JPS63145308A - 架橋ポリアクリルアミドースルフヒドリルゲル及びそのスルフヒドリル官能性誘導体並びにその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主１し！！思 本発明は、生物学的に活性な物質を固定化するための固
体支持材料に関する。特に、本発明は、生物学的に活性
な物質が結合しうる官能基によって誘導された架橋ポリ
アクリルアミドに関する。

生物学的に活性な物質の、固体支持材料上への固定化は
、バイオテクノロジーの種々の領域において重要な研究
及び診断具となっている。例えば、ペプチド類の骨格構
造に物理化学的に適合しうる化学構造を有する固体の支
持材料、特に架橋ポリマー支持体の合成及び使用が固相
のペプチド合成における使用に関して記載されており、
ここにおいて、ポリマーへのペプチドの結合の技術［５
ｔａｌｌｌ　　らの、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　
Ｓａｃ、、第１０１（１８）巻、５３８３頁（１９７９
年）］、及び水性有機混合物中の逆相懸濁重合を用いた
種々のボリマーノ架橋技術ＣＶａｒａｄａｒａｊａｎら
０’）　Ｂ　ｉ　ｏ　−ｐｏｌｙｍｅｒｓ、第２２巻、
８３９頁（１９８３年）１が適切な官能基を有する外部
及び内部の反応位置を増加せしめるために、かかる支持
材料の好適な膨潤性を得るために用いられている。

液体試験試料中に存在する分析対象物の量を測定するた
めに、標識試薬の結合体及びＭ離体を分離するための固
体の支持材料を用いる種々の分析試験系もまた記載され
ている０例えば、米国特許第４．２００．４３８号は、
当該技術において公知の方法によって多糖類又はプラス
チックのような固体の支持体又は坦体材料に、抗原を化
学的に結合、又は物理的に吸着させることによって得ら
れる、測定すべき固定化された抗原を用いた、抗原検出
のための免疫試験を開示している。同様に、米国特許第
４，５５１．４２ｆｉ号は、ウアバインを、当該技術に
おいて公知の方法によって、直接、あるいは蛋白質、ポ
リアミノ酸又は合成結合剤のようなスペーサーアームを
介して、ビーズ状アガロース、ビーズ状デキストラン、
ポリアクリルアミド又はガラスに結合させることによっ
て得られる固定化されたウアバインを用いる不均一免疫
試験を開示している。

上述したように、種々の固体支持材料が当該技術におい
て公知であるが、架橋ポリアクリルアミドゲルのような
ポリアクリルアミド支持体が、リガンド又は他の生物学
的に活性な基質をそれに、結合せしめるのに有用であり
、生物学的巨大分子の低い非特異的吸着、高い化学的及
び熱安定性並びに酵素による攻撃が無いといったような
多くの利点を有する。架橋ポリアクリルアミドゲルの網
状構造は、主として、ポリアクリルアミドの親木性及び
巨大分子への低吸着性を与える第１級アミド基を有する
骨格炭素原子を交互に有する線状ポリエチレンセグメン
トからなる。線状ポリアクリルアミドは水溶性であるが
、架橋結合を与える重合反応において２官能性モノマー
を包含せしめることによって不溶”ゲル網構造が形成さ
れる。

生物学的に活性な物質をかかる架橋ポリアクリルアミド
支持体に有効に結合させるためには、官能基を導入して
反応性結合位を与えることが必要である０例えば、架橋
ポリアクリルアミド［Ｓ、　Ｈｊｅｒｔｅｎ　　及びＲ
，Ｍｏ５ｂａｃｈ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、第３巻、
１０９頁（１９６２年）］をアミノエチル誘導して［Ｊ
、　Ｋ、　Ｉｎｍａｎ及びＨ，Ｍ、Ｄｉｎｔｚｉｓ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７、第８巻、４０７４頁（１９６
９年）］アミン官能基を導入することができ、あるいは
、アミノエチルジチオ−又はスルフヒドリル誘導して［
Ｊ、　Ｋ、　Ｉｎｍａｎ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ、第３４Ｂ巻、３０頁（１９７
４年）］スルフヒドリル官能基を導入することができる
。

