JPH1045798A - ペプチドの新規な合成方法 - Google Patents
ペプチドの新規な合成方法Info
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- JPH1045798A JPH1045798A JP20377196A JP20377196A JPH1045798A JP H1045798 A JPH1045798 A JP H1045798A JP 20377196 A JP20377196 A JP 20377196A JP 20377196 A JP20377196 A JP 20377196A JP H1045798 A JPH1045798 A JP H1045798A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ペプチド同士を直接結合させるこ
とにより新規なペプチドをブロック単位で合成する方法
を提供することを課題とする。 【解決手段】 シアノシステイン残基を有するペプチド
鎖「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」にアミノ末端がフ
リーな別のペプチド鎖「NH2-R3」を作用させ、ペプチド
鎖内のアミノ基にペプチド結合上のカルボニル炭素を求
核攻撃させることにより、ペプチド間の結合反応を生じ
させ、「R1-CO-NH-R3」の配列を持つペプチド鎖を合成
した。
とにより新規なペプチドをブロック単位で合成する方法
を提供することを課題とする。 【解決手段】 シアノシステイン残基を有するペプチド
鎖「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」にアミノ末端がフ
リーな別のペプチド鎖「NH2-R3」を作用させ、ペプチド
鎖内のアミノ基にペプチド結合上のカルボニル炭素を求
核攻撃させることにより、ペプチド間の結合反応を生じ
させ、「R1-CO-NH-R3」の配列を持つペプチド鎖を合成
した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペプチド工学の分
野、特に、ペプチドの合成の分野に属する。
野、特に、ペプチドの合成の分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】近年のペプチド工学の進歩に伴い、これ
までに開発された純粋化学合成技術を駆使して最小活性
単位ペプチドの迅速スクリーニング等により機能単位の
部分ペプチドを明らかにする手法が開発されている。例
えば、ランダムペプチドライブラリーと称される膨大な
多様性を持つペプチドの一群を構築して、この中から有
用な機能を有するペプチドを見つけだすことが行われる
ようになった(K.Janda,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91, 1
0779-10785(1994))。
までに開発された純粋化学合成技術を駆使して最小活性
単位ペプチドの迅速スクリーニング等により機能単位の
部分ペプチドを明らかにする手法が開発されている。例
えば、ランダムペプチドライブラリーと称される膨大な
多様性を持つペプチドの一群を構築して、この中から有
用な機能を有するペプチドを見つけだすことが行われる
ようになった(K.Janda,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91, 1
0779-10785(1994))。
【０００３】しかしながら、それらの機能単位のペプチ
ドを組み合わせて、さらに高度の機能のペプチドの合成
を試みる場合において、従来の手法を用いる場合、次の
ような問題点があった。即ち、従来の化学合成法では、
その材料として保護アミノ酸を用いる必要があり、一
旦、化学合成し、脱保護精製して得られたペプチドは、
もはや化学合成の材料として用いることはできなかっ
た。このため、機能単位のペプチドを組み合わせて、さ
らに高度の機能のペプチドを合成しようとする場合は、
もはや保護基をもたないペプチドは化学合成の材料とし
て利用できないという欠点があった。精製して得られた
ペプチドを原料として、従来の化学合成で行われている
ような保護を行うことなく、ペプチド同士を結合できれ
ば、ペプチド工学の分野において画期的な技術となる。
このため、ペプチドの末端どうしを結合させる技術の開
発が試みられるようになった。例えば、Tamら（C.F.Li
u, C.Rao, J.P.Tam, J.American Chemical Society, 11
8, 307(1996)）は、一般に化学反応の進みにくいペプチ
ド間の反応を、まずアルデヒドとシステイン間にチオエ
ステル結合中間体を形成させ（キャプチャー反応（Capt
ure反応））、その後近接効果に基づいたアリルリアレ
ンジメント反応（Aryl rearrangement反応）によりアミ
ド結合生成に導いている。しかしながら、この方法によ
り生成される結合部位は天然のペプチド結合と異なり、
５員環の環状構造を持つことに難点がある。また同様な
方法がいくつか開発されているが、いずれも結合により
生じた構造はいわゆるペプチド結合、「-CO-NH-」、と
は全く異なった構造となっている。さらに、その反応も
複雑である（三原久和、化学、５１巻６号、３９６ペー
ジ）。このように、現在まで、ペプチド同士を組み合わ
せて、新規なペプチドを合成する効果的な方法は皆無に
