR2和CDR3序列的组合。在一些实施例中，这样的亲和配体抗体将在温和洗脱条件下，例如在等于或大于约4.0且小于或等于约5.5的pH下具有降低的对IgE的结合，使得IgE从亲和试剂洗脱。例如，如实施例2中所述，某些抗IgE抗体在包含pH 4.0和pH 5.0的洗脱条件下基本上从其靶标解离。在一些情况下，洗脱缓冲液条件还包括相对低的盐，如150mMNaCl，和缓冲剂，如柠檬酸盐。也可考虑其他合适的盐和缓冲剂。
又例如，亲和配体可以是分别与具有图2A和图2B中所示的任何重链和轻链CDR序列的IgA特异性结合的Fab片段。在一些情况下，IgA特异性抗体可以包含如图2A或图2B所示的CDR1，CDR2和CDR3序列的组合。在一些实施例中，这样的亲和配体抗体将在温和洗脱条件下，例如在等于或大于约4.0且小于或等于约5.5的pH下具有降低的对IgA的结合，使得IgE从亲和试剂洗脱。例如，如实施例2中所述，某些抗IgA抗体在包含pH 4.0和pH 5.0的洗脱条件下基本上从其靶标解离。在一些情况下，洗脱缓冲液条件还包括相对低的盐，如150mMNaCl，和缓冲剂，如柠檬酸盐。也可考虑其他合适的盐和缓冲剂。
又例如，亲和配体可以是分别与具有图3A和图3B中所示的任何重链和轻链CDR序列的IgM特异性结合的Fab片段。在一些实施例中，亲和配体可具有图4A-4I中所示的至少一条重链序列和至少一条轻链序列。在一些情况下，亲和配体可具有至少一个重链和轻链序列对，如图4A-4I所示。在一些情况下，IgM特异性抗体可以包含如图3A或图3B所示的CDR1，CDR2和CDR3序列的组合。在一些实施例中，这样的亲和配体抗体将在温和洗脱条件下，例如在等于或大于约4.0且小于或等于约5.5的pH下具有降低的对IgM的结合，使得IgM从亲和试剂洗脱。例如，如实施例2中所述，某些抗IgM抗体在包含pH 4.0和pH 5.0的洗脱条件下基本上从其靶标解离。在一些情况下，洗脱缓冲液条件还包括相对低的盐，如150mM NaCl，和缓冲剂，如柠檬酸盐。也可考虑其他合适的盐和缓冲剂。
在某些实施例中，除了在一个或两个氨基酸位置处的氨基酸序列改变之外，该亲和配体可具有与本公开中鉴定的CDR序列类似的CDR序列。在一些情况下，序列中的变异是保守的氨基酸变化。
虽然本公开描述了对免疫球蛋白靶标有特异性的亲和配体的具体实施例和特征，但也可考虑对其他类型配体有特异性的亲和配体。
II.选择方法
所述的选择方法允许快速高效地鉴定亲和配体，特别是抗体，用于使用温和洗脱条件的亲和色谱方法。在一些实施方式中，提供并处理多种潜在亲和配体，使得选择的配体在中性缓冲液条件下特异性结合靶标，并在温和洗脱条件下显示与靶标的弱特异性结合强度。
多种方法是已知的并且可以用于表达多种亲和配体。具体而言，天然表达文库可用于表达大量重组蛋白，多肽和肽，包括例如，抗体，其结合域具有大的结构或特异性的多样性。天然文库是从先前未经过针对靶标的增加的亲和性的选择的合成或天然配体库中生成的文库。在一些情况下，从编码多种亲和配体或至少多种靶标结合区域的多个核酸序列生成天然文库。在一些情况下，编码所述多种亲和配体的靶标结合区的核酸序列可以具有随机化序列以在具有随机化氨基酸序列的多种亲和配体中产生结合区。在一些情况下，表达文库表达具有具有共同氨基酸序列的结构域和具有可变序列的结合域的蛋白质或多肽，使得该文库表达的蛋白质或多肽可显示基于序列变异性的大量不同结合结构域。因此，文库表达的不同蛋白质或多肽可能在不同条件下对不同靶标具有不同的结合特异性。在一些实施例中，表达文库表达数十万，数百万或数十亿种不同的蛋白质或多肽，其中的每一种可具有不同的结合亲和性，并因此可在不同条件下以不同的特异性程度结合不同靶标。可用于表达用于该方法中的多种亲和配体的表达文库包括噬菌体展示文库，酵母展示文库，核糖体展示，mRNA展示或其他选择系统，或任何其他能够表达多种亲和配体的重组表达文库，所述亲和配体具有一定范围的结合特异性。可用的亲和配体表达文库的示例是HuCAL
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平台(AbD Serotec，生物辐射(Bio-Rad))，其提供了Fab形式的抗体的噬菌体展示文库，其代表CDR序列可变性的广泛阵列(＞1010个成员)(Prassler，J.等，(2011).“HuCALPLATINUM，针对序列多态性优化的合成Fab文库和在哺乳动物表达系统中的优异表现(HuCAL PLATINUM，a synthetic Fab library optimized for sequence diversity andsuperior performance in mammalian expression systems)”J.Mol.Biol.413(1)：261-278)。在一些情况下，文库表达的多种亲和配体的变异性有助于鉴定在中性缓冲液条件下以特异性结合亲和性结合靶标，并且在I部分中所述的温和洗脱条件下具有显著降低的特异性结合的配体。
为了实施该方法，感兴趣的靶标被连接或吸附到固体支持物上。靶标可以是如上所述的蛋白质，核酸或其他生物分子。固体支持物可以是测定容器的壁或底板，或插入到测定容器中的浸染条或其它器具，或放置在测定容器内或悬浮在测定容器中的颗粒(例如，磁珠)。在许多实施方式中可使用颗粒(尤其是珠)，包括微观尺寸(微粒)和由聚合物材料形成的珠。
为了防止亲和配体的非特异性结合，可以用封闭缓冲液封闭靶标连接的固体支持物。例如，封闭缓冲液可含有动物蛋白质封闭剂(如牛奶或牛血清白蛋白)，非动物蛋白封闭剂(例如ChemiBLOCKERTM)或去污剂(例如吐温
Figure BDA0001483905050000151
)。在一些情况下，封闭缓冲液可含有密切相关的抗原。例如，在靶标是具有κ轻链的IgM抗体的情况下，封闭缓冲液可含有具有κ轻链的不同同种型(例如，IgG)的抗体作为封闭剂。包含该封闭剂可以帮助避免富集与κ轻链或与IgM和IgG中类似的重链表位特异性结合的亲和配体。具体地，在靶蛋白是免疫球蛋白并且多种亲和配体是抗体的情况下，靶标连接的固体支持物可以用一种或多种类型的抗体轻链作为封闭剂来封闭。例如，在配体是人IgM或人IgA的情况下，如实施例1和2中所述，可用人IgG1λ或IgG1κ将靶标连接的固体支持物封闭。在一些情况下，封闭缓冲液可含有培养基(例如，维持产生免疫球蛋白如IgE、IgA或IgM的真核细胞培养物生长的培养基)。用培养基封闭可用于避免富集与培养基中的组分有交叉反应性的亲和配体。在一些情况下，这可能是有用的，因为靶蛋白在培养基中生长的细胞中表达。例如，如实施例1和2中所述，在配体是人IgE的情况下，可以用培养基封闭靶标连接的固体支持物。
如果文库中的任何配体对靶标具有亲和力，则表达的亲和配体可以在中性缓冲液条件下与靶标连接的固体支持物接触以实现亲和配体的结合。为了去除非特异性或弱结合的亲和配体，可以使用如上文I部分中所述的中性缓冲液条件进行洗涤步骤。
然后可以使用上文I部分所述的温和洗脱条件进行洗脱步骤。在这样的温和洗脱条件下，可以充分降低一些亲和配体与其靶标的结合，使得亲和配体和靶标在这些条件下基本上彼此解离。在一个方面，温和洗脱条件可以包括约4.0至约5.5的pH。另一方面，温和洗脱条件可以包含约1-2M MgCl2。
所述的方法允许对在中性缓冲液条件下特异性结合靶标，并且在温和洗脱条件下具有显著降低的与靶标的特异性结合的亲和配体进行特异性选择和富集。可以评估各种洗脱条件以确定特定亲和配体-靶标组合的最佳洗脱条件。可以使用对照洗脱条件，特别是苛刻洗脱条件(例如pH 3.0)进行比较，以评估在各种测试的洗脱条件下获得的洗脱程度。
可以进行对使用该方法鉴定的亲和配体的额外评估。例如，一旦使用上述方法鉴定了感兴趣的亲和配体，则可以克隆编码感兴趣的亲和配体的核苷酸序列用于更大规模生产(例如，体外真核或细菌表达)。然后可以进一步筛选克隆的感兴趣亲和配体以确认特异性，例如，通过评估对其他靶标的结合亲和性。
III.亲和色谱方法
鉴定的在中性缓冲液条件下与靶特异性结合并且在温和洗脱条件下与靶标的结合显著减少的亲和配体可用于亲和色谱。例如，这类亲和配体可用于对样品或表达培养物中靶标的亲和纯化。靶标可以是蛋白质，核酸或其他生物分子。亲和配体对于对苛刻缓冲液条件(包括低pH(例如pH 3.0))敏感的靶标的亲和色谱特别有用。例如，使用本文所述的亲和配体的亲和色谱可用于纯化或评估在苛刻缓冲液条件下变性、解离成单个亚基的靶标或从辅因子解离的靶标。本文所述亲和色谱的示例性靶标是免疫球蛋白。由于IgM和IgA对低pH条件相对敏感，特异性结合IgM或IgA的亲和配体特别适用于免疫色谱纯化IgM和IgA。
可以表达并纯化用于亲和色谱的亲和配体。这些步骤可以用使用编码这些配体或其结合结构域的核酸序列的常规亚克隆和表达技术(例如，细菌表达)进行。在一些情况下，编码亲和配体的多核苷酸可以用可用于纯化亲和配体(例如，
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肽，6X-组氨酸肽中的至少一个)的亲和标签或部分进行亚克隆。亲和配体通常在用于产生亲和色谱基质之前以基本纯化的形式制备。
为了使用亲和配体进行亲和色谱，可将亲和配体结合到固体支持物上以产生亲和色谱基质。亲和配体与固体支持物结合或连接。在一些实施例中，亲和配体通过离子相互作用结合到固体支持物上。在一些情况下，亲和配体通过化学键或交联与固体支持物连接。可考虑任何固体支持物与亲和配体连接。可以使用各种商购基质来产生具有与其结合的亲和配体的亲和基质。示例性的基质包括NHS活化的琼脂糖基质或Ni-NTA琼脂糖。可以基于纯化的亲和配体的特性，靶标的特性或亲和色谱之后靶标的预期用途来选择固体支持物。固体支持物可以是，例如，多孔的或无孔的，并且可以是，例如，基质，珠，颗粒，碎片或其他构造的形式，例如，膜或整体件(例如，材料的板，单块，或丸粒)。固体支持物可以是测定容器的壁或底板，或插入到测定容器中的浸染条或其它器具，或放置在测定容器内或悬浮在测定容器中的颗粒。在许多实施方式中可使用颗粒(尤其是珠)，包括微观尺寸(微粒)和由聚合物材料形成的珠。用作微粒的聚合物是相对于生物样品的组分和固定在微粒表面的亲和配体以外的试验试剂具有化学惰性的那些。合适的聚合物的示例是聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。许多聚合物中可使用交联来赋予微粒结构完整性和刚性。微粒的尺寸范围可以变化。在一些实施方式中，微粒的直径范围是约0.3微米至约120微米，在另一些实施方式中为约0.5微米至约40微米，在又一些实施方式中为约2微米至约10微米。
亲和色谱可以在包含感兴趣靶标的大范围的样品上进行。在一些情况下，样品是从对象(包括人类，灵长类动物，非灵长类哺乳动物，鸟类，爬行动物和两栖动物)获得的。例如，样品可以是体液。样品也可以是培养的细菌或其它表达感兴趣靶标的细胞或组织，细胞培养上清液或来自细菌或真核细胞的裂解物。另外，可使用本文所述的亲和配体在亲和色谱之前对样品进行一个或多个纯化步骤以富集靶标。
将样品施加到固体支持物上以使靶标被亲和配体结合。结合的条件可以是中性的或生理的。为了去除非特异性或弱结合的非靶标化合物，可以使用如上文I部分中所述的中性缓冲液条件进行洗涤步骤。
为了洗脱与亲和配体-固体支持物结合的靶标，使用如上文I部分中所述的温和洗脱条件进行洗脱步骤。在温和洗脱条件下，亲和配体与其靶标的结合减少，使得亲和配体和靶标在这些条件下基本上彼此解离。在一个方面，温和洗脱条件可以包括约4.0至约5.5的pH。另一方面，温和洗脱条件可以包含约1-2M MgCl2。在一些情况下，洗脱可以作为单步洗脱来进行，使得结合到亲和配体-固体支持物上的靶标通过将其直接暴露于温和洗脱条件而被洗脱。在一些情况下，洗脱可以多步洗脱来进行，使得结合到亲和配体-固体支持物上的靶标通过将其依次暴露于具有增加的盐浓度或降低的pH的多个温和洗脱条件而被洗脱。在一些情况下，可以使用pH或盐梯度进行洗脱，使得与亲和配体-固体支持物结合的靶标通过将其暴露于线性增加的盐浓度或降低的pH的梯度的动态洗脱条件来洗脱。
洗脱的靶标可用于多种应用。例如，在靶标是抗体(免疫球蛋白，如IgM，IgA或IgE)的情况下，洗脱的免疫球蛋白靶标可以用作，例如，治疗分子，或作为诊断或实验室试剂。在一些情况下，可以对洗脱的靶标进行额外步骤以将其制备用于后续使用(例如，后续色谱步骤，过滤如超滤或渗滤，透析，标记等)。
IV.试剂盒
还可考虑含有在中性缓冲液条件下与靶特异性结合并且在温和的洗脱条件下洗脱靶标的亲和配体的试剂盒。试剂盒可以包含一种或多种类型的亲和配体。试剂盒中的亲和配体可能对同一靶标或不同靶标具有特异性。如果多个亲和配体对同一靶标具有特异性，则它们可能对靶标的不同表位具有特异性。在一些情况下，亲和配体被标记(例如，用肽标签或用于位点特异性偶联于基质的化学部分)。试剂盒可包含与固体支持物结合的亲和配体。在一些实施例中，将亲和配体结合的固体支持物填充到色谱柱中。有时，分开提供色谱柱，并在使用之前将亲和配体结合的固体支持物填充到色谱柱中。在一些情况下，试剂盒分开提供亲和配体和固体支持物以及将亲和配体与固体支持物偶联的说明书。该试剂盒还可包含平衡缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液或这些缓冲液的一些组合。在一些情况下，提供超过一种洗涤缓冲液或洗脱缓冲液。可以提供多种洗脱缓冲液，每种洗脱缓冲液具有不同的洗脱条件(如pH，盐类型或盐浓度)。例如，可以为试剂盒中包含的不同亲和配体提供不同的洗脱缓冲液。
在本公开中引用的示例性缓冲液可包括，例如，柠檬酸盐，MES或Bis-Tris等等。
包括所示实施方式的某些实施方式的前述描述仅出于说明和描述的目的而呈现，并且不旨在穷尽或将本公开限制到所公开的精确形式。在不脱离本公开的范围的情况下，对本领域技术人员来说，许多修改、改变和使用将是显而易见的。本说明书各单独实施方式的内容中描述的某些特征也可以组合起来在单个实施方式中实现。相反，在单一实施方式的内容中描述的各种特征也可以在多个方式中独立地或者以任何适当次级组合的形式实现。此外，虽然上述特征被描述成以某些组合的形式起作用，但所要求权利的组合中的一种或多种特征在一些情况下可以从该组合中去除，该组合可以针对次级组合或者次级组合的变化。因此，已描述了特定实施方式。其他实施方式落在本公开的范围内。