しかしながら、かかる誘導ポリアクリルアミド支持材料
は、イオン性化合物との望ましくない相互作用をもたら
しうる残留アミノ及び／又はカルボン酸基をなおも含有
しており、高い緩衝能を有するゲルが生成される。かか
るアミン官能基は、また、アミン感受性リガントと相互
作用して、対応する結合相手に対するその結合能を不活
性化又は減少せしめる可能性がある。特に、アミノエチ
ル誘導ポリアクリルアミド支持体に結合するりガントが
、例えばグリコジル化ペプチド配列のようなアミン感受
性リガンドである場合は、かかるリガンドの対応する抗
体と結合する能力は実質的に減少する。

したがって、本発明の目的は、アミン感受性リガンドと
非特異的に相互作用することのない官能基によって誘導
されたポリアクリルアミド支持材料を提供することであ
る。

更に、本発明の目的は、イオン性化合物と相互作用する
であろう残留アミン又はカルボキシル官能基を有さない
ポリアクリルアミド支持材料を提供することである。

本発明の他の目的は、低い緩衝能を有するポリアクリル
アミド支持材料を提供することである。

灸旦辺１１ 本発明は、次式： （ａ） （式中、ａ、ｂ及びＣはランダムなポリアクリルアミド
−スルフヒドリルコポリマー鎖のランダムに緑り返され
るモノマー構造単位であり；ｍ及びｎは、独立して、１
〜６、好ましくはそれぞれ１〜３及び２〜４の整数であ
り；Ｙ及びＺは、他のランダムなポリアクリルアミド−
スルフヒドリルコポリマー釦からのアミド基である）の
繰り返しモノマー構造単位からなる、水不溶性の架橋ポ
リアクリルアミド−スルフヒドリルコポリマーを提供す
る。ランダムなコポリマー鎖は、Ｙ及びＺが他のかかる
ランダムなコポリマー鎖からのアミド基であるモノマー
構造単位ａ及びＣによって互いに架橋されて１本発明の
架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポリマーを
提供する。

架橋コポリマーは、概して不連続の粒子、好ましくはゲ
ル粒子の形態であり、モノマー構造単位Ｃの外表面のジ
スルフィド基によって特徴付けられる。かかるジスルフ
ィド架橋は還元することにより、生物学的に活性な物質
に結合しうる外表面上の化学的に活性なスルフヒドリル
官能基を与えることができる。

本発明は、更に、 （１）次式； （ａ のモノマーからなる混合物を共重合し、（１１）本発明
の架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポリ、マ
ーを単離することからなる架橋ポリアクリルアミド−ス
ルフヒドリルコポリマーの製造方法を提供する。

ましい１　熊　の弯【 本発明の架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポ
リマーは、概して、内表面及び外表面領域を画定する、
架橋したランダムなポリアクリルアミド−スルフヒドリ
ルコポリマー鎖からなる固体マトリックスの形態をとる
。特に、ランダムなポリアクリルアミド−スルフヒドリ
ルコポリマー鎖は、線状コポリマー鎖に沿ってランダム
に配置されるモノマー残基構造単位ａ、ｂ（アクリルア
ミド残基）及びＣからなる。ランダムなコポリマー鎖は
、モノマー残基構造単位ａ及びＣによって互いに架橋さ
れ、ここでモノマー残基構造単位ａ及びＣのＹ及びＺは
他のかかるランダムなコポリマー鎖からのアミド基であ
る。