等しい。
ドを組み合わせて、さらに高度の機能のペプチドの合成
を試みる場合において、従来の手法を用いる場合、次の
ような問題点があった。即ち、従来の化学合成法では、
その材料として保護アミノ酸を用いる必要があり、一
旦、化学合成し、脱保護精製して得られたペプチドは、
もはや化学合成の材料として用いることはできなかっ
た。このため、機能単位のペプチドを組み合わせて、さ
らに高度の機能のペプチドを合成しようとする場合は、
もはや保護基をもたないペプチドは化学合成の材料とし
て利用できないという欠点があった。精製して得られた
ペプチドを原料として、従来の化学合成で行われている
ような保護を行うことなく、ペプチド同士を結合できれ
ば、ペプチド工学の分野において画期的な技術となる。
このため、ペプチドの末端どうしを結合させる技術の開
発が試みられるようになった。例えば、Tamら（C.F.Li
u, C.Rao, J.P.Tam, J.American Chemical Society, 11
8, 307(1996)）は、一般に化学反応の進みにくいペプチ
ド間の反応を、まずアルデヒドとシステイン間にチオエ
ステル結合中間体を形成させ（キャプチャー反応（Capt
ure反応））、その後近接効果に基づいたアリルリアレ
ンジメント反応（Aryl rearrangement反応）によりアミ
ド結合生成に導いている。しかしながら、この方法によ
り生成される結合部位は天然のペプチド結合と異なり、
５員環の環状構造を持つことに難点がある。また同様な
方法がいくつか開発されているが、いずれも結合により
生じた構造はいわゆるペプチド結合、「-CO-NH-」、と
は全く異なった構造となっている。さらに、その反応も
複雑である（三原久和、化学、５１巻６号、３９６ペー
ジ）。このように、現在まで、ペプチド同士を組み合わ
せて、新規なペプチドを合成する効果的な方法は皆無に
等しい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ペプチド同
士を直接結合し、新規なペプチドをブロック単位で合成
することを可能にする方法を提供することを課題とす
る。
士を直接結合し、新規なペプチドをブロック単位で合成
することを可能にする方法を提供することを課題とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、タンパク
質中のシステイン残基のスルフヒドリル基を化学修飾す
ることによりシアノシステイン残基に転換し、シアノシ
ステイン残基を介したペプチド鎖切断の反応のメカニズ
ムを検討し、図１に示される反応が関与することを明ら
かにした。
質中のシステイン残基のスルフヒドリル基を化学修飾す
ることによりシアノシステイン残基に転換し、シアノシ
ステイン残基を介したペプチド鎖切断の反応のメカニズ
ムを検討し、図１に示される反応が関与することを明ら
かにした。
【０００６】図１中、反応１は、ヤコブソン（Jacobso
n）ら（G.R.Jacobson, M.H.Schaffer, G.R.Stark, T.C.
Vanaman, J.Biological Chemistry, 248, 6583-6591(19
73)に記載）により報告された反応で、水酸基がシアノ
システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸に由来す
るカルボニル炭素を求核的に攻撃することにより起こる
ペプチド鎖の切断反応であり、反応２は、水酸基が酸・
塩基触媒として働くことにより、チオシアノ基が脱離す
るβ脱離反応で、シアノシステイン残基がデヒドロアラ
ニンに転換する反応である（Y.Degani, A.Patchornik,
Biochemistry, 13, 1-11(1974)に記載）。反応３は、発
明者らが、リジン−シアノシステインの配列を有するペ
プチドを開裂させた時に得られた切断生成物を詳細に解
析した結果見出した反応である。この反応３において
は、カルボキシ末端がラクタムを含む７員環構造となる
ことから、反応３はリジンのεアミノ基がカルボニル炭
素を求核的に攻撃した結果起こったものと考えられる。
本発明者等は、分子間でも、一級アミンがシアノシステ
イン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸に由来するカル
ボニル炭素を求核的に攻撃することができるはずである
と考えた（図４）。即ち、本発明者等は、反応４によっ
てどのような一級アミン誘導体でも、シアノシステイン
残基の前までの配列に結合させることができ、且つ、生
じる結合は、「-CO-NH-」、即ちペプチド結合であると
いう着想を得た。そして、本発明者等は、図１の反応４
が実際起こることを証明し、この機構に基づき２つのペ
プチド鎖を容易に結合させることができることを示し、
本発明を完成した。具体的には、図２の反応４に示され
るように、シアノシステイン残基を有するペプチド鎖
「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」にアミノ末端がフリ
ーな別のペプチド鎖「NH2-R3」を作用させ、ペプチド鎖
内のアミノ基にペプチド結合上のカルボニル炭素を求核
攻撃させることにより、ペプチド間の結合反応を生じさ
せ、「R1-CO-NH-R3」の配列を持つペプチド鎖を合成で
きること示し、本発明を完成した。
n）ら（G.R.Jacobson, M.H.Schaffer, G.R.Stark, T.C.