实施例提供以下实施例以说明而非限制所要求的发明。
在下面描述的实施例中，使用包含
Figure BDA0001483905050000191
选择技术的HuCAL
Figure BDA0001483905050000192
文库产生抗体(Rothe，C.等，2008.“人类组合抗体文库HuCAL GOLD根据天然免疫系统用新展示方法组合所有六个CDR的多样化用于高效选择高亲和性抗体(The humancombinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all sixCDRs according to the natural immune system with a novel display method forefficient selection of high-affinity antibodies)”，J Mol Biol 376(4)：1182-1200)。目的是产生在中性pH下结合，但是可以在温和条件下(例如pH 4至pH 5)从抗原洗脱的针对人IgM，IgA和IgE的Fab抗体。使用温和条件下的洗脱对抗原进行选择产生了14种针对IgM的抗体，40种针对IgA的抗体，和17种针对IgE的抗体。进行测定以鉴定用作亲和色谱试剂的具有所需性质的抗体。
实施例1
该实施例提供了在进行实施例2中所述的实验中使用的材料和方法的描述。
下表1列出了抗原和密切相关的抗原(CRA)。
表1.抗原和CAR
抗原/CRA 参考 来源
hIgM Ag05450 人IgM，人血浆(AbD Serotec 5275-5504)
hIgA Ag5451 人IgA，人初乳(AbD Serotec 5111-5504)
hIgM Ag04815 人IgM，人血清(西格玛I8260)
hIgA Ag4813 人IgA，人初乳(西格玛I2636)
hIgE Ag05681 具有λ轻链的人IgE，AbD00264
hIgE Ag05682 具有κ轻链的人IgE，(AbD Serotec，HCA190)
hIgE Ag05711 人IgE，骨髓瘤(AbD Serotec PHP142)
hIgG1λ Ag05029 人IgG1λ，人骨髓瘤浆(西格玛I5029)
hIgG1λ Ag05419 人IgG1λ，人骨髓瘤浆(西格玛I5029)
hIgG1κ Ag05153 人IgG1κ，人骨髓瘤浆(西格玛I5154)
使用标准方案，通过用表1中所述的抗原反复三轮淘选，从HuCAL
Figure BDA0001483905050000201
人抗体基因文库分离重组抗体。(Knappik等，J.Mol.Biol.2000，296：57-86；Prassler等，J.Mol.Biol.2011，413：261-278；Krebs等，J.Immunol.Methods 2001，254：67-84；Jarutat等，Biol.Chem.2006，387：995-1003)。
对于淘选274.17-274.22(见表2)，将抗原被动吸附到微量滴定板(F96MaxisorpTMNunc-Immuno Plate#442404)上，用于如下所述的“固相淘选”。
对于淘选274.4-274.9和289.12-14，将抗原偶联到Dynal M-450环氧珠(Invitrogen 140-11)上。将抗原偶联的珠子在室温下孵育过夜，通过加入Tris，pH7.4进行封闭，随后重新悬浮于PBS中。
将噬菌体抗体文库与含有表1和表2列出的CRA的封闭缓冲液孵育。然后将封闭的文库与抗原偶联的珠孵育，并洗去非特异性或封闭的抗体。通过与作为对照选择的pH 3洗脱缓冲液(150mM NaCl，100mM柠檬酸盐缓冲液pH3)，与pH 4洗脱缓冲液(150mM NaCl，100mM柠檬酸盐缓冲液pH 4)，或与pH 5的洗脱缓冲液(150mM NaCl，100mM柠檬酸盐缓冲液或150mM NaCl，100mM乙酸钠缓冲液)的pH洗脱条件，或与高盐洗脱缓冲液(含2M MgCl2的PBS溶液)一起孵育，如表2所示洗脱特异性抗体噬菌体。在大肠杆菌感染之前，用1M Tris中和pH洗脱条件缓冲液。含有噬菌粒的细菌在37℃下过夜生长，产生新的抗体展示噬菌体用于下一轮淘选。
在3轮淘选后，分离富集的Fab基因集并将其插入导致功能性周期表达单价Fab片段的大肠杆菌表达载体pMx11-FH中。(Rauchenberger等，J.Biol.Chem.2003，278：38194-38205)。每个Fab在重链的C端包含串联的FLAG标签和6XHis标签。
然后用连接的表达载体转化大肠杆菌TG1F(耗尽F菌毛的TGI；Rauchenberger等，2003)。转化后，随机挑取368个单独的菌落进行每次淘选，并在微量滴定板上生长，然后在-80℃下用15％的甘油储存。这些主平板被复制，所得的子板用于表达抗体。在22℃下用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导抗体表达过夜后，化学裂解培养物，并用固定的抗原和密切相关的抗原在酶联免疫吸附测定(ELISA)中检测特异性结合固定的抗原的抗体片段的存在。另外测试了与来自不同来源(西格玛(Sigma))的IgM或IgA的结合。这些抗原也被用来确定在与不同的洗脱缓冲液孵育20分钟后哪种抗体可以从ELISA板上洗去。抗体VH和VL互补决定区(CDR)的序列通过选择在ELISA中对抗原产生强信号(至少比背景信号，来自AbD Serotec和西格玛的抗原高5倍)以及在洗脱缓冲液处理后CRA上和抗原上信号弱或无信号(低于背景信号5倍以上)的克隆来确定。选择含有具有独特序列的抗体的克隆用于抗体生产。
表2.淘选，封闭和筛选抗原
Figure BDA0001483905050000221
Figure BDA0001483905050000231
Figure BDA0001483905050000241
Figure BDA0001483905050000251
ELISA筛选方案如下表3所示。
表3.ELISA筛选方案
Figure BDA0001483905050000252
Figure BDA0001483905050000261
含有选择的抗体基因的大肠杆菌TG1F-培养物(250mL)在30℃下生长直到OD600nm达到0.5，并通过加入IPTG至终浓度1mM诱导抗体表达。在30℃下进一步孵育至少14小时后，收集细胞，化学裂解，并将可溶性粗提取物进行一步亲和色谱(Ni-NTA琼脂糖，Qiagen1018240)。从柱中洗脱纯化的抗体后，将缓冲液从洗脱缓冲液变为pH7.4的3x PBS，通过UV280nm测量测定浓度。随后通过考马斯染色的SDS-PAGE和ELISA分别测试纯度和活性。
下表4列出了使用纯化HuCAL抗体的质量控制ELISA(间接ELISA)方案。
表4.QC ELISA方案
Figure BDA0001483905050000262
Figure BDA0001483905050000271
实施例2
在该实施例中描述了实施例1中所述方法的结果。
初步ELISA筛选
在对几种抗原和密切相关的抗原(CRA)的初步筛选中测试淘选的结果。抗原作用定义是否预期阳性(+)信号(淘选抗原的阳性对照)或是否不需要信号(-)(阴性对照；CRA)。
如果信号高于背景5倍，则在抗原平板(阳性对照)上的ELISA信号被认为是命中。背景是平板上未经抗原或抗体处理的许多孔的平均值。
对CRA(阴性对照)上的信号进行计数，并且在分析期间，如果信号至少高于背景2倍，则将其从正命中(positive hit)中减去。
如果一个克隆在所有抗原(阳性对照)上都是阳性的，而在所有的CRA(阴性对照)上都是阴性的，则该克隆被认为是命中。
表5中的值表示根据上述定义的命中数。分析栏显示在测试洗脱条件下不再与抗原结合的命中数。
表5.初步筛选ELISA结果
Figure BDA0001483905050000272
Figure BDA0001483905050000281
Figure BDA0001483905050000291
*命中数量太高，因此该结果被认为是伪差，其不用于挑选用于进一步表征的克隆。
独特抗体的测序和鉴定
对于IgE项目，对20个克隆(289.12∶1，289.13∶9，289.14∶10)进行测序并产生17种不同的抗体(AbD22512，AbD22628-22643)。图1A和图1B显示了这些抗体的重链和轻链CDR1，CDR2和CDR3区序列。
对于IgA项目，共选择45个克隆(274.7∶18，274.9∶3，274.20∶15，274.22∶9)进行进一步分析。对编码VH和VL的基因区的测序揭示了40种不同的抗体(AbD20776-20791，AbD20797-20799，AbD20801-20812，AbD20813-20821)。图2A和图2B显示了这些抗体的重链和轻链CDR1，CDR2和CDR3区序列。
对于IgM项目，共选择50个克隆(274.6∶15，274.8∶20，274.19∶15)用于进一步分析。对编码VH和VL的基因区的测序揭示了14种不同的抗体(AbD20768-20775，AbD20792-20796，AbD20800)。图3A，3B显示了这些抗体的重链和轻链CDR1，CDR2和CDR3区序列；在图4A-4I中显示了这些抗体中的某些的全重链和轻链序列。
表达抗体，通过亲和色谱纯化并使用ELISA测试。结果显示在图5-9和表6-8中并在下面进一步描述。
对于显示的每个克隆，测试了多个抗原和条件。条表示以特定的荧光除以背景荧光绘制的信号强度。克隆的名称是“clone-name.batch-number”。例如，AbD20768.1是第一批AbD20768。
图5：BSA和N1-CD33-6XHis是不相关的抗原。hIgG1κ-对照和hIgG1λ对照是CRA(分别具有κ和λ轻链的人IgG1同种型)。hIgM是来自AbD Serotec的人IgM(5275-5504)。H-IgM(西格玛)是来自西格玛公司的人IgM(I8260)。具有“pH4洗涤”的抗原指示用洗脱缓冲液(pH4)对相应孔连续5分钟孵育3次之后该抗原上的残留信号。
图6：BSA和N1-CD33-His6是不相关的抗原。hIgG1κ-对照和hIgG1λ对照是CRA(分别具有κ和λ轻链的人IgG1同种型)。hIgM是来自AbD Serotec的人IgM(5275-5504)。H-IgM(西格玛)是来自西格玛的人IgM(I8260)。具有“2M MgCl2洗涤”的抗原指示用洗脱缓冲液(含2MMgCl2的PBS)对相应孔连续5分钟孵育3次之后该抗原上的残留信号。
图7：BSA和GST是不相关的抗原。hIgG1κ-对照和hIgG1λ对照是CRA(分别具有κ和λ轻链的人IgG1同种型)。hIgA是来自AbD Serotec的人IgA(5111-5504)。HIgA(西格玛)是来自西格玛公司的人IgA(I2636)。具有“pH4洗涤”的抗原指示用洗脱缓冲液(pH 4)对相应孔连续5分钟孵育3次之后该抗原上的残留信号。在初步筛选中最初为阳性的多个抗体在这里表现为阴性(AbD20801至AbD20812)。
图8：BSA和N1-CD33-His6是不相关的抗原。hIgG1κ-对照和hIgG1λ对照是CRA(分别具有κ和λ轻链的人IgG1同种型)。hIgA是来自AbD Serotec的人IgA(5111-5504)。HIgA(西格玛)是来自西格玛的人IgA(I2636)。具有“2M MgCl2洗涤”的抗原指示用洗脱缓冲液(含2MMgCl2的PBS)对相应孔连续5分钟孵育3次之后该抗原上的残留信号。在初步筛选中最初为阳性的多个抗体在这里表现为阴性(AbD20814-AbD20821)。
图9：BSA和GST是不相关的抗原。hIgG1κ-对照和hIgG1λ对照是CRA(分别具有κ和λ轻链的人IgG1同种型)。hIgG4κ是具有κ轻链的人IgG4(西格玛I4639)。hIgM是来自AbDSerotec的人IgM(5275-5504)。AbD00264_hIgG1f是来源于HuCAL并格式为IgG1同种型的人抗体。AbD00264_hIgE是格式为IgE同种型的相同抗体。AbD18705_hIgE是格式为IgE同种型的另一种HuCAL衍生的抗体。hIgE是来自骨髓瘤的人IgE(AbD Serotec PHP142)。
表6：特异性抗hIgM抗体的概述
Figure BDA0001483905050000301
Figure BDA0001483905050000311
表7：特异性抗hIgA抗体的概述
Figure BDA0001483905050000312
Figure BDA0001483905050000321
表8：特异性抗hIgE抗体的概述
Figure BDA0001483905050000322
Figure BDA0001483905050000331
实施例3
使用如实施例2中所述分离的所选抗体Fab片段作为亲和配体以纯化免疫球蛋白靶标。选择两种抗IgM抗体Fab片段作为代表性亲和配体：AbD20771和AbD20775。亲和配体在大肠杆菌中以重链上具有FLAG-His6标签的单体表达。使用Ni-NTA琼脂糖纯化配体。
选择4个hIgM分子作为示例性靶分子来评估配体的纯化能力。这些配体示于表9中。在培养表9中所示的细胞系期间收集含有这些配体的上清液。使用从骨髓瘤血清纯化的IgM蛋白OBT1524 hIgM(AbD Serotec，生物辐射)作为标准对照。
表9.用于纯化的IgM靶分子
Figure BDA0001483905050000332
根据制造商的方案(GE医疗#17-0716-01)将纯化的亲和配体偶联到1ml“HiTrapNHS-活化的HP”柱上，将7mg配体施加到柱上。柱在