架橋コポリイーは、架橋コポリマーの内表面及び外表面
領域のいずれにも存在し、還元剤によって還元されて化
学的に活性なスルフヒドリル官能基を与えうる、モノマ
ー残基構造単位Ｃによって与えられる架橋結合のジスル
フィド基によって特徴付けられている。架橋コポリマー
のかかる還元体は、固定化試薬の固体支持材料として特
に有用であり、より一般的には本願と同日付で同時に出
願した「不均一系免疫測定試験において用いるための安
定な固定化ハプテン試薬」と題された、共に審査にかか
っている米国特許出願（書類番号第１４５５番）におい
て記載されているもののように、液体雰囲気中の場合は
ゲル又はゲル粒子の形態で存在し、ここで、生物学的に
活性な物質は。

以下により詳しく記載するように、かかる外表面の化学
的に活性なスルフヒドリル官能基に共有結合することが
できる。かかる化学的に活性なスルフヒドリル官能基に
結合可能な、広範囲にわたる生物学的に活性な物質が公
知であり、例えば、有機分子類、蛋白質類、核酸類など
が挙げられるがこれらに制限されるものではない、特に
、ハプテン類、抗原類、抗体類、レクチン類、酵素類、
受容体蛋白質類、及びビオチンのようなりガント類のよ
うな生物学的に活性な物質を、かかる化学的に活性なス
ルフヒドリル官能基と共有結合させることによりその固
定化試薬を与えることができる。

上述のように、架橋コポリマーを固定化試薬における固
体支持材料として用いる場合、かかる生物学的に活性な
物質を、実質的に、外表面のスルフヒドリル官能基にの
み共有結合させることが望ましいことが理解されるべき
である。しかしながら、架橋コポリマーは高い親木性を
有し、したがって、水性液体雰囲気中の場合は、通常、
寸法で２〜３倍を超える望ましくない膨潤量を示す。

かかる膨潤によって、その中のかかる生物学的に活性な
物質又は他の試薬の望ましくない浸透及び内在化が起こ
り、その結果、その内表面領域での、かかる生物学的に
活性な物質とスルフヒドリル官能基との間の望ましくな
い共有結合の形成が起こる。顧みるに、非膨潤液雰囲気
、あるいは、はとんど、又は全く水を含有しない溶媒、
好ましくは、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド、アセトン、塩素化炭化水素類、非環式及び環式ア
ルキルエーテル類などのような有機溶媒の存在下の場合
は、本発明の架橋コポリマーは実質的に膨潤しない、し
たがって、かかる生物学的に活性な物質及び他の試薬の
架橋コポリマー中への浸透又は内在化を最少にする、か
かる非膨潤溶媒中の場合は、かかる生物学的に活性な物
質の共有結合は、架橋コポリマーの外表面領域のスルフ
ヒドリル官能基のみに実質的に制限される。かかる非膨
潤性架橋コポリマーは、また、上記記載のように、ジス
ルフィド基を還元して化学的に活性なスルフヒドリル基
を与えるために用いられる還元剤に対して不浸透性であ
り、したがって、その還元を、架橋コポリマーの外表面
領域のジスルフィド基の還元のみに実質的に制限するこ
ともまた理解されるべきである。

以下により詳細に記載するように、膨潤度は。

モノマー構造単位の比率、コポリマー鋼量の架橋度及び
架橋基、並びに、架橋コポリマーにおけるモノマー組成
に依存する。好ましくは、架橋コポリマーは、モノマー
構造単位ａ約１〜１８％、モノマー構造単位す約７０〜
９５％、及びモノマー構造単位Ｃ約２〜１２％からなる
。更に好ましくは、架橋コポリマーは、モノマー構造単
位ａ約２〜１６％、モノマー構造単位す約８０〜９０％
、及びモノマー構造単位Ｃ約２〜１０％からなる。

ｍ及びｎが上述で定義したものであるモノマー構造単位
ａ及びＣを提供するために、種々のモノマーが出業者に
よって選択され得るが、上記記載。

のような、ランダムなポリアクリルアミド−スルフヒド
リルコポリマー鋼量の架橋結合を与える、それぞれ、ｍ
が１でありｎが２であるビスアクリルアミド（モノマー
構造単位ａ）及びＮ。