Vanaman, J.Biological Chemistry, 248, 6583-6591(19
73)に記載）により報告された反応で、水酸基がシアノ
システイン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸に由来す
るカルボニル炭素を求核的に攻撃することにより起こる
ペプチド鎖の切断反応であり、反応２は、水酸基が酸・
塩基触媒として働くことにより、チオシアノ基が脱離す
るβ脱離反応で、シアノシステイン残基がデヒドロアラ
ニンに転換する反応である（Y.Degani, A.Patchornik,
Biochemistry, 13, 1-11(1974)に記載）。反応３は、発
明者らが、リジン−シアノシステインの配列を有するペ
プチドを開裂させた時に得られた切断生成物を詳細に解
析した結果見出した反応である。この反応３において
は、カルボキシ末端がラクタムを含む７員環構造となる
ことから、反応３はリジンのεアミノ基がカルボニル炭
素を求核的に攻撃した結果起こったものと考えられる。
本発明者等は、分子間でも、一級アミンがシアノシステ
イン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸に由来するカル
ボニル炭素を求核的に攻撃することができるはずである
と考えた（図４）。即ち、本発明者等は、反応４によっ
てどのような一級アミン誘導体でも、シアノシステイン
残基の前までの配列に結合させることができ、且つ、生
じる結合は、「-CO-NH-」、即ちペプチド結合であると
いう着想を得た。そして、本発明者等は、図１の反応４
が実際起こることを証明し、この機構に基づき２つのペ
プチド鎖を容易に結合させることができることを示し、
本発明を完成した。具体的には、図２の反応４に示され
るように、シアノシステイン残基を有するペプチド鎖
「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」にアミノ末端がフリ
ーな別のペプチド鎖「NH2-R3」を作用させ、ペプチド鎖
内のアミノ基にペプチド結合上のカルボニル炭素を求核
攻撃させることにより、ペプチド間の結合反応を生じさ
せ、「R1-CO-NH-R3」の配列を持つペプチド鎖を合成で
きること示し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、一般式 （１） R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2 で示されるシアノシステイン残基を有するペプチド性化
合物に、一般式 （２） NH2-R3 で示される一級アミンを有する化合物を作用させること
により、一般式 （３） R1-CO-NH-R3 で示される化合物を生成させる方法〔式中、R1、R2、R3
は、任意のアミノ酸配列を表す〕に関する。
合物に、一般式 （２） NH2-R3 で示される一級アミンを有する化合物を作用させること
により、一般式 （３） R1-CO-NH-R3 で示される化合物を生成させる方法〔式中、R1、R2、R3
は、任意のアミノ酸配列を表す〕に関する。
【０００８】本発明に係る反応の本質からして、ここ
で、R1、R2、及びR3の化学的形態は限定されないことは
明白である。従って、本発明は、R1、R2、及びR3として
は、非天然アミノ鎖を含むペプチド鎖及びその誘導体、
アルキル鎖及びその誘導体、糖鎖及びその誘導体、脂肪
酸及びその誘導体、ポリヌクレオチド及びその誘導体、
ポリデオキシヌクレオチド及びその誘導体、ビタミン類
及びその誘導体、各種抗生物質、などが含まれる他幅広
い化学基が利用可能である。
で、R1、R2、及びR3の化学的形態は限定されないことは
明白である。従って、本発明は、R1、R2、及びR3として
は、非天然アミノ鎖を含むペプチド鎖及びその誘導体、
アルキル鎖及びその誘導体、糖鎖及びその誘導体、脂肪
酸及びその誘導体、ポリヌクレオチド及びその誘導体、
ポリデオキシヌクレオチド及びその誘導体、ビタミン類
及びその誘導体、各種抗生物質、などが含まれる他幅広
い化学基が利用可能である。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明によって、図２の反応式４
のごとく、前記一般式（１）「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO
-NH-R2」で示される化合物に、前記一般式（２）「NH2-
R3」で示される化合物を反応させることにより、前記一
般式（３）「R1-CO-NH-R3」で示される化合物を生成さ
せることができる。ここで、一般式（１）で示される化
合物は、一般式 （４） R1-CO-NH-C(CH2-SH)-CO-NH-R2、 即ち、R1とR2の間にシステイン残基を有する化合物のシ
ステインのスルフヒドリル基を選択的にシアノ化するこ
とにより生成することができる。
のごとく、前記一般式（１）「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO
-NH-R2」で示される化合物に、前記一般式（２）「NH2-
R3」で示される化合物を反応させることにより、前記一
般式（３）「R1-CO-NH-R3」で示される化合物を生成さ