Figure BDA0001483905050000333
FPLC仪器上运行。使用PBS(pH约7.0-7.2)作为结合和洗涤缓冲液，以0.4ml/分钟(62cm/小时；停留时间2.4分钟)的流速上样上清液样品(200ml)。洗脱缓冲液是100mM柠檬酸盐，150mM NaCl，pH4.0。洗脱后，使用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0)中和纯化的IgM靶标的pH。
显示靶分子AbD18705 IgM的示例性结果。其他两个靶分子的结果是相似的。洗脱曲线(UV 280nm)显示在图10中(指出收集的分级分离部分)。从细胞培养物上清液中捕获AbD18705IgM靶分子，并使用亲和配体AbD20771和AbD20775在温和条件(pH 4.0)下洗脱。
为了评估纯化的靶分子的纯度和完整性，纯化的蛋白质分级分离部分(AbD20775柱的A3/4/5和AbD20771柱的A10/11/12，如图10中鉴定的；1μg蛋白质/泳道)在4-20％Mini-PROTEANTM无污染TGX凝胶(生物辐射)上运行。对于每个分级分离部分，分别显示了示例性还原和非还原泳道，如图11所示。与纯化的OBT1524 IgM标准对照蛋白进行比较(图11，右图)。在还原条件下，分级分离部分中AbD18705 IgM靶分子的纯度高，并且可以同时检测到重链和轻链。在非还原条件下，可检测到组装的IgM。
还使用Superose 6 SEC柱(GE医疗)进行尺寸排阻色谱(SEC)以评估纯化的靶分子的完整性。图12显示了图10中鉴定的分级分离部分A4/5/10/11/12的SEC运行(UV280nm信号)的叠加。峰停留体积为10.8ml，对应于916kDa的MW(对于未经糖基化的五聚体形式的AbD18705的IgM计算的MW为859kDa。所有分级分离部分显示相同的洗脱表现，表明分级分离部分中存在组装的未聚集的IgM。没有观察到降解或聚集。
最后，进行对各种分级分离部分的ELISA分析以评估纯化的AbD18705hIgM靶分子的活性和特异性。以5μg/ml将阴性对照抗原(BSA，N1-CD33-6XHis，GST)与作为AbD18705的抗原的特异性抗原His-GFP一起包被在ELISA板上。在洗涤，封闭和额外洗涤后，加入纯化的IgM AbD18705的六个分级分离部分A3/4/5和A10/11/12(此处编号为1至6)(各20μl)。使用抗人IgM HRP偶联物(AbD Serotec)与QuantabluTM底物组合进行检测。如图13所示，纯化的AbD18705 hIgM抗体分级分离部分全部特异性识别His-GFP抗原，并因此具有天然活性构象。
出于所有目的，本公开中所讨论的所有专利，专利出版物，专利申请，期刊文章，书籍，技术参考文献等以全文引用的方式并入本文中。
应该理解的是，本发明的附图和说明已经被简化以说明与清楚理解本发明有关的元件。应该理解的是，附图仅用于说明的目的，而不是作为结构图。省略的细节和修改或替代实施方式在本领域的普通技术人员所熟知的范围内。
可以理解的是，在本发明的某些方面，可以用多个部件替换单个部件，并且可以用单个部件替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一个或多个功能。除了所述替换不可操作以实践本发明的某些实施方式之外，所述替换被认为在本发明的范围内。
这里给出的实施例旨在说明本发明的潜在的和具体的实现。可以理解的是，这些实施例主要是为了对本领域技术人员说明本发明的目的。在不脱离本发明的精神的情况下，本文所述的这些图或操作可以有变化。例如，在某些情况下，方法步骤或操作可以以不同的顺序进行或执行，或者可以添加，删除或修改操作。
上述或在附图中描绘的部件的不同布置以及未显示或描述的部件和步骤是可能的。类似地，一些特征和子组合是有用的，并且可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用。已经为了说明而非限制的目的描述了本发明的实施方式，并且替代实施方式对于本专利的读者将变得显而易见。因此，本发明不限于上述或者附图所示的实施方式，并且在不偏离以下的权利要求范围的情况下能够进行各种实施方式以及修改。
序列表
<110> 生物辐射实验室股份有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.）
A·纳皮克（Knappik, Achim）
S·帕琴（Paschen, Stefan）
<120> 亲和配体及其相关方法
<130> 1010896
<150> US 62/167,387
<151> 2015-05-28
<160> 288
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Asp Ile His
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 3
Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 6
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<213> 人工序列
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Gly Asp Ser Val Ser Arg Asn Ser Ala Ala Trp Asn
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile His
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Thr
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Gly Gly Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Ile His
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Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Ile Ser
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Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met His
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<213> 人工序列
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Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Gly Met Ser
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Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met Ser
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Ile His
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Trp Met Gly Thr Ile Phe Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Ser Phe Gln Gly
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<212> PRT
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Trp Met Gly Trp Ile Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
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Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asp Tyr Ala Gln
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Lys Phe Gln Gly
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Trp Met Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro
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Ser Phe Gln Gly
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Trp Leu Gly Arg Ile Gln Tyr Arg Ser Lys Trp Ile Asn Asp Tyr Ala
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Val Ser Val Lys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成亲和配体肽序列
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Trp Met Gly Gly Ile Gly Pro Ile Phe Gly Val Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
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Trp Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Trp Met Gly Gly Ile Ala Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 27
Trp Met Gly Gly Ile Glu Pro Val Phe Gly Thr Ala Lys Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 28
Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 29
Trp Met Gly Gly Ile Ser Pro Asp Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 30
Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Gln Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Val Lys Gly
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 31
Trp Val Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 32
Trp Val Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 33
Trp Met Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 34
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 34
Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser His Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Val Lys Gly
20
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 35
Met Gly Tyr Tyr Thr Ala Gly Gln Ala His Ala Tyr Asp Phe
1 5 10
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 36
Asp Met Gly Thr Ser Tyr Leu Pro Ser Asn Trp Ser Tyr Pro Phe Ala
1 5 10 15
Tyr
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 37
Ser Arg Ala Ser Tyr Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 38
Ser Gln Arg Gly Gly Ala Ser Val Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 39
Gly Arg Gly Tyr Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 40
Asp Ser Tyr Thr Ser Thr Gly Gly Met Asp Ile
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 41
Asp His Ser Tyr Tyr Pro Val Phe Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 42