Ｎｏ−ビスアクリルシスタミン（モノマー構造単位Ｃ）
残基が特に好ましい。好ましくは、かかる架橋コポリマ
ーは、それぞれ、アクリルアミド残基８８〜９４％、ビ
スアクリルアミド（モノマー残基構造単位ａ）１０〜２
％、及び、Ｎ、Ｎ’−ビスアクリルシスタミン残基２〜
４％からなる。

架橋コポリマーは、一般的に塊状ポリマーの形態であり
、これは機械的配合機又はホモジナイザーのような当該
技術において公知の方法によって、より大きい外表面積
を有する、個々の不規則な形状の粒子に寸法を縮少させ
、ゼラチン状粒子からなるスラリーにすることができる
。得られる粒子又はゲル粒子は、上記と同様の架橋コポ
リマーの物理的及び化学的特性を示し、寸法も種々のも
のが得られ、これは所定の網目の大きさを有する篩のそ
れぞれの大きさによって分別することができる。好まし
くは、本発明の架橋コポリマーは直径約２０〜２００４
、好ましくは直径約３８〜１５０μｍの粒子に均質化さ
れ分別され、上記記載のような固定化試薬における固体
支持材料として用いられる。

例えば、かかる架橋コポリマー粒子を用いて、上記記載
の「不均一系免疫測定試験において用いるための安定な
固定化ハプテン試薬」と題された、共に審査にかかって
いる米国特許出願において記載されているような、コポ
リマーマトリックスの外表面のスルフヒドリル基に共有
結合しているヒトヘモグロビンのβ−サブユニッ）　（
Ｓｕｂ−ｕｎｉｔ）におけるグリコジル化Ｎ−末端ペプ
チド配列（すなわちグリコペプチド）からなる固定化グ
リコペプチド試験を製造することができる。

特に、グリコペプチドは、まずビスマレイミド（１、１
’−（メチレンジー４．１フエニレン）ビスマレイミド
）、ビスマレイミド−ヘキサン、又はビスマレイミド−
ヘキサエチレングリコールのような２官能性化合物によ
って活性化され、次に、上記記載のような、非膨潤溶媒
の存在下で、還元された本発明の架橋コポリマーと反応
せしめられる。架橋コポリマー粒子の非膨潤性によって
、グリコペプチド及び他の試薬の浸透及び内在下が防止
され、したがって、グリコペプチドはその内部から排除
され、それによってグリコペプチドの共有結合が外表面
のスルフヒドリル官能基のみに実質的に制限されること
が理解されるべきである。

本発明の架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポ
リマーは、残留アミン又はカルボン酸を含有せず、それ
らが存在すれば、イオン化合物と相互作用してコポリマ
ーに対して非特異的結合を起こし、かかる残留基が存在
しない場合は、架橋゛コポリマーの緩衝能は低くなるこ
とが理解されるべきである。更に重要なことには、活性
アミノ基が存在しないことによって、上記記載のグリコ
ペプチドのようなアミン感受性リガンドの化学的に活性
なスルフヒドリル官能基への結合が起こる（そうでない
場合は、それに結合するかわりに、かかるアミン基と相
互作用し、それによって不活性化される）。

本発明はまた、それぞれが、上記記載のようなそれぞれ
のモノマー構造単位ａ、　　ｂ及びＣに対応するモノマ
ーａ（ビスアクリルアミド又はその類縁体）　、　　ｂ
’　（アクリルアミド）及びｃ’（Ｎ。