せることができる。ここで、一般式（１）で示される化
合物は、一般式 （４） R1-CO-NH-C(CH2-SH)-CO-NH-R2、 即ち、R1とR2の間にシステイン残基を有する化合物のシ
ステインのスルフヒドリル基を選択的にシアノ化するこ
とにより生成することができる。
【００１０】シアノ化試薬としては、通常、2-ニトロ-5
-チオシアノ-安息香酸（2-nitro-5-thiocyanobenzoic a
cid (NTCB)）（Y.Degani, A.Patchornik, Biochemistr
y, 13, 1-11(1974)に記載)を用いる方法が簡便である。
シアノ化の手法によって、本発明が制限を受けないこと
は明白である。NTCBは市販のものをそのまま用いること
ができる。NTCBを用いたシステインのスルフヒドリル基
のシアノ化は、ｐＨ７〜９の間で効率よく行うことがで
き、且つ、遊離するが、チオニトロ安息香酸（thionitr
obenzoate）の４１２ｎｍの吸光度の増加（分子吸光係
数＝１３，６００）でシアノ化の反応効率を調べること
ができる。また、システインのスルフヒドリル基のシア
ノ化は、文献（J.Wood, & N. Catsimpoolas, J. biolog
ical Chemistry, 233, 2887(1963))記載の方法に従い,
スルフヒドリル基のシアンによる直接的酸化で行うこと
もできる。従って、シアノ化の手法によって、本発明が
制限を受けないことは明白である。
-チオシアノ-安息香酸（2-nitro-5-thiocyanobenzoic a
cid (NTCB)）（Y.Degani, A.Patchornik, Biochemistr
y, 13, 1-11(1974)に記載)を用いる方法が簡便である。
シアノ化の手法によって、本発明が制限を受けないこと
は明白である。NTCBは市販のものをそのまま用いること
ができる。NTCBを用いたシステインのスルフヒドリル基
のシアノ化は、ｐＨ７〜９の間で効率よく行うことがで
き、且つ、遊離するが、チオニトロ安息香酸（thionitr
obenzoate）の４１２ｎｍの吸光度の増加（分子吸光係
数＝１３，６００）でシアノ化の反応効率を調べること
ができる。また、システインのスルフヒドリル基のシア
ノ化は、文献（J.Wood, & N. Catsimpoolas, J. biolog
ical Chemistry, 233, 2887(1963))記載の方法に従い,
スルフヒドリル基のシアンによる直接的酸化で行うこと
もできる。従って、シアノ化の手法によって、本発明が
制限を受けないことは明白である。
【００１１】一般式（１）の化合物「R1-CO-NH-C(CH2-S
CN)-CO-NH-R2」への、一般式（２）の化合物「NH2-R3」
の反応は、弱アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）に、室温
で行うことができる。実施例１においては、「NH2-R3」
としてグリシンアミドを用いた例を示す。この場合、図
１に示される反応１及び反応２が競争反応となるが、ペ
プチド結合生成反応が最も効率良く進むことが示されて
いる。実施例２においては、ｐＨ１０の条件を用いて、
「NH2-R3」として、グリシン-Ｌ-アラニン-Ｌ-アラニン
-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニンを用いた結果を示している
が、ペプチド結合反応の生成物が主反応生成物であるこ
とが示されている。この結果は、図１の反応４が実際に
起こることを証明しており、さらに、この機構に基づ
き、２つのペプチド鎖を容易に結合させることができた
ことを実証している。しかしながら、本発明のペプチド
鎖結合反応は、実施例で示した結合反応条件には、限定
されない。即ち、図１の反応４は、反応の原料である一
般式（１）の化合物「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」
及び一般式（２）の化合物「NH2-R3」が溶解し互いに溶
液中で混じりあう条件でありさえすれば、進行する。原
料を溶解する溶媒としては、水溶性の溶媒である、水、
メタノール、エタノールなどのアルコール類の他ペプチ
ドの溶解に用いられる、ジメチルホルムアミド(DMF)、
ジメチルスルホキサイド(DMSO)などが可能であるが、本
発明は、用いる溶媒によっては限定されないことは明白
である。反応温度は、室温で高い反応効率が得られる
が、用いる溶媒が、凍結もしくは沸騰しない温度範囲で
あれば問題なく用いることができる。
CN)-CO-NH-R2」への、一般式（２）の化合物「NH2-R3」
の反応は、弱アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）に、室温
で行うことができる。実施例１においては、「NH2-R3」
としてグリシンアミドを用いた例を示す。この場合、図
１に示される反応１及び反応２が競争反応となるが、ペ
プチド結合生成反応が最も効率良く進むことが示されて
いる。実施例２においては、ｐＨ１０の条件を用いて、
「NH2-R3」として、グリシン-Ｌ-アラニン-Ｌ-アラニン