Ser Glu Tyr Ala Ile Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 43
Ser Arg Thr Leu Val Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 44
Met Gly Tyr Tyr Pro Pro Ala Gly Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 45
Val Arg Gly Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Asp Val
1 5 10
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 46
Ser Ile Lys Thr Tyr Tyr Val Tyr Gln Ala Phe Asp His
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 47
Thr Arg Arg Gly Thr Trp Tyr Arg Tyr Ala Arg Ser Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 48
Tyr Ala Tyr Ala Ala Gly Thr Ile Phe Asp Val
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 49
Tyr Ala Tyr Ala Ala Gly Thr Ile Phe Asp Val
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 50
Glu Met Gly Tyr Tyr Gln Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 51
Glu Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 52
Ser Gly Asp Lys Ile Gly Lys Lys Tyr Ala Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 53
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Phe Ala Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 54
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1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 55
Ser Gly Asp Ala Leu Gly Thr Gln Phe Ala His
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 56
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Thr Met Phe Ala His
1 5 10
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 57
Ser Gly Asp Ser Leu Val Lys Lys His Ala Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 58
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val His
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 59
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 60
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Phe Lys Phe Ala His
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 61
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Thr Gln Phe Val Gln
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 62
Ser Gly Asp Ala Ile Gly Asp Lys Phe Val His
1 5 10
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 63
Ser Gly Asp Ala Leu Gly Thr Lys Tyr Val His
1 5 10
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 64
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 65
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn Thr Val Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 66
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn Thr Val Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 67
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 68
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Lys Phe Val His
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 69
Leu Val Ile Tyr Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 70
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 71
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 72
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 73
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 74
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asp Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 75
Pro Val Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 76
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 77
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 78
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn His Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 79
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 80
Leu Val Ile Ser Asp Asp Asn Glu Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 81
Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Thr Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 82
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ile Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 83
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ile Gln His Pro Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 84
Leu Leu Ile Ser Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 85
Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Asn His Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 86
Tyr Val Thr Asp Gly Tyr Phe Thr Thr Gly
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 87
Tyr Ser Arg Ala Gln Ser Gly Ser Pro Val
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 88
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Ser Leu Arg
1 5 10
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 89
Gln Ser Ala Asp Trp Met Asp Tyr
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 90
Ala Ser Tyr Ala Ser Ser Leu Asn Pro Val
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 91
Ala Ser Tyr Asp Gly Trp Gly Asn Glu Arg
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 92
Gln Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Asp Phe Asn
1 5 10
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 93
Gln Gln Gly Ile Ser Trp Leu Arg
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 94
Ser Ser Tyr Asp Tyr Ser Ser Val
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 95
Ala Ser Arg Asp Lys Ser Ala Asn Ser Val
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 96
Gln Ser Tyr Asp Phe Gly Gly Asn Gly Ile
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 97
Gln Ser Tyr Asp Phe Ser Ala Ser Ser Val
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 98
Gln Ser Arg Ala His Gly Gly Asn Ser Ile
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 99
Ala Ala Tyr Asp Ala Ile Phe Asn Lys Ile
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 100
Ala Ala Tyr Asp Ala Ile Phe Asn Lys Ile
1 5 10
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 101
Gln Gln Asn Leu Ser Gly Pro Phe
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 102
Ala Ser Trp Asp Ile Glu Ser Val
1 5
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 103
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Ile Ser
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 104
Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 105
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 106