Ｎ゛−ビスアクリルアミドミンヌはその類縁体）の混合
物を共重合することからなる、上記記載のような架橋ポ
リアクリルアミド−スルフヒドリルコポリマーの製造方
法を提供する。このようにして得られた架橋ポリアクリ
ルアミド−スルフヒドリルコポリブーを、次に１個々の
粒子に、好ましくは、直径約２０〜２００Ｑ、更に好ま
しくは直径約３８〜１５０μの個々のゲル粒子からなる
ゲルスラリーの形態に均質化し、上記記載のような化学
的に活性なスルフヒドリル官能基を得るためにジチオト
レイトールのような還元剤によって還元することができ
る。

一般に、架橋コポリマーは、モノマーｆ約１〜１２％、
モノマーｂ′約３２〜４８％、モ／マーＣ′約２〜８％
からなるモノマーａ′、ｂｏ及びＣ′の混合物を、Ｎ、
Ｎ、Ｎ”　Ｎ　ｌ−テトラメチルエチレンジアミン及び
過硫酸アンモニウムの存在下、水中で遊離基共重合する
ことによって得られる。混合物を水浴中で冷却し、透明
な固体物質からなる塊状ポリマーの形態に重合せしめる
。このようにして得られた塊状ポリマーを、次に機械的
配合機によって、直径約２０〜２００−の個々のゲル粒
子の形態の種々の大きさの架橋コポリマーからなる水ス
ラリーの形態に均質化する０次に、所望のゲル粒子の大
きさに対応する網目の大きさを有する適切な篩によって
、好ましくは直径約３８〜１５０戸の所望の大きさの粒
子を分別することができる。

好ましくは、モノマーａ′、ｂ′及びＣ′の共重合混合
物は、上記記載のような非膨潤液雰囲気中において実質
的に非膨潤性の架橋コポリマーを得るためには、モノマ
ーｄ約２〜１０％、モノマーｂｇ３６〜４４％、及びモ
ノマーＣ′約３〜７％からなる。

本発明方法の好ましい実施態様によれば、ｍが１であり
、ｎが２であり、共重合反応混合物が、モノマーａ′約
ｌＯ％、モノマーｂ′約４０％、及びモノマーＣ’約３
．４％、あるいは、モノマーｉ約２％、モノ−ｙ−ｂｌ
ｉ４０％、及びモノマーｃ°約６．８％からなる。かか
る好ましい実施態様によると、モノ−ｔ−１ｉはビスア
クリルアミドであり、モノマーｂ゛はアクリルアミドで
アリ、モ／　ｆ−Ｑ’はＮ、Ｎ’−ビスアクリルシスタ
ミンである。

上記記載のような塊状共重合法は、本発明の架橋ポリア
クリルアミド−スルフヒドリルコポリマーを得るのに好
適であるが、懸濁重合法などをはじめとする（しかしな
がら、これに限定する必要はない）他の重合法もまた用
いてよいことが理解されるべきである。

特に、本発明を以下の実施例によって説明するが、これ
らに限定されるものではない。

アルゴン雰囲気下で、アクリルアミド（４０％）、ビス
アクリルアミド（１０％）及びＮ。

Ｎｏ−ビスアクリルシスタミン（３，４％）を水３０／
と混合した。全ての固形分を溶解するために混合物の温
度を４０〜４５℃に上昇せしめた。

Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
１０ＯＪＬ文を加えた後、混合物を４０℃に冷却し、過
硫酸アンモニウム２５ｍｇを加え、溶液を水浴中で塊状
ポリマーの形態に重合せしめた。

３時間後、塊状ポリマーを容器から、透明な固体物質と
して取り出し、水と混合し、機械的配合機で均質化し、
ゲル懸濁液を得た。ゲル懸濁液をまず８５メツシユの篩
（ＵＳＣ値）で篩い分けて直径１５０．未満の直径を有
するゲル粒子を得、次に、４００メツシユの篩で篩い分
けて直径３８〜１５０−の粒子を得た。得られた３８〜
１５０゜の粒子を水で良く洗浄し、ゲル濾過し、エタノ
ールで洗浄し、最終的に吸引及び減圧によって乾燥した
。