-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニンを用いた結果を示している
が、ペプチド結合反応の生成物が主反応生成物であるこ
とが示されている。この結果は、図１の反応４が実際に
起こることを証明しており、さらに、この機構に基づ
き、２つのペプチド鎖を容易に結合させることができた
ことを実証している。しかしながら、本発明のペプチド
鎖結合反応は、実施例で示した結合反応条件には、限定
されない。即ち、図１の反応４は、反応の原料である一
般式（１）の化合物「R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2」
及び一般式（２）の化合物「NH2-R3」が溶解し互いに溶
液中で混じりあう条件でありさえすれば、進行する。原
料を溶解する溶媒としては、水溶性の溶媒である、水、
メタノール、エタノールなどのアルコール類の他ペプチ
ドの溶解に用いられる、ジメチルホルムアミド(DMF)、
ジメチルスルホキサイド(DMSO)などが可能であるが、本
発明は、用いる溶媒によっては限定されないことは明白
である。反応温度は、室温で高い反応効率が得られる
が、用いる溶媒が、凍結もしくは沸騰しない温度範囲で
あれば問題なく用いることができる。
【００１２】反応の追跡は、高速液体クロマトグラフィ
ーを連結した質量分析装置を用いて、生成物を質量数で
同定・帰属し、定量することにより行うことができる。
実施例における生成物の同定・帰属・定量は、「ＬＣ１
０Ａ型高速液体クロマトグラフィー」（島津製作所製）
を連結した「PE Sciex API III質量分析装置」（パーキ
ンエルマー社製）を用いて行ったが、生成物を正確に同
定・帰属・定量できる方法であればどのような方法で行
ってよく、本発明が反応の追跡方法に制限されることは
ないことは明らかである。
ーを連結した質量分析装置を用いて、生成物を質量数で
同定・帰属し、定量することにより行うことができる。
実施例における生成物の同定・帰属・定量は、「ＬＣ１
０Ａ型高速液体クロマトグラフィー」（島津製作所製）
を連結した「PE Sciex API III質量分析装置」（パーキ
ンエルマー社製）を用いて行ったが、生成物を正確に同
定・帰属・定量できる方法であればどのような方法で行
ってよく、本発明が反応の追跡方法に制限されることは
ないことは明らかである。
【００１３】
[実施例１] Ｎ-アセチル-Ｌ-アラニン-Ｌ-アラニン-グ
リシン-（Ｓ-シアノ）Ｌ-システイン-Ｌ-アラニン（以
下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」と略す。質量＝６２
２）とグリシンアミド（Ｇ-ＮＨ2）との結合反応 ペプチド内のシアノシステインとそのＮ末端側に隣接す
るアミノ酸残基との間のペプチド結合内に存在するカル
ボニル炭素に対して、アミノ基による分子間求核攻撃が
可能であると考えられた。そこで、ペプチドとして「ac
Ｙ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を用い、アミノ基を有する分子
としてグリシンアミドを用いて、反応を行った。具体的
には、0.05Ｍリン酸と0.1Ｍホウ酸からなる緩衝液（ｐ
Ｈは、７〜１０まで変動させた）に、終濃度１mg/mlと
なるように 「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を加え、さらに
終濃度１０mg/mlとなるようにグリシンアミド（Ｇ-ＮＨ
2）を加え、室温で３時間反応させた。なお、本実験の
対照としてグリシンアミドの非存在下で反応を行った。
本反応の場合、シアノシステインのＮ末端側に隣接する
アミノ酸がグリシンであるため、図１の反応３は、起こ
り得ない。従って、本実施例において起こりうる反応経
路は、図２で示される反応１、反応２、及び反応４であ
る。また、それぞれの反応生成物である、「R1-COOH」,
「R1-CO-NH-(C=CH2)-CO-NH-R2」, 及び「R1-CO-NH-R3」
のそれぞれの質量数は、４２３、５６３、及び４８０で
ある。
リシン-（Ｓ-シアノ）Ｌ-システイン-Ｌ-アラニン（以
下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」と略す。質量＝６２
２）とグリシンアミド（Ｇ-ＮＨ2）との結合反応 ペプチド内のシアノシステインとそのＮ末端側に隣接す
るアミノ酸残基との間のペプチド結合内に存在するカル
ボニル炭素に対して、アミノ基による分子間求核攻撃が
可能であると考えられた。そこで、ペプチドとして「ac
Ｙ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を用い、アミノ基を有する分子
としてグリシンアミドを用いて、反応を行った。具体的
には、0.05Ｍリン酸と0.1Ｍホウ酸からなる緩衝液（ｐ
Ｈは、７〜１０まで変動させた）に、終濃度１mg/mlと
なるように 「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を加え、さらに
終濃度１０mg/mlとなるようにグリシンアミド（Ｇ-ＮＨ
2）を加え、室温で３時間反応させた。なお、本実験の
対照としてグリシンアミドの非存在下で反応を行った。
本反応の場合、シアノシステインのＮ末端側に隣接する