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Ile Ser
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 107
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Asn Thr Ile Ser
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 108
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 109
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 110
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 111
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 112
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 113
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 114
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 115
Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 116
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Leu His
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 117
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Asn
1 5 10
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 118
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 119
Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 120
Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Val His
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 121
Gly Gly Thr Phe Ser Asp Asn Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 122
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 123
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 123
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Ser Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 124
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 124
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Arg Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 125
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 125
Trp Met Gly Gly Ile Tyr Pro Phe Val Gly Thr Ala His Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 126
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 126
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 127
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 127
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 128
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 128
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Lys Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 129
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 129
Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 130
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 130
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 131
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 131
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Lys Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 132
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 132
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro His Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 133
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 133
Trp Met Gly Gly Ile His Pro Ala Phe Gly Thr Ala Thr Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 134
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 134
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 135
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 135
Trp Met Gly Gly Ile Tyr Pro Ile Phe Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 136
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 136
Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Val Lys Gly
20
<210> 137
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 137
Trp Met Gly Gly Ile Ala Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 138
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 138
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro His Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 139
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 139
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 140
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 140
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Asn Phe Gly Thr Ala His Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 141
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 141
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro His Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 142
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 142
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Thr Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 143
Asp Ser Ser Ser Ile Glu Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 144
Gly His Arg Tyr Thr Asp Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 145
Asp Arg Ser Ile Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 146
His Gly Val Ser Glu Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 147
Glu Val Asp Ser Ser Tyr Pro Glu Asp Tyr
1 5 10
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 148
Asp Ile Arg Ile Ser Thr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 149
Asn Ser Phe Tyr Ser Glu Trp Phe Asp Val
1 5 10
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 150
Val Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Gly His Tyr Glu Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 151
Asp Ile Arg Ile Ser Thr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 152
His Ser Tyr Ser Thr Gly Leu Tyr Met Gly Ser Asp Tyr Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 153
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 153
His Ala Gly Tyr Gly Ala Ser Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Asn
1 5 10
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 154
Asp Val Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Phe His Tyr His Ala Tyr Trp
1 5 10 15
Phe Asp Val
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 155
Asp Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 156
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 156
Ser Lys Gly Arg Gly Leu Tyr Gln Asn Ile Gln Asp Tyr
1 5 10
<210> 157
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 157
Gly His Tyr Ile Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Val
1 5 10