実施例１によって製造された架橋ポリアクリルアミド−
スルフヒドリルゲル粒子の外表面スルフヒドリル官能基
に共有結合したグリコペプチドからなる固定化試薬を次
のように製造した。すなわち、 （ａ）実施例１によって製造された架橋ポリアクリルア
ミド−スルフヒドリルコポリマーゲル粒子２．０ｇをま
ずジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５−によって４回洗
浄し、液体を除去し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）４
００ｍｇ及びＤＭＦＯ１５−と混合した。混合物を室温
で攪拌し、時々渦動させた。１時間後、液体を除去し、
ゲルをアルゴン下に保持し、アルゴンでパージしたＤＭ
Ｆを用いて洗浄液からＤＴＴが検出されなくなるまで洗
浄した。

（ｂ）別の容器中で、水１００ｐＱ中１．０ｍｇの濃度
のグリコペプチド（ヨーロッパ特許出願部、１８５．８
７０号において記載されているようなヘモグロビンのβ
−サブユニー／　トにおけるグルコシル化Ｎ末端ペプチ
ド配列）の溶液８００　ｇｆＬを、ビスマレイミド−ヘ
キサエチレングリコール溶液（ＤＭＦ１００ル文中１．
０＋ｅｇ）２００終文及びＤＭＦ６００ｐｌと混合した
。室温で１０分後、溶液を本実施例の工程（ａ）で得た
活性化ゲルに加えた。ゲル混合物を２時間攪拌し、しば
しば渦流状に攪拌した。ゲルから液体を除去し、ＤＭＦ
　（２＋＋＋ｌｔ’８回）　、２Ｍｃ７）ＮａＣｊｌと
Ｏ，ｌＮの酢酸との溶液（５ｍｌで６回）、水（１５Ｃ
）Ｊ）及びエタノール（１０−で４回）で洗浄した０次
にゲルを減圧吸引乾燥すると、実質的に、架橋コポリマ
ーゲル粒子の外表面のスルフヒドリル官能基のみに共有
結合するグリコペプチドからなる固定化グリコペプチド
試薬２．０ｇが得られた。

実質的にコポリマーゲルの外表面のスルフヒドリル官能
基のみに対するグリコペプチドの共有結合は、まずＧｒ
ａｓｓｅｔｔｉ及びＭｕｒｒａｙのＡｒｃｈｉｖｅｓ　
ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７　ａｎｄ旧ｏｐｈ７ｓｉ
ｃｓ　、第１１９巻、４４〜４９頁（１９６７年）に記
載された方法にしたがって、ジメチルホルムアミド中、
過剰量のジチオトレイトール（ゲルｔｇあたり１．３ｍ
Ｍ）でスルフヒドリル官能基を活性化することによって
測定した。架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルゲ
ルＩｇあたり約ｌＯ〜５００ｎＭのスルフヒドリル基が
検出されるか、あるいは、その還元前に、架橋コポリマ
ーの０．０５％未満の有効なジスルフィド基が検出され
た。したがって、実質的に表面のジスルフィド基のみが
還元剤に暴露され、その結果、実質的にかかるジスルフ
ィド基のみが、所望の外表面スルフヒドリル官能基に還
元せしめられたものと思われる。