アミノ酸がグリシンであるため、図１の反応３は、起こ
り得ない。従って、本実施例において起こりうる反応経
路は、図２で示される反応１、反応２、及び反応４であ
る。また、それぞれの反応生成物である、「R1-COOH」,
「R1-CO-NH-(C=CH2)-CO-NH-R2」, 及び「R1-CO-NH-R3」
のそれぞれの質量数は、４２３、５６３、及び４８０で
ある。
【００１４】本実験におけるグリシンアミド存在下での
結果を表１に、非存在下での結果を表２にそれぞれ示
す。
結果を表１に、非存在下での結果を表２にそれぞれ示
す。
【００１５】
【表１】 ──────────────────────────────────── 反応生成物の割合（グリシンアミドの存在下） ──────────────────────────────────── ｐＨ acY-A-A-G-cC-A 反応１の 反応２の 反応４の （未反応物） 生成物１ 生成物２ 生成物４ （質量数 622 423 563 480 ) ──────────────────────────────────── ７ 〜100（％） 〜0（％） 〜0（％） 〜0（％） ８ 96.8 0 1.2 2.0 ９ 65.2 0 4.7 14.1 １０ 32.1 0.5 5.9 26.4 ────────────────────────────────────
【００１６】
【表２】 ──────────────────────────────────── 反応生成物の割合（グリシンアミドの非存在下） ──────────────────────────────────── ｐＨ acY-A-A-G-cC-A 反応１の 反応２の 反応４の （未反応物） 生成物１ 生成物２ 生成物４ （質量数 622 423 563 480 ) ──────────────────────────────────── ７ 〜100（％） 〜0（％） 〜0（％） 〜0（％） ８ 89.6 9.2 1.2 0 ９ 65.2 32.0 2.8 0 １０ 32.1 53.0 14.9 0 ──────────────────────────────────── 表２から明らかなように、グリシンアミドの非存在下で
は、塩基性条件における水酸化物イオンが、ペプチド結
合上のカルボニル炭素に対して求核攻撃を行う、反応１
が主反応となって、ペプチドの切断が起こり、「acＹ-
Ａ-Ａ-Ｇ」（質量数＝４２３）と2-イミノチアゾリジン
-4-カルボキシル-アラニン（2-iminothiazolidine-4-ca
rboxylyl-alanine）が生成した。また、水酸化物イオン
が塩基として作用しβ-脱離反応が起こる結果、ペプチ
ドの切断が生じない反応２が副反応となり、Ｎ-アセチ
ル-Ｌ-アラニン-Ｌ-アラニン-グリシン-Ｌ-デヒドロア
ラニン−Ｌ-アラニン（以下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｄＡ-
Ａ」と略す。質量＝５６３）が生成した。
は、塩基性条件における水酸化物イオンが、ペプチド結
合上のカルボニル炭素に対して求核攻撃を行う、反応１
が主反応となって、ペプチドの切断が起こり、「acＹ-
Ａ-Ａ-Ｇ」（質量数＝４２３）と2-イミノチアゾリジン
-4-カルボキシル-アラニン（2-iminothiazolidine-4-ca
rboxylyl-alanine）が生成した。また、水酸化物イオン
が塩基として作用しβ-脱離反応が起こる結果、ペプチ
ドの切断が生じない反応２が副反応となり、Ｎ-アセチ
ル-Ｌ-アラニン-Ｌ-アラニン-グリシン-Ｌ-デヒドロア
ラニン−Ｌ-アラニン（以下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｄＡ-
Ａ」と略す。質量＝５６３）が生成した。
【００１７】一方、表１から明らかなように、グリシン
アミド存在下では、グリシンアミド中のアミノ基が、ペ
プチド結合上のカルボニル炭素へ求核攻撃を行う反応４
が主反応となって、この結果、ペプチドの切断と共に新
たなペプチドの合成が引き起こされ、Ｎ-アセチル-Ｌ-
アラニン-Ｌ-アラニン-グリシン-グリシンアミド（以
下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-Ｇ−ＮＨ2」と称する。質量数＝
４８０）が生成した。特に、高ｐＨ条件下では、主反応
である反応４が促進されると共に、グリシンアミド非存
在下の場合と比較して、副反応である反応２が阻害され
た。
アミド存在下では、グリシンアミド中のアミノ基が、ペ
プチド結合上のカルボニル炭素へ求核攻撃を行う反応４
が主反応となって、この結果、ペプチドの切断と共に新
たなペプチドの合成が引き起こされ、Ｎ-アセチル-Ｌ-
アラニン-Ｌ-アラニン-グリシン-グリシンアミド（以
下、「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-Ｇ−ＮＨ2」と称する。質量数＝
４８０）が生成した。特に、高ｐＨ条件下では、主反応
である反応４が促進されると共に、グリシンアミド非存
在下の場合と比較して、副反応である反応２が阻害され
た。
【００１８】[実施例２] Ｎ-アセチル-Ｌ-アラニン-Ｌ
-アラニン-グリシン-（Ｓ-シアノ）Ｌ-システイン-Ｌ-