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 158
Asp Ile Arg Ile Ser Thr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 159
Asp Phe Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 160
Asp Glu Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His
1 5 10
<210> 161
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 161
Glu Pro Ile Val Asn Ser Ser Pro Met Ala Val
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 162
Gln Glu Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 163
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 164
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 164
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn His Leu Asn
1 5 10
<210> 165
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 165
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr Val His
1 5 10
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 166
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 167
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Met Leu Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 168
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 169
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 169
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 170
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 170
Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser Tyr Leu Val
1 5 10
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 171
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Leu Ser Phe Leu Thr
1 5 10
<210> 172
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 172
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Arg Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 173
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 174
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Lys Lys Tyr Val His
1 5 10
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 175
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 176
Ser Gly Asp Lys Ile Gly Asp Lys Tyr Ala Asp
1 5 10
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 177
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Ser Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 178
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 179
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 180
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 181
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 182
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 182
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 183
Leu Leu Ile Ser Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 184
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 185
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 185
Val Leu Ile Tyr Arg Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 186
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 187
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 187
Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 188
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 189
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 190
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5 10
<210> 191
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 191
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 192
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 192
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 193
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 193
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 194
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 194
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Glu Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 195
Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Thr Gln Gln Ser
1 5 10
<210> 196
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 196
Leu Val Ile Tyr Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 197
Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 198
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 199
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 199
Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 200
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 200
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 201
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 201
Leu Leu Ile His Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 202
Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 203
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 203
Gln Gln Ala Tyr Thr Arg Ser Phe
1 5
<210> 204
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 204
Gln Gln Glu Tyr Ser Ser Pro Ile
1 5
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 205
Gln Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Arg Arg Trp
1 5 10
<210> 206
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 206
Gln Gln Tyr Tyr His Phe Pro Ile
1 5
<210> 207
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 207
Gln Gln Arg Ser His Trp Ser Asn
1 5
<210> 208
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 208
His Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
<210> 209
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 209
Gln Gln Tyr Tyr Ser Trp Pro Ile
1 5
<210> 210
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 210
Gln Gln Ala Asp Gln Tyr Pro Met
1 5
<210> 211
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 211
His Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 212
Gln Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Val
1 5
<210> 213
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 213
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Ala
1 5
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 214
Gln Val Ala Thr Tyr Leu Asn Arg
1 5
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 215
Gln Gln Ala Tyr Ser Asn Pro His
1 5
<210> 216
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 216
Ala Ser Tyr Asp Trp His Met Ile His Tyr
1 5 10
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 217
Gln Val Trp Thr Arg Thr Gln Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 218
His Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
<210> 219
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 219
Met Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr
1 5
<210> 220
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 220
Gln Gln Met Tyr Asp Lys Pro Phe
1 5
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 221
Gln Gln Ser Leu Gln Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 222
Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Pro Phe
1 5
<210> 223
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 223
Gly Asp Ser Val Ser Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 224
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 224
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 225
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 225
Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 226
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 226
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 227
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 227
Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 228
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 228
Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Thr Ile Ser
1 5 10
<210> 229
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 229
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 230
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 230
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 231
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 231
Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
1 5 10 15
Val Ser Val Lys Ser
20
<210> 232
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 232
Trp Val Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 233
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 233
Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 234
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 234
Trp Val Ser Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 235
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 235
Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Arg Ser Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 236
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 236
Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Ser Phe Gln Gly
20
<210> 237
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 237
Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Met Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Val Lys Gly
20
<210> 238
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 238
Trp Val Gly Phe Ile Lys Ser Lys Thr His Gly Gly Thr Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Pro Val Lys Gly
20
<210> 239
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 239
Glu Ser Pro Ala Asp Val Ser Gly Ile Asn Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 240
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 240
Arg Ser Arg Tyr Pro Tyr Val Tyr Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 241
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 241
Ser Leu Tyr Trp Arg Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 242
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 242
Ala Pro Tyr Pro Gly Ser Val Ser Arg Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 243
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 243
Asp Val Ser Gly Val Thr Gly Tyr Arg Lys Ala Arg Asp Tyr
1 5 10
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 244
Ser Ser Val Val Gly Phe Asp Val
1 5
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 245
Ser Leu Thr Ser Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 246
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 246
Asn Arg Gly His Phe Asp Tyr
1 5
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 247
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser His Leu Ala
1 5 10
<210> 248
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 248
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 249
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 249
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn His Leu Asn
1 5 10
<210> 250
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 250
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Tyr Val His
1 5 10
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 251
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Arg Leu Lys
1 5 10
<210> 252
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 252
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 253
Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asp Lys Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 254
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 254
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Tyr Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 255
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 255
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 256
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 256
Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 257
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 257
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 258
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 259
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 259
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 260
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 260
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 261
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 261
Leu Val Ile Tyr Ser Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 262
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 263
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 263
Gln Gln Ser Asp Glu Ser Ile
1 5
<210> 264
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 264
Ser Ala Tyr Thr Gly Leu Ser Ser Ser Pro
1 5 10
<210> 265
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 265
Gln Gln Ser Leu His Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 266