実施例２によって製造された固定化グリコペプチド試薬
（樹脂）を、標識試薬として、β−Ｄ−ガラクトシタン
ゼによって標識された一価の抗体フラグメン）（Ｆａｂ
’）の単複合体を用いて非結合標識（バックグラウンド
）のレベルを測定して評価した。ＰｏｒｔｅｒのＢｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｊ、　、第７３巻１１９頁（１９５９年）
及びＮｉｓｏｎｏｆｆｃ７Ｎ１５ｏｎｏｆｆｃ７）、　
Ｒｅｓ、　、第１０巻１３２頁（１９６４年）に記載さ
れた方法に従って、−価の抗体フラグメントを、ヒトヘ
モクロビンのβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ
−末端ペプチド配列に特異的なモノクローナル抗体（ヨ
ーロッパ特許出願第１８５．８７０号を参照）から誘導
し、イシカワのＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第９６巻６５９
頁（１９８４年）、カド−らのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
第１１６巻１５５４頁（１９７８年）及びヨシタケらの
Ｅｕｒａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１０１巻３９５
頁（１９’７７年）に記載された方法にしたがってβ−
ｐ−ガラクトシダーゼ標識した。−価の抗体フラグメン
ト−β−ｐ−ガラクトシダーゼ複合体は、本願と同日付
で同時に出願された「実質的に純粋な酵素−抗体単複合
体製剤」と題された米国特許出願（書類番号ＭＳ−１４
７７号）において記載されているように、ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動的に精製され、その結果、単独
のＦａｂ゛成分及び単独のβ−ｐ−ガラクトシダーゼ成
分からなる実質的に純粋な単複合体製剤となる。

（ａ）単複合体標識試薬２５０座文溶液に、緩衝液（ｐ
Ｈ７，４、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、塩化ナトリウ
ム０．５Ｍ、塩化マグネシム１ｍＭ、ウシ血清アルブミ
ン１１００ｐ／ｗＪ及びアジ化ナトリウム０．０２％）
３０ｇＭを加え；（ｂ）本実施例の工程（＆）で得た溶
液のアリコート２７０ｇ１を、固定化グリコペプチド試
薬（樹脂）１０〜２０ｍｇと混合し、懸濁液を室温で３
０分間転倒回転させ； （ｅ）樹脂を濾去し、濾液の７リコート３０ＪＬｌをレ
ゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが包含せしめ
られた試薬パッドに施した。

上澄み中の標識試薬すなわち結合種のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ活性を測定するために、試料を試薬パッドに施
した後、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとレゾルフィンβ−
ローガラクトピラノシドとの間の相互作用によって起こ
る発色の割合を５６０　ｎＭで測定した。多ポートイン
ターフェースを介してＨＰ−８５コンピユーター（米国
、カリ７ｆル：−７州、パロアルトのＨｅｗｌｅｔｔ　
ＰａｃｋａｒｄＣｏｍｐａｎ７製）に取り付けられた５
ｅｒａｌｙｚｅｒ　８反射光度計（米国、インディアナ
州、エルクハートのＭｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ、　　製）で反応性の測定（表１）を行な
い、このようにして測定された反応性の、樹脂の処理を
行なわない標識試薬の反応性に対する比をバックグラウ
ンドのパーセンテージとして示した（表１を参照のこと
）。

実」ｌ江Ａ （ａ）標識試薬（実施例３）の溶液２５０ｐＪｌに、種
々の濃度の変成血液、すなわちＨｂＡｌｃ（図１）３０
ｇＪｌを加え、混合物を室温で１０分間放置し； （ｂ）それぞれの混合物からのアリコート２７０ｇ１を
固定化グリコペプチド試薬（実施例２）１５ｍｇと混合
し、室温で１０分間転倒回転させ； （ｃ）樹脂を濾去し、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドが包含せしめられた試薬パッドに濾液を施し
た。

上記記載のような５ｅｒａｌｙｚｅｒ＠反射光度計によ
って反応性の測定を行なったところ、反応性が、全血中
に存在するＨｂＡｌｃの濃度に対して正比例することが
判明した。