アラニン（acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ）とグリシン-Ｌ-ア
ラニン-Ｌ-アラニン-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニン（以下、
「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」と称する）とのペプチド結合反応 実施例１において、グリシンアミド内のアミノ基によ
る、ペプチド結合上のカルボニル炭素に対しての求核攻
撃が可能であることが証明された。そこで、次に、グリ
シンアミドのような単純なアミノ酸誘導体に代えて、ペ
プチドである「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を用いて、同様の反応
を行った。具体的には、0.05Ｍリン酸と0.1Ｍホウ酸か
らなる緩衝液に、終濃度１mg/mlとなるように 「acＹ-
Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を、終濃度１０mg/mlとなるように
「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を加え、室温で３時間反応させた。
なお、緩衝液のｐＨは、実施例１で最もペプチド結合反
応が促進されたｐＨ１０とした。この結果を表３に示
す。
-アラニン-グリシン-（Ｓ-シアノ）Ｌ-システイン-Ｌ-
アラニン（acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ）とグリシン-Ｌ-ア
ラニン-Ｌ-アラニン-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニン（以下、
「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」と称する）とのペプチド結合反応 実施例１において、グリシンアミド内のアミノ基によ
る、ペプチド結合上のカルボニル炭素に対しての求核攻
撃が可能であることが証明された。そこで、次に、グリ
シンアミドのような単純なアミノ酸誘導体に代えて、ペ
プチドである「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を用いて、同様の反応
を行った。具体的には、0.05Ｍリン酸と0.1Ｍホウ酸か
らなる緩衝液に、終濃度１mg/mlとなるように 「acＹ-
Ａ-Ａ-Ｇ-ｃＣ-Ａ」を、終濃度１０mg/mlとなるように
「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を加え、室温で３時間反応させた。
なお、緩衝液のｐＨは、実施例１で最もペプチド結合反
応が促進されたｐＨ１０とした。この結果を表３に示
す。
【００１９】
【表３】 ──────────────────────────────────── 反応生成物の割合 ──────────────────────────────────── acY-A-A-G-cC-A 反応１の 反応２の 反応４の （未反応物） 生成物１ 生成物２ 生成物４ （質量数 622 423 563 857 ) ──────────────────────────────────── 60.1（％） 5.8（％） 12.4（％） 21.7（％） ──────────────────────────────────── 表３から明らかなように、グリシンアミドに代えて、ペ
プチドである「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を用いた場合でも、ペ
プチド内のグリシン残基のアミノ基による求核攻撃（反
応４）により、新たなペプチド、Ｎ-アセチル-Ｌ-アラ
ニン-Ｌ-アラニン-グリシン-グリシン-Ｌ-アラニン-Ｌ-
アラニン-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニン（「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-
Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ］、質量数＝８５７）が生成した。
プチドである「Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ」を用いた場合でも、ペ
プチド内のグリシン残基のアミノ基による求核攻撃（反
応４）により、新たなペプチド、Ｎ-アセチル-Ｌ-アラ
ニン-Ｌ-アラニン-グリシン-グリシン-Ｌ-アラニン-Ｌ-
アラニン-Ｌ-チロシン-Ｌ-アラニン（「acＹ-Ａ-Ａ-Ｇ-
Ｇ-Ａ-Ａ-Ｙ-Ａ］、質量数＝８５７）が生成した。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、保護基を用いずに、簡易
かつ迅速にペプチドの合成を行う画期的な技術が提供さ
れた。これにより、機能単位のペプチドを組み合わせ
て、さらに高度の機能のペプチドを合成するなど、ペプ
チド合成の分野を中心に幅広い利用が期待される。
かつ迅速にペプチドの合成を行う画期的な技術が提供さ
れた。これにより、機能単位のペプチドを組み合わせ