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 266
Gly Ala Arg Asp Phe Gln Leu Ser Ser Trp
1 5 10
<210> 267
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 267
Gln Gln Gln Asp Gln Thr Pro Tyr
1 5
<210> 268
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 268
Gln Gln His Leu Ser Trp Pro Glu
1 5
<210> 269
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 269
Tyr Ala Trp Ala Arg Arg His Thr Gly Ala
1 5 10
<210> 270
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 270
Tyr Ser Trp Asp His Met Leu Asn Gly Tyr
1 5 10
<210> 271
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 271
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Tyr Pro Gly Ser Val Ser Arg Tyr Gly Ala Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His
225 230 235 240
His His His His His
245
<210> 272
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 272
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Arg Asp Phe Gln
85 90 95
Leu Ser Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala
210 215
<210> 273
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 273
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Lys Ser Lys Thr His Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Gly His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Thr Lys Ser Glu Phe Asp Tyr
210 215 220
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His His His His His
225 230 235
<210> 274
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 274
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Trp Asp His Met Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala
210 215
<210> 275
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 275
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Met Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Asp
210 215 220
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His His His His His
225 230 235 240
<210> 276
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 276
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asp Lys Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ser Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ala Trp Ala Arg Arg His Thr Gly
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Ala
210
<210> 277
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 277
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Arg Ser Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Ser Gly Val Thr Gly Tyr Arg Lys Ala Arg Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 278
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 278
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Arg
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Asp Gln Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210
<210> 279
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 279
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Leu Tyr Trp Arg Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe
210 215 220
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His His His His
225 230 235 240
His
<210> 280
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 280
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu His Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210
<210> 281
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 281
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Asp Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Pro Ala Asp Val Ser Gly Ile Asn Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro
225 230 235 240
His His His His His His
245
<210> 282
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 282
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Glu Ser Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Ala
210
<210> 283
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 283
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asp Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Pro Val Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Asp
210 215 220
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His His His His His
225 230 235 240
<210> 284
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 284
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Leu Gly
85 90 95
Arg Lys Tyr Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala
210 215
<210> 285
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 285
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Tyr Gly Gly Tyr Ser His Val Tyr Ser Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 286
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 286
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Arg Arg Lys Ile Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Thr Leu Gly Pro Arg Ile
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Ala
210
<210> 287
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 287
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Val Val Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Asp Tyr Lys
210 215 220
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Pro His His His His His His
225 230 235
<210> 288
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成亲和配体肽序列
<400> 288
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Leu Ser Trp Pro Glu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210

Claims (8)

1.一种特异性结合靶分子的亲和配体，其中所述亲和配体与靶分子的特异性结合强度在包括4.0的pH的缓冲液条件下降低，其中所述亲和配体是抗IgM抗体，其包含：
以下的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列和轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3序列：
分别为SEQ ID NO:226，SEQ ID NO:234，SEQ ID NO:242，SEQ ID NO:250，SEQ ID NO:258，和SEQ ID NO:266。
2.如权利要求1所述的亲和配体，其特征在于，所述亲和配体是重组Fab片段。
3.如权利要求1所述的亲和配体，其特征在于，所述亲和配体连接固体支持物。
4.如权利要求3所述的亲和配体，其特征在于，所述固体支持物是珠或样品板。
5.如权利要求4所述的亲和配体，其特征在于，所述珠是琼脂糖珠，聚苯乙烯珠、聚甲基丙烯酸酯珠，聚丙烯酰胺珠，或磁珠。
6.如权利要求4所述的亲和配体，其特征在于，所述珠是顺磁珠。
7.一种分离靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供与权利要求1-6中任一项所述的亲和配体连接的固体支持物；
b)使所述固体支持物与含所述靶分子的样品接触；
c)用洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物以去除样品的未结合组分；并且
d)用包括4.0的pH的洗脱缓冲液从所述固体支持物上洗脱结合的靶分子。
8.一种包含权利要求1所述的亲和配体的试剂盒。
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