【図面の簡単な説明】

図１は、液体試験試料からのグリコペプチドの量を測定
するためのイムノアッセーにおける、本発明のポリアク
リルアミド−スルフヒドリルゲルを用いた固定化グリコ
ペプチド試薬の反応性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式： （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（ｂ）▲数式
   、化学式、表等があります▼（ｃ）▲数式、化学式、表
   等があります▼ （式中、ｍ及びｎは、独立して、１〜６の整数であり、
   Ｙ及びＺほ他のポリアクリルアミドポリマー鎖からのア
   ミド基である） の繰り返しモノマー構造単位からなることを特徴とする
   、水不溶性の架橋ポリアクリルアミドポリマー。 ２、ｍが１〜３の整数であり、ｎが２〜４の整数である
   特許請求の範囲第１項記載のポリマー。 ３、ｍが１であり、ｎが２である特許請求の範囲第２項
   記載のポリマー。 ４、モノマー構造単位（ａ）約１〜１８％、モノマー構
   造単位（ｂ）約７０〜９５％及びモノマー構造単位（ｃ
   ）約２〜１２％からなる特許請求の範囲第１項記載のポ
   リマー。 ５、モノマー構造単位（ａ）約２〜１６％、モノマー構
   造単位（ｂ）約８０〜９４％及びモノマー構造単位（ｃ
   ）約２〜１０％からなる特許請求の範囲第４項記載のポ
   リマー。 ６、モノマー構造単位（ａ）１０％、モノマー構造単位
   （ｂ）８８％及びモノマー構造単位（ｃ）２％からなる
   特許請求の範囲第３項記載のポリマー。 ７、モノマー構造単位（ａ）２％、モノマー構造単位（
   ｂ）９４％及びモノマー構造単位（ｃ）４％からなる特
   許請求の範囲第３項記載のポリマー。 ８、直径約２０〜２００μｍの個々の粒子の形態の特許
   請求の範囲第１項記載のポリマー。 ９、直径約３８〜１５０μｍの不連続な粒子の形態の特
   許請求の範囲第８項記載のポリマー。 １０、該粒子が個々のゲル粒子である特許請求の範囲第
   ８項又は９項記載のポリマー。 １１、（１）次式： （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼（ｂ）▲数式
   、化学式、表等があります▼（ｃ）▲数式、化学式、表
   等があります▼ （式中、ｍ及びｎは独立して１〜６の整数である） のモノマー類からなる混合物を共重合せしめ、（ｉｉ）
   得られた架橋ポリアクリルアミドポリマーを単離するこ
   とを特徴とする、水不溶性の架橋ポリアクリルアミドポ
   リマーの製造方法。 １２、該架橋ポリマーを還元剤で還元してモノマー（ｃ
   ）の架橋結合中のジスルフィド結合を開裂させて化学的
   に活性なスルフヒドリル基を形成する工程を更に含む特
   許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、還元された架橋ポリマーを生物学的に活性な物質
   と反応させ、該生物学的に活性な物質を化学的に活性な
   スルフヒドリル基と結合させる工程を更に含む特許請求
   の範囲第１２項記載の方法。 １４、該架橋ポリマーを個々の粒子に均質化する工程を
   更に含む特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、ｍが１〜３の整数であり、ｎが２〜４の整数であ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １６、ｍが１であり、ｎが２である特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 １７、該混合物が、モノマー（ａ）約１〜１２％、モノ
   マー（ｂ）約３２〜４８％及びモノマー（ｃ）約２〜８
   ％の水溶液からなる特許請求の範囲第１１項記載の方法
   。 １８、該混合物が、モノマー（ａ）約２〜１０％、モノ
   マー（ｂ）約３６〜４４％及びモノマー（ｃ）約３〜７
   ％の水溶液からなる特許請求の範囲第１７項記載の方法
   。 １９、該混合物が、モノマー（ａ）約１０％、モノマー
   （ｂ）約４０％及びモノマー（ｃ）約３．４％の水溶液
   からなる特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、反応混合物が、モノマー（ａ）約２％、モノマー
   （ｂ）約４０％及びモノマー（ｃ）約６．８％の水溶液
   からなる特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、該個々の粒子が直径約２０〜２００μｍである特
   許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２２、該個々の粒子が直径約３８〜１５０μｍである特
   許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、該粒子が個々のゲル粒子である特許請求の範囲第
   ２１項記載の方法。