て、さらに高度の機能のペプチドを合成するなど、ペプ
チド合成の分野を中心に幅広い利用が期待される。
【図１】シアノシステイン残基を介したペプチド鎖切断
に関与する反応の模式図である。
に関与する反応の模式図である。
【図２】シアノシステイン残基を介したペプチド鎖切断
に関与する反応のうち本発明において関与している反応
の模式図である。
に関与する反応のうち本発明において関与している反応
の模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹縄 辰行 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 吉成 幸一 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 小田 吉哉 茨城県つくば市二の宮４丁目８−１ (72)発明者 石濱 泰 茨城県つくば市春日３丁目５−１−101
Claims (1)
- 【請求項１】 一般式 R1-CO-NH-C(CH2-SCN)-CO-NH-R2 で示されるシアノシステイン残基を有するペプチド性化
合物に、一般式 NH2-R3 で示される一級アミンを有する化合物を作用させること
により、一般式 R1-CO-NH-R3 で示される化合物を生成させる方法。〔式中、R1、R2、
R3は、任意のアミノ酸配列を表す〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20377196A JP3788828B2 (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | ペプチドの新規な合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20377196A JP3788828B2 (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | ペプチドの新規な合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1045798A true JPH1045798A (ja) | 1998-02-17 |
| JP3788828B2 JP3788828B2 (ja) | 2006-06-21 |
Family
ID=16479541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20377196A Expired - Lifetime JP3788828B2 (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | ペプチドの新規な合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3788828B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1367121A3 (en) * | 2002-05-23 | 2003-12-17 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Process for immobilizing polypeptides via the carboxyl group of the C-terminus |
| WO2004089977A1 (ja) * | 2003-04-10 | 2004-10-21 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 固定化タンパク質及びその製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5963248B2 (ja) | 2012-06-14 | 2016-08-03 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 抗体精製用担体並びにその製造方法及びその用途 |
-
1996
- 1996-08-01 JP JP20377196A patent/JP3788828B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1367121A3 (en) * | 2002-05-23 | 2003-12-17 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Process for immobilizing polypeptides via the carboxyl group of the C-terminus |
| WO2004089977A1 (ja) * | 2003-04-10 | 2004-10-21 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 固定化タンパク質及びその製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3788828B2 (ja) | 2006-06-21 |
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